Facultatea de Medicina Veterinara BucurestiIgiena produselor alimentare de origina animala si Sanatate Publica

METODE DE LABORATOR UTILIZATE IN PROGRAMELE DE AUTOCONTROL

Masteranzi:ILIE ADRIANAILIE FLORINA

-2011-

METODE DE LABORATOR UTILIZATE IN PROGRAMELE DE AUTOCONTROL

Alimentul reprezinta orice produs in stare naturala sau prelucrata care contine substante nutritive necesare organismului uman si se foloseste pentru intretinerea activitatii sale vitale, nefiind daunator.

Alimentul se poate prezenta ca produs agroalimentar natural de origine vegetala si animala, constituind o materie prima pentru prelucrarea produselor alimentare sau se poate consuma ca atare de catre populatie, respectiv printr-o prelucrare in gospodarie. Produsul alimentar este un alt mod de prezentare a alimentului si este realizat din produse agroalimentare printr-un procedeu industrial, fiind pus la dispozitia populatiei prin intermediul pietei.

Sistemul de supraveghere-control al calitatii alimentului este un ansamblu ordonat de activitati privind urmarirea periodica sau permanenta a evolutiei caracteristicilor esentiale sau globale ale calitatii unui aliment si determinarea organizata a starii lui de conformitate.

Garantare calitatii alimentelor, si prin aceasta, a alimentatiei, nutritiei si sanatatii populatiei trebuie sa fie element de baza a comertului intern si international al Romaniei. Se intelege prin aceasta:

- protejarea populatiei fata de riscurile degradarii sanatatii prin achizitionarea si consumul unor produse neconforme reglementarilor privind alimentele;

- combaterea fraudei sub orice forma in domeniul realizarii, comercializarii si utilizarii alimentelor;

- promovarea responsabilitatilor ce revin tuturor celor care participa la procesele mai sus mentionate;

- coordonarea si supravegherea in acest scop a produselor care intervin in lantul realizarii produselor agroalimentare si alimentare, respectiv in conditionare, transport, depozitare, comercializare si utilizare;

- in domeniul securitatii alimentare a populatiei prin supravegherea si controlul securitatii alimentului;

- respectarea legislatiei si a tuturor reglementarilor privind asigurarea calitatii alimentelor.

Conform normei sanitar veterinare nr. 487/dec.2001 toate unităţile care produc şi procesează produse de origine animală sunt obligate să implementeze programe proprii de autocontrol al activităţii productive desfăşurate.

Programul de autocontrol este obligaţia unităţilor şi aplicarea acestuia constituie dovada supravegherii proprii in unitate. Programul de autocontrol include recoltarea de probe de către producător din fiecare şarjă de fabricaţie, recoltare de teste de sanitaţie pentru controlul stării de igienă al unităţii şi probe de apă potabilă care este folosită în procesul tehnologic.

2

Probele recoltate de unitate în cadrul programului de autocontrol se examinează în laboratorul uzinal autorizat sau în oricare alt laborator autorizat. Laboratorul care a efectuat analizele eliberează buletin de analiză conform prevederilor legale.

Medicii veterinari de stat eliberează certificate sanitare veterinare pentru produsele care circulă pe piaţa internă, pe baza certificatului de calitate al producătorului şi a buletinului de analiză emis de laboratorul autorizat, care atestă rezultatele la probele recoltate de unitate în cadrul programului de autocontrol.

Pentru certificarea conformităţii, agenţii economici sunt obligaţi să verifice fiecare şarjă de fabricaţie şi să emită certificat de calitate/declaraţie de conformitate pentru fiecare lot de livrare. Expertiza sanitar veterinară de laborator a produselor de origine animală este obligatoriu prealabilă valorificării produselor pentru consum şi admiterii pentru utilizarea produselor care intră în compoziţia sau vin în contact cu produsele de origine animală.

Se supun controlului sanitar veterinar următoarele produse: materii prime şi produse de origine animală, alte materii prime şi produse care intră în compoziţia produselor de origine animală, alte materii şi produse care vin în contact cu produsele de origine animală, materii prime furajere şi furaje.

Certificatele sanitar-veterinare sunt emise numai pe baza buletinelor oficiale de analiză. Producătorul este obligat să implementeze programe proprii de autocontrol; în acest sens este obligat să recolteze probe şi să supună analizelor sanitar veterinare fiecare şarjă de fabricaţie.

Medicii veterinari de stat eliberează certificate sanitare veterinare pentru produsele care circulă pe piaţa internă, pe baza certificatului de calitate al producătorului şi a buletinului de analiză emis de laboratorul autorizat, care atestă rezultatele la probele recoltate de unitate în cadrul programului de autocontrol.

In cadrul acestei lucrari vom evidentia traseul parcurs de o proba trimisa catre analizare intr-un laborator de incercari neutru, prin programul de autocontrol al unei firme producatoare de carne si produse din carne.

