Tema 3: METODE I TEHNICI UTILIZATE N ENZIMOLOGIE

18

3.1. Introducere

Datorit structurii lor chimice i rolului pe care-l ndeplinesc n organismele vii, enzimele prezint unele caracteristici comune cu ale altor biomolecule dar i proprieti specifice. Fiind proteine, enzimele prezint toate proprietile fizico-chimice i structurale ale acestora. Fiind biocatalizatori, respect toate legile catalizei chimice, iar faptul c acioneaz n organismele vii determin o serie de caracteristici specifice.Un studiu complet i corect al enzimelor sub aspectul structurii lor chimice, cineticii reaciilor enzimatice, specificitii lor de aciune etc. presupune, n primul rnd, izolarea lor din surse biologice i purificarea pn la un grad de puritate ct mai nalt. Metodele utilizate la izolarea i purificarea enzimelor sunt comune cu cele utilizate n studiul proteinelor n general. Spre deosebire ns de proteinele necatalitice, n cazul enzimelor trebuie evitat nu numai denaturarea ci i inactivarea lor. Este cunoscut faptul c stabilitatea maxim a enzimelor se ntlnete in vivo, adic n mediul lor natural. Cu ct gradul lor de puritate crete, cu att stabilitatea enzimelor scade, fapt ce impune unele precauiuni suplimentare pe parcursul procedurilor de separare i purificare. Principalii factori ce inactiveaz enzimele n timpul acestor proceduri sunt temperatura i pH-ul mediului. n afara temperaturilor ridicate i a valorilor extreme de pH, enzimele sunt puternic afectate i de modificrile brute ale acestor factori. De aceea, toate operaiunile se execut la rece (0 +4 oC), iar separarea fazei insolubile se face utiliznd centrifuga cu rcire. Sunt i operaiuni care se execut la temperaturi foarte joase. De exemplu, precipitarea enzimelor cu diferii solveni (aceton, alcool izopropilic etc.) se face la 15 oC sau chiar 20 oC.Modificarea pH-ului ntr-un interval mic al valorilor acestui parametru determin o modificare mai mult sau mai puin accentuat a activitii enzimelor, iar valorile extreme (de regul n afara intervalului de pH 5 - 9) produc chiar denaturarea acestora. De aceea ajustarea pH-ului se face la pH-metru i nu cu ajutorul hrtiei indicatoare. Acest lucru se face sub agitare continu, utiliznd soluii acide sau alcaline diluate care se adaug cu pictura pentru a evita o modificare prea puternic a pH-ului n zona de contact din jurul picturii.i modificarea triei ionice a mediului are influen asupra capacitii catalitice a enzimelor prin afectarea structurii chimice a biocatalizatorului. Acest lucru se explic prin faptul c enzimele au, n general, o structur compact n care resturile polare sunt orientate spre exterior n marea lor majoritate interacionnd cu dipolii apei. Fora ionic a mediului poate perturba stratul apos din imediata vecintate a moleculei enzimatice. n mod similar pot aciona i unii ageni tensioactivi utilizai n scopul solubilizrii enzimelor fixate n membranele biologice ale diferitelor structuri subcelulare. i prezena n mediu, chiar n concentraii mici, a inhibitorilor i activatorilor influeneaz capacitatea catalitic a enzimelor. Un factor extern ce poate influena puternic activitatea enzimelor l reprezint contaminarea microbian, motiv pentru care operaiunile de separare i purificare trebuie efectuate ct mai repede posibil.n cercetrile de enzimologie se utilizeaz soluii preparate n ap distilat sau bidistilat (n funcie de enzim), iar reactivii folosii trebuie s aib un grad de purificare ct mai nalt posibil. De regul se folosesc reactivi din categoria chimic pur (c.p.) i reactiv pentru analiz (p.a.).3.2. Stabilirea enzimei ce urmeaz a fi obinut

n obinerea unei enzime de uz industrial se ine cont, n primul rnd, de procesele de biotransformare n care va fi utilizat enzima respectiv. Este absolut obligatorie determinarea principalelor caracteristici ale enzimei n cauz, cele mai importante fiind urmtoarele: Specificitatea de aciune. Din acest punct de vedere o problem extrem de important o constituie activitatea global a preparatelor enzimatice comerciale dat fiind probabilitatea existenei i altor capaciti catalitice pe lng cea principal, activiti ce pot realiza transformri indezirabile. n cazul pectinazei de exemplu (enzim utilizat pe scar larg n industria de cofetrie), preparatele enzimatice pot conine de fapt trei enzime cu activiti catalitice diferite. n funcie de procesele ce urmeaz a se realiza, se aleg preparatele enzimatice convenabile a cror specificitate de aciune se manifest fa de substratele de care dispunem. pH-ul optim de aciune. Acest factor poate manifesta o influen hotrtoare asupra bunei desfurri a proceselor biotehnologice realizate de enzime. n general, se aleg enzime ce i menin activitatea catalitic ntr-un interval ct mai larg posibil de pH. Temperatura optim de aciune. n general, n industrie sunt preferate enzimele a cror temperatur optim de aciune este ct mai mare posibil deoarece la temperaturi relativ crescute este facilitat meninerea sterilitii mediului. 3.3. Alegerea tulpinii microbiene

