Obiectul microbiologieiMicrobiologia este tiina care se ocup cu studiul organismelor microscopice. Ea are numeroase ramuri (microbiologia medical, industrial, a solului, a plantelor etc) dintre care noi ne vom opri asupra microbiologiei medicale care studiaz urmtoarele aspecte legate de agenii infecioi microscopici: Biologia agenilor infecioi Relaiile dintre aceti ageni i organismul uman Diagnosticul etiologic al infeciilor Bazele terapiei antiinfecioase Bazele profilaxiei infeciilor

1

LOCUL AGENILOR INFECIOI N SISTEMATICA MICROORGANISMELORMicroorganismele difer n mod fundamental unele de altele, fiind ncadrate n 3 regnuri: protista, procariotae i vira. Regnul Protista cuprinde microorganisme a cror celule sunt evoluate, de tip eucariot, cu nucleu i organite celulare nespecifice cum sunt reticolul endoplasmatic, ergastoplasma etc.

are toate caracterele celulelor evoluate nucleu organite celulare comune nu are perete celular se divide prin direct sau prin mitoza

Figura 1 Celula de tip eucariot Algele sunt microorganisme acvatice, fotosintetizante, de la dimensiuni microscopice pna la forme gigante, pluricelulare, filamentoase. Ele nu prezint interes medical propriu-zis, cu excepia agar-agarului din care se obine agarul, polizaharid care servete la prepararea mediilor de cultur solide. Mycetele sau ciupercile microscopice sunt grupate n 4 clase. Din cele 12.000 de specii, doar 100 sunt de interes medical.

Figura 2 - Mycetele Protozoarele sunt microorganisme unicelulare eucariote, evoluate structural i n general mobile, asemnnndu-se cu celulele animale. Cele de interes medical se ncadreaz n 4 clase: flagelata, rhizopoda, sporozoa 2

i ciliata.

Figura 3 - Protozoarele Regnul Procariote cuprinde microorganisme a cror celule sunt primitive, de tip procariot, lipsite de nucleu adevrat i de organite celulare nespecifice, dar cu un nveli suplimentar numit perete celular. nu au nucleu adevrat ci un cromozom haploid format dintr-o molecul circular de ADN lipsite de organite celulare comune cu excepia ribozomilor au perete celular rigid Se divid direct nu au nucleu adevrat ci un cromozom haploid format dintr-o molecul circular de ADN lipsite de organite celulare comune cu excepia ribozomilor au perete celular rigid Se divid direct

Figura 3 Celula de tip procariot Archaebacteriile sunt lipsite de interes pentru medicin. Ele sunt bacterii termofile, productoare de metan. Eubacteriile cuprind un numr foarte mare de bacterii, dintre care cele de interes medical sunt: bacteriile clasice - cu forme variate i cu perete celular, chlamydiile - bacterii cu parazitism intracelular obligatoriu i care prezint un mecanism de multiplicare unic n lumea bacteriilor, rickettsiile - bacterii cu habitat intracelular (cu o excepie), dar cu diviziune direct, ntlnit la majoritatea bacteriilor, micoplasmele - bacterii crora le lipsete n mod natural peretele celular. n prezent sunt incluse n eubacterii i cyanobacteriile sau algele albastre, care sunt microorganisme acvatice. Regnul Vira cuprinde entiti infecioase de natur subcelular care sunt virusurile i viroizii. Virusurile se deosebesc fundamental de formele celulare de via. Ele sunt formate dintr-un singur acid nucleic (ADN sau ARN), nvelit de o capsid proteic i sunt parazite obligatoriu intracelulare. Virusurile sunt 3

particule inerte n stare extracelular dar, dup ce ptrund ntr-o celul vie, deviaz metabolismul acesteia n scopul propriei replicri. Viroizii au o structur i mai simpl, fiind alctuii doar dintr-un acid nucleic cu GM mic. Unii dintre ei produc boli transmisibile la plante. Virusurile i viroizii alctuiesc mpreun regnul VIRA. Entiti infecioase acelulare cu parazitism obligatoriu intracelular Acid nucleic (ADN sau ARN) i un nveli proteic capsida. Uneori au un nveli suplimentar anvelop. Inerte n afara celulei gazd Paraziteaz celula la nivel genetic, deviaz metabolismul acesteia n scopul propriei replicri entiti infecioase acelulare cu parazitism obligatoriu intracelular un singur acid nucleic (ADN sau ARN) Inerte n afara celulei gazd paraziteaz celula la nivel genetic, deviaz metabolismul acesteia n scopul propriei replicri

Figura 4 Structura virusurilor Prionii sunt entiti infecioase de dimensiuni foarte mici (5nm), de natur proteic. Pn n prezent exist relativ puine date referitoare la aceti ageni, dar se presupune c ei ar constitui cauza unor boli degenerative ale SNC, cum sunt bolile Jacob-Creutzfeld, Kuru, scrapia oilor etc. La agenii infecioi microscopici se adaug paraziii multicelulari cum sunt helminii i artropodele, cu structur complex i cu studiul crora se ocup parazitologia.

4

Bacteriologie generalMORFOLOGIA I STRUCTURA BACTERIILORDimensiunea bacteriilor se exprim n micrometri (1=10-3 mm), fiind cuprins ntre 1-10. Dimensiunea, forma i aezarea bacteriilor se apreciaz prin microscopie optic, iar detaliile morfologice i structurale prin microscopie electronic. Forma bacteriilor constituie baza clasificrii lor. Form i aezare. n raport cu forma lor deosebim 4 categorii de bacterii: rotunde (cocii), alungite (bacili), ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) i filamentoase (actinomycetele).

Figura 5 Forma i dimensiunile bacteriilor cocii sunt bacterii rotunde, aezate n grmezi (genul Staphylococcus), ovalare, aezate n lanuri (genul Streptococcus), lanceolate, dispuse n diplo ca dou flcri de lumnare, (specia Streptococcus pneumoniae) i reniforme dispuse ca dou boabe de cafea ce se privesc fa n fa (genul Neisseria) cu de 0,8 - 1;

5

bacilii sunt bacterii cu form alungit de bastona cu dimensiuni ntre 1,5 10. cocobacilii sunt forme intermediare ntre coci i bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae); vibrionii sunt bacterii ncurbate n form de virgul (Vibrio cholerae); spirilii sunt bacterii spiralate cu 1-2 spire rigide (Spirillum volutans); spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil i 12-20 de spire (Treponema pallidum), foarte multe spire strnse (Leptospira) sau 2-3 spire (Borrelia): actinomicetele sunt bacterii foarte asemntoare fungilor i formeaz filamente sau hife lungi i ramificate care se rup, rezultnd forme bacilare (Actinomyces).

Figura 6 Aezarea cocilor

Figura 7 Bacili gram pozitiv sporulai

Figura 8 Stafilococi i streptococi in sput

6

STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

Figura 9 Structura celulei bacteriene

Structuri celulare obligatorii Peretele celular

Figura 10 Structura peretelui celular Component celular obligatorie care nconjoar membrana citoplasmatic, peretele celular este o structur rigid, specific bacteriilor. El este format 7

dintr-un strat bazal sau peptidoglican, asemntor la toate bacteriile i un strat al structurilor superficiale, foarte difereniat, n funcie de care bacteriile manifest caractere tinctoriale diferite: bacterii gram - pozitive, gram negative i acido-alcoolorezistente. Peptidoglicanul sau mureina este structura chimic responsabil de rigiditatea peretelui celular i care asigur forma i rezistena mecanic a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el const dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamin i acid N-acetilmuramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanurile vecine sunt legate ntre ele prin puni polipeptidice, transversale.

Figura 11 Structura peptidoglicanului La bacteriile gram - pozitive, peptidoglicanul are o grosime de 15-30 nm i conine pn la 200 de lanuri paralele de murein. Stratul structurilor speciale este redus i alctuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici. Ei reprezint antigenele de supafa ale bacteriilor grampozitive. Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la aciunea lizozimului care rupe legturile dintre acidul N-acetil muramic i N-acetilglucozamin. La bacteriile gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm. Stratul superficial este ns mult mai complex dect la bacteriile gram pozitive fiind alctuit dintr-o membran extern, lipoproteine i lipopolizaharidul de perete. Membrana extern este format dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Membrana extern se leag de protoplast prin intermediul unei lipoproteine din membrana extern. Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afl lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. Aceasta este alctuit din:

8

lipidul A care are o structur particular, fiind format din uniti dizaharidice de glucozamin, legate de beta-hidroxiacizi grai cu 10-16 atomi de carbon fixai direct de membrana extern, miezul sau core, numit i antigen R, comun tuturor bacteriilor gram negative,

uniti monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie i tip i constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative. LPZ este o toxin termolabil, care se elibereaz n mediul nconjurtor de ctre bacteriile gram-negative numai dup liza lor i foarte reactiv n organismul gazd. Astfel, lipidul A produce febr, activeaz mecanismele aprrii antiinfecioase i n exces produce ocul endotoxic cu evoluie grav, chiar fatal. Spaiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creeaz un compartiment ce se ntinde de la membrana celular pn la membrana extern, numit spaiu periplasmic. El conine peptidoglicanul i un gel care favorizeaz nutriia bacteriei prin coninutul n enzime degradative ca, de pild, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt betalactamazele i cefalosporinazele. Bacteriile acido-alcoolorezistente de interes medical sunt bacilul tuberculos i bacilul leprei. Peretele celular se aseamn cu cel al bacteriilor gram-pozitive, dar structurile speciale conin acid micolic i o cear, ce confer acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite i rezisten crescut la factorii de mediu. Ele se coloreaz la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen. Funciile peretelui celular: asigur forma, rezistena mecanic i osmotic a bacteriei; regleaz traficul molecular de perete n ambele sensuri este sediul antigenelor de suprafa este sediul unor factori de patogenitate; are rol n diviziunea bacterian i n procesul de sporulare.

Membrana citoplasmatic

Figura 12 Structura membranei citoplasmatice Este o membran fin (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic. Pe seciune apare trilaminat, fiind alctuit din dou straturi fosfolipidice dispuse cu prile hidrofobe fa n fa. Printre moleculele fosfolipidice se gsesc

9

molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele dou straturi fosfolipidice, fie le traverseaz fiind expuse la ambele fee ale membranei. Mezozomii. Sunt structuri membranare care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice sub form de buzunar, prezente la bacteriile gram pozitive i ocazional la cele gram - negative. Ei sunt n contact direct cu materialul nuclear fiind implicai n diviziunea cromozomului. Funciile membranei citoplasmatice: este o membran cu permeabilitate selectiv, ndeplinind funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, n ambele sensuri cu mediul nconjurtor. secret enzime hidrolitice n mediul nconjurtor unde scindeaz substratul nutritiv n uniti absorbabile, ndeplinete rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind centrul energogenezei celulare, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor, este implicat n sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participnd activ la creterea i diviziunea celulei bacteriene i la formarea sporului bacterian.

