Medtorrents.com

1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei.

Obiectul de studiu:

1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare) ( identificare

2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda

Scopurile studierii mi/o:

1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase

2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina), alimente (unt, brinza)

3) insecticide biologice

4) fabricare plastic biodegradabil ???

5) decompunere deseuri, metan

Disciplini microbiologice:

particularitati biologice mi/o

bacteriologie

virologie

protozoologie

micologie, etc

habitat mi/o

microbiologia solului

... marina

... cosmica

implicatii in activitatea umana

microbiologia medicala

... veterinara

... alimentara, etc

Genetica microbiana

Ecologia microbiana

Microbiologia medicala studiaza:

a) relatia mi/o-gazda umana

b) capacitatile patogene mi/o

c) capacitatile antiinfectioase organism uman

d) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioase

e) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana

Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei:

I. empirica (pina in sec. 15)

II. morfologica (sec. 16-18)

A. von Leewenhoek: 1673 prima observare si descriere a mi/o

III. fiziologica (sec. 19)

L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelorR. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch)

I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei

2. Tipurile de laboratoare microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase.

3. Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote.

Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete)

Clasificari mi/o: fenotipica (prima tentativa Carl von Linne)

genotipica

filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA)

Grupe taxonomice: domeniu ( regn ( increngatura ( clasa ( ordin ( familie ( gen ( specieTaxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente:

biovar (activitate biochimica/fiziologica)

serovar (structura Ag)

patovar (grad de patogenitate)

lizovar (sensibilitate la bacteriofagi)

antibiovar (sensibilitate la AB)

Rolul taxonilor infraspecifici: markeri epidemiologici!

Clasificare mi/o: forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni)

forme celulare:

bacteria = procariote, eubct

1) G-2) G+

3) micoplasme (lipsite de PC)

archaea = procariote, PC fara peptidoglican, habitat in conditii extremale

eucarya = eucariote (fungi, protozoare)

4. Metodele microbiologice de diagnostic si esenta lor. Metoda microscopica in diagnosticul bolilor infectioase. Tipurile de microscoape, utilizarea practica, particularitatile si rolul uleiului de emersie.

Metode microbiologice de diagnostic: diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui)

1. microscopic (orientativ) ( prezenta bct, nr, forma, structura2. bacteriologic ( izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB

3. biologic (experimental) ( inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie tipica

4. depistare Ag mi/o in lichide biologice

5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara

diagnostic indirect (imunologic)

1. serodiagnostic ( detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului

2. intradermoreactie ( introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie pozitiva = aparitie eritem ( hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag)

5. Morfologia bacteriilor. Grupurile morfologice de bacterii. De desenat. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii de baza utilizati in microbiologie. Metodele de colorare. Aplicarea practica.

Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonomGrupe morfologice de bct:

coci:

1. micro

2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati)

3. tetra

4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus5. stafilo (gramezi)

6. sarcine (pachete 8-16-32 coci)

bastonase

1. bacterium capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli)

2. bacillus capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B. anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili

3. clostridium capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens)

spiralate/incurbate

1. vibrio (ex. V. cholarae)2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni)

3. spirillum = cel. spiralate rigide

4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia)

polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma)

6. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii lichide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: sputa si frotiuri amprente. Metodele de fixare.

Pregatirea frotiurilor ( examen microscopicEtape in pregatirea frotiului:

1) etalare material microbian

2) uscare

3) fixare ( oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant

4) colorare ( asigura contrast intre mi/o si fundal

5) examinare (microscop optic cu imersie)

Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul

7. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii solide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: singe, puroi. Metodele de fixare.8. Structura celulei bacteriene. Enumerati elementele permanente (obligatorii) si nepermanente (neobligatorii) de structura. Membrana citoplasmatica si citoplasma. Structura, compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere.

Elemente permanente: PC, MCt, Ct, nucleoid, ribosomi, mezosomi ( G+ (E, citocromi)Elemente nepermanente: capsula, spor, flageli, fimbrii, plasmide, incluziuni celulare

MCt:

mozeic fluid Singer

lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi

mai bogata in prot. decit eucariotele ( fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite)

PBP catalizare transpeptidare si sinteza PC

permeaze transport

prot. sist. de secretie

receptori

E lant respirator

Rol MCt:

1. Bariera semipermeabila, selectiva ( difuziune simpla, facilitata

2. Permeaze ( transport activ

3. E ( activitate metabolica

4. Metabolism energetic

5. Participa la diviziunea celulara

6. Sinteza PG si fosfolipidelor

7. Chemotaxis (R specifici)

Mezozomi: cresc S MCt ( cresc activitatea metabolica, energetica

Ct:

Lipsesc organitele

Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide

pH acid

Rol Ct: sediul proceselor metabolice

9. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram pozitive. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram pozitive.