Microorganismele capabile s sintetizeze n cantiti crescute anumite enzime se ntlnesc, n condiii naturale, n acele habitaturi care conin substratele enzimelor respective, acesta fiind un factor extrem de important de care se ine cont n alegerea tulpinii productoare. De exemplu, dac se intenioneaz s se obin enzime celulozolitice, tulpinile microbiene productoare se vor izola din medii naturale bogate n celuloz. Iniial cele mai multe microorganisme se izolau din sol. Actualmente ns aria cercetrilor a fost mult extins, fiind studiat posibilitatea izolrii productorilor industriali de enzime i din alte surse: ape reziduale, reziduuri din industria celulozei, a pielriei, cea alimentar etc., reziduuri din zootehnie i altele. Pentru izolarea tulpinilor microbiene productoare de enzime se folosesc metodele clasice, cea mai important fiind metoda cultivrii pe medii mbogite urmat de realizarea de subculturi pe medii selective. ntr-un mediu selectiv ideal, substratul enzimei n cauz reprezint unica surs a unuia din elementele vitale (de exemplu unica surs de carbon). Astfel, pentru obinerea de amilaze, mediul selectiv trebuie s conin amidonul ca unic surs de carbon i energie.Pentru obinerea de enzime la scar industrial, tulpinile microbiene productoare trebuie s ndeplineasc o serie de condiii: s se dezvolte pe medii ct mai simple cu putin i ieftine; s produc ct mai puini metabolii secundari; enzima ce urmeaz a fi obinut s fie exportat n mediul de incubare n aa fel nct s fie uor de izolat i purificat; s nu fie poluante; s nu fie patogene i s nu produc metabolii toxici.Dac enzimele n cauz urmeaz s fie utilizate n industria alimentar, tulpinile microbiene productoare trebuie s ndeplineasc toate condiiile G.R.A.S. (Generaly Recognized As Safe) adic toate condiiile impuse produselor alimentare. De aceea, orice nou tulpin studiat, nainte de a fi utilizat n producerea de enzime, este supus unui minuios examen toxicologic, ceea ce necesit mult timp. Acesta este motivul datorit cruia majoritatea cercettorilor prefer tulpinile microbiene deja incluse n cataloagele GRAS.Dup alegerea tulpinii productoare se pot face numeroase studii de optimizare a proceselor fermentative, iar ingineria genetic ofer posibiliti teoretic infinite de ameliorare. Se apeleaz foarte des la realizarea de mutante n vederea obinerii unor tulpini productoare de enzime cu randamente superioare. n acelai timp, prin mutaii pot fi suprimate acele caractere ale tulpinii slbatice care influeneaz negativ producia industrial a enzimelor, dat fiind faptul c, deseori, tulpinile slbatice produc unii metabolii secundari, alte enzime dect cea care ne intereseaz, antibiotice etc., compui ce se elimin relativ greu. De exemplu, n cazul obinerii glucoamilazei, preparatele rezultate conin de multe ori cantiti relativ mari de transglucozidaz, iar proteaza produs de Bacillus licheniformis este impurificat cu bacitracin. Cea mai eficient metod const n obinerea unor mutante care s nu produc metaboliii secundari respectivi.n ultimul timp, ingineria genetic ofer noi posibiliti de obinere a enzimelor de interes industrial. Cel mai adesea se recurge la clonarea genei responsabile de biosinteza unei enzime dintr-un microorganism incompatibil cu industria alimentar ntr-un al microorganism agreat de G.R.A.S.3.4. Cultivarea tulpinii productoare

Iniial, enzimele de origine microbian se obineau prin realizarea culturilor de suprafa pe medii solide sau semisolide. Aceast metod se mai utilizeaz nc la obinerea unor enzime de origine fungic cum ar fi amilazele (Aspergillus), proteazele (Aspergillus i Mucor), pectinazele (Penicillium) i altele. Actualmente sunt ns preferate culturile submerse deoarece n cazul culturilor pe mediu solid apar dificulti n ceea ce privete controlul temperaturii, umiditii i aerrii. Culturile n mediu lichid reduc riscul contaminrii i permit controlul periodic al parametrilor biochimici i microbiologici.3.5. Extracia i purificarea enzimelor

La sfritul perioadei de cultivare, enzimele trebuie extrase din celule i/sau lichidul de cultur dup care sunt supuse unui ir de operaiuni pentru obinerea preparatelor comerciale. Cel mai adesea se folosete centrifugarea, filtrarea, evaporarea, precipitarea reversibil, liofilizarea .a., iar preparatele enzimatice obinute se pot comercializa sub form de pudre, soluii, cristale, sub form imobilizat etc.n cazul enzimelor intracelulare extracia lor este mai dificil i presupune realizarea unei etape suplimentare de liz a celulelor microbiene, dup care procedurile sunt similare cu cele aplicate enzimelor extracelulare.

