Microbiologie branzeturilor

5/17/2018 Microbiologie branzeturilor - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/microbiologie-branzeturilor 1/29

Microbiologia branzeturilorIstoricul utilizarii culturilor starter Nevoia obtinerii culturilor starter a aparut odata cu observarea faptului ca se realizeaza ofermentatie mai buna la fabricarea branzeturilor, daca in laptele proaspat se adauga zerul din ziuaprecedenta. La inceput transferul culturii se realiza prin insamantari pe zer, si astfel era propagatao anumita cultura de microorganisme. Deoarece cultura transferata era folosita pentru a incepe

fermentatia si a imbunatati activitatea culturii existente ea a fost denumita cultura starter.La inceputul secolului XX oamenii de stiinta au inceput studierea microorganismelor implicate infabricarea branzeturilor. Asa cum era de asteptat in afara de bacterii lactice s-a gasit si un numar mare de contaminati. Culturile au fost purificate progresiv si mentinute astfel prin insamantari inmedii sterile. Din aceste culturi cele mai active au fost selectionate si comercializate sub forma deculturi starter comerciale.Micoorganisme utilizateMicroorganismele adaugate la fabricarea branzeturilor pot fi impartite in doua mari grupemicroorganisme starter si microflora secundara. Pe langa acestea in timpul fabricatiei se maipot dezvolta in branza si microorganisme non-starter provenite din lapte, sau din contaminari intimpul prelucrarii.Microflora starter este formata cu precadere din bacterii ce produc fermentatia lactica, procesanarob de metabolizare a glucidelor sub actiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor,

avand ca produs principal acidul lactic.Microorganismele din cultura secundara nu contribuie la formarea acidului lactic,dar in general joaca un rol important in timpul maturarii.Bacteriile lactice intalnite frecvent in culturile starter sunt: Lactoccocus lactis,Streptococcus therpmophillus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii,utilizate fie individual, fie in combinatii in functie de sortimentul de branza.O serie de microorganisme cunoscute sub denumirea de microflora secundara,pot fi adaugate alaturi de cultura starter. Din aceasta categorie fac parteporpionibacterii, brevibacterii si specii de mucegaiuri (Penicillim). Acestemicroorganisme sunt utilizate impreuna cu bacteriile lactice si sunt specifice unuianumit sortiment de branzeturi (de exemplu in branza Elvetiana gaurile specificese datoraeza propionibacteriilor, culoarea galbena si aroma tipica branzei Brickse datoreaza lui Brevibacterium linens).

Producerea de acid lactic de catre microflora starter in timpul fabricariibranzeturilor determina o reducere a pH-ului laptelui care combinata cutratamentul termic si amestecarea promoveaza sinereza prin expulzarea zeruluidin cas (Walstra, 1993) contribuind semnificativ la unul din procesele de baza alefabricarii branzeturilor.Maturarea branzeturilor este un proces complex care implica un numar de reactiibiochimice la care iau parte si concentratii mari de microorganisme prezente inbranza (Cogan, 2000). Atat continutul de acid lactic cat si procentul detransformare al lactozei in acid lactic reprezinta doi indicatori foarte importantipentru evaluarea calitatii branzeturilor. In timpul maturarii, culturile de bacteriisufera procesul de autoliza, eliberand enzime intracelulare in reteaua de branza,iar aceste enzime vor continua sa actioneze asupra componentilor casului,dezvoltand aroma si producand modificarile dorite de textura in timpul maturarii.

Bacteriile lactice (BL)Bacteriile producatoare de acid lactic (BL) indeplinesc mai multe functii:

Τ produc acid lactic si contribuie la coagularea laptelui;

Τ dau taria coagulului si influenteaza formarea branzeturilor;



Τ dezvoltarea acidului determina prezenta cantitatilor reziduale decoagulant, care afecteaza maturarea; mai mult acid in cas inseamna maimult coagulant rezidual legat

Τ nivelul formarii acidului influenteaza disocierea fosfatului de calciucoloidal, care la randul sau influenteaza proteoliza in timpul maturarii si

determina proprietatile reologice ale branzeturilor;Τ formarea acidului si producerea altor substante antimicrobiene

controleaza cresterea bacteriilor patogene in branzeturi;

Τ formarea acidului lactic contribuie la proteoliza si la formarea aromei inbranza;

Τ cresterea bacteriilor producatoare de acid lactic produce scadereapotentialului redox (Eh), necesar pentru producerea si reducereacompusilor cu sulf (metantiolul), care contribuie la formarea aromeibranzei Cheddar.

Caractere morfologice: bacteriile lactice prezinta heterogenitate morfologica.Principalele forme sunt derivate de la forma coccus si se gasesc sub forma de

streptococi (g. Lactococcus si g. Streptococcus), de diplococi (g. Leuconostoc ),de tetrade (g. Pediococcus), iar numeroase bacterii lactice se prezinta sub formade bastonase (g. Lactobacillus).Caractere fiziologice: BL folosesc ca sursa de carbon si energie pentozele(riboza, xiloza, arabinoza), hexozele (glucoza, galactoza) si diglucidele (lactoza,maltoza, zaharoza). Dintre acizi, acidul malic poate fi transformat in acid lactic,iar acidul citric in acetoina si diacetil.

Acidul lactic nu poate fi folosit de BL si acumularea sa prin fermentare conducela inhibarea inmultirii si incetinirea vitezei de fermentatie. Ca surse de azot BLfolosesc aminoacizii, peptidele si amidele. Echipamentul enzimatic intracelular proteolitic al BL contribuie semnificativ la maturare dupa autoliza celulelor

microbiene.BL necesita ca factori de crestere vitaminele B1, B6, biotina, acidul para-aminobenzoic, acidul folic si acidul pantotenic.

Acidotoleranta BL este exprimata de domeniul de pH in care are loc cresterea4,3-4,8 pentru lactococi si 3,8-4,4 pentru lactobacili.In raport cu oxigenul din aer bacteriile lactice subt anaerobe sau facultativanaerobe, iar in ceea ce priveste domeniul de temperatura BL sunt adaptate sacreasca intr-un domeniu larg de temperaturi (0-55 0C) cu valori optime:mezofiledomeniu de crestere 15-40 0C

- t opt 25-30 0C pentru streptobacterii

- t opt 30-35 0C pentru lactococitermofiledomeniu de crestere 30-50 0C

- t opt 45-50 0C pentru lactobacteriiCulturile mezofile au temperatura optima de crestere in jurul valorii de 30 0C sisunt utilizate in branzeturi care nu sunt tratate la mai mult de 400C.Caracteristicile culturilor mezofile starter sunt prezentate in tabelul 1.



Branzeturile care se prelucreaza la temperaturi de 50-56oC utilizeaza culturitermofile.Lactococcus lactis ssp. lactis

O parte din tulpinile izolate din laptele crud produc o bacteriocina denumitanizina. Nizina cunoscuta si numele de lantibiotic (contine lantionina Ala-S-Ala si

β-metilantionina) este termostabila si este solubila la pH scazut, ceea ce reducepotentialul sau de utilizare. Producerea sa este legata de pretenta unei plasmidedin gama de la 28 la 30 MDa. Plasmida este responsabila pentru abilitatea de afermenta zaharoza si rezistenta nizinei.Nizina este activa impotriva sporilor de Clostridium botulinum si a altor catevabacterii G (+) cum sunt Bacillus, Listeria si Streptococcus. Multe tulpini deLactococcus lactis ssp. lactis din laptele crud produc un miros “amar”. Acestetulpini metabolizeaza leucina si produc 3-metilbutanolul, care este un compusnedorit si o cantitate de 0,5 ppm este suficienta pentru a produce defectul deamareala.Lactococcus lactis ssp. cremoris

Originea acestei bacterii nu este cunoscuta si ea nu a putu fi izolata din laptelecrud. O serie de tulpini produc o gama restransa de bacteriocine, denumitediplocine. Aceste microorganisme nu cresc la 400C si sunt mult mai sensibile laprezenta sarii. Multe culturi comerciale contin predominant tulpini din aceastaspecie.