Materialul nuclearEste un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o structur primitiv n comparaie cu nucleul celulelor eucariote. Nucleoidul este format dintr-o molecul circular de ADN, organizat sub forma unui cromozom haploid care este n contact direct cu citoplasma datorit lipsei membrane nucleare. Molecula de ADN dublu spiralat este la rndul ei suprahelicat n jurul unui miez de ARN, dispoziie necesar funcionalitii materialului nuclear. Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia.

CitoplasmaSituat ntre materialul nuclear i faa intern a membranei citoplasmatice, citoplasma este un sistem coloidal alctuit din 80% ap, n care se gsete o cantitate mare de molecule organice, ioni anorganici, enzime, ARN, vacuole i incluzii. Este lipsit de organitele celulare prezente la celulele eucariote cum sunt reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile, centrul celular, ergastoplasma. Ribozomii. Se apreciaz c o celul bacterian are 20.000 de ribozomi ce conin 80-90% din ARN-ul citoplasmatic. Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul. Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind n funcie de specia bacterian i condiiile de mediu. Ele sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie.

10

Structuri celulare neobligatorii CapsulaCapsula este un nveli compact, intim legat de celula bacterian, vizibil pe preparatele uzuale sub forma unui halou clar ce nconjoar bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natur polizaharidic (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepia capsulei bacilului crbunos care este polipeptidic. Capsula are rol n rezistena bacteriilor fa de fagocitoz, fiind astfel un factor de virulen. Variantele necapsulate ale acelorai specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la oarecele alb de laborator o septicemie mortal, pe cnd varinata necapsulat nu este patogen. Capsula este o structur cu proprieti antigenice specifice (antigenele K) care permit diferenierea unor serotipuri n cadrul speciei. Microcapsula este o structur discret cu o grosime sub 0,2m care nu se evideniaz la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulen. Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf i vscos ce nvelete bacteria. El este format din lanuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii i dextranii, cu rol major n adezivitatea bacteriilor de suprafee. Astfel, de pild, Streptococcus mutans produce cantiti mari de dextran i levan prin intermediul crora se ataeaz de suprafaa diniilor contribuind la formarea cariilor i a plcii dentare. Funciile capsulei: este un factor de aderen i colonizare a bacteriile pe suprafee; protejeaz bacteriile de diferii ageni antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; protejeaz bacteriile de aciunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulen; reprezint sediul antigenelor capsulare, importante n identificarea acestor bacterii.

Cilii sau flagelii bacterieniSunt apendici filamentoi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea n citoplasma bacterian, i servesc ca organe de locomoie. Ei sunt prezeni mai ales la bacili. Dispoziia i numrul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fr cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situai la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) i peritriche - cu cilii dispui pe ntreaga suprafa a bacteriei (Salmonella, E. coli, Proteus etc.).

11

Figura 13 Cilii bacterieni

Pilii bacterieniNumeroase specii bacteriene gram-negative au pe suprafaa lor lor nite apendici filamentoi, rigizi, mai scuri dect flagelii, n numr mare (100500/celul) i cu dispoziie n general peritrich. Ei se evideniaz numai prin microscopie electronic. Din punct de vedere funcional, pilii se mpart n: sex pili codificai plasmidic i care au rol n transferul de material genetic ntre bacterii. Sunt prezeni mai ales la bacteriile gram-negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas), pili comuni sau pili de aderen (fimbrii), n numr mare, codificai cromozomial, i care servesc bacteriilor la fixarea ferm de mediul de cultur sau de celulele pe care se afl. Ei constituie, deci, un factor important de virulen. n afar de aderen, pilii comuni mai au i proprieti antifagocitare.

SporiiUnele bacterii se transform n spori, care sunt forme primitive de difereniere celular, cu rezisten crescut la factorii de mediu i care apar endocelular n condiii nefavorabile de via. Ei au un inveli rezistent, format din mai multe straturi datorit cruia rezist n mediul extern zeci de ani. Sporogeneza se ntlnete numai la 2 genuri de bacterii gram-pozitive de interes medical, Clostridium i Bacillus. Poziia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi central, subterminal i terminal.

Figura 14 Poziia sporului Sporularea se declaneaz n condiii nefavorabile de via, cnd bacteriile sunt lipsite de surse nutritive.

12

Figura 15 - Structura sporului Sporii nu sunt forme de nmulire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativ se formeaz un singur spor, care n condiii favorabile de via germineaz i va da natere unei singure celule bacteriene vegetative identice cu aceea n care s-a format.

Figura 16 - Germinarea sporului Sporii au un rol important n epidemiologia unor infecii, cum sunt antraxul, tetanosul, botulismul i gangrena gazoas.

STUDIUL MORFOLOGIC AL BACTERIILORExaminarea microscopic este frecvent primul pas n identificarea unor bacterii. Caracterele morfologice i tinctoriale ncadreaz bacteriile ntr-unul din grupurile majore stabilind conduita diagnosticului bacteriologic. Elementele morfologice importante n identificarea unei bacterii sunt: dimensiunea, forma, aezarea, prezena unor structuri speciale ca, de pild, endospori, flageli, capsul sau incluzii intracelulare. Microscopul cu cmp luminos. Acesta are 2 sisteme de lentile care mresc imaginea obiectului studiat: lentilele obiectivului i lentilele ocularelor. n mod obinuit se folosesc 3 obiective: un obiectiv care mrete de 10x i care se folosete pentru obinerea unei imagini de ansamblu a 13

preparatului examinat, un obiectiv ce mrete de 40x, cu care se examineaz microorganisme mai mari ca, de pild fungi, parazii i n fine obiectivul cu imersie care amplific imaginea de 100x i cu care se examineaz bacteriile. Imaginea mai este amplificat nc de 10 ori de lentilele ocularelor. Puterea de rezoluie (distana cea mai mic ntre 2 puncte ce poate fi perceput) a unui microscop fotonic este de 0,2. La microscopul cu cmp luminos se examineaz preparatele colorate, dar uneori i preparate native. Microscopul cu fond ntunecat. Are un condensator special, cardioid, care permite ptrunderea luminii numai de la periferia obiectivului. La acest tip de microscop se examineaz preparatele native, ntre lam i lamel, efectuate direct dintr-un produs, n care se caut bacterii a cror lime nu depete 0,1-0,2 (ca, de exemplu, evidenierea treponemelor din ancrul sifilitic), sau dintr-un mediu de cultur lichid, n care se urmrete dezvoltarea unei culturi (Leptospira etc.). Microscopul cu contrast de faz se utilizeaz la examinarea preparatelor native. El are un sistem de filtre care permit sesizarea diferenelor de faz a luminii cnd aceasta trece prin obiecte de densitate diferit. Microorganismele examinate la acest microscop au aspect tridimensional. Microscopul cu raze UV. Preparatele de examinat sunt colorate cu un compus fluorescent cum este izotiocianatul de fluorescein. Particulele colorate vor apare luminoase, fluorescente pe cmpul ntunecat al microscopului.

Microscopul electronic. Lumina este nlocuit cu un fascicul de electroni. n microscopia electronic cu transmisie, electronii trec direct prin preparat, iar n microscopia prin baleiaj ei trec dintr-un anumit unghi prin preparat, astfel nct imaginea ce apare pe ecran este tridimensional. Examinarea morfologiei bacteriene se efectueaz pe diverse preparate microscopice. Efectuarea frotiurilor fixate i colorate este o metod de rutin n laboratorul de bacteriologie. Frotiurile se pot colora simplu cu un singur colorant, elementele preparatului avnd toate aceeai culoare, sau difereniat cu mai muli colorani, bacteriile colorndu-se diferit n funcie de afinitatea lor tinctorial. Dup efectuarea frotiurilor, acestea se usuc la temperatura camerei i se fixeaz cel mai des prin cldur, trecnd frotiul de 2-3 ori prin flacr. n timpul fixrii, formele vegetative ale bacteriilor sunt omorte i devin permeabile pentru colorani. Fixarea chimic (cu alcool metilic, aceton, MayGrnwald, acid osmic etc.) se utilizeaz mai ales cnd preparatele sunt seciuni de esuturi sau frotiuri de snge, deoarece protejeaz celulele din produs de degradare. Coloraiile simple folosesc soluii apoase a unui colorant bazic ca, de exemplu, albastru de metilen, violet de metil, fuxin bazic etc. Dup colorare, frotiurile se spal pentru ndeprtarea excesului de colorant. Unii microbi se coloreaz bipolar datorit dispoziiei citoplasmei la ambele capete ale bacteriei. Coloraia negativ este o metod rapid i simpl de studiu a morfologiei bacteriene. Bacteriile se amestec cu colorantul i se ntind ca un film pe lam. Ele apar incolore pe fondul colorat al preparatului.

14

Impregnarea argentic se utilizeaz pentru colorarea spirochetelor, mai ales cnd se urmrete evidenierea lor n esuturi. n aceast coloraie, spirochetele se coloreaz n brun-negru pe fondul galben al preparatului. Coloraiile difereniale sunt cele mai importante n laboratorul de bacteriologie. Cel mai des folosit este coloraia gram, introdus de studentul danez Christian Gram la sfritul secolului trecut. Dup cum apar bacteriile n aceast coloraie, ele se mpart n gram-pozitive i gram-negative. Principiul coloraiei gram const n colorarea iniial a bacteriilor cu cristalviolet sau violet de geniana. Mordansarea se face cu lugol. Urmeaz decolorarea n urma creia unii microbi, cei gram-pozitivi, pstreaz colorantul violet, iar alii, cei gram-negativi, vor fi decolorai cu un amestec de alcoolaceton. Acetia din urm se vor recolora cu fuxin bazic. Bacteriile grampozitive vor aprea, deci, de culoare violet iar cele gram-negative roii.

FIZIOLOGIE BACTERIANFiziologia bacterian se multiplicarea bacteriilor. ocup cu studiul nutriiei, metabolismului i

Nutriia bacterianNutriia bacterian reprezint totalitatea proceselor prin care bacteriile i procur din mediul nconjurtor substanele necesare supravieuirii, creterii i nmulirii, iar respiraia bacterian modalitatea de a-i produce energia necesar activitii metabolice. Dup sursa de carbon i azot bacteriile se clasific n: autotrofe, care sintetizeaz compui organici utiliznd ca surs de carbon CO2 i ca surs de azot amoniacul, nitriii sau nitraii

heterotrofe, care utilizeaz ca surs de carbon numai substane organice. Bacteriile de interes medical sunt, cu foarte puine excepii, heterotrofe. Ele au nevoie pentru multiplicare de substane organice, diveri ioni, oligoelemente i factori de cretere (vitaminele B1, B2, acid pantotenic, biotin, lactoflavin acid folic etc.). Necesitile nutritive difer chiar i n cadrul

aceleiai specii. n cadrul bacteriilor paratrofe se gsesc cele paratrofe, cu habitat obligatoriu intracelular care sunt dependente de celula gazd. Aceste microorganisme sunt rickettsiile i chlamydiile. Metabolismul bacterian Respiraia bacterianDin punct de vedere practic, bacteriile se mpart dup necesarul de oxigen, n: bacterii strict aerobe, care se dezvolt numai n prezena oxigenului atmosferic, folosind exclusiv respiraia aerob i deci oxigenul ca acceptor final de hidrogen ca, de exemplu, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis etc. bacterii strict anaerobe, care nu se dezvolt dect n absena oxigenului, prezena lui fiind foarte toxic culturii chiar la o presiune de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reacie energogenetic exclusiv fermentaia, n condiii anaerobe. Dac fermentaia se produce n prezena oxigenului, se formeaz radicali de superoxid (O2-) foarte toxici.