3.5.1. Extracia enzimelor

n cazul enzimelor solubilizate n lichide biologice, extracia enzimelor se face direct din acestea. Pentru enzimele fixate pe structuri celulare, se efectueaz mai nti omogenizarea esutului, izolarea structurilor subcelulare i solubilizarea enzimelor.Omogenizarea esuturilor se face fie prin mojarare pe nisip de cuar sau sticl pisat, fie cu ajutorul omogenizatoarelor speciale (de exemplu de tip Potter). Pentru aceasta, se sacrific animalul fr a-l stresa. Se recolteaz imediat organul sau esutul interesat i se introduce ntr-o capsul rece, aflat pe ghea. Dac omogenizarea i operaiunile ulterioare nu se execut imediat, se recomand congelarea esutului pentru a mpiedica inactivarea enzimelor.Se mrunete apoi esutul cu un bisturiu sau cu un foarfece rece. Fragmentele astfel obinute se introduc n tubul de omogenizare care este o eprubet cu pereii interiori rodai. Aceasta se introduce apoi ntr-un pahar ce conine ap cu ghea, iar n tub se introduce pistilul omogenizatorului. Se apas pe pedala acestuia pentru a conferi pistilului o micare de rotaie i se omogenizeaz esutul executnd o micare de du-tevino de-a lungul axului pistilului. Omogenizarea se realizeaz un anumit interval de timp i cu o anumit vitez de rotaie, n funcie de tipul esutului. n lipsa omogenizatorului special, dezintegrarea esutului se poate face i prin mojarare pe nisip de cuar, sticl pisat, oxid de aluminiu, pmnt de diatomee etc. Se recomand ca aceast operaiune s se execute la rece i n camere frigorifice speciale.Att omogenizarea ct i mojararea se face n prezena unui lichid de extracie (soluie salin izotonic, soluie izotonic de zaharoz, diferite soluii tampon, ap bidistilat etc.). O alt modalitate de obinere a extractelor acelulare o constituie congelarea-decongelarea repetat, metod des folosit n special pentru levuri. Dezintegrarea peretelui celular se mai poate efectua prin tratare cu ultrasunete, tratament enzimatic (lizozim, proteaze, lipaz etc.), tratament chimic (deoxicolat de sodiu, triton X-100, uree, guanidin etc.) i alte metode.Izolarea structurilor subcelulare. Dup omogenizarea esutului, omogenatele obinute sunt supuse centrifugrii dife-reniate n vederea separrii structurilor subcelulare.Centrifugarea se face la rece, dup ce instalaia frigorific a centrifugei cu rcire a fost cuplat n prealabil pentru rcirea rotorului i eprubetelor. n funcie de scopul urmrit, se folosesc diferite viteze de rotaie i intervale de timp diferiteDei viteza de rotaie este marcat la toate tipurile de centrifug n rotaii pe minut, n toate metodele i tehnicile de centrifugare difereniat aceasta este redat ca multiplii ai acceleraiei gravitaionale (g) deoarece una i aceeai centrifug poate avea rotoare cu raze diferite, ceea ce nseamn c fora centrifug este diferit pentru rotoare de diametru diferit la acelai numr de rotaii pe minut. Folosind viteze de rotaie i timpi intermediari pot fi obinute fraciuni mai fine. De exemplu mitocondriile formeaz reziduuri n condiii apropiate cu cele specifice reticulului endoplasmatic, cele dou fraciuni putnd fi obinute printr-o nou centrifugare. n mod similar, dup dezintegrarea mem-branelor mitocondriale, cele dou membrane pot fi obinute n fraciuni separate.Solubilizarea enzimelor. Enzimele fixate pe structurile subcelulare nu pot fi extrase dect dup ndeprtarea lor din aceste structuri. n acest scop, fraciunea subcelular ce ne intereseaz este supus dezintegrrii prin diferite metode. Poate fi utilizat tratamentul sonic, tratamentul enzimatic, chimic etc. Printr-o modalitate sau alta, membrana biologic respectiv este dezintegrat, iar enzimele se solubilizeaz n mediul de extracie. ndeprtnd prin centrifugare la rece resturile membranare se obin, n final, supernatante ce conin enzimele n form solubil.Pentru separarea i purificarea enzimelor din diferite lichide biologice, acestea se utilizeaz direct, operaiunile ce se execut fiind asemntoare cu cele aplicate supernatantelor obinute n ultima faz pentru enzimele membranare. n cazul enzimelor microbiene, cele extracelulare se extrag direct din lichidele de cultivare dup ndeprtarea biomasei, iar enzimele intracelulare pot fi extrase ca i enzimele membranare de origine vegetal sau animal.Schema general de extracie i purificare a enzimelor microbiene extracelulare i intracelulare cuprinde o serie de etape obligatorii ce se respect pentru toate enzimele.3.5.2. Metode de extracie a enzimelor. Condiii optime de extracie.