Amestecuri de lactococi sunt utilizate drept culturi starter pentru ranza Cheddar,Colby si Cottage, atunci cand producerea gazului si a texturii deschise nu suntde dorit.Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis este utilizata in combinatie cualte culturi starter pentru producerea branzeturilor cu mucegai in pasta, maturate:Edam, Gouda si branzeturile crema. Aceste microorganisme sunt capabile sa

produca CO2, diacetil, acetoina si acetati din citratii prezenti in lapte.Tabelul 1. Proprietatile culturilor starter mezofile

Denumireveche

Streptococcu s lactis

Streptococcu s cremoris

Streptococcu s

diacetylactis

Leuconostoc lactis

Leuconostoccremoris

Denumirenoua

Lactococcus

lactis ssp.

lactis

Lactococcus

lactis ssp.

cremoris

Lactococcus

lactis ssp.

lactis bvar.

diacetylactis

Leuconosto

c lactis

Leuconostoc

mesenteroide

s ssp.

cremoris

To optimaCrestere la

10o

CCrestere la40oC

Crestere la

45oC

Supravietuir

e la72oC/15sec

30oC+

+-

-

+

+

-

+

-

30oC+

--

-

+

+

-

-

-

30oC+

+-

-

+

+

-

+/-

+

30oC+

+-

-

-

-

-

-

+

30oC+

--

-

-

-

-

-

+



Crestere in

NaCl 2%

Crestere in

NaCl 4%Crestere in

NaCl 6,5%Producerede NH3 din

arginina

Metabolizar e citratului

ProducereCO2

Izomer al

acidului

lactic produs

% acid lacticin lapteProducere

de

bacteriocine

Lactoza

Glucoza

Galactoza

-

L

0,8

Nizinaa

+

++

-

L

0,8

Diplocinaa

+

++

+

L

0,4-0,8

-

+

++

+

D

0,2

-

+

++

+

D

0,2

-

+w

++

a- nu toate tulpinile produc bacteriocine; + pozitive; -negativeGenul Leuconostoc include bacterii heterofermentative sub forma de coci,diplococi, care produc prin fermentatie: acid lactic D(-), alcool etilic si CO2.

Bacteriile din g. Leuconostoc se gasesc in culturile starter si sunt considerateimportante in formarea aromei, datorita abilitatii de a descompune citratii siformarea diacetilului din piruvatul produs. Leuconostocii sunt mai putin actividecat Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis, atacand citratul doar inmediu acid. Leuconostoc reprezinta max. 5-10% din cultura starter. Atunci candin cultura de lactococi se adauga Leuconostoc pentru producerea aromei, culturamixta este de tip B sau L, iar cand componentul de aroma este Lactococcuslactis ssp. lactis var. diacetylactis cultura este de tip D. Culturile de tip BD sau DLcontin atat Leuconostoc cat si Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis.Lactococii fara aroma sunt N sau O. Leuconostoc ssp. se diferentiaza de altebacterii starter prin capacitatea de a metaboliza zaharurile pe calea

fosfocetolazei si prin capacitatea redusa de a creste in lapte. Aceasta sedatoreaza, probabil lipsei unui sistem de proteinaze, care sa degradezeproteinele laptelui si sa permita cresterea. Aceasta problema poate fi depasitaprin adaugarea a 0,3 (w/v) extract de drojdie ca stimulent, iar daca lactoza nupoate fi catabolizata, se poate adauga glucoza sa fie necesara (1% w/v).Streptococcus salivarius ssp. thermophillus -microorganisme G(+), anaerobe,sub forma de streptococi care sunt utilizate la fabricarea iaurtului si a branzeiMozzarella. Streptococcus nu creste la temperaturi de 10oC dar se dezvolta bine



intre 40-45oC, iar majoritatea tulpinilor poate supravietui la 60oC timp de 30minute. Bacteria este foarte sensibila la prezenta antibioticelor. Penicilina (0,05UI/ml) poate interfera si bloca procesul de acidifiere a laptelui. Streptococcussalivarius ssp. thermophillus creste foarte bine in lapte si fermenteaza lactoza sizaharoza. O concentratie de 2% NaCl poate preveni dezvoltarea multor tulpini.

Acesti streptococi poseda un sistem proteolitic slab, fiind adesea combinati culactobacilii proteolitici in cultura starter. Majoritatea streptococilor cresc mai rapidin lapte decat lactobacilii si produc acid mai repede. Tulpinile de streptocociposeda β-galactozidaza si utilizeaza numai galactoza din lactoza, lasand glucozain mediu. Un studiu recent care a urmarit activitatea proteolitica a tulpinilor deStreptococcus salivarius ssp. thermophillus si a noua tulpini de Lactobacillusdelbrueckii ssp. bulgaricus a aratat ca lactobacilii au prezentat activitateproteolitica intensa (14,6-61,0 μg tirozina/ml lapte) si Streptococcus salivariusssp. thermophillus a prezentat o activitate proteolitica mai redusa (2,4-14,8 μgtirozina/ml lapte).Culturile in amestec, cu exceptia unei singure combinatii, au eliberat mai multa

tirozina (92,6-419,9 μg tirozina/ml lapte) decat suma cantitatilor produse deculturile individuale. Amestecurile de culturi produc de asemenea mai mult acid,scazand pH-ul. Din 81 de combinatii ale culturilor de Streptococcus salivariusssp. thermophillus si Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus numai ocombinatie s-a dovedit mai putin activa in ceea ce priveste proteoliza (92,6 μgtirozina/ml lapte) decat cantitatea de tirozina produsa de Lactobacillusdelbrueckii ssp. bulgaricus (125 μg tirozina/ml lapte).Lactobacillus -microorganisme G(+), catalazo-negative, anaerobe siacidotolerante (tabelul 2). Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillusdelbrueckii ssp. lactis sunt microorganisme homofermentative termofile careproduc numai acid lactic si cantitati minore de substante de aroma si sunt

utilizate in combinatie cu Streptococcus salivarius ssp. thermophillus drept culturistarter pentru branzeturile Elvetiene, Parmesan si Mozzarella. Lactobacillushelveticus si Lb. acidophillus sunt microorganisme homofermentative mezofilecare prezinta topt = 30-35 0C.In genul Lactobacillus exita si tulpini de lactobacili heterofermentativi mezofilicare produc acid lactic, acid acetic, diacetil si CO2: Lb. plantarum, Lb. casei siheterofermentativi termofili: Lb. brevis, Lb. fermenti , Lb. bifidum s.a.Proprietatile tulpinilor sunt prezentate in tabelul 2. Premi s.a., in 1972 au izolattulpini si au gasit ca β-galactozidaza este enzima dominanta in Lactobacillushelveticus, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis si Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus. Lactobacillus casei nu poseda activitate β-galactozidazica. Acest tip

de fermentatie influenteaza calitatea branzeturilor. Culturile cu activitate β-galactozidazica utilizeaza jumatate din cantitatea de lactoza, reprezentata deglucoza si elibereaza galactoza in mediu. Un exces de galactoza in branzaMozzarella poate cauza brunificarea branzei pentru pizza, iar galactoza poateservi ca sursa de energie pentru fermentatii nedorite produse demicroorganismele rezidente din branzeturi. Se recomanda ca Lb. helveticus, carepoate fermenta galactoza sa fie utilizat impreuna cu Streptococcus salivariusssp. thermophillus.



O relatie de simbioza exista intre Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus siStreptococcus salivarius ssp. thermophillus. Intr-o cultura in amestec, crestereaasociata a bastonaselor si a cocilor duce la o producere mai mare de acid si odezvoltare a aromei mai buna decat prin utilizarea culturilor singulare.S-a stabilit ca numerosi aminoacizi eliberati de proteazele din Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus prin actiunea asupra cazeinei stimuleaza cresterea luiStreptococcus salivarius ssp. thermophillus. In schimb Streptococcus salivariusssp. thermophillus produce CO2 si acid formic care stimuleaza cresterea luiLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. In timpul primei parti a incubarii,Streptococcus salivarius ssp. thermophillus creste repede, indeparteaza excesulde oxigen si produce stimulentii amintiti. Ulterior, cresterea lui Streptococcussalivarius ssp. thermophillus incetineste datorita acumularii acidului lactic, iar cresterea aciditatii permite dezvoltarea lui Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus, care este mult mai acidotolerant (fig. 1).In branza Emmental densitatea maxima a streptococilor lactici 109 ufc/g laperiferie si 108 ufc/g in mijloc este atinsa dupa aproximativ 3 ore de presare.

Acidul lactic si formic produs de streptococi stimuleaza stimuleaza cresterealactobacililor pana la atingerea densitatii de aprox. 109 ufc/g dupa 10-20 ore depresare. Populatia de lactobacili si streptococi scade apoi in timpul presarii sisararii. Pentru utilizarea unui inocul cu 1:1 raportul dintre coci si bastonase,cantitatea de inocul, timpul si temperatura de incubare trebuie controlate si tanculstarter trebuie racit rapid. Multe tulpini de Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus continua sa produca acid la temperatura ridicata.Numerosi lactobacili au fost identificati in timpul maturarii branzeturilor.Lactobacilii ocupa o nisa specifica in maturarea branzeturilor. Lactobacilii au fostizolati din branzeturi si supusi identificarii, iar cele mai raspandite sunt subspeciigasite au fost Lactobacillus casei, Lb. fermentum, Lb. brevis.

Fig. 1 Schema de metabolizare a lactozei de cultura starter

Prezenta microorganismelor heterofermentative - Lb. fermentum, Lb. brevis (>106 ufc/g) a determinat defecte de textura la branza Cheddar. Adaugarealactobacililor homofermentativi determina imbunatatirea calitatii branzeturilor inspecial prin accelerarea proceselor de maturare.