La receptia obiectelor de incercat la sediul laboratorului se au in vedere urmatoarele aspecte, in cazul laboratorului de analize fizico-chimice si microbiologice cu caracter obligatoriu :

- produsul sa fie ambalat;- ambalajul sa fie intact, etichetat;- obiectul de incercat sa fie in cantitatea corespunzatoare pentru efectuarea incercarilor

(cel putin 100g) ; - eticheta sa contina toate datele de identificare (denumire produs, date despre prelevare, daca este cazul, lotul, etc.) care sa corespunda cu datele din comanda, proces verbal, certificate de calitate ;

- se confrunta informatiile din cerere/comanda cu informatiile de pe probe. In caz de diferente se ia legatura cu clientul.

De asemenea, la receptia obiectului de incercat este inregistrata orice anomalie sau abatere de la conditiile normale sau specificate, descrise in metoda de incercare /etalonare. Atunci cand exista indoieli referitoare la adecvarea obiectului, sau cand nu este conform cu descrierea furnizata sau incercare/etalonare ceruta nu este descrisa suficient, laboratorul consulta clientul, inainte de a actiona si face inregistrarea discutiei.

3

Daca obiectele de incercat sunt prezentate necorespunzator, acestea se refuza si se ia legatura cu beneficiarul, pentru lamuriri suplimentare. Probele care nu indeplinesc criteriile de acceptabilitate sunt etichetate ca si « neconforme » si sunt returnate clientului conform contractului fiind trasanportate in conditii corespunzatoare pentru evitarea deteriorarii acestora.

Obiectele de incercat acceptate pentru a fi analizate sunt identificate intern cu un numar propriu generat de sistemul informatic ce cuprinde urmatoarele informatii : numarul de comanda, numarul probei din comanda respectiva, data de receptie.

Obiectele de incercat se introduc in lucru in maxim 24 ore de la data receptiei pentru compartiment microbiologie si in maxim 48 ore pentru compartiment chimie.

Pastrarea obiectelor de incercat pana la intrarea in lucru si pana la raportarea rezultatelor se realizeaza intr-un spatiul special amenajat pentru fiecare compartiment (camera probe lucru micro, camera probe in lucru chimie) in conditiile specificate pe comanda sau pe ambalaj.

Manipularea obiectelor de incercat pana la intrarea in lucru se realizeaza astfel incat sa nu se deterioreze caracteristicele acestuia, inclusiv ambalajul.

Obiectele de incercat pastrate ca probe martor se depoziteaza intr-un spatiu special amenajat si in conditiile specificate in comanda sau pe ambalaj,durata de pastrare a acestora este de 3 luni de zile, pentru produsele neperisabile si pana la raportarea rezultatelor pentru produsele perisabile (Produsele perisabile se pstreaza pana la raportarea rezultatelor in frigiderele din camerele cu probe in lucru). Nu se pastreaza probe martor din produse vrac. Beneficiarul este consultat in privinta probelor pastrate drept probe martor.

Analiza cerintelor/comenzilor se face de catre Seful de laborator la primirea fiecarei cereri/comenzi si asigura ca cerintele sunt clar definite si ca exista capabilitatea de a fi realizate (resurse fizice, umane si de informatii necesare si ca personalul laboratorului are aptitudinile si experienta necesare).

Comenzile/contractele sunt primite si analizate de Seful de Laborator, urmarindu-se daca :

-cerintele clientilor sunt clar specificate ;-denumirea incercarilor solicitate sunt conforme cu standardele ; -daca este precizata metoda de incercare. Daca metoda de incercare este o metoda

nestandardizata se aduce la cunostinta clientului si se obtine acordul acestuia pentru executia incercarii solicitate.

Operatorii introduc comenzile acceptate in sistemul informatic si automat se genereaza fisele de lucru ce se transmit catre responsabilii tehnici de incercari.

Cand clientul nu specifica exact metoda utilizata, laboratorul alege metodele corespunzatoare in conformitate cu standardele si legislatia in vigoare si informeza clientul privind metodele utilizate pentru incercarile respective.

In cazul in care comanda/contractul nu este completa/complet se ia legatura cu clientul, pentru clarificarile si precizarile suplimentare necesare.

Executarea incercarilor se efectueaza in functie cu cerere/comanda si in conformitate cu procedurile specifice de catre responsabil tehnic si de incercare. Toate obiectele de incercat sunt insotite de fisele de lucru care specifica incercarile ce trebuie executate.

Inregistrarile privind efectuarea incercarilor se realizeaza in fisa de lucru ce contine urmatoarele informatii :

- data efectuarii incercarii ;- denumirea probei de analizat , numarul comenzii/data comenzii ; - codificarea probei de analizat ;

4

- metodele de incercare utilizate ; -incercarea efectuata, daca acestea sunt impuse, rezultatele directe obtinute din incercare,

prelucrarile de date efectuate, rezultatele finale.Fisele de lucru sunt numerotate automat de catre soft-ul utilizat. Se pot face pana la trei

modificari pe fisele de lucru. Se taie textul gresit si scrie deasupra, validandu-se prin semnatura si data.

Laboratorul asigura calitatea rezultatelor incercarilor si etalonarilor prin monitorizarea rezultatelor ce cuprinde :

- utilizarea cu regularitate a materialelor de referinta certificate si/sau controlul calitatii folosind materiale de referinta secundare ;

- participarea la incercari interlaboratoare sau programe incercari de aptitudine ;- repetarea incercarilor si/sau etalonarilor folosind aceleasi metode, sau metode diferite ;- reincercarea/retalonarea obiectelor pastrate ; - corelarea rezultatelor pentru diferite caracteristici ale unui obiect.

