Lucrari Practice Microbiologie

download Lucrari Practice Microbiologie

of 77

  • date post

    15-Jul-2015
  • Category

    Documents

  • view

    785
  • download

    6

Embed Size (px)

Transcript of Lucrari Practice Microbiologie

1. INTRODUCERE

n domeniul observaiei, hazardul nu favorizeaz dect minile pregtite - L. Pasteur Existena lumii microbiene a rmas necunoscut pn la inventarea microscopului la nceputul secolului al XVII-lea. Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723), savant olandez, a fost primul care a observat cu ajutorul unui microscop rudimentar fabricat de el nsui, particulele invizibile cu ochiul liber: sfere, bastonae, spirili. Microorganismele au fost descoperite n sec. al XIX-lea i clasificate n regnul vegetal. Haeckel (1866) propune crearea regnului Protista, alturi de cel animal i vegetal. Astfel, el regrupeaz organismele unicelulare sau pluricelulare care nu formeaz esuturi difereniate n: alge, ciuperci, protozoare i bacterii. n 1978, fiinele vii au fost clasificate n 5 regnuri, dup Whittaker i Margulis: (Prokaryotae, Protoctista, Fungi, Plantae i Animalia), urmnd ca , odat cu dezvoltarea biologiei moleculare, C. Woese s propun, n 1990, o nou clasificare n trei domenii: Archaea, Bacteria i Eucarya. Microbiologia este tiina care se ocup cu studiul microorganismelor, fiine unicelulare sau multicelulare microscopice. Aceast tiin biologic este scindat n mai multe specialiti: micologie, bacteriologie, virologie, algologie, protozoologie.

1

2. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE - GENERALITI

Laboratorul de microbiologie trebuie s cuprind dou compartimente: - o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare, coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria, mediile de cultur precum i reactivii. - o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent, impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 250C, 300C, 370C, 440C, 550C). Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care s se evite cele dou tipuri de contaminare: 1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit personalului sau mediului inconjurtor; 2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre microorganismele studiate. In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril de protecie din jurul flcrii becului de gaz. Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat. Laboratorul de microbiologie trebuie s aib n dotare urmtoarele aparate i echipamente:

2

robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul; hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de microbiologie bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru sterilizarea ansei etuv pentru sterilizarea sticlriei autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea obiectelor baie de ap termostatat frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor balane

termostat bacteriologic pentru incubarea culturilor

pH-metru microscoape

3

3. TEHNICI DE STERILIZARE A OBIECTELOR N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultur. Un produs este considerat steril cnd nu mai conine forme de microorganisme ce pot fi revitalizate. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie de analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai ntrebuinat.

STERILIZAREA PRIN CLDUR Cldura umed Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare. Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare. Autoclavul permite: - pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor; - decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie neaprat distruse. Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin,n mod separat. Timpul de sterilizare Duratele de sterilizare sunt date doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Materialul

Temperatura (0C)4

Presiunea (barr)

Timp (minute)

sterilizat Sticlrie curat Ap , ser fiziologic Parafin Sruri minerale Medii curente (bulion nutritiv, geloz nutritiv) Lapte degresat Medii coninnd substane termolabile (ex. glucide) Glucoz n soluie

121 121 121 121 121

1 1 1 1 1

20 20 20 20 15 - 20

115 110

0,7 0,5

15 20

110

0,5

20

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile de sterilizare. Pasteurizarea Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate. Tyndalizarea Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Tyndalizearea se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore. Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile. Cldura uscat5

Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuve). Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C. Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor. ALTE PROCEDEE DE STERILIZARE Sterilizarea prin filtrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni. Sterilizarea prin gaze toxice Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie. Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate : - pentru sterilizarea apei - pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant

Radiaiile gamma Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.6

Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.

3.1. PREGTIREA I STERILIZAREA STICLRIEI N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz. Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt: - splarea - uscarea - executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare. Pentru evitarea contaminrii mediilor de c