Lichidele biologice, precum i supernatantele obinute dup solubilizarea enzimelor mem-branare, se trateaz n continuare n mod asemntor. Deoarece mediile respective conin un numr foarte mare de proteine, enzimele fiind deseori n cantiti mai mici dect proteinele structurale, se trece la extracia acestora n vederea obinerii aa-numitelor preparate enzimatice brute care conin cea mai mare parte a enzimei studiate i un numr relativ restrns de proteine balast. Aceast operaiune are la baz proprietatea proteinelor de a precipita reversibil i difereniat n funcie de cantitatea, respectiv intensitatea factorului precipitant. Enzimele pot fi precipitate selectiv prin mai multe metode, alegerea metodei optime fiind n funcie de enzima ce urmeaz a fi izolat.Termoprecipitarea este o metod aplicat relativ rar, putnd fi aplicat doar pentru enzimele termostabile. Marea majoritate a proteinelor sunt stabile ntr-un interval termic relativ restrns (0 +40 oC), temperaturile situate n afara acestui interval putndu-le denatura. Dac enzima ce urmeaz a fi separat este termostabil, se nclzete mediul la o temperatur ct mai ridicat posibil dar care s nu afecteze enzima respectiv. La aceast temperatur proteinele balast sunt denaturate, putnd fi ndeprtate prin centrifugare.Precipitarea la pH izoelectric. Fiind proteine, moleculele enzimelor conin grupe funcionale acide i bazice care sunt orientate, de regul, spre exterior unde interacioneaz cu dipolii apei. Fiecare protein, n general, este caracterizat de o structur primar specific, avnd deci un numr dat de grupe funcionale ionizabile. De aceea, fiecare din ele se caracterizeaz printr-o valoare specific a punctului izoelectric, adic a acelei valori de pH la care molecula este neutr din punct de vedere al ncrcrii electrice. Ajustarea mediului la un pH egal cu punctul izoelectric al unei enzime date face ca interaciunea moleculelor acesteia cu dipolii apei s nceteze, stratul apos din micromediul imediat vecin moleculei enzimatice dispare, iar enzima precipit.Grupele funcionale polare, valoarea punctului izoelectric i comportarea acido-bazic a unei enzime pot fi determinate prin trasarea curbei de titrare poteniometic. n general, enzimele au valori diferite ale pH-ului lor izoelectric. De exemplu, pentru catalaz pI=5,4; pepsina are pI=1,0; elastaza are pI=8,5; iar punctul izoelectric al lizozimului (muramidaza) din ou este la pH=11,0.Precipitarea cu solveni organici se bazeaz pe proprietatea acestora de a diminua valoarea constantei dielectrice a mediului cu repercusiuni asupra forelor de atracie coulombian dintre radicalii polari ai enzimei. n mediu apos, forele de atracie dintre moleculele de protein-enzim datorate grupelor ionizate cu sarcini electrice de semn contrar sunt anulate prin interaciunea acestora cu moleculele de ap care se comport ca un dipol datorit electronilor neparticipani ai atomului de oxigen i caracterului electropozitiv al atomilor de hidrogen. Prin adugarea solvenilor organici, are loc o diminuare treptat a numrului moleculelor de ap din stratul imediat nconjurtor moleculelor enzimatice i scderea constantei dielectrice a mediului. Grupele polare sunt astfel eliberate putndu-i exercita fora de atracie electrostatic, iar proteinele precipit.Precipitarea cu sruri neutre se bazeaz pe solubilitatea diferit a proteinelor n general i a enzimelor n special n soluii saline. Reprezentarea grafic a solubilitii unei proteine n funcie de concentraia srii are aspectul unui clopot. Aceasta nseamn c la concentraii mici ale srii solubilitatea proteinelor crete pn la o anumit valoare cu creterea concentraiei n sare dup care diminueaz treptat. Deci, la concentraii saline mari, proteinele precipit din soluii putnd fi separate prin centrifugare. Deoarece fiecare protein precipit la o anumit concentraie a srii, este posibil realizarea unei precipitri fracionate a proteinelor dintr-un lichid biologic. Nu orice sare poate fi ns utilizat n precipitarea fracionat a proteinelor. Pentru a fi un bun agent precipitant, o sare trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s posede o solubilitate mare n aa fel nct s se poat realiza o gam larg de concentraii; dizolvarea srii respective n ap nu trebuie s modifice pH-ul i temperatura soluiei (s nu fie un proces exoterm); s nu reacioneze cu proteinele i s poat fi ndeprtat prin metode obinuite (de exemplu prin dializ).Cel mai adesea se utilizeaz n acest scop sulfatul de amoniu, amestecul sulfat monopotasic i bipotasic, sulfatul de magneziu .a. De regul, concentraia srii n cazul precipitrii fracionate a proteinelor nu se exprim procentual (g substan la 100 g soluie) ci n procente de saturaie. De regul se prepar mai nti o soluie saturat dup care, n funcie de metod, se adaug aceast soluie la lichidul biologic i nu sarea cristalin, pn la un procent de saturaie dat. n literatura de specialitate ce abordeaz metode practice de enzimologie, se gsesc nomograme cu ajutorul crora se poate calcula cantitatea de sare ce trebuie adugat la 1000 ml soluie pentru a obine un anumit procent de saturaie.3.5.3. Purificarea enzimelor