15

Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt lipsite de superoxiddismutaz care transform radicalul superoxid n ap oxigenat i catalaz care descompune apa oxigenat. Exemple de bacterii strict anaerobe sunt cele din genurile Clostridium, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta att n prezena ct i n absena oxigenului atmosferic. Ele utilizeaz ca reacii energogenetice respiraia aerob i fermentaia. Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pild, enterobacteriile). bacterii anaerobe aerotolerante folosesc numai fermentaia n prezena aerului atmosferic, fr participarea oxigenului la reaciile energogenetice. Ele tolereaz oxigenul n mediu fie pentru c au n echipamentul enzimatic superoxiddismutaz i catalaz, fie c enzimele exist n mediul de cultur. Astfel, bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaz, dar pot fi cultivate n condiii de aerobioz pe medii cu snge, care suplinete catalaza. bacterii microaerofile folosesc respiraia i fermentaia, dar necesit o concentraie mai mare de bioxid de carbon dect cea din atmosfer pentru reacii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, Campylobacter, necesit concentraii de bioxid de carbon de 610%.

Curba de cretere i nmulire a bacteriilor ntr-un mediu limitatBacteriile se nmulesc prin diviziune direct. Dac se introduce un inocul (un numr redus) de celule bacteriene ntr-un mediu de cultur proaspt i se incubeaz ntr-o atmosfer prielnic speciei respective, bacteriile vor crete i se vor nmuli, iar timpul care trece de la o diviziune celular la urmtoarea se numete timp de generaie.

Figura17 Diviziunea bacteriana a bacteriilor gram pozitiv

16

Figura 18 Curba de multiplicarea a bacteriilor in mediu limitat Dac se apreciaz numrul de celule bacteriene vii la intervale diferite de timp de la momentul inoculrii i reprezentm grafic raportul care se stabilete ntre acest numr i timpul care s-a scurs, vom obine o curb caracteristic ce cuprinde urmtoarele faze: Faza de lag. n aceast perioad nu se remarc o cretere a numrului de celule, cu toate c ele cresc n volum i dovedesc o activitate metabolic intens. Durata acestei faze variaz n funcie de specie, condiiile de mediu, de numrul de celule din inocul i este intervalul de timp n care celulele se adapteaz noilor condiii de mediu. La majoritatea bacteriilor de interes medical, durata ei este n jur de 1/2 de or, iar la formele sporulate 3-4 ore. Sensibilitatea bacteriilor fa de chimioterapice este crescut. Faza exponenial sau logaritmic este precedat de o faz de accelerare n care celulele bacteriene ncep s se nmuleasc. Celulele se divid constant prin fisiune binar, deci n progresie logaritmic, raportul dintre numrul bacteriilor i timp fiind liniar. Aceast rat intens de multiplicare este posibil doar in vitro, in vivo ea fiind mult frnat de mecanismele aprrii antiinfecioase. Durata acestei perioade este dependent de aceleai condiii de mediu ca i faza precedent dar i de specie. Astfel E.coli are un timp de generaie de aproximativ 10 minute iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore. Sensibilitatea la antibiotice a microbilor rmne crescut. Compoziia mediului de cultur se modific pn la sfritul acestei faze pe de o parte datorit consumului principiilor nutritivi iar pe de alt parte, acumulrii de metabolii.

Faza staionar. Multiplicarea bacteriilor n progresie logaritmic nu mai este posibil, rata de nmulire scade treptat pn cnd bacteriile trec n faza staionar. n aceast faz, celulele nu mai cresc, ci are loc o activitate metabolic endogen, prin care celula i sintetizeaz rezerve de energie i produi intermediari necesari meninerii n viaa n noile condiii. ncetarea multiplicrii n faza staionar se datoreaz n principal epuizrii unui factor nutritiv esenial din mediu, numit factor limitant i acumulrii unor produi toxici. n acest faz scade sensibilitatea tulpinilor la chimioterapice. La nceputul fazei staionare, unele specii bacteriene produc anumii metabolii secundari cu distribuie taxonomic foarte riguroas. Acet metabolii includ antibiotice, colicine i exotoxine. Iniierea sporogenezei la bacteriile sporulate se petrece la sfritul fazei exponeniale sau la nceputul fazei staionare. Durata fazei staionare este n general de cteva ore. 17

Faza de declin care dureaz mai multe zile se caracterizeaz prin scderea numrului de bacterii. Ea se datoreaz scderii substanelor nutritive i acumulrii de substane toxice pentru bacterii. La aceti factori se adaug la unele specii bacteriene proprietatea de autoliz cu eliberarea coninutului citoplasmatic n mediu. Modificrile morfologice sunt pregnante att n ceea ce privete forma, dimensiunile ct i caracterele tinctoriale. n timp mor toate bacteriile, cu excepia celor sporulate, i cultura se autosterilizeaz. Cultivarea bacteriilor n mediu limitat este utilizat n laboratoarele de bacteriologie medical, pentru stabilirea diagnosticului unei infecii bacteriene, caracterele culturale sunt deosebit de importante n identificarea bacteriilor.

Influena factorilor de mediu asupra nmulirii bacteriilorUnii parametri fizici ai mediului nconjurtor influeneaz n mod hotrtor creterea i multiplicarea microorganismelor.

TemperaturaTemperarura optim de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. n funcie de aceast temperatur, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmulesc optim la 20C dar i sub aceast temperatur, mezofile, cu temperatura optim cuprins ntre 20-40C i termofile, care se nmulesc optim la peste 45C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se nmulesc la temperatura organismului, fiind denumite i bacterii homeoterme. Limitele de temperatur n care aceste bacterii pot s creasc sunt ns mai mari i variaz de la specie la specie. Astfel, gonococul i meningococul nu suport variaii mai mari de 1-2C fa de temperatura optim, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi. Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicaia practic a acestui aspect fiind sterilizarea. Temperaturile moderat sczute, ca, de pild, cea de +4 oC din frigidere, nu distrug bacteriile dar opresc, n general, nmulirea lor prelungindu-le viabilitatea. Congelarea. Dac o suspensie bacterian este supus ngheului la temperaturi nu prea mici fa de 0oC, cristalizarea apei determin leziunea structurilor bacteriene. Prin ngheare nu vor fi omorte toate celulele unei suspensii, dar ngheul i dezgheul repetat scad foarte mult numrul de bacterii viabile. Conservarea prin congelare. Temperatura optim este cea realizat de CO2 (78C) sau de azotul lichid (-180C).

pH-ulBacteriile se pot dezvolta n limite largi de pH, cele patogene pentru om dezvoltndu-se optim la un pH de 7,2-7,4. Exist i excepii ca, de pild, bacteriile din genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 i vibrionul holeric la pH de 9,0. Lactobacilii, prezeni n flora vaginal normal se dezvolt chiar i la un pH de 3,9.

18

Concentraia de CO2Necesarul de bioxid de carbon al bacteriilor este diferit. Astfel, unele specii (Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae) sunt dependente de prezena lui n concentraii ridicate pn la 10% n atmosfera n care se dezvolt, pe cnd altele ca, de exemplu, S.aureus se dezvolt la concentraia obinuit de CO2 din atmosfer (0,03%), nu i ntr-o atmosfer complet lipsit de CO2. Astzi, incubarea produselor patologice din care se urmrete izolarea bacteriilor se efectueaz n termostate cu CO2 (6%), deoarece dezvoltarea lor este superioar celei din termostatele obinuite.

UmiditateaApa liber este absolut necesar creterii i multiplicrii microbilor. Necesarul de ap variaz n funcie de specie. Prin liofilizare (desicare brusc la -78oC), care este o metod de conservare a microbilor, se extrage practic ntreaga ap liber din celulele bacteriene, ceea ce are ca urmare creterea stabilitii biopolimerilor i ncetarea metabolismului. Bacteriile liofiliizate se pstreaz ani de zile.

Presiunea osmoticBacteriile se nmulesc optim pe medii izotonice, rezisten lor la variaiile presiunii osmotice fiind incomparabil mai mare dect cea a celulelor organismelor superioare. Aceast rezisten se datoreaz peretelui celular. Bacteriile osmofile, dintre care cele halofile, sunt capabile s se nmuleasc n soluii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus i Enterococcus). Pe baza acestei proprieti se prepar unele medii de mbogire i selective.

RadiaiileRazele neionizante Razele ultraviolete. Puterea bactericid a razelor luminoase devine perceptibil la o lungime de und de 330nm, crescnd pe msur scderii lungimii de und a luminii UV. Mecanismul bactericid al razelor UV const n inducerea formrii n celula bacterian a unor dimeri de timin care interfereaz replicarea DNA. Alterrile altor elemente structurale bacteriene sunt neglijabile. n scop practic lmpile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce numrul de bacterii existente n aer n slile de operaie, n laboratoare, n ncperi n care sunt adpostite animale de exprien etc. Efectul bactericid al razelor solare se datoreaz coninutului n raze UV (300400nm). n condiii naturale efectul bactericid al luminii solare este mai mare n rile sudice unde coninutul n raze UV este mare. Radiaiile ionizante Mecanismul bactericid al acestor raze const n formarea n celul a unor radicali cu via scurt i protoni. Aceti produi vor altera bazele azotate i legturile dintre ele. Sporii sunt n general mai rezisteni dect formele vegetative ale bacteriilor. ???

Metode de cultivare a le bacteriilorCunoaterea necesitilor nutritive ale bacteriilor este foarte important n bacteriologia medical, deoarece st la baza preparrii mediilor de cultur

19

destinate izolrii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice. Prin cercetarea necesitilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvate pentru aproape toate bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte puine, ca, de pild, Mycobacterium leprae i unele spirochete printre care Treponema pallidum. Cultivarea bacteriilor n scop diagnostic pune n esen dou probleme: alegerea unui mediu de cultur optim, care s permit izolarea tuturor bacteriilor care ar putea fi prezente n produsul de examinat i obinerea bacteriilor n culturi pure, pentru a putea fi identificate.