Primirea probelor pentru cazul în care se solicită examen din partea celor doua compartimente: dupa receptionare probele sunt directionate catre laboratorul de microbiologie pentru recoltare sterila dupa care sunt directionate catre laboratorul fizico-chimic, fiind insotite de fisele de lucru .

Probele care nu se introduc imediat în lucru se păstrează în conform cu specificatiile producatorului in camera de depozitare probe in lucru.

Pentru cazul în care se solicită examen numai din partea laboratorului microbiologic: dupa receptie probele sunt insotite de fisa de lucru si pana la introducerea in lucru se păstrează conform cu specificatiile producatorului in camera de depozitare probe in lucru.

Efectuarea incercarilor microbiologiceDupa primirea probelor in cadrul laboratorului microbiologic acestea sunt analizate in

ordinea intrarii lor, a naturii lor sau a urgentei lor.Din fiecare proba sau sortiment (dupa caz), se constituie cate doua probe, din care una

intra in procesul analitic si cea de-a doua, ambalata in recipienti (ambalaje) adecvate, se depoziteaza in camera de probe in lucru cu temperatura controlata, unde sunt realizate conditiile impuse de fabricant (pentru pastrarea caracteristicilor initiale), devenind contraproba laboratorului microbiologic.

Contraproba laboratorului microbiologic este folosita, in anumite cazuri, pentru repetarea analizei (analizelor) si pastrata pana la emiterea raportului de incercari .

Pe fluxul analitic probele poarta pentru identificare numarul de inregistrare unic si vor fi inregistrate in fisele de lucru.

Produsele din carne sunt examinate conform Regulamentului (CE) nr. 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare + Modificarea 1441/2007.

Conform Regulamentului, determinarile se fac pe 5 esantioane de minim 200g fiecare.Pentru carne si produse de carne vom exemplifica metodele de determinare pentru

Salmonella, Escherichia coli si Listeria monocytogenes.

Salmonella – sunt enterobacterii patogene pentru om si animale, care fermenteaza glucoza cu producere de gaz, produc de regula hidrogen sulfurat, folosesc citratul ca unica sursa

5

de carbon, nu fermenteaza lactoza, nu produc indol si uree, prezinta structura antigenica specifica pusa in evidenta prin reactii serologice.

Principiul metodeiDeterminare a prezentei sau absentei Salmonellei intr-o anumita masa sau volum de

produs . Detectarea Salmonellei necesita patru etape successive: preimbogatirea in medii lichide neselective (apa peptonata tamponata) , imbogatirea in medii selective lichide (bullion RVS si MKTTn) , izolare si identificare pe medii selective solide, confirmare prin teste biochimice si serologice.

Aparatura, sticlarie si consumabile necesare:- Autoclav- Balanta- Baie de apa reglata la 47±2ºC- Spatule- Plita electrica- Cilindru gradat etalonat de capacitate 1000ml- pH-metru- Pipete sterile de 1ml, 5ml, 10 ml- Incubator : 30 0 C±10C- Placi Petri- Eprubete- Bec de gaz- Dilutar (Baby Gravimate)- Stomacher- Pungi sterile- Alcool etilic 70%(v/v)- Penseta sterila- Cutit, foarfeca – sterilizate.Medii de cultura si diluanti Diluanti conform ISO 6887Mediu de cultura – RVS ( bulion Rappaport –Vassiliadis cu soia)Mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se

instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 5,2±0,2 la 250C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza in autoclav 15 minute la 1150C. Mediul se pastreaza la 30C±20C .

Mediu de cultura - MKTTn (bulion Muller-Kauffman –tetrationat –novobiocina)Mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se

instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 8,2±0,2 la 250C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza prin fierbere timp de 5 minute. La mediul de baza se adauga solutie de novobiocina. Mediul de baza se poate pastra 4 saptamani la 30C±20C.

XLD(agar xiloza- lizina-dezoxicolat) Mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se

instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 7,4 ±0,2 la 250C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza prin fierbere la 900C . Mediul se raceste intr-o baie de apa fixata intre 440C si 470C ,

6

se agita si se toarna in placi.Se lasa sa se solidifice. Placile turnate se pastreaza in frigider la 30C±20C, pana la 5 zile .

Agar Rambach Mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se

instructiunile producatorului . Se adauga un flacon de lichid-mix la 250 ml de apa distilata sau deionizata si se amesteca . Se adauga 1 flacon de nutrient-praf şi se amestecă prin agitare până la dizolvarea completa. Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 7,3±0,2 la 250C .Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza prin fierbere timp de 20-25 de minute agitand mediul din timp în timp . Mediul se raceste intr-o baie de apa fixata intre 440C si 500C , se agita si se toarna in placi. Se lasa sa se solidifice. Placile turnate se pastreaza la frigider la temperaturi de sub 60C timp de 3 saptamani .Daca sunt sigilate in pungi de plastic placile pot fi pastrate la frigider timp de 3 luni.