PC = invelis rigid ceinconjoara protoplastul; e constituit din PG.PG = mureina = heteropolimer macromolecular, format din 2 parti:

Partea glicanica (PZ) = catene liniare paralele: NAG + NAM

Partea peptidica = peptide 4*aa (izoforme D si L) legate de NAM ( protectie de proteaze

G-: tetrapeptidele unite direct (bidimensional)

G+: tetrapeptidele unite prin punti interpeptidice 5*Gly (tridimensional)

Structuri prezente doar la procariote:

1. ac. diaminopimelic (tetrapeptid, la G+)

2. izoforma D aa

3. NAM

Fragmente solubile de mureina (PG) ( interactiune cu toll-likeR/CD14R de pe macrofage ( secretie citokine ( soc septic!

Rol PC:

1. Protectie de liza osmotica

2. Forma

3. Factor de patogenitate (soc septic)

4. Protectie contra subst. toxice (AgO, E din spatiul periplasmatic)

5. Tinta de atac a unor substante:

Lizozim scindare legaturi din catena glicanica (intre NAG si NAM)

AB inhibitie proces de transpeptidare

PC G+:

Componente:

PG (tridimensional) 40-80%

ac. teichoici (fixati de NAG), ac. lipoteichoici (fixati de MCt) = polimeri de ribitol, glicerol-fosfat;

sarcina electrica negativa

transfer de ioni

fctie Ag

activare complement pe cale alternativa

stimulare secretie citokine

adeziune intercelulara

prot. asociate PC

Streptococcus pyogenes = prot. M

Staphylococcus aureus = prot. A (clumping factor), prot. fixatoare de fibronectina

Uniform

Grosime 80 nm

10. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram negative. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram negative.

PC G-: Componente:

PG (bidimensional) 1-10%

MEx: existenta situsuri de comuniune intre MEx si MCt ( rol in transport

Prot. majore: porine, receptori (pili, fagi)

Prot. minore: E de captare si transport a subst.

LP Braun = uneste Mex si PG ( stabilizare MEx

LPZ (cel mai neobisnuit component) ( stabilizare MEx

Lipid A localizat in MEx; endotoxina (stimuleaza secretia citokinelor)

Miex PZ transport unele subst.; AgR ( specificitate de gen Lant O (OZ) sarcina negativa, impiedica fagocitoza; AgO ( specificitate de specie

N.B. Bct au capacitatea de a modifica structura AgO ( capacitate de a amagi apararea imuna

Neomogen

Grosime 12 nm

Spatiul periplasmatic: E si prot. fixate de MCt

Rol e: hidroliza, sinteza PC, detoxifiere (ex. Beta-lactamaze)

Coloratia GRAM1. Violet de gentiana ( Ct violeta

2. Spalare cu apa, tratare cu sol. Lugol (iodin) ( formare complex insolubil violet-iodin ( fixare colorant in celule

3. Tratare cu alcool 95%

eliminare colorant din bct G- ( pori mai mari in PG, continut mai mare de lipide (solubile in alcool), pH slab acid

mentinere colorant in bct G+ ( pori mai mici, continut scazut de lipide ( alcoolul dehisrateaza peretele si reduce diametrul porilor

4. Recolorare cu fuxina apoasa

Rezultat: G-: rosu, G+: violet

Utilizarea coloratiei Gram: Diagnostic, Sensibilitate la AB

Forme particulare, osmotic sensibile:

Protoplast = G+, fara PG

Sferoplast = G-, MCt+MEx, partial fara PG

Forme L = bct lipside de PC, din cauza AB, (i)reversibile

Mycoplasma lipsite de PC, osmotic rezistente ( rezistenta marita MCt; forma pleiomorfa

11. Particularitatile de structura si compozitia chimica a peretelui celular al bacteriilor acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen. Componentele, tehnica si mecanismul de colorare. Exemple de bacterii acidorezistente.

Coloratia Ziehl-Neelsen:1. Colorare cu fuxina fenicata + incalzire lama pina la aparitia vaporilor

2. Spalare cu apa, tratare cu sol. ac. sulfuric 5%

3. Spalare cu apa, recolorare cu albastru de metilen

Rezultat: Acidorezistente: rosu; Acidonerezistente: albastru

12. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Plasmidele bacteriene, tipurile si functiile lor.