Condiii generale pentru cultivarea bacteriilorUn mediu de cultur trebuie s conin ap, substane organice, minerale, oligoelemente i factori de cretere. Pentru satisfacea acestor necesiti se ultilizeaz substraturi biologice complexe care au n compoziia lor aceste ingredinente. Acestea sunt: - peptonele, care se obin prin hidroliza enzimatic sau acid a proteinelor de origine animal (de exemplu fin de oase). Prin coninutul n peptide i aminoacizi constituie o surs universal de azot, fiind folosite practic n prepararea tuturor mediilor de cultur, - extractul de carne, se obine prin deshidratarea decoctului de carne de vit. - extractul de drojdie, care conine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B, n afar de ingredientele mai sus menionate mai amintim: - clorura de sodiu, care se adaug la mediile uzuale ntr-o concentraie de 0,9% Cultivarea microbilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc pentru nmulirea unor microbi care se gsesc n numr mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplu mediu folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepar din decoct de carne de vac, pepton i clorur de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul c nu permite obinerea unei culturi pure. Cultivarea bacteriilor pe medii solide. Introducerea mediilor de cultur solide a nsemnat un progres uria n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distinct a microbilor, sub form de colonii izolate. O colonie bacterian este o micropopulaie ce rezult din nmulirea unui singur microb pe un mediu, vizibil n general cu ochiul liber.

20

Figura 19 Colonii izolate Cel mai simplu mediu solid este geloza simpl, ce se obine prin adugarea la bulion a unei substan gelificabile, care de regul este geloza, un polizaharid obinut din alga marin agar-agar. La aceast mediu simplu se pot aduga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascit, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretenioase. Caracterele culturale pe medii solide sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaz fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistena, aderena la mediu, activitatea hemolitic a coloniilor i unele modificari pe care microorganismele le produc n mediul respectiv. Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate i care se suspend omogen n ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiai specii, cu suprafaa rugoas, relief i margini neregulate i care aglutineaz sponatan n ser fiziologic - colonii de tip R (rough). n general, cu unele excepii, coloniile S aparin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt nevirulente. Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numrtoarea de germeni ntr-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infecii criteriul de implicare etiologic este numrul bacteriilor n produsul de examinat (infecii urinare). Medii speciale. Exist situaii n care izolarea unui microb necesit medii deosebite care s favorizeze selectarea lui din produse intens contaminate. Mediile de mbogire sunt medii lichide care permit nmulirea preferenial a unui microb dintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu coninut mare de clorur de sodiu (1-10%) n care se pot dezvolta numai bacterii halofile ca, de exemplu, stafilococul (mediul Chapmann lichid) i enterococul. Medii selective. Dac un mediu de mbogire se solidific, rezult un mediu selectiv care are avantajul obinerii microbilor sub form de colonii izolate. Datorit acestor medii, izolarea i identificarea bacteriilor este astzi mult simplificat. Mediile selective, care se bazeaz pe particularitile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezistena natural a acestora la antibiotice, sunt utilizate n mod curent n laboratoarele de bacteriologie, deoarece permit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricrui microb n cultur pur. Mediile de diagnostic sunt medii de cultur care evideniaz anumite proprieti fiziologice i caractere biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza

21

crora acestea pot fi identificate. Astfel, de exemplu, numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le fermenteaz. Mediile de diagnostic cu zaharuri conin zaharul de cercetat i un indicator de pH. n cazul n care bacteria nsmnat n acest mediu va fermenta zaharul, culoarea mediului se va schimba dup cteva ore datorit scderii pH-ului. Producia mediilor de cultur a devenit o industrie puternic. Exist mii de firme, care sunt ntr-o permanent concuren, rezultatul fiind elaborarea unor medii de cultur din ce n ce mai performante, care uureaz i mbuntesc asistena medical microbiologic.

Figura 20 Tehnica nsmnrii n vederea obinerii coloniilor izolate

GENETICA BACTERIANEreditatea este nsuirea tuturor vieuitoarelor de a transmite caracterele specifice speciei la urmai iar variabilitatea apariia unor caractere diferite de cele ale genitorilor. Variabilitatea la bacterii este cea care intereseaz medicina n mod deosebit. Modificarea zestrei ereditare la bacteriilor d natere unor tulpini bacteriene noi care, prin virulen i rezistena la chimioterapice, se adapteaz mai bine condiiilor de mediu i nlocuiesc bacteriile mai puin adaptabile. Suportul material al ereditii este ADN. Structura i replicarea acestuia este similiar cu cea de la celulele eucariote.

22

Organizarea materialului genetic la bacteriiGenomul bacterian este alctuit din repliconi, care sunt formaiuni genetice ce se pot replica independent. Acestea sunt cromozomul bacterian, elementele genetice extracromozomiale (plasmidele i genomul bacteriofagilor) i elementele genetice transpozabile (fragmentele de inserie i transpozonii).

Cromozomul bacterianMajoritatea genelor bacteriene se gsesc ntr-un cromozom haploid, echivalent nuclear care codific informaiile absolut necesare supravieuirii speciei n condiii normale. Pe lng dispoziia dublu spiralat spre dreapta a catenelor de ADN, acestea sufer o suprahelicare spre stnga. Acest mod de organizare denumit supercoil sau supertwist asigur pe de o parte mpachetarea economic a ADN i pe de alt parte o configuraie optim activitii funcinale a ADN (replicare, transcripie, recombinare).

Formaiunile genetice extracromozomialePlasmidele Plasmidele sunt molecule circulare de ADN autonome, extracromozomiale, libere n citoplasm care se replic independent de cromozom. Importana lor practic a fost sesizat n 1963 de Watanabe, o dat cu descoperirea posibilitii transmiterii prin plasmide a rezistenei la antibiotice ntre bacterii. Plasmidele pot fi: conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezisten la antibiotice R, neconjugative, care nu pot prsi ele nsi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codific secreia de beta-lactamaz la S.aureus) episomi, care se pot integra prin recombinare n cromozomul bacterian, pierzndu-i astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate).

Figura 21 - Structura plasmidului

23

Plasmidele de virulen poart determinanii genetici ai unor factori de virulen la bacterii, ca de exemplu secreia de enterotoxina (termolabil i termostabil) i factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis i E.coli, exfoliantina la S. aureus, gena de invazivitate la Shigella etc. Plasmidele R -de rezisten la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau n esen din dou regiuni genetice distincte: genele care codific rezistena la antibiotice R, care pot fi unice sau multiple i genele care confer plasmidului capacitatea de a se transfera FTR. Rezistena la peste 90% din tulpinile de spital este de natur plasmidic. Bacteriofagii

Figura 22 Structura bacteriofagului Sunt virusuri care pazariteaz bacteriile. Morfologie. Bacteriofagii sunt formai dintr-un cap hexagonal, un gt i o prelungire numit picior (coad). Capul este alctuit dintr-un nveli proteic (capsida) i adpostete ADN. Coada este un cilindru rigid nvelit ntr-un manon proteic asemntor miozinei i se termin cu o plac hexagonal ce conine o enzim de tipul lizozimului. De placa bazal se aprind 6 fibre cu rol n fixarea bacteriofagului pe suprafaa bacteriei. Ataarea bacteriofagului pe suprafaa peretelui bacterian este determinat de existena unor receptori de perete, specifici. Dup ataare are loc contracia manonului proteic i bacteriofagul i injecteaz numai ADN n celula bacterian. Dup ptrunderea genomului fagic n celula bacterian, acesta va determina sinteza de noi bacteriofagi identici cu cel de la care a provenit ADN. Dup asamblarea noilor virusuri ele vor prsi celula bacterian care se lizeaz. Acesta este ciclul litic al bacteriofagilor, iar ei se numesc fagi viruleni. Dar nu ntotdeauna relaiile bacteriofag-bacterie evolueaz n acest fel. Uneori genomul bacteriofagului se va integra n cromozomul bacterian ncadrndu-se i funcional n acesta. n aceast situaie el nu se mai replic dect n acelai timp cu cromozomul bacterian, deci n timpul diviziunii bacteriene i se numete profag. Acest ciclu este ciclul lizogen iar bacteriofagii se numesc fagi temperai. Elemente genetice transpozabile Elementele genetice transpozabile sunt fragmentele de inserie (IS) i transpozonii (Tn).

24

ABCDEF G

Transpozaz

GFEDCB A

Figura 23 Structura secvenelor de inserie

Figura 24 Structura tranpozonilor IS i Tn sunt fragmente mici de ADN cu limite structurale bine precizate care se pot integra repetat n mai multe situsuri dintr-un genom. Existena lor a fost presupus nc n anul 1931 i n anul 1952 de Barbara Mc Clintock care le-a denumit gene sltree (jumping genes). Descoperirea a fost primit cu mult scepticism i nencredere la vremea respectiv, dar timpul a dovedit importana ei, autoarea fiind onorat cu premiul Nobel n anul 1983.

Variabilitatea la bacteriiVariabilitatea la bacterii se produce prin: mutaii, transfer de material genetic i transpoziie.

MutaiaModificrile spontane ale genomului se numesc mutaii i constau din modificarea secvenei de nucleotide dintr-o gen. Ele pot fi punctiforme, inversii, inserii, deleii i mutaii secundare. Mutaiile duc la apariia unor indivizi cu caractere noi, din care importante din punct de vedere medical sunt rezistena la chimioterapice, modificarea structurii antigenice, modificarea virulenei etc. Mutaiile naturale sunt rare.

Transferul de material geneticBacteriile se nmulesc vegetativ prin diviziune direct, deci materialul genetic provine de la o singur celul. Cu toate acestea exist i la bacterii mecanisme care permit schimbul de material genetic de la o bacterie la alta. Acestea sunt transformarea, transducia i conjugarea. Transformarea Reprezint transferul de material genetic de la o celul donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracie chimic. Acest proces a fost observat pentru prima oar la pneumococi de Griffith n 1928. ADN-ul pneumococilor viruleni, capabili s sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urm dobndind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea are loc i intre specii diferite. Bacteria care primete materialul genetic trebuie sa se afle n stare de competen. Transducia Transducia reprezint un transfer de gene cromozomiale de la o celul bacterian la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili s transfere orice gen bacterian (transducie generalizat) iar alii numai anumite gene (transducia specializat).

25

Conjugarea Conjugarea este transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de mperechere, ce se realizeaz prin contactul direct dintre cele dou celule. Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum i gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+). Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiionat de prezena n plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului i de transferul plasmidului. Conjugarea ncepe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezeni pe peretele celular al bacteriei receptoare. Dup formarea legturii dintre celula donor i cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O caten parental de ADN va rmne n celula donor, iar a doua va trece n celula receptoare, pe tiparul lor sintetizndu-se catene complementare. Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten - plasmidele R. Transpoziia Transpoziia presupune integrarea ntr-un genom al unui elemente genetic transpozabil din aceeai molecul de ADN sau din alta prezent n aceeai celul. Inseria oricrei gene ntre dou elemente transpozabile face posibil transferul ei prin recombinare neomolog, n aceeai celul pe o molecul de ADN nenrudit structural. Astfel, prin transpoziie se pot produce deleii, inversii, transpuneri de determinani genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabil a unor repliconi complei, de pild a dou plasmide. Evoluia rezistenei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi conceput astzi fr fenomenul de transpoziie. Mecanismele transpoziiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezisten, prin inserarea succesiv pe un plasmid a determinanilor genetici de rezisten situai ntre dou elemente transpozabile de pe alte plasmide.