Preparatele enzimatice obinute prin una din metodele descrise mai sus prezint un grad mic de purificare, necesitnd operaii ulterioare prin care s se mreasc puritatea acestora. n cazul obinerii preparatului enzimatic brut prin precipitare fracionat cu sruri neutre, acesta se afl sub form de precipitat, operaia urmtoare constnd, n mod obligatoriu n ndeprtarea ionilor srii. Aceasta se poate realiza prin mai multe metode, cel mai adesea utilizndu-se dializa.3.5.3.1. Dializa

Dializa este o metod des utilizat n biochimie n general i enzimologie n special. Prin aceast metod se pot separa biomoleculele cu mase moleculare mari de compuii chimici obinuii cum ar fi srurile. Preparatele enzimatice obinute prin precipitare cu sruri se introduc n tuburi de dializ care sunt reprezentate de tuburi confecionate din celofan sau dintr-o alt membran semipermeabil. Se leag tubul la capete i se introduce ntr-un vas ce conine un volum mare dintr-un lichid fa de care se realizeaz dializa. Mrirea porilor membranei semipermeabile nu permite trecerea macromoleculelor, n schimb ionii srii sunt eliminai treptat n lichidul exterior. Dat fiind concentraia relativ crescut a srii cu care s-a realizat precipitarea, dializa nu se realizeaz direct fa de ap distilat. n acest caz, datorit efectului Donnan, ar avea loc o distribuie inegal a ionilor care ar determina o acidifiere a mediului intern, n paralel cu alcalinizarea mediului extern.Aceast acidifiere a mediului intern poate determina denaturarea enzimei. Pentru a nltura acest efect, dializa se execut mai nti fa de o soluie tampon adecvat (24 de ore), apoi fa de ap de robinet n flux continuu (24-48 de ore) i n final fa de ap distilat (24 de ore prin schimbarea periodic a acesteia).3.5.3.2. Purificarea enzimelor prin gel-cromatografie

n gel-cromatografie, compo-nentele amestecului ce urmeaz a fi separate, migreaz cu viteze diferite printr-un strat cromatografic, viteza de migrare depinznd de efectul repartiiei lor ntre faza lichid i cea staionar. Stratul cromatografic este reprezentat de un gel cu o structur tridimensional caracteristic, insolubil.Coeficientul de partiie al unui solvent ntre faza solid i cea lichid este dependent exclusiv de efectele sterice, acest lucru stnd la baza mecanismului gel-cromatografiei. Moleculele mici ptrund n porii gelului, n timp ce substanele cu mas molecular mare neputnd penetra n ochiurile reelei tridimensionale, au viteze mari de eluie, prsind reticulul gelului mai repede. Caracterizarea suportului se face prin doi parametri:a) geometria stratului cromatografic care se refer la nlimea i diametrul acestuia. Volumul total al suportului se calculeaz ca fiind egal cu volumul coloanei cromatografice (care are form cilindric):Vt = R2h (3.1)Volumul spaiului gol (Vo) care este volumul dintre granulele gelului, se determin cu ajutorul unor substane ce nu sunt reinute de gel, prin evaluarea volumului lor de eluie. Prin diferen, se determin volumul stratului cromatografic:Vx = Vt VO (3.2)Volumul lichidului din interiorul particulelor de gel (volumul interior Vi) se determin ca fiind diferena dintre volumul gelului umflat (hidratat) i volumul parial al suportului:Vi = Vx - mgVg (3.3)unde:mg - masa gelului din strat;Vg - volumul specific al acestuia.Acest volum mai poate fi determinat i prin relaia Vi = mgWr, unde Wr este capacitatea de reinere a apei de ctre gelul uscat;

(3.5)b) viteza de eluie este parametrul ce caracterizeaz eluia stratului cromatografic i se exprim prin ml/min sau ml/or. Volumul de eluie, Ve, se definete ca fiind volumul eluatului necesar pentru a transporta moleculele unei substane date prin coloana cromatografic. ntre volumul de eluie i coeficientul de partiie K ntre cele dou faze se poate scrie relaia:Ve = Vo + Kvs (3.4)n care Vs este volumul fazei staionare. Atunci cnd ntregul gel este considerat faz staionar, coeficientul de partiie este:iar dac faza staionar este considerat a fi doar lichidul care mbib gelul, coeficientul de partiie este:

(3.6)Pentru a putea fi utilizat n gel-cromatografie, un gel trebuie s prezinte urmtoarele proprieti:- s fie inert chimic;- s fie stabil din punct de vedere fizico-chimic;- s conin un numr ct mai mic posibil de grupri polare pentru a evita efectele de schimb ionic;- s permit obinerea unei game largi de porozitate pentru a acoperi un domeniu ct mai larg de fracionare;- porozitatea s poat fi riguros controlat;- s fie rigid i s opun rezisten la eluie.n acest tip de cromatografie, cel mai adesea se utilizeaz gelurile pe baz de dextran, cum ar fi de exemplu Sephadex-urile produse de firma Pharmacia Fine Chemicals, gelurile pe baz de poliacrilamid (de exemplu gelurile de tip Bio-Gel produse de firma Bio-Rad), cele pe baz de agar i agaroz (Sagavac, Sepharose, Gelarose etc.) i altele.3.5.3.3. Fracionarea enzimelor cu ajutorul schimbtorilor de ioni

Datorit prezenei n structura apoenzimelor a resturilor de aminoacizi diamino-monocarboxilici, monoamino-dicarboxilici, hidroxi-aminoacizilor etc., moleculele enzimatice prezint la suprafaa lor o serie de grupe polare ale cror natur i numr difer de la o enzim la alta. Datorit acestei caracteristici, enzimele mai pot fi purificate i prin fracionare cromatografic pe schimbtori de ioni. Acetia sunt reprezentai de unele substane insolubile care conin grupe ncrcate electric ce fac parte din structura lor i ioni de schimb mobili. Cromatografia pe schimbtori de ioni se bazeaz pe capacitatea ionilor mobili de a fi schimbai reversibil cu ali ioni ncrcai cu sarcini electrice de acelai semn, fr ca matricea suportului s sufere modificri fizico-chimice. n funcie de natura acestor sarcini, schimbtorii de ioni pot exista sub dou forme:- schimbtori de anioni (anionii) care au grefate grupri polare pozitive pe o matrice insolubil, ionii de schimb fiind negativi;- schimbtori de cationi (cationii) n care ionii de schimb sunt ncrcai cu sarcini pozitive, gruprile polare ale suportului fiind ncrcate negativ.n calitate de suport pot fi utilizate rini sintetice schimbtoare de ioni, silicai, polizaharide modificate etc. Capacitatea unui schimbtor de ioni de a-i schimba ionii si mobili cu ionii din mediu poart numele de capacitate de schimb i depinde de numrul de grupe polare raportat la 1 gram substan uscat, de accesibilitatea acestora, de natura ionilor de schimb, de natura chimic, fora ionic i pH-ul eluantului etc. n procesul de separare cromatografic a unui amestec de proteine pe o coloan cu schimbtori de ioni are loc un fenomen de adsorbie reversibil a fraciunilor proteice. Fracionarea se realizeaz n funcie de ncrcarea electric a fiecrei proteine n parte, iar ndeprtarea lor treptat se face cu un eluant adecvat. Metoda eluiei n gradient este una din metodele cel mai des utilizate.Printre suporturile frecvent utilizate n cromatografia prin schimb ionic se numr aluminosilicaii i hidroxizii de fier i aluminiu n calitate de suporturi anorganice, iar schimbtorii de ioni organici cei mai adecvai sunt unii derivai ai celulozei (AE-celuloza, DEAE-celuloza, TEAE-celuloza, PAB-celuloza, ECTEOLA-celuloza, CM-celuloza, P-celuloza, SE-celuloza etc.), diferite tipuri de Sephadex (DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, SP-Sephadex etc.), unii copolimeri ai stirenului cu divinilbenzenul, ai acidului metacrilic cu divinilbenzenul i altele.3.6. Fracionarea enzimelor cu ajutorul adsorbanilor

(3.7)Acest tip de fracionare reprezint o alt variant a cromatografiei solid-lichid, separarea depinznd de echilibrul ce se stabilete la interfaz i de solubilitatea relativ a fraciunii enzimatice respective. La baza acestei metode st adsorbia enzimei ce urmeaz a fi purificat pe un suport datorit grupelor polare, forelor van der Waals, interaciunilor dipol-dipol, punilor de hidrogen etc. n procesul adsorbiei se instaleaz un echilibru ntre moleculele proteice adsorbite i cele libere, masa de solut adsorbit de unitatea de mas a suportului fiind descris de ecuaia Langmuir:n care:K1 - numrul centrilor de adsorbie din unitatea de mas a adsorbantului;K2 - constant ce descrie gradul de afinitate a solutului fa de adsorbant;c - concentraia solutului.Materialele adsorbante cel mai des utilizate sunt alumina, gelul de fosfat de calciu, hidroxiapatit i altele.3.7. Separarea enzimelor prin cromatografia de afinitate