Aparatul nuclear = nucleoid, ADN bicatenar circular 1 crsN.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crs

ADN: pliat n bucle, stabilizat prin ARN i proteine (diferite de histone). Fiecare bucl hiperspiralizat sub aciunea ADN-girazei i topoizomerazei IV (se ntlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN polimeraze).Metode speciale de colorare (Feulgen): HCl.aldehida.react. Shiff.culoare rosie ???

Plasmide: elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom. Confer bacteriei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F se transmit prin conjugare. Episom - plasmida integrat n cromosomTipuri de plasmide:

F factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F)R rezisten la antibiotice

Ent producerea enterotoxinei

Hly producerea hemolizinei

Col producerea de bacteriocine

Utilizarea practic: n tehnologii de ADN-recombinant13. Sporii bacterieni. Compozitia chimica si functiile biologice. Etapele sporogenezei. Amplasarea sporului in celula. Exemple de specii patogene sporulate, de desenat. Metodele de evidentiere a sporilor.

Bacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium.F. vegetativa = activa metabolic

Spor:

Inactiv metabolic Coninut sczut de ap liber

Coninut mare (pn la 10%) n dipicolinat de calciu

Rezistent la temperaturi i pH extreme, desicare, radiaii, ageni chimici i fizici

n condiii favorabile sporul germineaz, dezvoltndu-se forma vegetativ.

Forma sporului (sferic, oval) i poziia n celul (central, subterminal, terminal) sunt caractere utile n identificarea bacteriilor.

Pozitia sporului in celula: central; subterminal; terminal; terminal, cu deformarea celuleiStructura sporului:

exospor

tunica externa = straturi proteice ( rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata)

tunica interna ???

cortex = PG ( inlaturare osmotica a apei ( dehidratare

PC sporal

protoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADN

15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast ( stabilizare ADN

ADN asociat la DNA binding proteins ( protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei

Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore); stimul carenta alimetara

Stadiul I se formeaz filamentul axial, compus din ADN

Stadiul II divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care conine un filament de ADN. MCt nglobeaz presporul.

Stadiul III nglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membrane

Stadiul IV formarea cortexului de PG ntre cele 2 membrane

Stadiile V-VI formarea tunicii proteice la exterior i maturarea sporului. Uneori se formeaz un nveli extern suplimentar - exosporiu

Stadiul VII sporul matur este eliberat iar celula-mam se dezintegreaz Germinarea sporului: activare (reversibil); germinatie; crestere

Evidenierea sporilor: colorarea dup AUJESZKY14. Capsula bacteriilor. Compozitita chimica si functiile biologice. Metodele pozitive si negative de colorare a capsulei. Exemple de bacterii capsulate, de desenat.

Capsula formata din polimeri organici sintetizati in mediul natural de existenta al bct.Se disting:

Capsula adevrat (peste 0,2m), vizibil la microscopul optic Microcapsula, detectat la microscopul electronic

Capsula flexibil (slime, glicocalix), o reea lax de fibre polizaharidice, care difuzeaz n mediu. Nu se evideniaz microscopic. Asigur formarea biofilmelor bacteriene ansamblu structurat de celule bacteriene nglobate ntro matrice de polimeri de origine bacterian, care poate adera la suprafee inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau esuturi vii. Compoziia chimic: ap i substane organice (polizaharide, mucopolizaharide, peptide)

Bacillus anthracis acid glutamic

Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae PZ

Streptococcus pyogenes acid hialuronic

Funciile capsulei:

1. Impiedic desicarea bacteriei ([apa] marita)2. Barier de permeabilitate pentru substane toxice (antibiotice, ioni metalici)

3. Barier protectoare faa de factori antiinfecioi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare

4. Rezerv nutritiv

5. Aderarea bacteriei la substrat esuturi sau suporturi inerte

6. Specificitate Ag de specie sau tip (Ag K)

S. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsuleEvidenierea capsulei

Coloraia Burri-Hinss coloratie negativPe lam se amestec suspensia bacterian cu tu de China, se etaleaz, se usuc

Frotiul se fixeaz cu alcool

Se coloreaz frotiul cu fucsin apoas

Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se coloreaz n rou.

Coloraia Romanovski Giemsa (capsula se coloreaz n roz) coloraie pozitiv15. Flagelii. Structura si compozitia chimica. Clasificarea bacteriilor dupa amplasarea si numarul flagelilor. Metodele directe de studiere si evidentiere a flagelilor. Coloratia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile.