26

Rezistena antiinfecioasMediul nconjurtor conine o infinitate de ageni infecioi, omul fiind supus unei contaminri permanente. Cu toate acestea, la individul sntos, infeciile se produc rar, sunt de obicei de durat limitat i dispar fr sechele, datorit mecanismelor rezistenei antiinfecioase. Rezistena antiinfecioas este suma tuturor mecanismelor care protejeaz organismul de infecii i cuprinde: rezistena nnscut, care asigur rezistena natural, nespecific, fa de agenii infecioi, comun tuturor indivizilor unei specii, necondiionat de un contact anterior cu un agent infecios, i rezistena dobndit sau imunitatea antiinfectioas, care se dezvolt pe parcursul vieii, ca urmare a contaminrii continue cu diveri ageni infecioi i care depinde, deci, de experiena individual a fiecruia.

REZISTENA ANTIINFECIOAS NATURALRezistena natural antiinfecioas reprezint totalitatea mecanismelor constituionale nnscute care se opun penetrrii i dezvoltrii microbilor patogeni n organism. n esen, organismul este aprat fa de unele infecii prin zestrea sa ereditar, care nu permite dezvoltarea anumitor germeni. Germenilor la care este sensibil, organsimul se opune ptrunderii lor prin bariere externe anatomice i chimice la care se adaug flora normal a organismului. Dac totui germenii au reuit s strbat aceste bariere i ajung n zonele interne sterile ale organismului, intervin o serie de factori umorali (complement etc.) care declaneaz reacia inflamatorie i care la rndul ei va mobiliza un alfux mare de celule fagocitare (PMN, macrofage) n focarul infecios. Rezultatul este distrugerea germenilor prin fagocitoz. Bineneles c exist germeni care au dezvoltat strategii ce ocolesc mecanismele rezistenei naturale i care dau infecii la indivizii neimunizai. Cu toate c mecanismele rezistenei naturale sunt distincte de cele ale rezistenei dobndite, ele nu pot fi separate deoarece se intric i acioneaz sinergic.

Factorii geneticiRezistena antiinfecioas de specie. Fiecare specie este genetic rezistent la anumii ageni etiologici infecioi. Astfel, de pild, omul este rezistent fa de virusul Carr, agentul etiologic al jigodiei la cine, la virusul hepatitei cinilor sau la pesta aviar. Rezistena genetic antiinfecioas de specie este absolut. Ea se explic prin condiiile impropri pe care un organism le ofer microorganismului fa de care este rezistent i prin lipsa receptorilor celulari specifici pentru agentul infecios respectiv. Rezistena individual. n cadrul aceleiai specii, rezistena antiinfecioas prezint variaii de ras i individuale. Este cunoscut faptul c n timpul unor epidemii, ca, de pild, n cele de poliomielit, unii indivizi fac forme grave de boal infecioas, alii forme fruste iar unii chiar infecii clinic inaparente. De asemenea, n timp ce exist purttori sntoi de streptococ beta-hemolitic de grup A, infeciile streptococice pot produce n funcie de rezistena individual, infecii faringiene banale sau complicaii alergice severe.

27

Relaia dintre factorii genetici i sensibilitatea la diveri ageni infecioi este deosebit de important, infeciile constituind de-a lungul timpului factorul cel mai puternic al seleciei naturale.

Barierele anatomiceIntegritatea anatomic a organismului este unul din factorii eseniali n aprarea antiinfecioas natural.

Pielea i mucoaseleTegumentele i mucoasele constituie bariere mecanice eficiente n prevenirea ptrunderii microbilor n organism. Pielea intact este impermeabil prin structura ei pentru majoritatea microorgansimelor, cu unele excepii, ca, de exemplu, leptospirele, virusurile papiloma i dermatofiii. Orice leziune a pielii poate constitui punctul de plecare a unei infecii. Astfel, bacilul piocianic, rezident al florei cutanate normale, infecteaz aproape ntotdeauna plgile arse. Acizii grai liberi produi de glandele sebacee i de unele specii microbiene de pe suprafaa pielii, acidul lactic, rezultat al metabolismului local, pH-ul sczut (5-6) i uscciunea relativ a pielii creeaz condiii nefavorabile dezvoltrii majoritii microorganismelor, cu excepia germenilor din genurile Staphylococcus, Corynebacterium, Proprionibacterium etc. i confer pielii proprieti autosterilizane. Proprietatea autosterilizant a pielii curate este superioar celei murdare. Descuamarea continu a stratului cornos este, de asemenea, o modalitate de ndeprtare a florei bacteriene de pe piele. Mucoasele, structuri ce delimiteaz suprafeele interne ale organismului, gzduiesc un mare numr de microbi i se opun ptrunderii acestora n organism nu att prin rezistena mecanic ct prin secreiile cu proprieti antibacteriene. Astfel, mucusul cervical, lichidul prostatic, lacrimile sau alte secreii au proprieti bactericide ce se datoreaz unor substane, dintre care aminitim lizozimul, activ mai ales pe flora gram-pozitiv i lactoferina, protein chelatoare ce spoliaz mediul de fierul necesar multiplicrii bacteriene.

Tractul respiratorTractul respirator este prevzut cu mecanisme de clearence microbian foarte eficiente. Mucoasa respiratorie este lubrefiat cu un strat de mucus. Acesta are proprieti tensioactive i surfactante inhibnd fixarea bacteriilor de celulele epiteliale. Microorganismele inhalate n particule de praf sau picturi mai mari dect 5 m ader de mucoasa tractului respirator superior i sunt readuse prin micrile cililor vibratili n faringele posterior, de unde sunt fie expectorate, fie nghiite. La micrile cililor se mai adaug tusea i strnutul, ambele foarte eficiente n eliminarea diverselor impuriti din cile respiratorii. Particulele mai mici de 5 m ajung pn n tractul respirator inferior, unde sunt fagocitate de macrofagele alveolare. Fumul de igar sau ali poluani, precum i unele bacterii i virusuri (B. pertussis, v. gripal) blocheaz acest clearence, prin paralizia cililor, favoriznd producerea unei pneumonii secundare.

Tubul digestivMicroorganismele sunt supuse deja n cavitatea bucal aciunii salivei care, prin coninutul de lizozim, lezeaz peretele celular i membrana citoplasmatic

28

a unor bacterii gram-pozitive. La aceasta se adaug aciunea unor anticorpi care se pot gsi n saliv. n stomac, flora bacterian sufer o reducere drastic sub aciunea acidului clorhidric din sucul gastric (pH=1,5). n perioadele de var crete numrul de toxiinfecii alimentare deoarece consumul de lichide este mare i sucul gastric se dilueaz. Creterea consecutiv a pH-ului permite trecerea microbilor de bariera gastric i nmulirea lor eficient n intestin. Tripsina i celelalte enzime din sucul pancreatic au aciune bactericid prin hidroliza proteinelor din peretele celular i membrana celular, iar bila interfereaz funciile vitale ale membranei celulare avnd i o aciune neutralizant asupra unor toxine bacteriene.

Tractul genito - urinarUrina este n mod normal steril. pH-ul acid i curgerea urinii asigur o splare permanent a cilor urinare. Vaginul este protejat parial de pH-ul acid rezultat n urma metabolizrii glicogenului de ctre bacilii lactici. Lichidul seminal conine spermina, o poliamin dependent de pH i care inhib creterea florei gram pozitive.

Flora normalFlora normal are o serie de funcii fiziologice, printre care prevenirea colonizrii organismului cu flor patogen. Mecanismele prin care flora normal se opune multipicrii florei patogene sunt: competiia pentru acelai receptor celular, competiia pentru un substrat nutritiv, secreia unor produi secundari toxici, stimularea sistemului imun, care va produce anticorpi naturali, ce vor reaciona ncruciat cu antigenele florei patogene. Administrarea abuziv de antibiotice va distruge echilibrul dintre speciile florei normale i unele specii condiionat patogene sau patogene, lipsind organismul de un mecanism antiinfecios important. Astfel, tratamentul oral ndelungat cu antibiotice va avea ca urmare apariia diareei prin dezvoltarea necontrolat a unei singure specii ca, de pild, S.aureus, Candida albicans, Clostridium difficile etc. care fac parte din flora normal i care se menin la individul sntos n anumite limite tocmai datorit antagonismului bacterian.

Mecanismele umoraleDac un microorganism trece de stratul protector al barierelor anatomice, el ntlnete mecanismele de aprare nespecifice nnscute, umorale i celulare, prezente n lipsa unui contact anterior cu agentul infecios respectiv. Serul proaspt este capabil s lizeze unele microorganisme (bacterii, virusuri) datorit n primul rnd coninutului n complement i lizozim, la care se mai adaug i ali factori umorali.

Sistemul complementComplementul este un sistem seric de 25 de proteine enzime care, ca i sistemul coagulrii i fibrinolizei, se activeaz n cascad sub aciunea unui trigger. 29

Desemnarea componentelor sistemului complement. Componentele majore sunt notate cu C1-C9.

Figura 25 Activarea complementului Activarea complementului se poate petrece pe dou ci cu punct de plecare diferit, dar, care converg spre aceiai produi finali: - calea alternativ, mai veche din punct de vedere filogenetic care se activeaz n absena anticorpilor specifici i face parte, deci, din rezistena antiinfecioas natural, i - calea clasic, a crei activare presupune n general prezena anticorpilor specifici, deci, un contact prealabil cu agentul etiologic respectiv. Momentul esenial n activarea complementului este activarea C3, care se descompune n C3a i C3b sub aciunea C3-convertazei. Calea alternativ. n prezena unor polizaharide de pe suprafaa bacteriilor, a endotoxinei i a acizilor theicoici, C3bBb rezultat al clivrii fiziologice a complementului se leag de suprafaa bacteriilor fiind protejat de inactivare. La stabilizarea C3bBb particip i o protein plasmatic, properdina. Deci, activarea complementului pe calea alternativ este rezultatul stabilizrii C3bBb (a C3-convertazei) ce poate fi determinat, printre altele, de prezena bacteriilor. Activarea complementului pe calea clasic se produce de regul n prezena complexelor antigen-anticorp, deci n urma unui rspuns imunitar.

30

Indiferent pe ce cale s-a activat complementul, reaciile urmtoare sunt comune ambelor ci. Se formeaz un complex de atac al membranei ce perforeaz membrana celular cu liza consecutiv a celulei bacteriene.