Masuri de precautie si igiena, etape premergatoare - purtarea de catre personalul din laborator a echipamentului de protectie; - inainte si dupa terminarea lucrului este obligatorie dezinfectarea mainilor cu alcool

70%; - dezinfectarea cu dezinfectant , inainte si dupa utilizarea a suprafetelor de lucru; - asigurarea ca pe suprafetele de lucru nu exista posibile surse de contaminare; - inchiderea usilor in timpul lucrului; - asigurarea ca este la indemana tot ce trebuie inainte de a incepe lucrul; - stergerea imediata cu vata imbibata in alcool 70% a eventualilor stropi de pe suprafata

de lucru. Etapa de preimbogatire in mediu neselectiv lichid Se face automat cu ajutorul dilutarului ( Baby Gravimate) care este echipat cu un sistem

de tragere a solutiei de apa peptonata tamponata . Produsele solide se omogenizeaza cu ajutorul stomacherului. Se cantaresc 25g proba la care se adauga 225 ml de solutie de apa peptonata tamponata cu dilutarul. Se incubeaza suspensia initiala la 370C ±10C timp de 18h±2.

Etapa de imbogatire in medii selective lichide Se transfera 0,1 ml de cultura intr-o eprubeta care contine 10 ml de bulion RVS, se

transfera 1 ml de cultura intr-o eprubeta care contine 10 ml de bulion MKTTn. Se incubeaza bulionul RVS inoculat la 41,50C±10C timp de 24h±3h si bulionul MKTTn la 370C ±10C timp de 24h±3h.

Etapa de izolare si identificareDin culturile obtinute in bulion RVS si bulion MKTTn se insamanteaza cu ansa prin

striere suprafata unei placi care contine mediu XLD , respectiv agar Rambach.Se incubeaza placile Petri la 37 0C±10C timp de 24h±3h. Dupa incubare se examinaeza placile si se selecteaza coloniile tipice de Salmonella si coloniile atipice care ar putea fi Salmonella. Coloniile tipice de Salmonella crescute pe XLD au un centru negru si o zona transparenta luminoasa de culoare rosiatica datorita shimbarii indicatorului. Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar Rambach au o culoare roşie caracteristică.

Pentru confirmare se iau 5 colonii .Daca pe o placa exista mai putin de 5 colonii tipice sau suspecte, se iau pentru confirmat toate coloniile. Se insamanteaza coloniile selectate pe suprafata uscata a placilor cu agar nutritiv , in asa fel incat sa se permita dezvoltarea de colonii bine izolate. Se incubeaza placile insamantate la 37 0C±10C timp de 24h±3h.

Coloniile obtinute se supun testelor biochimice si serologice conform SR ISO 6579 .

7

Se efectueaza teste biochimice (agar TSI , agar uree, mediu de decarboxilarea L-lizinei, punerea in evidenta a -galatozidazei, reactia Voges –Proskauer, testul indol) si serologice prin punerea in evidenta a prezentei antigenelor O, Vi ,H prin aglutinare pe lama . Antiserurile se folosesc conform intructiunilor producatorului. Interpretarea rezultatelor testelor biochimice se face conform tabelelor de interpretare a testelor de confirmare.

Rezultatul se exprima prin prezent /absent in 25 g /ml produs.

Escherichia coli - metoda pentru enumerarea Escherichia coli pozitive la β-glucuronidaza din produsele destinate consumului uman sau pentru hrana animalelor, prin numararea coloniilor crescute pe un mediu solid care contine un ingredient cromogen pentru detectarea enzimei β-glucuronidaza dupa incubarea la 44oC.

Principiul metodeiCate doua placi cu mediu triptona –bila- glucuronat (TBX) se inoculeaza cu cantitati

specifice de proba pentru analiza sau de suspensie initiala . Se inoculeaza , in aceleasi conditii, folosind dilutiile decimale ale probei sau ale suspensiei initiale cate doua placi din fiecare dilutie . Se incubeaza placile Petri 18-24 h la 440C±10C. Se numara coloniile caracteristice si se calculeaza numarul de microorganisme pe mililitru sau pe gram de proba.

Aparatura, sticlarie si consumabile necesare:- Autoclav- Balanta- Baie de apa reglata la 47±2ºC- Spatule- Plita electrica- Cilindru gradat etalonat de capacitate 1000ml- pH-metru- Pipete sterile de ml, 5ml, 10 ml- Incubator : 44 0 C±10C- Placi Petri- Eprubete- Bec de gaz- Dilutar (Baby Gravimate)- Stomacher- Pungi sterile- Alcool etilic 70%(v/v)- Penseta sterila- Cutit, foarfeca – sterilizate.Medii de cultura si diluanti Diluanti conform ISO 6887Mediu de cultura – mediu triptona –bila- glucuronat (TBX)Mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se

instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 7,2±0,2 la 250C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza in autoclav 15 minute la 1210C. Inainte de inceperea analizei se topeste mediul complet , apoi se raceste pe baie de apa intre 440Csi 470C.