Tabelul 2. Caracteristicile lactobacililor utilizati la fabricarea branzeturilor

bacterii %acid

lacticin

lapte

Izomer al

aciduluilactic

Crestere Sensibilitatela sare

Glu Gal Lac NH3 dinarginina

Bacteriocine15oC 45oC 50oC

Lactobacillus delbrueckii ssp.

bulgaricus Lactobacillus delbrueckii ssp.lactis

Lactobacillus helveticus

Lactobacillus casei ssp. casei

Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum

Lactobacillus casei ssp.

rhamnosus Lactobacillus platarum

Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum A

Lactobacillus brevis A

Lactobacillus buchneri A

Lactobacillus bifermentnas A, B

1,8

1,83,0

0,8

D

DDL

LDL

LDL

DL

DL

DL

DL

DL

-

--

++

++

+

C

+

+

+

+

++

--

+-

-

+

-

-

-

+

++

--

--

-

+

+

+

-

<2%

<2%<2%

8%+a, 10%-a

6%+a, 8%-a

8%+a, 10%-a

6%+a, 8%-a

8%+a, 10%-a

4%+a, 6%-a

+

++

++

++

+

+

+

+

+

-

-+

++

++

+

+

+/-

+/-

+/-

+

++

+/-+

++

+/-

+

+/-

+/-

-

+/-

--

--

--

-

+

+

+

-

+

++

++

+

a – necunoscuta /creste in mediu cu sare/4 zile la 35oC;

+ creste;

- nu creste;

A – produce gaz in branzeturi; B – fermentatie lactica in branzeturi cu producere de CO2 , etanol si acid acetic;

C – poate creste in branzeturi la 15oC.



Cultura secundaraPropionibacterium – bacterii G(+), catalazo-pozitive, anaerobe/facultativ aerobe,nesporulate. Patru specii sunt asociate cu branza Elvetiana: Propionibacteriumfreundenreichii, P. jensenii, P. thoenii si P. acidipropionici. Fermentarea conducela producerea de acid propionic, acid acetic si CO2. Aceste microorganisme pot

tolera temperaturi de 520

C.

3 C6H12O6 → 2 CH3-COOH + 4 CH3-CH2-COOH + 2 CO2 + 2 H2O P. thoenii si si P. acidipropionici pot produce pigmentarea nedorita in rosu, marosi galben-portocaliu. Cresterea propionibacteriilor este indusa atunci cand branzaeste transferata intr-o camera calda ( 20-25 0C si 80-85 % umiditate relativa). Aicidensitatea celulelor bacteriene a propionibacteriilor ajunge la 109 ufc/g in mijloculbranzei dupa 3 saptamani.Pediococcus – sunt asociati cu ingredientele si provin din plante. Sunt bacteriiG(+), catalazo-negative sau slab pozitive, cresc in 6,5% NaCl, 45oC si producamoniac din arginina. Pot fi uneori confundati cu micrococii datorita formei

asemanatoare. Pediococii nu sunt utilizati in culturi lactice desi ei se pot inmulti inbranza maturata si pot fermenta lactoza reziduala pentru o perioada lunga detimp. Doar doua specii: P. pentosaceus si P. acidilactici au fost gasite in produselactate, dar nici una nu fermenteaza lactoza.Pediococii au fost identificati prima data in Noua Zeelanda si mai tirziu in Angliasi s-a considerat ca imbunatatesc aroma. Ei produc D- si L-lactat din lactoza siracemizeaza L-lactatul. Efectul lor este neglijabil pana la 106-107 ufc/g, iar cresterea lor in branzeturi depinde de temperatura.Pediococii apar in branza Cheddar si exista un interes crescut fata de activitateaacestora deoarece unele tulpini au activitate antimicrobiana fata de Listeriamonocytogenes, Staphylococcus aureus si Clostridium perfrigens. Intr-un studiu

a 49 tulpini de P. pentosaceus in toate tulpinile selectionate au fost gasiteaminopeptidaze ale valinei si leucinei, catava lipaze si esteraze, α-glucozidaza,β-glucozidaza si N-acetil-β-glucozamidaze. Bhowmik si Marth, intr-un studiu maiamanuntit au gasit aminopeptidaze intracelulare, proteaze, dipeptidaze sidipeptilaminopeptidaze in 6 tulpini de P. pentosaceus si 2 de P. acidilactici. S-aobservat de asemenea ca αS1- si β-cazeinele purificate din laptele degresat sunthidrolizate de enzimele provenite din aceste microorganisme. Autorii nu au pututdetecta insa activitate esterazica in toate tulpinile de P. acidilactici studiate.Utilizarea lactozei ca sursa de energie este redusa pentru acestemicroorganisme si variaza de la tulpina la tulpina. Recent s-a demonstrat catoate tulpinile de de P. pentosaceus si P. acidilactici poseda β-galactozidaza

intracelulara, care este mai mare in celulele crescute in prezenta lactozei decatcele in glucoza, indicand natura inductiva a sintezei β-galactozidazei.Sinteza enzimei a fost indusa de prezenta in mediu a galactozei si lactozei.Glucoza nu induce sinteza enzimei in tulpina de P. pentosaceus ATCC 25745.Desi aceste microorganisme sunt considerate homolactice, deoarece produclactat, producerea etanolului si acetatului a fost observata atunci cand P.

pentosaceus PC 399 a fost cultivata pe medii cu diferite hexoze si pentoze.



Proportia de lactat si acetat a fost mai mare cu cat cantitatea de riboza a crescutin substrat.

Culturi starter

In concluzie principala functie a culturilor starter este aceea de a produce acidlactic in timpul procesului de fermentare. Culturile starter contribuie, de

asemenea la maturarea branzeturilor, unde enzimele lor sunt implicate inproteoliza si in transformarea aminoacizilor in compusi de aroma (Wallace,1997).Deoarece definitia culturilor lactice starter este inca o problema controversata s-apropus ca denumirea de cultura starter sa se aplice izolatelor care producsuficient acid pentru a reduce pH-ul laptelui la mai putin de 5,3 in 6h la 30-37 oC.Culturile starter sunt fie adaugate in mod deliberat la inceputul prelucrarii sau potcontamina in mod natural laptele, cum este cazul mai multor sortimenteartizanale obtinute din lapte crud. Ele cresc in timpul prelucrarii, atingand oconcentratie de 108ufc/g, in cateva ore de la inceperea prelucrarii.Se utilizeaza:

culturi starter mezofile – pentru branza Cheddar, Gouda, Edam, Brie siCamembert;

culturi starter termofile (50-55oC) – pentru branzeturile tratare termic,branzeturile cu pasta tare ca: Emmental, Gruyere, Parmesan si Grana.

Principalele culturi folosite la fabricarea unor sortimente de branzeturi romanestisunt prezentate in tabelul 3. Bacteriile lactice cel mai des folosite fac parte dingenurile: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc siEnterococcus.

Atat culturile mezofile cat si cele termofile pot fi impartite in culturi mixte(nedefinite), culturi in care un numar de tulpini este necunoscut si culturi definitecare sunt formate dintr-un numar cunoscut de tulpini.

Tulpinile nedefinite sau mixte de culturi mezofile sunt formate in special dinLactococcus lactis ssp. cremoris si Lactococcus lactis ssp. lactis, care potcontine si tulpini ce metabolizeaza citratul, pentru formarea aromei. Un studiu a113 tulpini izolate dintr-o cultura mixta utilizata in mod curent a aratat ca o seriede tulpini au un profil diferit al plasmidului, capacitate diferita de a produce acid sirezistenta diferita la fagi, confirmand faptul ca reprezinta amestecuri (Lodics siSteenson, 1993). Bacteriile termofile pot fi formate din tulpini singulare saumultiple: Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp.lactis sau Lactobacillus helveticus.Culturile nedefinite sau mixte de bacterii lactice termofile se utilizeaza pe scararedusa pentru obtinerea branzeturilor Gruyere, Emmental si Grana din Franta,

Elvetia si Italia. Aceste culturi sunt produse de obicei prin incubarea zeruluiprodus in ziua precedenta de productie la 40-45oC. Flora este formata dinStreptococcus termophillus, enterococi si bacterii din genul Leuconostoc si maipot exista specii de lactobacili: Lactobacillus helveticus, Lactobacillusdelbrueckii, Lactobacillus acidophillus si Lactobacillus fermentum. O culturastarter cultivata pe zer, continand BL termofile este utilizata la fabricareaParmesanului, sortiment de branza tare din nordul Italiei.