Rolul biologic al complementuluiActivarea complementului genereaz o serie de efecte biologice de o importan deosebit n rezistena antiinfecioas: declanarea inflamaiei. Activarea complementului aduce dup sine declanarea reaciei inflamatorii prin produii intermediari rezultai pe parcursul activrii. Astfel, C5a este un puternic factor chemotactic i chemokinetic pentru PMN pe care le va aduce n focarul infecios. C3a i C5a sunt anafilatoxine care vor duce la o degranulare fiziologic a mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici vasoactivi; citoliza. Celulele pe care s-a fixat complementul i care n mod fiziologic sunt celulele strine organismului (bacteriile, n cazul de fa) sunt lizate sub aciunea complexului de atac al membranei. n cazuri patologice, complementul se poate fixa de celulele proprii organismului producnd distrugerea acestora;

opsonizarea. Fagocitele au pe suprafaa lor receptori pentru C3b. Astfel, microbii de care s-a fixat C3b vor adera de celulele fagocitare fiind fagocitai mai eficient. Deficienele ereditare ale unor componente ale complementului scad capacitatea de aprare antiinfecioas a organismului.

LizozimulLizozimul este o mucopeptidaz prezent aproape n toate umorile organismului (ser, lacrimi, saliv, secreie nazal), fiind absent n LCR, urim i umoarea apoas). Este singura enzim a vertebratelor capabil s rup legturile din interiorul peptidoglicanului, prezent n peretele bacterian precum i chitina fungilor. Lizozimul este activ pe peretele celular al bacteriilor grampozitive. Bacteriile gram-negative nu sunt sensibile la aciunea lizozimului, deoarece peptidoglicanul este acoperit de membrana extern. Dac bacteriile sunt supuse iniial aciunii complementului, acesta va leza membrana extern dezvelind peptidoglicanul, sensibil acum la aciunea lizozimului. Multe specii bacteriene au dezvoltat strategii de eludare a aciunii complementului i lizozimului, ceea ce ns nu scade importana lor n aprarea antiinfecioas.

CitokineleCitokinele sunt peptide, asemntoare hormonilor, cu proprieti imunomodulatoare, produse de celulele care rspund invaziei microbiene. Cele care acioneaz chiar asupra celulelor care le produc sunt denumite autocrine, cele cu efect pe celulele nvecinate paracrine, iar cele cu efect pe celule la distan endocrine. Exist multe celule productoare de citokine, dar cele mai importante sunt macrofagele i limfocitele. n cazul invaziei organismului de ctre ageni strini (bacterii, toxine), se declaneaz secreia de citokine care contribuie n ansamblu la creterea rezistenei la infecii. Astfel, citokinele au rol important n declanarea inflamaiei.

31

Unele simptome generale ale infeciei, ca, de exemplu, febra, somnolena, starea de disconfort, durerea muscular etc., se datoreaz activitii acestor substane.

Rspunsul de faz acutEste o reacie generalizat, nespecific a organismului, stimulat de infecie, inflamaie, leziuni tisulare i inconstant de procese proliferative fiind mediat de citokine dintre care mai importante sunt IL-1, IL-6, TNFa, PGE1 (prostaglandina E1) i interferoni. Febra este cel mai evident semn al rspunsului de faz acut i este rezultatul aciunii IL-1, TNF i alfa interferonului care acioneaz mpreun asupra centrului termoreglrii al hipotalamusului. La aceasta se adaug creterea PMN n sngele periferic. Se remarc scderea fierului i zincului n ser, necesare multiplicrii bacteriilor. Dintre proteinele serice a cror concentraie crete n timpul rspunsului de faz acut amintim proteina C-reactiv (CRP), produs de celula hepatic stimulat de IL-1. n 24-48 ore de la debutul inflamaiei acute concentraia seric a CRP crete de mii de ori. CRP se poate lega de polizahardele unui numr mare de bacterii i fungi. Prin activarea consecutiv a a complementului, pe cale alternativ, se faciliteaz ndeprtarea acestor microorgansime prin bacterioliz i fagocitoz.

Opsoninele i opsonizareaOpsoninele sunt substane care ader de suprafaa unui microorganism fcndu-l accesibil fagocitozei. Exist opsonine nespecifice i specifice. C3b, de pild, opsonin nespecific ce se produce n timpul activrii complementului se leag covalent de microbi. Acest complex, microb-C3b, se leag de glicoprotein-receptorul pentru C3b prezent pe membrana fagocitelor (CR1). Fiind legat de fagocit, microbul va fi fagocitat eficient. Alt exemplu de opsonin nespecific este fibronectina, o glicoprotein cu funcii de opsonin fa de bacteriile gram-pozitive. Ea se gsete la suprafaa mucoaselor, mpiedicnd, prin proprietatea de a se lega de flora gram-pozitiv, colonizarea mucoaselor cu flor gram-negativ (de exemplu mucoasa faringian). Opsoninele specifice sunt unii anticorpi care, ns, sunt implicai n aprarea antiinfecioas dobndit.

Interferonii (IFN)Interferonii sunt glicoproteine (GM 20 kD) cu rol important n rezistena fa de virusuri. Se deosebesc 3 tipuri de interferoni: IFN- , secretat de macrofage i PMN ca urmare a infeciei celulelor respective cu un virus sau dup stimulare cu polinucleotide, diverse componente bacteriene cum ar fi endotoxina bacteriilor gram negative etc.; IFN- , secretat de fibroblati n aceleai condiii; interferonii alfa i beta sunt produi de celule dup ptrunderea unui virus sau a inductorilor de interferoni (polinucleotide, endotoxina bacteriilor gam-negative, ARN dublu catenar etc.). Ei mpiedic ptrunderea altui virus n celula respectiv pe de o parte, iar pe de alt parte, secretat n exterior se fixeaz pe receptorii pentru virusuri ale celulelor invecinate protejndu-le i pe acestea fa de ptrunderea virusului.

32

IFN- sau interferonul imun, secretat de limfocitele T dup stimularea acestora cu un antigen fa de care limfocitele au fost sensibilizate anterior. Dintre efectele biolologice ale interferonilor amintim aici activitatea antiviral antimitotic i imunomodulatoare. Vom reveni asupra lor n capitolul de virusologie.

Rspunsul inflamatorn esen, ptrunderea microbilor n esuturi duce la activarea complementului, ceea ce are ca urmare liza celulelor microbiene, pe de o parte, i declanarea rspunsului inflamator infecios, pe de alt parte. Cascada de activare a complementului va antrena eliberarea unor mediatori chimici (citokine, proteinele de faz acut, mediatori rezultai din degranularea mastocitelor etc.) care particip direct n procesul inflamator i vor atrage n focarul infecios fagocitele. Acestea vor nltura microorganismele invadatoare prin fagocitoz.

Figura 26 - Modificrile vasculare din inflamaie Inflamaia acut este rezultatul schimbrilor ce se petrec ntr-un esut ca rspuns la o agresiune mecanic, chimic sau infecioas. Ea este un mecanism de aprare antiifecios rapid, care tinde s localizeze infecia i s previn diseminarea ei. Manifestrile locale ale inflamaiei sunt eritemul (rubor), cldura (calor), durerea (dolor) i edemul (tumor). Inflamaia poate evolua spre vindecare cu restitutio ad integrum a esuturilor sau cu sechele. Deznodmntul unei reacii inflamatorii depinde de extinderea procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum i de reactivitatea gazdei. Cele 3 evenimente majore ale inflamaiei sunt:

33

vasodilataia capilar local, modificrile structurale microvasculare,

acumularea leucocitelor la locul injuriei. Vasodilataia capilar. Mediatorii plasmatici ai inflamaiei, ca, de pild, complementul, exist sub forma unor precursori care, aa cum am vzut, devin biologic activi numai dup activare. Activarea C3 a complementului este o etap critic a inflamaiei. C3a i C5a rezultate n cursul activrii complemenetului sunt anafilatoxine puternice ce determin degranularea mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici. O parte dintre acetia sunt preformai, aa cum este histamina. Ea are aciune vasodilatatoare asupra capilarelor, crescnd totodat i permeabilitatea acestora. n consecin, se produce o exudare din capilare spre zona infectat a plasmei cu mediatorii pe care aceasta i conine. Modificrile structurale microvasculare i acumularea de leucocite. Sub aciunea unor mediatori chimici rezultai n timpul activrii complementului i secretai de macrofagele stimulate de toxine bacteriene se modific endoteliul capilar, care permite adeziunea PMN de acesta.

Figura 27 - Diapedeza PMN sunt atrase de factorii chemotactici de natur bacterian, de cei produi n urma activrii complementului i de cei rezultai din degranularea mastocitelor. Ele vor prsi capilarul prin diapedez i se vor ndrepta ctre focarul inflamator unde vor distruge microbii prin fagocitoz.

Mecanisme celulare nespecifice - fagocitozaFagocitoza este un mecanism important de ndeprtare a microorganismelor i a celulelor lezate fiind proprietatea unor celule de a ngloba i digera particule

34

strine organismului. Aceste celule sunt PMN i monocitele (care dup ce migreaza n esuturi se numesc macrofage). PMN apar primele ca rspuns ntr-o inflamaie acut, fiind urmate mai trziu de macrofage. Fagocitoza are urmtoarele etape: chemotaxia, opsonizarea, ataarea, internalizarea i digestia

Figura 28 - Fagocitoza Chemotaxia. Fagocitele sunt atrase n focarul infecios de factori de origine bacterian i factori chimiotactici ce apar n cursul inflamaiei, cum sunt: C5a, kallicreina produs de esuturile lezate, produi rezultai din metabolismul acidului arahidonic (prostaglandine, tromboxan, leucotriene). Aceste substane favorizeaz exprimarea receptorilor pentru C3b al fagocitelor. Fagocitele prsesc capilarele prin diapedez. Opsonizarea. Reprezint faza n care microorganismele sunt pregtite pentru fagocitoz i ader de fagocite. Aceast aderare comport 4 modaliti ce definesc eficiena fagocitozei. figura Menionm c ultimele dou posibiliti aparin rezistenei antiinfecioase dobndite, deoarece presupun participarea anticorpilor rezultai n urma unui rspuns imunitar. nglobarea. Dup ataare, particulele sunt nglobate ntr-o vacuol format din membrana citoplasmatic. Acest vacuol, sau fagozom, va fuziona cu lizozomii primari pentru a forma fagolizozomii n care enzimele lizozomale vor declana digestia. Totodat are loc explozia respiratorie care este de fapt o activare puternic a metabolismul oxidativ al PMN. Digestia. Distrugerea microbilor sub aciune enzimelor lizozoale se petrece prin dou mecanisme: oxigen dependente i oxigen independente. mecanismele dependente de oxigen sunt consecina exploziei respiratorii (intensificare brusc a metabolismului) ce nsoete fagocitoza i pe parcursul creia se formeaz ioni de superoxid (O3-), oxigen atomic (O-),

35

radicali hidroxili, peroxid de hidrogen (H2O2) i hipoclorit. Toi aceti produi sunt puternic bactericizi. mecanismele bactericide independente de oxigen se datoreaz unor enzime me hidrolitice: catepsina, glicozidaza, arilsulfataza ce diger peretele celular al microbilor; defensine: proteine cationice care se leag de peretele celular i determin formarea unor canale ce strpung peretele; lizozimul care atac peptidoglicanul; lactoferina care spoliaz mediul de fierul necesar bacteriilor. Fagocitoza prin PMN poate fi considerat principalul mecanism de aprare fa de bacteriile piogene. Fagocitoza prin macrofage.