O alt metod des utilizat n purificarea enzimelor este cromatografia de afinitate care are la baz interaciunea biospecific a acestor compui fa de anumii liganzi. Suportul se formeaz prin imobilizarea prin legare covalent a unui anumit ligand pe un suport insolubil cu formarea unui adsorbant de afinitate. Prin trecerea amestecului proteic printr-o coloan umplut cu un astfel de adsorbant, enzima ce urmeaz a se purifica este adsorbit datorit interaciunilor specifice cu ligandul, celelalte fraciuni trecnd libere prin coloan. Dup fracionare, enzima poate fi eluat fie specific, de exemplu cu o soluie a substratului ei natural, fie nespecific cum ar fi n cazul modificrii pH-ului sau concentraiei eluantului.Suportul insolubil inert utilizat n cromatografia de afinitate, poate fi reprezentat de agaroz, celuloz, sticl poroas, granule de poliacrilamid, dextrani reticulai etc.n etapele finale ale purificrii enzimelor se pot folosi: electroforeza preparativ n gel de poliacrilamid, izoelectrofocusarea prin electroforez n gradient de pH i alte metode.3.8. Cristalizarea enzimelor

Odat cu creterea gradului de puritate al unei enzime crete puternic i labilitatea acestora, att fa de temperatur ct i fa de pH-ul mediului de stocare sau ali factori. De aceea, dup obinerea unui grad de puritate convenabil, preparatele enzimatice nu se stocheaz sub form de soluii, cu cteva excepii cnd exist stabilizatori specifici hidrosolubili ai anumitor enzime. De cele mai multe ori enzimele se cristalizeaz n vederea stocrii, prin aceast operaiune realizndu-se i o etap suplimentar de purificare. Exist mai multe metode de cristalizare a enzimelor, cea mai frecvent utilizat fiind cristalizarea cu ajutorul sulfatului de amoniu sau a solvenilor polari cum ar fi alcoolii. Cristalizarea cu sulfat de amoniu se face la rece (0-4oC) prin adugarea treptat a srii sau a unei soluii saturate, sub agitare continu, pn la apariia unei turbiditi. Suspensia se las apoi cteva ore (n unele cazuri cteva zile sau chiar sptmni) la rece pentru maturarea cristalelor. n cazul cristalizrii enzimelor cu ajutorul solvenilor organici polari (de exemplu etanol) operaiunile se execut, de asemenea, la rece dup ce solventul a fost rcit n prealabil la -10oC sau chiar mai mult. Formele cristalelor difer de la o enzim la alta sau depind de sursa biologic, procedeul de purificare utilizat, agentul de cristalizare, pH-ul mediului de cristalizare etc.Dei enzimele pure sunt mult mai instabile dect cele aflate n mediul lor natural, ele sunt totui mai stabile dect preparatele enzimatice brute. Enzimele cristaline se pot pstra la rece (0-4oC) un timp relativ ndelungat fr pierderea activitii catalitice. Dac deshidratarea se face prin liofilizare, stocarea se face, de asemenea la rece, dar n absena total a umiditii. Enzimele aflate n soluii se pstreaz foarte bine la congelator dar nghearea-dezghearea repetat determin o inactivare destul de rapid. Din aceast cauz, acestea se stocheaz n frigider (0-4oC) dup ce s-a adugat un stabilizator adecvat. 3.9. Determinarea activitii enzimatice

Determinarea activitii catalitice a unei enzime poate fi evideniat fie prin evaluarea consumului de substrat fie prin evaluarea produsului de reacie format. Pentru marea majoritate a enzimelor, viteza de reacie este o funcie liniar de timp doar pentru primele minute de reacie. Din aceast cauz, determinarea activitii enzimelor se face prin efectuarea transformrii respective n condiii optime de reacie ntr-un interval de timp n care aceast dependen este liniar. Dup scurgerea acestui interval de timp se stopeaz reacia enzimatic printr-o modalitate sau alta dup care se determin fie concentraia substratului (substratelor) fie a produsului (produilor) de reacie prin metode fizico-chimice specifice. Crearea condiiilor optime de reacie nseamn crearea unor condiii de pH, temperatur, presiune osmotic, raport masic enzim/substrat etc., care s fie ct mai apropiate posibil de condiiile naturale, adic de condiiile pe care enzima le ntlnete in vivo. n funcie de proprietile fizico-chimice ale substratelor sau produilor de reacie, metodele de determinare a activitii enzimelor se mpart n mai multe grupe: metode spectrofotometrice, fluorimetrice, titrimetrice, calorimetrice, polarimetrice, radiometrice etc.