Masuri de precautie si igiena, etape premergatoare- purtarea de catre personalul din laborator a echipamentului de protectie;

8

- inainte si dupa terminarea lucrului este obligatorie dezinfectarea mainilor cu alcool 70%;

- dezinfectarea cu dezinfectant , inainte si dupa utilizare. a suprafetelor de lucru- asigurarea ca pe suprafetele de lucru nu exista posibile surse de contaminare .- inchiderea usilor in timpul lucrului;- asigurarea ca este la indemana tot ce trebuie inainte de a incepe lucrul.- stergerea imediata cu vata imbibata in alcool 70% a eventualilor stropi de pe suprafata

de lucru Pregatirea probei si a dilutiilor decimaleSe face automat cu ajutorul dilutarului ( Baby Gravimate) care este echipat cu un sistem

de tragere a solutiei de diluare (apa peptonata salina) pentru realizarea primei dilutii . Produsele solide se omogenizeaza cu ajutorul stomacherului .Se cantaresc 10g proba la care se adauga 90 ml de solutie de diluare cu dilutarul , astfel obtinandu-se prima dilutie (10 -1). Pentru a doua dilutie (10-2) se pun intr-o eprubeta 9 ml de diluant si 1 ml din dilutia 10 -1 . Se amesteca bine cu ajutorul vortexului .Se procedeaza in mod similar pentru obtinerea dilutiilor urmatoare , schimband pipeta la fiecare dilutie .

Inoculare si incubareFolosind o pipeta sterila, se transfera intr-o cutie Petri sterila 1ml din suspensia initiala

(10-1). Se inoculeaza cate 2 placi pentru fiecare dilutie. Se repeta modul de lucru cu urmatoarele dilutii decimale , daca este necesar , folosind o pipeta sterila pentru fiecare dilutie .

Se toarna 15 ml mediu TBX in fiecare cutie Petri. Se amesteca atent inoculul cu mediu, prin rotirea placilor Petri si se lasa sa se solidifice la temperatura camerei in laborator pe o suprafata rece. Intervalul de timp intre distribuirea inoculului in cutie si turnarea mediului nu trebuie sa depaseasca 15 minute.

Dupa solidificare se introduc placile cu fata in jos si se pun in incubator la 44 0C ±1◦C timp de 18-24 h.

Numararea coloniilor Dupa perioada de incubare , se numara coloniile tipice de Escherichia coli pozitive la β-

glucuronidaza din fiecare placa care contine mai putin de 150 UFC (unitati formatoare de colonii) tipice.

Metoda de calcul Pentru ca un rezultat sa fie valabil , in general se considera ca este necesara numararea

UFC de pe cel putin o placa care contine un minim de 15 UFC albastre.Se calculeaza N, numarul de UFC de Escherichia coli pozitive la β-glucuronidaza

prezente in proba analizata , pe mililitru sau pe gram , media a doua dilutii successive folosind ecuatia urmatoare:

Numarul total de Escherichia coli pozitive la β-glucuronidaza prezent in proba se calculeaza astfel :

N= SC/ V(n1+0.1n2)d,unde,

SC-suma coloniilor numarate in toate cutiile retinute de la doua dilutii succesive , din care cel putin una contine 15 colonii albastre ;

V- volumul de inocul depus in fiecare cutie ,in mililitri ; n1-numarul de cutii retinute la prima dilutie ; n2-numarul de cutii retinute la a doua dilutie ; d- factorul de dilutie corespunzator primei dilutii retinute.

9

Daca cele doua placi contin mai putin de 15 UFC albastre, se foloseste urmatoarea relatie:

N = ∑c / V× n×dUnde,

∑c – suma de UFC albastre numarate pe cele doua placi; V – volumul de inocul aplicat pe fiecare placa, in mililitri; n- numarul de placi retinute ( n= 2 in acest caz); d- factorul de dilutie a suspensiei initiale sau a primei dilutii inoculate sau retinute.Daca cele doua placi la nivelul suspensiei initiale din prima dilutie inoculata sau retinuta

nu contin nici o UFC albastra , rezultatul se exprima astfel :- mai putin de 1/d de Escherichia coli pozitive la β-glucuronidaza pe gram in care d este

factorul de dilutie al suspensiei initiale sau al primei dilutii inoculate sau retinute.

Listeria Monocytogenes- microorganisme care formeaza colonii tipice pe un mediu selectiv solid (colonii de culoare verzi- albastre inconjurate de un halou opac).

Principiul metodeiDin proba nediluata omogenizata se insamanteaza10 g (10 ml) in 90 ml bulion de

imbogatire selectiv, se resusciteaza 1 h , la 20 0C,dupa care se disperseaza pe suprafata unui agar selectiv ,se incubeaza 24-48 h la 35 0C sau 37C(prin intelegere intre partile interesate), dupa care se fac , daca este cazul, confirmari specifice pentru coloniile considerate prezumptive. Pe baza numarului de colonii confirmate, se calculeaza numarului de Listeria monocytogenes pe gram sau mililitru de proba luata in lucru.

Aparatura, sticlarie si consumabile necesare:- Autoclav- Balanta- Baie de apa reglata la 47±2ºC- Spatule- Plita electrica- Cilindru gradat etalonat de capacitate 1000ml- pH-metru- Pipete sterile de 1ml, 5ml, 10 ml- Incubator : 20 0 C±10C, 35 0 C±10C sau 37 0 C±10C- Placi Petri- Eprubete- Bec de gaz- Dilutar (Baby Gravimate)- Stomacher- Pungi sterile- alcool etilic 70%(v/v)- penseta sterila- cutit, foarfeca – sterilizate.