Tabelul 3. BL folosite pentru diferite tipuri de branzeturi

Culturi utilizate Tipuri de branzeturi

Lactococcus lactis ssp. lactisLactococcus lactis ssp. lactis var.diacetylactis

Branza proaspata de vaci

Lactococcus lactis ssp. lactisLactobacillus casei Telemea, cas

Lactococcus lactis ssp. lactisLactococcus lactis ssp. cremorisLactobacillus casei

Branzeturi albe in saramuratip fetta, branzeturi frimantate:burduf, Moldova

Lactococcus lactis ssp. lactisStreptococcus thermophillusLactobacillus casei

Branzeturi cu pasta oparita

Lactococcus lactis ssp. lactisStreptococcus lactis ssp. cremorisLactococcus lactis ssp. lactis var.

diacetylactis

Branzeturi semitari tip Trapist,Olanda, Edam

Streptococcus salivarius ssp. thermophillusLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricusLactobacillus delbrueckii ssp. lactisLactobacillus helveticusPropionibacterium

Branzeturi tari: svaiter

Lactococcus lactis ssp. lactisLactococcus lactis ssp. lactis var.diacetylactisLactococcus lactis ssp. cremorisLactobacillus helveticus

Lactobacillus casei

Tip Cheddar

Un studiu care a urmarit caracterizarea a 4379 izolate bacteriene din 35 desortimente obtinute in mod traditional in Europa a aratat ca: 38% din izolate erauLactococcus, 17% Entorococcus, 14% Streptococcus termophillus, 12%Lactobacillus mezofili, 10% Leuconostoc, 9% Lactobacillus termofili.Din bacteriile genului Leuconostoc ssp si izolatele de Lactobacillus mezofili doar 8% si respectiv 2% produc suficient acid pentru a reduce pH-ul laptelui la valorimai mici de 5,3 in 6 ore si la 30oC.Spre deosebire de acestea 53%, 32% si 13% din tulpinile de Streptococcus,

Lactobacillus termophillus si izolatele de Enterococcus reduc pH-ul la valoarea5,3. Acest lucru indica ca majoritatea izolatelor bacteriene mezofile din

branzeturile fabricate prin procedee traditionale nu produc suficient acid lacticatunci cand sunt testate individual pentru fabricarea branzeturilor si deci nu pot fidenumite bacterii “starter”.Multe izolate termofile erau au fost gasite bune producatoare de acid lactic, decipotrivite pentru a fi denumite culturi starter. Enterococii prezenti ca parte naturalaa microflorei unor produse traditionale au provocat multe dezbateri, deoareceexista dovezi ca pot fi asociati cu infectii clinice ale pacientilor cu sistemulimunologic compromis, sau pacienti aflati sub tratament (Boyce, 1992).



In ciuda acestor probleme, enterococii au fost gasiti in concentratii mari inbranzeturile din zona mediteraneana si se considera ca au un rol pozitiv indezvoltarea aromei.



Morfologia celulei, izomerii, rata de acid lactic produs si capacitatea de a metaboliza citratul, capacitatea de a creste la10oC, 40 si 45oC, utilizarea glucozei, galactozei si lactozei sunt prezentate in tabelul 4.Tabelul 4. Taxonomia si caracteristicile bacteriilor lactice

Microorganisme

Denumireveche

Forma Reducer eaturnesolului in

lapteinaintedecoagular e

%acidlacticprod

us inlapte

Izomer ullactatprodus

Metabolizare citrat

NH3

dinarginina

Crestere Fementeaza10o

C40o

C45o

CGlu

Gal

Lac



Streptococc ustermophillusLactobacillushelveticusLactobacillusdelbrueckii

ssp.bulgaricusLactococcuslactisssp.cremorisLactococcuslactisssp. lactisLactobacillusdelbrueckii ssp. lactisLeuconostoc lactis

Leuconostoc mesenteroid es ssp.cremoris

NeschimbataNeschimbataLb.bulgaricus Str.

cremorisStr. lactisLb. lactis NeschimbataLeuconost oc cremoris

streptocociBastonaseBastonaseCoci

CociBastonaseCocidiplococi

---++--

-

0,62,01,80,80,81,8<0,5

0,2

LDLDLLDD

D

----+/--+

+

----+-/+-

-

---++-+

+

+++--+-

-

+++--+-

-

+++++++

+

-+-++-/++

+

+++++++

+

+/- - majoritatea tulpinilor pozitive;-/+ - majoritatea tulpinilor negative.



Influenta CS asupra calitatii branzeturilor Obtinerea branzei Cheddar omogena din punct de vedere calitativ necesita ofermentare uniforma a lactozei si proteoliza adecvata. La o rata mare, impreunaaceste procese depind de temperatura si de concentratia de sare, care trebuiesa fie distribuita cat mai uniform posibil. Rata de fermentare a lactozei de catre

culturile starter din branza Cheddar depinde de raportul sare/umiditate in branzaproaspata (Thomas, 1985). La niveluri scazute S/U, toata lactoza (4%) a fostutilizata, in 8 zile, in timp ce metabolismul a fost stopat la 6% S/U, astfel incatconcentratia lactozei in branza a ramas foarte ridicata pentru mai multesaptamani dupa fabricare.Lactoza reziduala a fost utilizata de BLNS, dar nu au existat corelatii puterniceintre lactoza reziduala si cresterea BLNS, indicand faptul ca ele utilizeaza altesurse de energie in afara de lactoza si/sau alti factori de crestere. Conform luiMarley si Lawrance (1972), tulpinile de Lactococcus lactis ssp. lactis ausupravietuit mai bine decat Lactococcus lactis ssp. cremoris, in prezenta sarii inconcentratie de 4-5% NaCl.

Unul dintre rolurile de baza ale bacteriilor lactice starter este de a furniza unmediu adecvat, in acord cu potentialul redox, pH-ul si continutul de umiditate dinbranza, care sa permita o activitate enzimatica adecvata pentru enzimele dincheag si cultura starter si cresterea microflorei secundare (daca este necesar).Temperatura in timpul fabricarii si raportul S/U trebuie controlate pentru a seasigura ca o activitate corespunzatoare a culturilor starter este suficienta pentrua atingerea valorii de pH ceruta in timpul unei zile de prelucrare.Cultura starter are o contributie semnificativa numai pentru biomasa microbianaa BL din branza tanara. Aceasta biomasa formata din cultura starter relativ marereprezinta un potential biocatalitic considerabil pentru reactiile de maturare alebranzeturilor, care pot fi modelate prin autoliza celulelor bacteriilor starter.

Activitatea autolitica a lactococilor se datoreaza unei muraminidaze (Mou,Sullivan, 1976, Niskasaari, 1989). Autoliza celulelor starter poate fi influentata de concentratia de sare, de valorilesarii asociate cu umiditatea in branza (Bie si Sjostrom, 1975) si de variatiileconditiilor de fabricare, cum ar fi temperatura ridicata de prelucrare. Ar trebui camicroorganismele starter sa atinga concentratii mari si sa supravietuiasca preamult pentru ca defecte de aroma precum aparitia gustului amar sa se produca.Intr-un studiu realizat de Wilkinson, Guinee, O`Callaghan si Fox (1994), in careau fost monitorizate viabilitatea culturilor starter si eliberarea enzimelor starter intracelulare, s-a concluzionat ca tulpinile de Lactococcus lactis ssp. cremoris auavut modele diferite de autoliza.

Concentratii ridicate de aminoacizi liberi au fost produse de majoritatea tulpinilor autolitice (AM2) comparativ cu tulpinile mai putin autolitice (HP). Crow s.a.(1995a) au stabilit ca celulele starter intacte au fermentat lactoza, au consumatoxigenul si probabil au initiat un numar de reactii de formare a compusilor dearoma, in timp ce procesele peptidolitice au fost accelerate de celulele autolizate.In casul tanar, nivelul celulelor moarte este foarte important pentru maturareabranzei Cheddar (Crow, Martley, 1995). Produsii finali ai peptidolizei-



aminoacizii- se acumuleaza mai repede daca se formeaza prin autoliza culturilor starter si sunt precursori majori ai compusilor de aroma (Urbach, 1995).In branza Cheddar celulele de Lactobacillus helveticus autolizeaza foarte repedesi formeaza niveluri mari de aminoacizi, care contribuie semnificativ laimbunatatirea aromei.

Microflora non-starter Microflora non-starter sunt culturi mezofile de lactococi si pediococi, carereprezinta o parte importanta a florei microbiene in majoritatea branzeturilor intimpul maturarii. Ele nu fac parte din microflora normala starter si de regula nucresc in bune conditii in lapte (Cogan, s.a, 1997) si nu contribuie la producereaacidului in vanele de coagulare.Lactobacilii se impart in mod traditional in trei grupe:

(a)obligatoriu homofermentativi;(b) facultativ heterofermentativi;(c)obligatoriu heterofermentativi.