Figura 29 macrofag n fagocitoz Rolul fagocitozei prin PMN este distrugerea bacteriilor. Macrofagele intervin mai trziu n focarul infecios, unde vor fagocita microbi i detritusurile celulare rezultate n urma leucocitelor distruse la locul injuriei. Fazele fagocitozei prin macrofage sunt asemntoare cu cele descrise mai sus, dar, spre deosebire de PMN, macrofagele se pot activa dac sunt stimulate corespunztor. Ele se activeaz sub aciunea unor substane ce apar n urma prezenei microorganismelor, ca, de pild, C3b i g-interferon, unele componente bacteriene, cum ar fi endotoxinele, i de limfocitele Tdh n cadrul rspunsului imun celular. Cu toate acestea, unele bacterii, protozare sau fungi

36

sunt capabile s supravieuiasc i s se multiplice n macrofagul neactivat (micobacterii, brucelle, criptococi, listerii etc.). Dup activare unele ele pot fi distruse. Deci, fagocitoza efectuat de macrofage este eficient asupra microorganismelor cu habitat intracelular. Uneori, ns, microorganismele nu sunt distruse i supravieuiesc pe durat lung n macrofag, rezultatul fiind inflamaia cronic. Fagocitoza prin macrofage are, pe lng rolul de a ndeprta bacteriile, mai ales cele cu habitat intracelular, i cel de a iniia rspunsul imun. Macrofagele sunt celule prezentatoare de antigen care dup prelucrarea acestuia l prezint limfocitelor Th.

Limfocitele NKCelulele NK sunt limfocite citotoxice naturale care exist deja la natere. Ele nu sunt fagocite, dar pot ataca i distruge n mod nespecific celule infectate cu virusuri sau chiar celule tumorale. n contact cu celulele infectate, celulele NK secret o perforin nrudit cu C9 a complementului. Aceasta polimerizeaz pe membrana celulei int i formeaz aici canale ce distrug integritatea acesteia.

Rezistena antiinfecioas dobnditApariia unor substane strine organismului este recepionat de sistemul imun care: discrimineaz selful de non-self; rspunde prin efectori umorali i celulari care vor elimina ceea ce este strin organismului, meninnd astfel individualitatea i integritatea acestuia;

memoreaz acest rspuns. Funcionalitatea sistemului imun se pe bazeaz pe complementaritatea steric dintre doi parteneri. Primul partener, perceput de sistemul imun ca non-self, se numete antigen i are capacitatea de a induce modificri biologice ale sistemului imun, care constau, n esen, n apariia efectorilor imuni umorali (anticorpi) i celulari (limfocite sensibilizate). Partenerul reaciei imune care provine din partea organismului se numete anticorp n ser i secreii i receptor pentru antigen cnd se constituie ca parte component a membranei celulare a limfocitelor (BCR pentru limfocitul B i TCR pentru limfocitul T). Reaciile imunologice care au loc ntre antigen i efectorii imuni a cror formare a indus-o pot avea consecine diferite asupra organismului. La o extrem a acestor reacii stau cele fiziologice, care asigur imunitatea organismului i pe care omul ncearc s le provoace artificial prin imunizare pasiv (seroterapie) sau activ (vaccinare). La cellalt capt stau reaciile imunopatologice, care sunt defavorabile organismului, fie c sunt ndreptate spre un agent infecios, fie spre propriile antigene pe care organismul nu le mai recunoate ca propri (reacii autoimune). n aceste cazuri omul caut s intevin prin depresia reaciilor imunologice.

37

ANTIGENELE

1.1.Definiie. Antigene complete. HapteneAntigenele sunt substane capabile de a interaciona specific cu receptorii pentru antigen (anticorp, BCR1, TCR2). Datorit configuraiei de suprafa, antigenele sunt recunoscute de organism ca strine, ca non-self. n unele situaii patologice chiar i unele substane proprii ale organismului pot deveni antigenice, nemaifiind recunoscute de organism ca self. Un agent infecios, indiferent de natura lui, este un mozaic de antigene capabile s produc un rspuns imunitar. Antigenele complete au dou proprieti de baz: imunogenitatea, care este capacitatea unui antigen de a induce un rspuns imunitar (umoral sau/i celular), i antigenicitatea, care este proprietatea antigenelor de a reaciona n mod specific cu efectorii imuni (anticorpi sau limfocite sensibilizate) a cror producere au indus-o. Haptenele sunt antigene incomplete lipsite de imunogenitate, deci de proprietatea de a induce ele nile un rspuns imunitar, dar sunt capabile s reacioneze cu anticorpi specifici. Contradicia din definiia de mai sus se explic prin faptul c o hapten devine imunogen legat covalent de o molecul mai mare, numit carrier. Anticorpii care se vor forma vor reaciona la un contact ulterior i cu haptena liber fr ca aceasta s fie asociat cu carrierul. Epitopii. Gruprile unui antigen care sunt recunoscute de organism ca nonself se numesc epitopi. Partea complementar a efectorilor imuni (anticorpi sau receptori de pe suprafaa limfocitelor) se numete paratop. Un antigen poart n general mai muli epitopi diferii fa de care organismul va produce tot atia anticorpi cu paratopi diferii. S-au descris i antigene cu epitopi identici repetitivi. Poziia epitopilor ntr-un antigen este diferit i n funcie de aceast poziie pot fi recunoscui de limfocitele - T sau B. Epitopii care vor fi recunoscui de anticorpi sau limfocitele B sunt proeminene ale unor molecule ghemuite la suprafaa antigenului i se numesc epitopi structurali sau epitopi B. Aceti epitopi nu sunt antigenici dect n stare nativ, denaturarea proteinei modificnd aspectul acestor epitopi.

Figura 30 Epitopii B

38

Limfocitele T recunosc doar epitopi situai n interiorul moleculei de antigen i care sunt peptide scurte (8-10 aminoacizi). Aceti epitopi liniari se numesc epitopi secveniali sau epitopi T. Ei sunt recunoscui de limfocitelele T doar dup prelucrarea antigenului de ctre macrofag i dup ce ajung la suprafaa acestuia.

Figura 31 - Epitop T Deci, limfocitul B recunoate epitopul ca o parte a moleculei intacte de antigen, pe cnd limfocitul T i vede epitopul corespunztor doar dup descompunerea moleculei. Cu alte cuvinte, limfocitul T recunoate o poriune ascuns din carrier iar limfocitul B haptena. Antigenele pot fi timodependente stimulnd sistemul imun prin intermediul limfocitelor T dup prelucrare macrofagic i timoindependente care stimuleaz direct limfocitele B, n stare nativ, fr intervenia limfocitelor T. Antigenele timodependente sunt proteine, iar cele timoindependente sunt n general polizaharidele i antigenele cu epitopi repetitivi. Factori care influeneaz imunogenitatea. Intensitatea rspunsului imun fa de un antigen este n funcie de natura chimic, greutatea molecular, persistena n organism, doza, ritmul, calea, intervalul i calea de administrare. Cunoaterea rspunsului n funcie de aceti factori st la baza elaborrii calendarului de vaccinri.

Antigene microbieneMicroorganismele sunt mozaicuri de antigene. Acestea sunt fie corpusculare legate de structura microorganismului (bacterii, virusuri fungi etc.), sau eliberate n mediu dup distrugerea microorganismului (endotoxinele), fie solubile, secretate de microorganism n mediul nconjurtor (enzime, exotoxine). Dintre antigenele corpusulare, cele mai importante sunt antigenele de suprafa (polizaharidele capsulare, componente ale peretelui celular, antigene flagelare). Componentele de suprafa a florei microbiene normale a organismului favorizeaz colonizarea acesteia n niele naturale, cum ar fi cavitatea bucal, faringele, intestinul gros etc. Antigenele acestei flore au o importana deosebit, deoarece datorit lor organismul se imunizeaz ocult, rezultatul fiind apariia anticorpilor naturali, cu rol n aprarea antiinfecioas.

39

Antigenele care sunt implicate n patogenitatea agenilor infecioi se numesc antigene de patogenitate. Dintre acestea amintim: antigenele capsulare (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella, Bacillus anthracis, antigenul de nveli Vi al bacilului tific, antigenul K al bacilului coli enteropatogen etc.), antigenele de perete (antigenul O din peretele bacteriilor gramnegative, proteina M a streptococului de grup A), exoenzimele (coagulaza, hemolizinele secretate de Staphylococcus aureus, fibrinolizinele streptococului beta-hemolitic de grup A etc.), exotoxinele (difteric, tetanic, diferitele enterotoxine etc.) Imunogenitatea antigenelor bacteriene depinde de mai muli factori, cum sunt: predispoziia genetic a gazdei, cantitatea, forma de prezentare a antigenului, care practic nu este niciodat pur, fiind combinat cu diveri adjuvani sau carrieri ce aparin peretelui bacterian, cililor, capsulei etc. La aceti factori se mai adaug variabilitatea antigenic a unor microorganisme i modificrile pe care le pot suferi antigenele bacteriene n organism. Componentele bacteriene intracelulare pot fi i ele antigenice, dar numai n cazul n care se elibereaz n mediu dup liza bacteriei. Rspunsul imunitar difer, de asemenea, n funcie de habitatul bacteriilor n organismul infectat, Astfel, agenii infecioi care se nmulesc n mediul extracelular induc un rspuns predominant umoral, pe cnd cei cu habitat facultativ sau obligatoriu intracelular un rspuns predominant celular. Structura antigenic a agenilor infecioi este important deoarece pe baza ei putem recunoate diferiii ageni prin intermediul serurilor imune care conin anticorpi specifici cunoscui. Figura 32 - Superantigenele Superantigenele sunt antigene care stimuleaz n mod necontrolat i dramatic proliferarea limfocitelor T. Ca urmare, limfocitele vor secreta cantiti deosebit de mari de citokine, care determin manifestri clinice foarte grave, cum este ocul. Foarte multe exotoxine bacteriene funcioneaz ca superantigene. Astfel, de pild, exotoxinele secretate de S.aureus sunt superantigene responsabile de manifestrile clinice ale ocului toxic stafilococic. Eritrotoxinele streptococice sunt, de asemenea, superantigene.

SISTEMUL CELULAR IMUNOCOMPETENTOrganele sistemului imun sau organele limfoide sunt rspndite n tot organismul i implicate n creterea, diferenierea i activitatea limfocitelor. 40

Organele limfoide primareSunt mduva osoas roie i timusul. n aceste organe limfocitele devin celule imunocompetente, dobndind repertoriul de recunoatere a antigenelor i proprietatea de a deosebi selful de non-self. Acest proces de colarizare se desfoar n absena antigenelor din mediul extern.