10

Medii de cultura Bulion semi-Fraser- mediul se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil

comercial, respectandu-se instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 7,2±0,2 la 250C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza in autoclav 15 minute la 1210C. Mediul se raceste pe baie de apa la 470C , se adauga solutia de citrat de fier si amoniu si se amesteca bine.

Mediu de cultura – Agar ALOA - se prepara din mediu complet deshidratat , disponibil comercial , respectandu-se instructiunile producatorului . Se foloseste apa distilata sau deionizata . Se regleaza pH-ul astfel incat dupa sterilizare sa fie 7,2±0,2 la 25 0C. Se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza in autoclav 15 minute la 1210C. Mediul se raceste pe baie de apa la 470C si se adauga cele doua suplimente. Se toarna 15-20 ml de mediu in placi si se lasa sa se solidifice.

Pregatirea probei de analizatSe face automat cu ajutorul dilutarului ( Baby Gravimate) care este echipat cu un sistem

de tragere a solutiei de diluare (apa peptonata salina sau bulion semi-Fraser) pentru realizarea primei dilutii sau suspensiei initiale . Produsele solide se omogenizeaza cu ajutorul stomacherului .Se cantaresc 10g proba la care se adauga 90 ml de solutie de diluare cu dilutarul , astfel obtinandu-se prima dilutie (10-1). Se lasa suspensia initiala sa stea 1h±5min la 200C ± 20C in scopul resuscitarii microorganismelor stresate.

Inoculare si incubareSe iau doua cutii Petri sterile . Se transfera in fiecare cutie cu ajutorul unei pipete sterile

cu mediu ALOA 0,1 ml din suspensia initiala . Daca pentru anumite produse se doreste sa se numere cel mai mic numar de Listeria monocytogenes , limita de detectie poate fi marita cu un factor de 10, prin inocularea a 1 ml de proba daca produsul este lichid , sau 1 ml din suspensia initiala pentru celelalte produse pe suprafata unei placi mari de agar (140mm), fie pe suprafata a trei placi mici de agar (90 mm). Se disperseaza , cu mare atentie , inoculul , cat mai repede posibil , pe suprafata agarului din cutie , fara a atinge marginile cu dispersorul . Se lasa cutiile inchise , aproximativ 15 min , la temperatura laboratorului , pentru ca inoculul sa fie absorbit.in agar. Se incubeaza cutiile cu agarul insamantat la 37 0C timp de 24-48 h. Dupa incubare coloniile caracteristice de Listeria spp apar sub forma onor colonii de culoare verzi- albastre inconjurate de un halou opac.

Confirmare Dupa perioada de incubare , se numara coloniile caracteristice de pe placi si se numara

coloniile din fiecare cutie care contine mai putin de 150 de colonii caracteristice sau necaracteristice. Pentru confirmare , se iau 5 colonii . Daca pe o placa exista mai putin de 5 colonii tipice sau suspecte ,se iau pentru confirmat toate coloniile. Coloniile obtinute se supun testelor biochimice si serologice conform SR ISO 11290 .

Se efectueaza teste biochimice :-se striaza coloniile slectate pe agar TSYEA(agar cu extract de

drojdii,soia,triptona),pentru a se forma colonii separate . Se incubeaza cutiile insamantate in termostat la 35 0C -37 0C, 18-24 h. Coloniile tipice au diametrul de 1mm-2mm ,sunt convexe , fara culoare si opace , cu marginile netede .

- reactia catalazei  cu peroxid de hidrogen .Se ia o colonie si se suspenda intr-o picatura de solutie de peroxid de hidrogen , pe o lama . Formarea imediata a bulelor de gaz indica o reactie pozitiva.

11

-colorarea Gram conform ISO 7218. Listeria spp. apar ca bacili scurti , subtiri ,Gram –pozitivi .

-testul mobilitatii - prin intepare cu un ac de inoculare a agarului cu o colonie tipica de pe TSYEA .Se incubeaza 48h-5 zile , la 25 0C cand se observa dezvoltarea sub forma de umbrela . -se ia o colonie si se suspenda intr-o eprubeta ce contine TSYEB, se incubeaza intr-un termostat la 25◦C, timp de 8 – 24 h , pana cand se observa o tulburare a mediului , apoi se depune o picatura din cultura ,folosind o ansa pe o lama microscopica curata de sticla , se pune peste ea

o lamela si se examineaza la microscop. Listeria spp. apare ca bacili scurti, subtiri,cu mobilitate prin rostogolire.

- testul hemolizei pe placi cu agar sange.- testul hidratilor de carbon se insamanteaza in bulioanele cu substante hidrocarbonate(L-

ramnoza sau D-xiloza), o cultura dezvoltata pe bulion TSYEB ,se incubeaza la 35 0C -37 0C, 24-48 h. Reactia pozitiva manifestandu-se prin aparitia culorii galbene(formare de acid) .