Lactobacilii care fac parte din BLNS (bacterii lactice non-starter) si sunt intalniti in

mod obisnuit in branza fac parte din grupul II – facultativ heterofermentative si deaceea sunt denumiti LFH. Multe specii de lactobacili mezofile au fost izolate dinbranzeturi, dar cel mai frecvent se intalnesc: Lactobacillus casei, Lb. paracasei,Lb. plantarum, Lb. rhamnosus si Lb. curvatus (Jordan si Cogan, 1993).Pediococcus acidilactici si Pediococcus pentosaceus sunt cei mai intalnitipediococi din branzeturi.

Influenta BLNS asupra calitatii branzeturilor BLNS in branzeturile semitari maturate (Gouda si din Norvegia), fabricate dinlapte pasteurizat sunt dominate de lactobacilii mezofili, predominanti fiindLactobacillus casei, Lb. paracasei si Lb. rhamnosus. BLNS pentru branzeturiledin Grecia sunt dominate de Lb. plantarum. In branzeturile Feta si Telemea

47,8% si 65,8% din lactobacilii izolati au fost reprezentati de Lb. plantarum(Tzanetakis, 1992).Lb. plantarum a fost evidentiat in cantitati mari in branza de 2 zile si numarulmicroorganismelor a scazut in timpul maturarii, in timp ce Lb. paracasei prezentinitial in cantitati mici a fost gasit dominant in microflora branzei la sfarsitulmaturarii (Zarate, 1997).Lb. paracasei domina microflora branzei Italiane. Acesta nu a fost depistatimediat dupa fabricare, dar niveluri ridicate (107 ufc/g) s-au gasit in primele lunide maturare si au ramas ridicate pe o durata de 120 zile.Durata mare de maturare este o caracteristica a branzeturilor ParmigianoReggiano. Evolutia microflorei bacteriene a fost studiata in 24 luni de la

maturare.Lb. paracasei, Lb. rhamnosus si Pediococcus acidilactici au fost gasitepredominant ca BLNS in banzeturile italiene. In timpul maturarii, concentratia ascazut de la aproximativ 108 ufc/g (la 5 luni de la maturare) la aproximativ 104

ufc/g la 24 luni de maturare (Coppola, 1997).Branzeturile Elvetiene (Emmental, Gruyere) pot fi fabricate din lapte crud,termizat sau pasteurizat, iar concentratia BLNS este de aproximativ 106 ufc/g.



Populatia microbiana initiala este formata din Lb. paracasei, Lb. plantarum si Lb.brevis, in timp ce in branza maturata Lb. paracasei devine dominant in BLNS.Branza Cheddar din Marea Britanie, dupa 6-9 luni de maturare a cuprins Lb.

paracasei/ Lb. casei, Lb. plantarum –drept sepcii dominante, dar si Lb. curvatus,Lb. brevis, Lb. fermentum, Lb. bifermentas, Lb. buchneri, Lb. parabuchneri, Lb.

farciminis si Lb. kefir (Williams si Banks, 1997).Sursa de energie utilizata de BLNS pentru crestere este de obicei lactoza. BLNSpot transforma izomerul lactat L in izomerul D, dar nu se doreste utilizareaizomerului D ca sursa de energie. Citratul prezent in branza Cheddar tanara(aproximativ 8 mmol/kg) poate reprezenta o potentiala sursa de energie pentruBLNS (Jimeno, 1995). O serie de studii asupra branzei Cheddar au indicat outilizare redusa a citratului in branza (Jordan, Cogan, 1993), deci concentratiimari de BLNS pot fi prezente si in absenta citratului.Factorii care influenteaza cresterea microorganismelor in branza:

UmiditateaCresterea continutului de apa in masa de branza mareste susceptibilitatea la

degradari. Activitatea apei este direct proportionala cu continutul de umiditate dinbranza si invers proportionala cu concentratia de sare si alti compusi cu masamoleculara mica (Esteban,1989). Indicele de activitate al apei aw este un concepttermodinamic definit ca raport intre presiunea vaporilor de apa prezenti in sistem(p ) si presiunea celor din apa pura (p0) la aceeasi temperatura.

In timpul primelor stadii de fabricare a branzei aw este de aproximativ 0,99 ceeace favorizeaza cresterea si activitatea culturilor starter.Dupa scurgere, sarare si in timpul maturarii aw are valori cuprinse intre 0,917-0,988. Aceste valori sunt semnificativ mai scazute decat optimul necesar

bacteriilor lactice. De aceea se poate considera ca aw contribuie la controlulmetabolismului si multiplicarii bacteriilor lactice (Brow,1976).BL (bacteriile lactice) in general au o valoare minima a aw mai mare decat a altor bacterii din branza. Indicele de activitate al apei minim pentru Lactoccocus lactis,Streptococcus therpmophillus, Lactobacillus helveticus si Popionibacteriumfreudenreichii ssp. shermanii este de 0.93;0,98; 0.96 si respectiv 0,96 (Weber,1987).O scadere a aw in timpul maturarii branzeturilor se datoreaza pierderilor de apaprin sarare, hidrolizei proteinelor la peptide si aminoacizi si trigileridelor la glicerolsi acizi grasi, hidroliza fiecarei legaturi peptidice sau esterice necesitand omolecula de apa. La o proteoliza semnificativa in branzeturi, in timpul maturarii

continutul de apa nelegata scade (Cogan 2000).



Tabelul 5. Valoarea minima a aw pentru dezvoltarea patogenilor

Patogeni aw

Aeromonas hydrophila 0,970Bacillus cereus 0,930Campylobacter jejuni 0,990

Clostridium botulinum A, B,E, G 0,94-0,965Escherichia coli 0,935Listeria monocytogenes 0,920Salmonella ssp. 0,940Shigella ssp. 0,960Staphilococcus aureus 0,86-0,91Vibrio parahaemoliticus 0,936Yersinia enterocolitica 0,960

Controlul pierderilor de umiditate se efectueaza prin cresterea umiditatii relativein camera de maturare, sau prin ambalarea branzei in parafina sau materialplastic. Pot exista variatii in valoarea aw pentru diferite zone ale branzei; pentru

branzeturile tari si semitari in saramura valoarea aw creste de la periferie sprecentru.Branza Cheddar este obtinuta prin sarare uscata si ambalata in vid, de aceea nuapar pierderi de umiditate, daca sarea este uniform repatizata in branza.aw influenteaza seminificativ si dezvoltarea bacteriilor patogene inbranzeturi(tabelul 5).

SareaSarea are un efect inhibitor pentru microorganismele din culturile starter siasupra bacteriilor de alterare, concomitent cu reducerea indicelui de activitate alapei. Concentratia ceruta depinde de natura alimentelor, pH si continutul deumiditate, dar in general 10-100 g/kg este o cantitate suficienta. Scaderea

indicelui de activitate al apei apare atunci cand sarea este dizolvata in apa.Relatia dintre concentratia de sare (g/kg branza) si aw este data de Cogan(2000):

Concentratia de sare variaza de la 0,7 la 7 g/100g, corespunzator valorilor pentruaw cuprinse intre 0,95-0,99 (tabelul 5). Multe microorganisme pot creste in acesteconditii. Efectul inhibitor este dat de raportul % S/U – sare dizolvata in umiditateabranzei, mai curand decat de sarea adaugata, sau sararea branzei.NaCl inhiba activitatea enzimelor produse de microoganisme si afecteazasinereza coagului, determinand eliminarea zerului, deci reducerea continutului deapa din branza, cu consecinte asupra activitatii microflorei si a enzimelor.

pH-ul si acizii organicipH-ul optim pentru cresterea majoritatii bacteriilor este situat in jurul valoriineutre, iar cresterea este adeseori incetinita la pH mai mic de 5. Datoritaacumularii acizilor organici, pH-ul branzei dupa prelucrare este cuprins intre 4,5-5,3. La astfel de valori scazute nu supravietuiesc speciile sensibile la aciditateridicata. Inhibitorul real este de fapt forma nedisociata a acizilor organici(Beuchat si Golden, 1989).



Principalii acizi organici gasiti in branza sunt: acidul lactic, acidul acetic sipropionic care au un pKas de 3,08; 4,75 si respectiv 4,87, asadar acidul lactic arecel mai slab iar acidul propionic cel mai puternic efect inhibitor, la aceeasiconcentratie si pH al branzei. Oricum, lactatul in branza este prezent la oconcentratie mult mai mare decat ceilalti doi acizi, cu exceptia branzei Elvetiene

maturate, unde concentratia acidului propionic poate fi mai mare decat a aciduluilactic (Steffen, Rueg, 1993).

Temperatura de maturareMicroorganismele implicate in fabricarea si maturarea branzeturilor sunt mezofilesi termofile, avand temperatura optima de dezvoltare de aproximativ 30o sau42oC. Temperatura la care se realizeaza maturarea branzeturilor este uncompromis intre necesitatea de a promova reactiile de maturare si controlulcresterii microflorei secundare utile cat si nevoia de a preveni propagareapotentialelor bacterii de alterare si patogene. Temperaturi mari de maturarepromoveaza accelerarea maturarii (McSweeny, 1996), dar modifica structura siaroma produsului, deseori in sensul nedorit.