(3.10)Metode spectrofotometrice de determinare a activitii enzimelor. Aceste metode se bazeaz pe proporionalitatea care exist ntre extincia E (sau densitatea optic D.O.) a unei soluii i produsul dintre concentraia soluiei respective (c) i drumul optic (d) adic grosimea stratului de soluie pe care lumina o strbate:E (sau D.O.) = cd (3.8)

(3.9)unde este coeficientul de extincie molar, adic extincia substanei respective aflat n soluie ntr-o concentraie de 1 molar atunci cnd drumul optic este de 1 cm. Pe de alt parte, valoarea extinciei este dat de relaia:unde:Io - intensitatea luminii incidente;I - intensitatea luminii transmise;T - transmisia.innd cont de aceste relaii, unitatea de msur a coeficientului de extincie molar este:Cea mai mare sensibilitate n determinarea unui compus prin metode spectrofotometrice se situeaz la lungimea de und corespunztoare absorbiei maxime. De aceea, determinrile se fac la lungimi de und bine stabilite n funcie de spectrul de absorbie, aceste metode fiind pe deplin realizabile deoarece este practic imposibil ca att substratul ct i produsul de reacie s posede acelai spectru de absorbie. n multe situaii se determin direct extincia substratului sau a produsului de reacie la o lungime de und bine determinat, situat n ultraviolet, domeniul vizibil sau chiar domeniul infrarou. De foarte multe ori, se folosesc metode n care substratul sau produsul de reacie formeaz compleci colorai cu reactivi specifici, iar intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia substanei respective. n asemenea situaii se determin densitatea optic a acestui compus colorat la o lungime de und din domeniul vizibil. Calculul rezultatelor n toate metodele spectrofotometrice, se face, fie prin utilizarea unei soluii etalon (standard), fie prin trasarea unei curbe de etalonare.Metode fluorimetrice de determinare a activitii enzimelor. Aceste metode de analiz sunt extrem de sensibile deoarece pot fi nregistrate modificri ale emisiei spectrale chiar la concentraii foarte mici ale substanelor analizate. Metodele fluorimetrice de dozare se pot utiliza atunci cnd fie substratul, fie produsul de reacie, fie cofactorul enzimatic prezint proprieti fluorescente. De exemplu, activitatea dehidrogenazelor FAD-dependente poate fi determinat cu mare exactitate prin metode fluorimetrice deoarece coenzimele flavinice sunt fluorescente n stare oxidat. Proprietile fluorescente dispar prin reducerea lor n procesele redox pe care le catalizeaz flavoenzimele.Metode titrimetrice de determinare a activitii enzimelor. Exist reacii enzimatice cnd substratul sau produsul de reacie prezint caracter acid sau bazic putnd fi dozat prin titrare. De exemplu lipaza, acionnd asupra triacilglicerolilor, hidrolizeaz acest substrat cu formare de glicerin i acizi grai liberi. Concentraia acestora poate fi apoi determinat prin titrare cu o soluie alcalin de titru cunoscut. Aria de aplicabilitate a acestor metode este totui destul de restrns deoarece formarea unor produi de reacie cu caracter acid sau alcalin determin modificarea pH-ului mediului de incubare cu repercusiuni asupra capacitii catalitice a enzimei respective.Metode calorimetrice. Aceste metode de determinare a activitii enzimelor se bazeaz pe msurarea cldurii de reacie ca o msur a vitezei cu care substratul este modificat enzimatic, atunci cnd reacia este exoterm. i aceste metode sunt puin utilizate deoarece eliberarea unei anumite cantiti de cldur modific condiiile de temperatur ale incubaiei, reacia enzimatic decurgnd n continuare n condiii termice diferite de cele optime. Metode polarimetrice. Datorit faptului c foarte multe biomolecule prezint activitate optic determinat de prezena unuia sau mai multor atomi de carbon chirali, aceste metode de determinare a activitii unor enzime se bazeaz pe msurarea unghiului sub care soluia substratului sau a produsului de reacie rotete planul luminii polarizate. Metodele polarimetrice de analiz se pot aplica n enzimologie n trei situaii:a) substratul reaciei este optic activ, iar produsul este optic inactiv;b) produsul de reacie este optic activ, iar substratul nu prezint activitate optic;c) att substratul ct i produsul transformrii enzimatice prezint activitate optic, dar rotaiile lor specifice sunt diferite.Pentru determinarea activitii unor enzime se mai folosesc metode radiometrice, metode cu enzime imobilizate, metode cu kit-uri de reactivi i altele.

REFERINE BIBLIOGRAFICE1. Pellerin, P. DSM Food Specialties Oenology. Personal communication.2. Ribereau-Gayon, P., et al. Handbook of Enology Vol. 2.3. Van Rensburg, P. and Pretorius, I.S. Enzymes in Winemaking: harnessing natural catalysts for efficient bio-transformations. South African Journal of Enology and Viticulture Vol. 21, Special Issue 2000.4. rdea C. Tratat de vinificaie. Ed.:Editura Ion Ionescu de la Brad, 2007, 713 p.