-Testul CAMP conform SR EN ISO 11290.Toate Listeria spp. sunt bastonase Gram-pozitive, mici, care prezinta mobilitate . Ele

sunt in general catalaza pozitive. Exprimarea rezultatului :Numararea coloniilor de Listeria monocytoogenes:Se calculeaza, pentru fiecare cutie, numarul ,a, de colonii de L. Monocytoogenes prezent,

folosind urmatoarea relatie :

a = b / A× C unde,b – numarul de colonii conforme cu criterile de identificare;A – numarul de colonii luate pentru confirmare;C – numarul total de colonii caracteristice numarate in cutie;Se rotunjeste la un numar intreg. Metoda de calcul :Cutiile care contin mai putin de 150 colonii, din care una cel putin sa contina 15 colonii

de Listeria monocytogenes.Se calculeaza numarul , N, de Listeria monocytogenes prezent in 1ml sau 1g de produs,

folosind urmatoarea relatie :

N = ∑a / V (n1+ 0,1n2)×dunde,∑a – suma coloniilor de Listeria monocitogenes, calculata dupa confirmare, din toate

cutiile retinute la doua dilutii consecutive, V – volumul inoculului insamantat in fiecare cutie, in mililitri;n1 – numarul de cutii retinute la prima dilutie;n2 – numarul de dilutii obtinut la a doua dilutie;d - factorul de dilutie care corespunde primei dilutii retinute;Se rotunjesc rezultatele obtinute la doua cifre semnificative.Se ia ca rezultat numarul de Listeria monocytogenes pe ml (produse lichide )sau pe g

(alte produse), exprimat ca un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10 la puterea corespunzatoare

12

Daca cele doua cutii insamantate cu suspensia initiala nu contin nici o colonie, rezultatul se exprima asfel :

- mai putin de 1 / d×V L. Monocytogenes pe gram sau mililitru.unde:d – factorul de dilutie al suspensiei initialae;V – volumul de inocul din fiecare cutie. Efectuarea incercarilor fizico-chimiceDupa ce au fost recoltate in mod steril probe in cadrul laboratorului de microbiologie,

probele sunt directionate catre laboratorul fizico-chimic.In continuare vom exemplifica determinarea umiditatii pentru carne si produse din carne.Principiul metodei Se determina pierderea de masa prin uscarea la etuva la o temperatura de 103 ± 2°C pana

la masa constanta dupa ce in prealabil s-a format un amestec omogen din proba de analizat, nisip si alcool etilic.

Pregatirea probei pentru analizaProba de laborator esantionata se omogenizeaza cu ajutorul mixerului de laborator sau

se taie marunt cu un cutit.In cazul carnii o proba de circa 200 g se toaca in intregime. La preparatele din carne se

toaca minim 100 g dupa indepartarea membranei. Proba maruntita si omogenizata se introduce intr-un recipient de sticla cu inchidere etansa. Determinarea umiditatii se executa imediat dupa pregatirea probei pentru analiza.

Etuva se incalzeste in prealabil la 103°C iar baia de apa la 60-80°C.Aparatura, sticlarie, reactivi- balanta analitica- etuva electrica termoreglabila.- fiole de cantarire din sticla cu capac - baghete de sticla l=max 7 cm- mixer de laborator - flacoane de sticla inchise etans- baie de apa termoreglabila Reactivi :- alcool etilic 96% vol- nisip de mare cu granulatie intre 0,25-1,4 mmNisipul spalat in prealabil se fierbe cu acid clorhidric d=1,19 diluat 1+1 timp de 30'

agitand continuu. Se repeta operatia cu o noua cantitate de acid pana acidul nu se mai ingalbeneste dupa fierbere.

Se spala apoi nisipul cu apa distilata pana la disparitia ionului clor, se usuca la 150-160 °C dupa care se pastreaza intr-un flacon inchis. Se poate utiliza si nisip de mare furnizat de firmele de reactivi.

Modul de lucru Intr-o fiola de cantarire cu capac se introduc 10 g nisip de mare calcinat si se usuca timp

de 30' in etuva la temperatura de 103±2°C, dupa racirea in exicator pana la temperatura camerei se cantareste fiola cu capac bacheta si nisip cu precizie de 0,001g.

Se introduc in fiola 5g proba pregatita conform 6.1.4. si se cantareste din nou cu o precizie de 0,001g

13

Dupa cantarire se adauga in fiola 5 ml alcool etilic si se omogenizeaza cu ajutorul unei baghete pentru a strivi aglomerarile (bagheta trebuie sa ramana tot timpul in fiola).

Se pune fiola fara capac pe baia de apa reglata la o temperatura de 60-80°C, unde se mentine agitand cu bagheta din cand in cand pana la evaporarea alcoolului.

Se trece fiola in etuva incalzita la 103°C si se continua incalzirea timp de 2 ore la aceasta temperatura.Se acopera fiola cu capacul si se introduce in exicator.

Dupa racirea la temperatura ambianta, se cantareste fiola cu precizie de 0,001g. Se repeta operatiunea de incalzire in etuva cate o ora, racire si cantarire pana cand rezultatele obtinute la doua cantariri cunoscute nu difera cu mai mult de 0,1% din masa probei.