Potentialul redoxPotentialul redox (Eh) este o masura a capacitatii unui sistem chimic/biochimic dea se oxida (de a pierde electroni) sau reduce (accepta electroni). O stare deoxidare sau reducere este indicata de valorile pozitive sau negative alepotentialului, exprimate in mV.Eh-ul laptelui este de aproximativ 150 mV, in timp ce in branzeturi este deaproximativ –250 mV. In timp ce mecanismul reducerii Eh in branza nu a fostcomplet elucidat, se presupune totusi ca este legat de fermentarea acidului lacticde catre culturile starter in timpul cresterii si reducerea unor cantitati mici deoxigen din branza, la apa (Crow, 1995). Ca o consecinta a acestor reactii, ininteriorul branzei exista un sistem in buna masura anaerob, care poate sprijini

cresterea microorganismelor facultativ anaerobe sau anaerobe. In diferite culturimicrobiene, Eh poate varia de la +300 mV pentru microorganismele aerobe lamai putin de –400 mV pentru microorganismele anaerobe (Brown, 1980).Eh-ul branzei este unul din factorii majori pentru determinarea tipului demicroorganism care poate creste in branza. De aceea, microorganisme aerobeca Pseudomonas, Brevibacterium, Bacillus si Micrococcus nu cresc in interiorulbranzeturilor. Aceste bacterii se pot dezvolta doar la suprafata branzeturilor.

Nitratii

Nitratii (NO3-) se adauga in laptele destinat fabricarii branzeturilor sub forma de

KNO3 sau NaNO3, in special in sortimentele Olanda, Edam si Gouda pentru apreveni cresterea lui Clostridium tyrobutyricum, care fermenteaza lactatul la

butirat, H2 si CO2:2 lactat → 1 butirat + 2 CO2 + 2 H2

H2 si CO2 sunt responsabili pentru gaurile mari si lipsa aromei. La acestesortimente de branzeturi, rata migrarii NaCl este relativ lenta si egalizareaconcentratiei de sare in branzeturi poate lua cateva saptamani. In plus, continutulde umiditatea este mare. De aceea, inhibarea cresterii microorganismelor dealterare, precum Clostridium tyrobutyricum este necesara, in principal pentru aatinge echilibrul salin, iar nitratii joaca acest rol.



In timpul maturarii, nitratul se reduce la nitrit (inhibitorul real al cresterii) subactiunea enzimei xantinoxidaza, de origine indigena (Niuwenhoff, 1977). Nitritiinu afecteaza cresterea BL, dar inhiba proprionibacteriile responsabile deformarea ochiurilor de fermentare in branza Emmental, si de aceea nu seutilizeaza pentru controlul lui Clostridium tyrobutyricum, acolo unde este dorita

prezenta golurilor de fermentare. Nitritii pot reactiona cu aminoacizi aromatici dinbranzeturi producand nitrozamine. Majoritatea nitratului adaugat la fabricareabranzeturilor se regaseste in zer sau difuzeaza in saramura. Odata cebranzeturile sunt gata de consum, nivelul nitritului este mult sub nivelul admis (50mg/kg), conform prevederilor pentru branza Olanda.

Cresterea culturilor starter de bacterii in lapteLaptele este un mediu de cultura foarte bun pentru cresterea bacteriilor lactice.De fapt, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus salivarius ssp.thermophillus si Lb. helveticus au laptele ca mediu preferat de crestere siutilizeaza lactoza pentru crestere.Producerea de acid lactic de catre culturile starter depinde chiar de calitatea

laptelui. Cresterea poate fi promovata sau inhibata de anumiti factori careactioneaza in lapte. Abilitatea culturilor starter de a se multiplica in lapte depindepartial de activitatea lor proteolitica.Lactococcus lactis ssp. lactis creste intr-un mediu cu cazeinat, ca unica sursa seazot, in timp ce Lactococcus lactis ssp. cremoris necesita o sursa suplimentarade aminoacizi. Toate bacteriile lactice utilizate in industria laptelui necesita sausunt stimulate de prezenta aminoacizilor. Aminoacizi liberi existenti in lapte nusunt corespunzatori, iar bacteriile lactice utilizeaza proteinazele, peptidazele sisistemele de transport pentru a-si indeplini cerintele lor nutritionale. Concentratiiminime de aminoacizi sunt necesare pentru unele bacterii lactice pentrumaximizarea cresterii. Aminoacizi ca: acidul glutamic, leucina, izoleucina, valina,

arginina, cisteina, prolina, fenilalanina si metionina sunt considerati foarteimportanti pentru nutritia lactococilor.Nu este neobisnuit ca in timpul transferului si a propagarii BL microorganismelesa-si diminueze activitatea si sa fermenteze lactoza mai incet. Aceasta se poatedatora pierderii uneia sau mai multor plasmide care controleaza metabolismullactozei si al proteinelor.

Inhibitori ai bacteriilor starter

Bacteriocinele- Calitatea bacteriologica a laptelui si durata depozitarii inaintede utilizare sunt doua aspecte deosebit de importante. Laptele contineintotdeauna microorganisme care pot creste si utiliza aminoacizii si peptidele dinlapte pentru a produce inhibitori (bacteriocine), activitatea inhibitoare fiind

considerabila si la concentratii foarte mici. Maltick si Hirsch au izolat un inhibitor (nizina) din Lactococcus lactis ssp. lactis, care este foarte eficient impotrivabacteriilor G(+), inclusiv a starterilor, a lactobacililor si a microorganismelor sporulate. Din Lactococcus lactis ssp cremoris a fost izolata diplocina, cu unspectru limitat de activitate.

Lipoliza – In laptele depozitat se pot multiplica microorganisme psihotrofe sidaca se gasesc intr-o proportie mai mare de 106-107 ufc/ml pot produce lipoliza.

Acizii grasi cu C4÷ C12 in lant si acidul sorbic din branzeturi au efect inhibitor



pentru cultura starter. Microorganismele starter acumuleaza acizii grasi liberi lasuprafata celulei si nu ii metabolizeaza. Celulele ramase libere din grupul N allactococilor la pH=4,5 metabolizeaza piruvatul cu formare de acetat (acizivolatili), acetoina si diacetil, CO2. In prezenta acidului oleic, utilizarea piruvatuluia fost maxima la pH=6,5 si complet inhibata la pH= 4,5.

Apa oxigenata - metabolizata de grupa N a lactococilor prin actiuneanicotinamidadenin dinucleotid-oxidaza, care catalizeaza oxidarea NADH inprezenta O2 molecular. Enzima este activata de FAD. O parte din apa oxigenataformata este indepartata de NADH peroxidaza:

NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O2

NADH + H+ + H2O2 NAD+ + 2H2OLaptele este agitat in timpul umplerii vanei si adaugarea culturii starter odata cuadaugarea cheagului la fabricarea branzeturilo conduce la formarea unei cantitatimici de H2O2 in lapte.

Adaugarea unor cantitati mici de H2O2 are un efect negativ asupra dezvoltarii

lactococilor.In lapte, culturile de lactococi si lactobacili produc la randul lor H2O2 in perioadeleinitiale de producere a acidului lactic, urmate de o reducere drastica a acumulariide H2O2 odata cu cresterea cantitatii de acid produsa.

Adaugarea sulfatului feros si a catalazei previne sau reduce acumularea H2O2 sistimuleaza producerea de acid. Adaugarea micrococilor reduce nivelul H2O2 inmediu si stimuleaza producerea de acid.