Figura 33 . Organe limfoide n timus prolifereaz limfocitele T, din care 10% dobndesc caracterul imunocompetent iar restul de 90% sunt distruse. La psri, limfocitele B migreaz i se difereniaz ntr-un organ numit bursa lui Fabricius. La mamifere, deci i la om, ele rmn n mduva roie i se difereniaz aici, mduva roie fiind i un organ limfoid secundar.

Figura 33: Circulaia limfocitelor

Organele limfoide secundareDup diferenierea lor n organele limfoide primare, limfocitele B i T migreaz pe calea vaselor sanguine i limfatice n organele limfoide secundare, care sunt ganglioni limfatici, splina, amigdalele i esutul limfoid ataat mucoaselor (MALT). Limfocitele imunocompetente care populeaz organele limfoide secundare sunt celule antigen-reactive. Deci spre deosebire de organele limfoide primare, unde instruirea se face n absena antigenului, n organele limfoide secundare prezena acestuia este obligatorie.

41

Sistemul imun al mucoaselor (MALT)1este format din esut limfoid ataat mucoasei gastrointestinale, respiratorii i a tractului uro-genital i este deosebit de important n aprarea antiinfecioas dobndit deoarece este principala barier antiinfecioas fa de microorganismele care ptund n organism pe cale digestiv, respiratorie i urogenital. Soarta unui agent infecios care strbate barierele externe ale aprrii antiinfecioase naturale depinde de calea de ptrundere. Astfel, dac agentul infecios ptrunde direct n circulaie va ajunge n splin unde va iniia un rspuns imunitar. Dac ptrunde prin piele, datorit unui traumatism, de pild, va fi transportat de la locul inflamaiei prin limf la ganglionii limfatici regionali, care vor servi ca sediu al rspunsului imun. Figura 33 Tesutul limfoid atrasat mucoaselor (MALT) n fine, dac strabate mucoasa digestiv sau respiratorie va ajunge n esutul limfoid ataat mucoaselor (MALT), unde se va produce i rspunsul imun. Aici se vor produce anticorpi (IgA) care vor ajunge la suprafaa mucoaselor respective, dar o parte din limfocite vor migra la alte organe limfoide, astfel ca informaia antigenic s ajung n ntreg organismul.

Celulele implicate n rspunsul imunPentru a produce un rspuns imunitar, un antigen trebuie s interacioneze cu o serie de celule prezente n snge i diferite esuturi. Acestea sunt celulele prezentatoare de antigen (CPA) i limfocitele T i B. n interaciunea dintre antigen i aceste celule de o importan major sunt antigenele de histocompatibilitate (MHC) de pe suprafaa acestor celule.

Celulele prezentatoare de antigen (CPA)CPA sunt celulele care au proprietatea de a prezenta antigenele limfocitelor. Ele cuprind macrofagele (fagocite profesioniste), celulele Langerhans din piele, celulele dendritice din ganglionii limfatici i splin, i limfocitele B

42

Figura 34 - Celule prezentatoare de antigene Macrofagele. Sistemul mononclear macrofagic este alctuit din celule cu origine mieloid, precursorul lor comun fiind monoblastul. Ele prsesc mduva roie, intr n snge unde se numesc monocite i reprezint 10% din leucocitele sanguine. Dup cteva zile prsesc circulaia, ptrund n diverse esuturi, devenind macrofage mature. Denumirea lor depinde de zona anatomic n care au migrat. Astfel, ele se numesc macrofage alveolare n plmn, microglii n esutul nervos, celule Kupffer n ficat, osteoclaste n schelet, celulele mezangiale renale etc. Macrofagele au pe suprafaa lor receptori pentru C3b a complementului i pentru Fc a imunoglobulinelor. Ele intervin n aprarea antiinfecioas prin fagocitoz, dar rolul lor esenial const n relaiile pe care le stabilesc cu limfocitele Th, crora le prezint antigenul. Macrofagele secret IL-1 cu activitate de stimulare asupra limfocitului Th, care la rndul lui secret IFN- care activeaz macrofagele. CPA au la suprafaa lor antigene de histocompatibilitate (MHC) de clasa II. Dup nglobarea antigenului, CPA prelucreaz antigenul degradndu-l pn la nivel de peptid format din 8-10 aminoacizi. Acest peptid ajunge printrun mecansim necunoscut la suprafaa CPA asociat antigenului MHC de clasa II i este prezentat limfocitului Th, care nu recunoate antigenul dect n aceast asociere. Cnd CPA prezint antigenul limfocitului T, ele secret o monokin IL-1 care are aciune stimulatoare asupta limfocitului Th. n concluzie, celulele prezentatoare de antigen sunt responsabile de legarea antigenului, prelucarea i prezentarea acestuia limfocitelor Th n asociaie cu MHC-II i secreia de IL-1.

Celule cu origine limfoid - limfociteleLimfocitele alctuiesc 10 -15% din elementele seriei albe sanguine. Cele aproximativ un trilion de celule limfocitare (1kg) poart responsabilitatea major a sistemului imun. Ele nu pot fagocita, dar demonstreaz alte proprieti speciale: poart pe suprafaa lor receptori specifici care permit fiecrei celule s reacioneze cu un anumit antigen. Aceasta constituie baza specificittii imunologice; se divid dup stimularea antigenic i formeaz clone celulare cu specificitate identic. Unele limfocite au durat de via lung reinnd informaia antigenic timp ndelungat, chiar toat viaa. Aceasta este baza memoriei munologice; limfocitele sunt vehiculate de snge i limf, memoria specific dobndit n urma unui rspuns imunologic repartizndu-se ntregului organism. Limfocitele cu funcionalitate diferit au aspect asemntor la microscopul optic, dar au markeri de suprafa ce pot fi identificai cu anticorpi monoclonali. Astfel se identific limfocitele B i limfocitele T cu subpopulaiile corespunztoare i celule nule.

43

Figura 35 - Subseturile de limfocite Limfocitele B reprezint 2-12% din limfocitele circulante. Ele au pe suprafaa lor markerul CD19 i antigene MHC de clasa II. Cnd limfocitul B este stimulat corespunztor prin limfocitul T-helper sau mai rar de antigene timoindependente, el ncepe s se divid transformndu-se n limfoblati care dau natere la plasmoblati, apoi la plasmocite. Toate celulele provenite dintr-un singur limfocit B aparin unei singure clone celulare, productoare a milioane de anticorpi identici care vor fi eliberai n mediul intern. Pe suprafaa limfocitelor B se gsete BCR care permite celulelor B s recunoasc antigenele specifice. Cele mai multe limfocite B sunt sub control direct al limfocitelor T-helper care stimuleaz activitatea lor i T-supresoare care o deprim. Exist ns i limfocite timoindependente, care nu necesit cooperarea cu limfocitele T reglatoare fiind stimulate direct de antigen. Dup stimulare antigenic, limfocitele se difereniaz, n afar de plasmocite secretoare de anticorpi, i n limfocite B cu memorie, care sunt celule cu via lung, fiind responsabile de un rspuns umoral rapid la o stimulare ulterioar cu acelai antigen. Limfocitele T reprezint 69-80% din limfocitele circulante. Ca i limfocitele B, ele recunosc n mod specific un numr imens de antigene ceea ce nseamn c i ele trebuie s dispun de un mecanism care s le garanteze variabilitatea receptorilor. Principiul mecanismului de sintez a receptorilor este asemntor celui prin care se sintetizeaz anticorpii. Se deosebesc i aici fragmentele de genele V,D,J, posibilitatea de variablitate fiind foarte mare. Markerii de surafa a limfocitelor T. La suprafaa limfocitelor T se gsesc markerii care individualizeaz subpopulaiile de limfocite T. Limfocitele T helper (Th) alctuiesc o subpopulaie de limfocite care dup interaciunea cu antigenul stimuleaz limfocitele B n elaborarea unui

44

rspuns imun umoral n anticorpi, limfocitele Tc pentru obinerea unui rspuns celular i activeaz macrofagele. Markerul de suprafa a limfocitului Th este molecula CD4+. Limfocitele T supresoare (Ts) limiteaz expansiunea clonal a limfocitelor B i T stimulate antigenic participnd la reglarea intensitii rspunsului imun. Limfocitele T citotoxice (Tc) sunt stimulate prin antigene care sunt exprimate la suprafaa celulei gazd ca, de pild, celule virus infectate, celule infectate cu microbi cu habitat intracelular sau celule tumorale pe care sistemul imun nu le mai recunote ca self. Markerul de suprafaa este tot CD8+. Limfocitele TDH1 sunt limfocite care au pe suprafaa lor marker CD4+ fiind responsabile de producerea hipersensibilitii de tip ntrziat (vezi capitolul de hipersensibilitate). Ele secret dup stimulare antigenic limfokine care activeaz macrofagele ce adpostesc bacterii cu habitat facultativ sau obligator intracelular. Limfocitele T cu memorie se formeaz n timpul rspunsului primar, ele avnd o viaa de aproximativ 40 de ani. Memoria lor imunologic ns se intinde pe o perioad de 10-15 ani. Celulele nule reprezint 10% din totalul limfocitelor i sunt reprezentate de limfocitele K i NK. Celulele NK (natural killer) recunosc nespecific celula int pe care o distrug printr-un mecanism de lezare a membranei celulare, asemntor complementului (vezi rezistena natural). Celulele K sunt responsabile de imunitatea celular anticorpodependent. Ele funcioneaz ca celule citotoxice dependente de anticorpi IgG. Aceti anticorpi se fizeaz prin fragmentul Fab de celula int (tumoral sau virus infectat) iar prin Fc de receptorul pentru Fc al celulei killer.

Figura 36 : Interrelaia dintre limfocitle B i T

n concluzie: limfocitele B vor duce la sinteza de anticorpi i sunt responsabile de imunitatea umoral, limfocitele T citotoxice vor distruge celule gazd care i-au pierdut caracterul de self, cum sunt celulele virus infectate sau tumorale. Ele rspund de imunitatea celular, limfocitele T helper au rol reglator.

45

Stimularea limfocitelor T citotoxice i a limfocitelor B timodependente nu poate avea loc n absena limfocitelor Th, limfocitele TDH au rol reglator prin secreia de limfokine. Ele activeaz macrofagele, care vor distruge la rndul lor bacteriile cu habitat intracelular, limfocitele T supresoare au rol reglator, limitnd intensitatea rspunsului imun.

Receptorii pentru antigeneRecunoaterea antigenului este punctul nodal al rspunsului imunitar i se bazeaz pe complementaritatea steric dintre antigen i moleculele implicate n recunoaterea sa, respectiv receptorii pentru antigene ai limfocitelor i anticorpii.

AnticorpiiAnticorpii sunt proteine serice care migreaz n cmpul electric cu gamaglobulinele, dar prezeni i n alte umori sau secreii, cu o structur capabil s le asigure legarea ferm i specific de antigen. Ei au fost pui n eviden pentru prima oar de Tiselius care a reuit separarea electroforetic a proteinelor plasmatice. a) Structura general a anticorpilor Anticorpii sunt structuri moleculare bifuncionale: o parte a moleculei se leag prin complementarit