Se efectueaza in paralel doua determinari din aceeasi proba pregatita pentru analiza.Calculul si interpretarea rezultatelor Continutul de apa se exprima in % si se calculeaza cu formula:

m1-m2% apa = -------------- x 100

m1-m0

in care: mo = masa fiolei cu bagheta si nisip in gm1 = masa fiolei cu bagheta, nisip si proba inainte de uscare in gm2 = masa fiolei cu bagheta, nisip si proba, dupa uscare in g Rezultatul va fi media aritmetica a celor doua determinari paralele( ).El se

calculeaza cu o zecimala. Repetabilitate Diferenta absoluta dintre rezultatele a doua determinari efecuate pe acelasi esantion

pentru laborator de acelasi operator in conditii de lucru identice,utilizind acelasi echipament intr-un interval scurt de timp nu trebuie sa depaseasca valoarea r data de formula :

r = 0,593% + 0,0017

Reproductibilitate Diferenta absoluta intre rezultatele din doua determinari individuale obtinute cu

aceeasi metoda pe acelasi esantion in laboratoare diferite cu analisti diferiti folosind echipamente diferite nu trebuie sa fie mai mare decit valoarea lui R data de

formula : R = 0,797%+0,00471

in care:w = este continutul mediu de apa al ambelor rezultate exprimat in procente de masa.

Rezultatele fiecarei serii de incercari sunt raportate: precis, clar, obiectiv si in conformitate cu instructiunile specifice din metodele de incercare

Rezultatele incercarilor se raporteaza in buetinul de analize precum si toate informatiile solicitate de client si necesare pentru interpretarea rezultatelor si toate informatiile solicitate de metoda utilizata.

14

Buletinele de analize cuprind urmatoarele informatii: - titlu „Buletin de analize”;- identificarea societatii emitente si a laboratorului de incercari, prin: denumire, sigla,

adresa, fax, e-mail, telefon, internet;- identificarea buletinului de analize care se realizeaza prin: numarul buletinului de

analize, data emiterii buletinului de analize; paginare si marcare sfarsitului buletinului;- cod de bare ce reprezinta codul primit la receptie de catre obiectul de incercat;- identificarea clientului (beneficiarului) prin: nume adresa,comanda;- denumirea obiectului de incercat, date de identificare obiect de incercat (data fabricatie,

data valabilitate, amabalare);- descrierea, prezentarea obiectului de incercat, cantitatea;- identificarea obiectului de incercat intern (numar proba, numar comanda, data

receptiei);- data primirii;- perioada de examinare;- esantionare (cand esantionarea se realizeaza de catre clienti se va mentiona „esantionare

pe raspunderea beneficiarului” iar daca recoltarea se realizeaza de catre personalul laboratorului se va metiona numele si profesia acestuia);

- mentiunea ca „rezultatele se refera numai la proba (probele) analizata(e)”.- rezultatele incercarilor efectuate (denumirea incercarii, unitatea de masura, valoarea

masurata, metoda de analiza, valorea admisa , referentialul);- numele, prenumele si functiile persoanelor care: au efectuat incercarile, care verifica si

aproba buletinul de analize;- semnaturi pentru : elaborare, verificare si aprobare;- suplimentar, incertitudinea estimata, informatii suplimentare legate de metoda de

analiza, informatii despre conditiile specifice de incercare.Buletinul de analize cuprinde suplimentar daca este cazul :- abateri, adaugiri sau excluderi de la metoda de incercare /esantionare;- data esantionarii, locul esantionarii;- conditii de mediu la esantionare.Buletinele de analize ajung la beneficiari prin soferii societatii.In cazul in care se doreste trasmiterea rezultatelor prin mail, buletinul de analize va fi

transformat in pdf pentru a nu putea fi modificat, copiat si va fi insotit de informarea clientului despre acest aspect.

15

Bibliografie

Norma sanitar veterinara nr. 487/dec.2001SR EN ISO 6579/2003 Microbiologia alimentelor si furajelor. Metoda orizontala pentru

detectarea bacteriilor din genul Salmonella.SR EN ISO 7218 /2007  Microbiologia alimentelor si furajelor. Cerinte generale si ghid

pentru examenele microbiologice.SR EN ISO 6887 – 1/2002Microbiologia alimentelor si furajelor. Pregatirea probei pentru analiza, a suspensiei

initiale si a dilutiilor decimale pentru examenul microbiologic. Partea 1. Reguli generale pentru pregatirea suspensiei initiale si a dilutiilor decimale.

SR EN ISO 6887 – 2/2009  Microbiologia alimentelor si nutreturilor.Pregatirea probelor pentru analiza, a suspensiei initiale si a dilutiilor decimale pentru

examenul microbiologic. Partea 2 .Reguli specifice pentru pregatirea carnii si a produselor din carne.

SR EN ISO 11290-2 /A1/2005 Microbiologia alimentelor si nutreturilor. Metoda orizontala pentru detectia si numararea Listeria monocytogenes. Partea 2: Metoda de numarare . Amendament 1: Modificarea mediului de numarare.

SR EN ISO 11290-2/2000 Microbiologia alimentelor si nutreturilor. Metoda orizontala pentru detectarea si numararea Listeria monocytogenes. Partea 1 : Metoda de numarare .

SR ISO 16649-2 / 2007 Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda orizontala pentru enumerarea Escherichia coli pozitive la β-glucuronidaza . Partea 2: Tehnica de numarare a coloniilor la 440C folosind 5-bromo-4 –cloro -3-indolil β-D-glucuronat.

SR ISO 1442-97 - Carne si preparate din carne. Determinarea continutului de apa. Metoda de referinta(engleza)

***www.wikipedia.org***www.romalimenta.ro***www.google.com

16