Sistemul lactoperoxidaza/Tiocianat/ H2O2

H2O2 produsa poate inhiba o serie de tulpini de lactococi si indirect culturileintroduse in lapte, prin oxidarea tiocianatului prezent in lapte intr-un produsinhibitor, reactie catalizata de lactoperoxidaza. Concentratii mici de H2O2

formeaza un complex cu lactoperoxidaza (LP) care stabilizeaza puterea oxidativaa H2O2, catalizand oxidarea tiociantului SCN-, conform reactiei:

H2O2 + SCN- OSCN- + H2O

OSCN- + H2O2 O2SCN- + H2O

O2SCN- + H2O2 O3SCN- + H2OProdusele finale ale oxidarii tiocianatului sunt CO2, NH4

+, SO42-, care sunt inerte,

dar reprezinta produse de oxidare intermediare. OSCN- este inhibitor pentrumicroorganismele G(+), microorganismele starter, coliformi, salmonele si altemicroorganisme G(-). In conditii aerobe OSCN - afecteaza membrana interna aaltor pereti celulari ai microorganismelor.Wright si Tramer au aratat ca o serie de culturi starter sunt inhibate de prezentaperoxidazei din lapte, care poate fi prevenita prin adaugarea cisteinei saugenerarea unor grupe –SH prin incalzire.Tiocianatul a fost indepartat din lapte cu o coloana de schimb ionic si s-a aratatca tulpina Streptococcus cremoris 972, peroxidazo-senzitiva nu a fost inhibata deproducerea de acid lactic la fabricarea branzeturilor. Adaugarea tiocianatului



previne substantial dezvoltarea acidului, similar comportamentului culturilor starter infectate de fagi.Standhouders si Veringa au aratat ca exista o corelatie intre inhibarealactococilor si prevenirea inhibarii streptococilor lactici de cisteina. Ei au explicatca intr-un amestec de H2O2, cisteina si peroxidaza din lapte, cisteina este oxidata

si se comporta ca donor de H+

. Daca cisteina si peroxidaza din lapte suntincubate in absenta H2O2, cisteina si enzima formeaza un compus ireversibil.Daca se adauga apa oxigenata atunci cisteina se comporta ca un inhibitor alenzimei. Ei au presupus ca varianta sensibila la peroxidaza a streptococilor lactici are probabil nevoie neaparat de cisteina libera, dar cisteina a fostcomplexata cu peroxidaza. Peroxidaza din lapte este inhibata de prezentacantitatilor foarte mici de hidrogen sulfurat care este produs in timpul incalziriilaptelui.Susceptibilitatea culturilor lactice starter la lactoperoxidaza/H2O2/tiocianat (LPS)este dependenta de: sensibilitatea tulpinii;

abilitatea tulpinii de a produce H2O2, care activeaza sistemul LPS; prezenta enzimelor nespecifice, de exemplu: xantinoxidaza sau hipoxantin

oxidaza, care produc H2O2.Sistemul inhibitor este labil la caldura si este distrus pinr tratamentul termic allaptelui care contine culturi starter.

Tratamentul termicLaptele este tratat termic pentru a putea fi conservat si pentru a fi sigur inconsum. Intensitatea tratamentului depinde de produsul finit si utilizareaintentionata. Multi specialisti au studiat efectul caldurii asupra activitatii culturiistarter. Este unamim recunoscut ca utilizarea unor culturi diferite determina oactivitate diferita atunci cand aceste culturi au fost inmultite in lapte si a fost

necesara aplicarea unor tratamente termice diferentiate in functie de tipul deculturi.Olson, Gilliland si Speck au observat ca producerea de lactococi a fost mai marein laptele pasteurizat la 71,1o/30 minute urmata de laptele sterilizat la 121,1oC/15minutesi la: 61,6oC/82,2oC si 98,8oC pentru 30 minute. Acele culturi care producacid repede in laptele pasteurizat la 61,6oC/30 minute sau la 71,7oC/15 secundeau fost denumite “culturi pentru temperaturi joase”. Culturile care produc acidrepede in laptele tratat la temperatura inalta au fost denumite “culturi pentrutemperaturi inalte”.

Au fost testate 37 de culturi comerciale, din care 49% au fost clasificate ca fiind“culturi pentru temperaturi joase”, 35% ca fiind “culturi pentru temperaturi inalte”

si 16% au prezentat un comportament nespecific.Pentru culturi termofile: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus siStreptococcus salivarius ssp. thermophillus, a fost studiat efectul tratamentuluitermic a laptelui in regim HTST (80oC/10 minute). Nu s-a observat un efectsemnificativ asupra cresterii lui Streptococcus salivarius ssp. thermophillus dar afost stimulat in crestere Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, efectulcrescand cu severitatea tratamentului termic. La 95oC/10 minute a aparut unefect de stimulare doar la culturile in amestec. Factorul stimulativ a putut fi



inlocuit de acidul formic. Producerea de acid formic de catre Streptococcussalivarius ssp. thermophillus a fost confirmata experimental.

Aglutinarea

Proprietatile inhibitoare ale anticorpilor cu insusiri de aglutinare este minor pentruculturile starter din tancuri, iar pe masura ce tratamentul termic este aplicat sau

formarea coagulului are loc, in timpul fabricarii branzeturilor se distruge aceastacapacitate de inhibare. Oricum, aglutininele sunt importante si impactul negativdin branza Cotttage a fost evidentiat prin formarea unui depozit la parteainferioara a vanei, care a dus in timp la inactivarea culturii.

Antibioticele

Un nivel scazut al antibioticelor in lapte poate incetini activitatea culturilor starter si poate face mai dificila obtinerea branzei.Heap a demonstrat ca in timp, lactococii pot creste si produce acid in lapteledegresat reconstituit, continand diferite cantitati de penicilina. Producerea de acida parut normala, dar activitatea culturii a fost mult mai scazuta (tabelul 6).Tabelul 6. Niveluri critice ale penicilinei in laptele pentru diferite bacterii

Bacterii UI/mlStreptococcus cremorisStreptococcus lactisStreptococi (starter)Streptococcus thermophillusStreptococcus faecalisLactobacillus bulgaricusLactobacillus acidophillusLactobacillus casei Lactobacillus lactisLactobacillus helveticus

Lactobacillus citrovorumProprionibacterium shermanii

0,05-0,100,10-0,300,10,01-0,050,300,3-0,60,3-0,60,3-0,60,25-0,50,25-0,5

0,05-0,100,05-0,10

Sisteme culturale1. Culturile starter necesita conditii bune de pastrare in tancuri, circulatiacorespunzatoare a aerului si un flux de productie adecvat, personal instruit inactivitatea de insamantare, cu sau fara filtrarea zerului.2. Amestecurile de culturi mezofile ce contin microflora nedefinita (Leuconostoc,Lactococcus lactis ssp. diacetylactis) sunt utilizate inca in Europa si SUA. Acesteculturi sunt utilizate fara a fi indeajuns cunoscute, sub forma concentrata siinghetata, si pot cauza probleme.3. Culturi cu bacteriofagi, utilizate in Olanda (bacteriofagi care transporta culturi

starter), denumite si culturi P. Aceste culturi sunt in echilibru cu fagii in mediul lor,iar fagii continuti nu influenteaza activitatea culturii. Cand un fag ataca tulpinadominanta poate apare o usoara diminuare a activitatii culturii, dar activitateaculturii este restabilita datorita prezentei unui numar mare de microorganisme cufagi.Institutul de Cercetari Olandez comercializeaza sub forma de starter P culturiconcentrate si inghetate. Sistemul pare foarte bun, dar atunci cand starterii P



sunt propagati in laborator fara contaminare cu fagi, ei devin sensibili la fagi. Acest comportament este atribuit unui numar mic de tulpini denumite starteri L.4. Culturile DVS sunt utilizate din 1970. Ele sunt suspensii de celule foarteconcentrate (1011ufc/g) a unor tulpini definite impreuna cu agenti crioprotectorica: glicerolulul si lactoza, racite rapid in azot lichid si mentinute la temperaturi de

–196o

C. Pentru transportul la fabrica se utilizeaza containere ambalate in gheatauscata.Culturile DVS sunt alcatuite din 3 sau 4 tulpini definite, propagate impreuna sauseparat.

Avantajele pe care le ofera culturile DVS:

convenabile – elimina necesitatea existentei unor tancuri, laboratoare sisisteme de aer steril. Pot contribui la suplimentarea sistemului conventional,in caz ca acesta nu mai este utilizabil;

culturi de incredere – ofera posibilitatea de standardizare a procedeuluide fabricarea a branzeturilor;

imbunatattirea performantei zilnice – in fiecare zi au aceeasi activitate;

imbunatatirea calitatii branzeturilor .Dezavantaje:

necesita un refrigerator performant, costurile sunt compensate de muncade preparare a culturilor;

datorita cantitatii mici de acid dezvoltate sunt necesare cantitati mai maride coagulanti. Pentru a creste taria casului, vana trebuie adusa la 32-33oC inloc de 30oC.

Motive pentru utilizarea restransa a culturilor DVS:

lipsa unui numar suficient de tulpini cu rezistenta la atacul fagilor;

multe tulpini sunt greu de controlat prin centrifugare;

activitatea culturilor congelate inoculate in vana este redusa in timpul taieriisi incalzirii branzeturilor.Etapele de fabricare trebuie adaptate la nivelul redus de acid produs in faza

umeda si de nivelul ridicat de producere a acidului in faza uscata (cedarizare);

cultura DVS este mai scumpa;

In SUA au fost introduse sisteme automate de masurare a pH-ului culturilor starter si prin multiplicarea culturilor starter pe zer se pot aduce beneficiieconomice importane producatorilor, reducandu-se semnificativ pierderile.

Producerea si propagarea culturilor In mod obisnuit, la obtinerea culturii de productie se trece de la culturacomerciala la cultura mama si la culturi intermediare, pentru a obtine in final

cultura de productie ce va fi inoculata in tanc.Τ Culturi starter sub forma lichida.

Primele procedee de obtinere a culturilor starter utilizau pentru insamantari unlapte praf cu 10-12% grasime, tratat termic la 90oC/45 minute, pentru inactivareabacteriofagilor. Culturile erau livrate in butelii de sticla si utlizate in maxim 72 ore.Ele erau reinsamantate pentru a fi utilizate in fabrica.



Τ Pentru transport pe distante lungi se utilizau culturi sub forma de pulbereamestecate cu lactoza, neutralizate cu CaCO3 si ambalate sub vid. Astfel deculturi necesita numeroase reactivari (1-2% supravietuitori in pulbere).

Τ Culturile congelate si uscate contin 42-80% microorganisme viabile, infunctie de tipul culturii. Aceste culturi cresc lent, avand o perioada lunga de lag.

Pentru a reduce faza de lag se adauga stimulatori inainte de liofilizare, sau insubstartul in care este reactivata cultura starter.

Τ Culturi concentrate au fost comercializate pentru prima data in 1973,eliminandu-se astfel etapa care necesita prepararea culturii mama si a culturilor intermediare. Aceasta metoda a minimizat riscul contaminarii cu bacteriofagi si adeschis drumul culturilor DVS. Laptele este pasteurizat la 90oC/45 minute, dupacare se face o racire la temperatura de inoculare (21-27oC), insamantare sitermostatare la 27o pana cand pH-ul atinge valoarea 4,6. In acest moment ocultura cu 5-8x108ufc/ml prezinta o buna activitate. Daca celulele sunt mentinutela pH=5 pentru o perioada de timp indelungata, activitatea culturii se reduce.Populatia finala de lactococi este marita prin controlul pH-ului la 6-6,5. Cand

cultura a fost propagata in mediu cu 2% triptona, 1% extract de drojdie 2,5%lactoza si 2,5% glucoza la pH constant 6 (mentinut prin adaugare de NaOH),populatia a crescut de 15 ori. La acest pH, rata de crestere si cantitatea totala aufost optime. Cand specii amestecate de tulpini bacteriene, continand speciiformatoare de aroma au fost cultivate pe lapte degresat (9,1% SU), mediu de zer cu triptona la pH constant, producerea de acid lactic (%)/compusi de aroma(diacetil) a fost mai mare la pH 5,9.Nu se recomanda cultivarea la pH sub 5,9-6,1. Cresterea cea mai mare (10 10

ufc/ml)s-a obtinut la 30-32oC/pH 6,0-6,3.

Adaugarea NH4OH in mediu a facilitat cresterea numarului de celule, mai mult

decat NaOH.PropagareaPentru prepararea culturii starter sunt necesare 106-107 ufc/ml.Metode de pregatire a mediului de crestere pentru culturile starter si protejareaculturii de atacul bacteriofagilor:(a) procedeul aseptic;(b) utilizarea unor vase speciale pentru prevenirea contaminarii;(c) utilizarea mediilor inhibitoare pentru fagi;(d) utilizarea culturilor DVS liofilizate.

(a) Procedeul aseptic presupune existenta unei camere separate pentruinceperea insamantarii, clorinarea, sterilizarea si afumarea cu clor a incaperii

inainte de inoculare. Acest procedeu este util, dar nu intotdeauna eficient pentruprevenirea contaminarii.(b) Utilizarea tancurilor speciale

Sistemul Lewis – sticle speciale pentru cultura mama si culturile de alimentare,inchise cu sistem de sigilare Astell. Acest mediu este sterilizat si racit in sticla sicultura este transferata prin 2 ace hipodermice. Sistemul Lewis necesita vasesub presiune. Aerul nu circula in vase in timpul incalzirii/racirii.



Sistemul Jones – tancul nu este sub presiune. Deschiderile sunt protejate desigilii cu apa. Aerul este fortat sa iasa in timpul incalzirii mediului si aerul steril(incalzit si filtrat) reintra in tanc in timpul racirii.Sistemul AlfaLaval – sistemul in care cultura mama si culturile intermediaresunt propagate intr-un incubator si cultura este transferata intr-un tanc mare

utilizand aerul sterilizat sub presiune. Acest sistem utilizeaza filtre de aer particulate cu eficienta ridicata (HEPA).Producatorii olandezi utilizeaza starteri P preparati de Niro. Masuri: laptele estetratat la temperaturi mai mari de 95oC/1 minut si in timpul racirii, inocularii sicultivarii tancurile sunt presurizate cu aer steril. Filtre absolute tip Pall Enflonfilter

ABI FR7PV permit trecerea a mai putin de 2,5x1010 fagi, asigurand ca tanculpresurizat nu este contaminat cu fagi.Tabelul 7. Cuturi starter utilizate pentru diferite sortimente de branzeturi:

Cheddar, Colby Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris,Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris* , Lactococcus lactis ssp.lactis bvar. diacetylactis

Elvetiana Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Lactobacillus helveticussau Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus sau Lactobacillus

delbrueckii ssp. lactis si PropionibacteriumParmesan, Romano Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Lactobacillus delbrueckii

ssp. bulgaricus sau Lactobacillus helveticus sau Lactobacillusdelbrueckii ssp. lactis

Mozzarella, Provolone Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus sau Lactobacillus helveticus

Blue, Roquefort si Stilton Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Lactococcus lactis ssp.lactis/cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis bvar. diacetylactis,Penicillium roqueforti

Gorgonzola Streptococcus salivarius ssp. thermophillus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Penicillium roqueforti, Lactococcus lactis ssp. lactisbvar. diacetylactis sau drojdii

Camembert Cultura Lactococcus/ Penicillium roqueforti

Brick, Limburger Amestec de cultura de lactococi si Streptococcus salivarius ssp.thermophillus, Brevibacterium linens si drojdii

Muenster Lactococcus lactis ssp. lactis

Gouda si Edam Lactococcus lactis ssp. cremoris cu B sau BD-culturi de aroma

Branza crema Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris cu B sauBD-culturi de aroma

Cottage Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris

B – Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris/Leuconostoc lactis; D - Lactococcus lactis

ssp. lactis bvar. diacetylactis; BD – cultura mixta: Leuconostoc mesenteroides ssp.

cremoris/Leuconostoc lactis si Lactococcus lactis ssp. lactis bvar. diacetylactis.

Recent, au fost realizate filtre groase, cu dimensiunea porilor de 0,015 μm, carepot retine bacteriofagii din aer. Aceste filtre sunt sisteme in-line de filtrare, care

pot fi utilizate la 50 de cicluri.Bactoscan utilizeaza o camera ultracurata cu 12 schimburi de filtre/ora. In acestsistem, vasele sub presiune sunt grupate astfel incat zonele de intrare suntaccesibile operatorului.In tabelul 7 sunt prezentate diferiteculturi starter utilizate pentru obtinerea unor sortimente de branzeturi.L-lactatdehidrogenaza



Bacteriile lactice homofermentative produc fermentarea anaeroba a zaharurilor pe calea Embden-Mayerhof-Parnas (EMP) pana la formarea acidului piruvic,apoi fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilaza, acidul piruvic devine acceptor de hidrogen.D-lactatdehidrogenaza

L(+) lactat + NAD+

Piruvat + NADH + + H+D(-) lactat + NAD+

Piruvat + NADH + + H+In fermentatia homolactica, forma predominanta a acidului lactic estedependenta de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei (lactococii formeazaL(+)-lactat si lactobacilii D(-) lactat), dar si de prezenta lactat racemazei careatunci cand este activa in celula microbiana, rezulta prin fermentatie, amesteculracemic (D, L-lactat), catalizand reactia:

L(+) lactat

D(-) lactatEcuatia globala a fermentatiei homolactice:C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2 CH3-CHOH-COOH + 2ATP +

75 KJCai de formare a produsilor principali si secundari in fermentatia lactica



Fig. 2 Fermentatia lactica produsa de bacteriile homofermentative

Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza si lactoza pot fi transportate ca atare incelula printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivariusssp. thermophillus si lactobacili termofili, sau prin transport activ catalizat desistemul fosfotransferaza-fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bateriile din genulLactococcus si Lactobacilus, cu formarea esterilor fosforici.Lactoza sau lactozo-P in celula bacteriana sub actiunea β-galactozidazei(lactazei) este transformata in glucidele componente (Fig. 2).In fermentatia homolactica se pot forma in cantitati mici substante de aroma,diacetil si acetoina, fie prin metabolizarea citratilor care asigura o sursasuplimentara de acid piruvic (fig.3).

Fig. 3 Biochimismul fermentatiei heterolactice



Bacteriile lactice heterofermentative produc fermentatia anaeroba a glucidelor pecalea pentozo-fosfatului (6P-gluconatului) (Fig.3).

Microbiologie branzeturilor

Documents

Transcript of Microbiologie branzeturilor