Flageli = structuri filamentoase proteice.Rol: mobilitate; Ag HTipurile de bacterii dup dispoziia flagelilor

monotriche (Pseudomonas) lofotriche = un mnunchi de flageli la o extremitate (Spirillum) amfitriche = cte un flagel sau un mnunchi de flageli la fiecare extremitate peritriche = flageli pe toat suprafaa celulei (Proteus vulgaris)La spirochete flagelii se plaseaz n spaiul periplasmic flageli interni, periplasmatici.Structura flagel1. filament = helicoidal, alcatuit din flagelina

2. cirlig de articulatie

3. corp bazal

G+

inel intern (MCt)

inel extern (PG)

G-

disc M (Mct)

disc S (spatiu periplasmatic)

disc P (PG)

disc LPZ (MEx)

Sinteza flagel = proprietate de autoasamblare

Rotire flagel E. coli = 270/s

Motilitatea e determinate de chemotaxis. Bct nu allege directia de miscare, cid oar determina daca trebuie sau nu sa continuie miscarea in aceeasi directie.

Evidentierea flagelilor:

microscopie electronic

coloratie Loeffler (mordansarea cu tanin, sruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cu fucsin sau albastru de metilen)Pilii comuni (fimbriile) elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-.

Structura: prot. pilina, fixate de MEx. Numrul fimbriilor per celul: sute.

Rol pili:

1. adeziunea bacteriilor la suprafee inerte, la celule sau alte bacterii

2. Ag FPili conjugativi structuri capiliforme de natur proteic, prezeni n numr de 1-10 per celul (codificati de plasmide conjugative F).

Rol pili conjugativi:

1. transferul de ADN prin conjugare

2. R pentru unii bacteriofagi

Evidenierea pililor: microscopia electronic16. Metodele indirecte de studiere a mobilitatii bacteriilor. Pregatirea preparatelor native. Metodele de examinare. Principiul microscopiei cu fond negru si contrast de faza.

Studierea preparatelor native pictur suspendat sau ntre lam i lamel (microscopia cu contrast de faz sau pe fond negru).

nsmnarea culturii bacteriene n medii semisolide (se observ turbiditate) .

Creterea culturii n vl pe suprafaa mediului solid.

17. Granulatiile de volutina. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Coloratia Loeffler si Neisser. Mecanismul si tehnica de colorare. Exemple de bacterii cu granulatii de volutina. Importanta practica.

Tipuri de incluziuni Ct: glicogen sau PHB (poli-beta-hidroxibutirat)

vacuole de gaz ( plutire (ex. cianobacterii)

magnetosomi = incluziuni de Fe sub forma de magnetit --. orientare in cimpul magnetic al pamintului

granule de volutina (polimetafosfat) = granule metacromaticeLa tratarea cu unii colorani bazici granulele de volutin se coloreaz n alt culoare, de ex. n rou-violet la colorarea cu albastru de metilen fenomenul metacromaziei.Rol granule de volutina:

1. rezerva energetic

2. sursa de fosfati ( sinteza AN

3. scadere presiune osmotic

Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutin se localizeaz la extremitile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform n citoplasm.

Evidenierea: metoda Loeffler, metoda Neisser18. Morfologia si ultrastructura spirochetelor. Clasificarea. Metodele de studiere. Speciile patogene si diferenierea lor.

Sunt germeni helicoidali,mobili.au corpul compus din mai multe spire. Miscarile sunt datorate unui aparat locomotor,care consta din fibrile dispuse pe toata lungimea corpului intre perete si membrana. Peretele este elastic, format din glucide, lipide, polipeptide. Nu sunt rezistente in mediul extern. (Nu rezista la variatii de temperatura,sunt sensibile la peniciline si cefalosporine)

Familia Spirochaetaceae, cuprinde 3 genuri, toate avind importanta in patologia umana.

1. Genul Treponema(se subdivid in specii patogene,si saprofite.)Cele patogene...

Treponema pertenue

Treponema carateum

Treponema pallidum

2. Genul Leptospira

Din specii saprofite.Leptospira biflexa

Din specii patogene-L.Icterohaemorrhagiae(rezervorul soarecele)

-L.grippotyphosa(rezervorul soarecele)

-L.pomona(rezervorul porcul)

-L.canicola(rezervorul cainele)

3. Genul Borrelia

Patogenitatea.

Treponema este patogena prin multiplicarea intracelulara si prin invazivitate.Boala se numeste Sifilis.

Leptospirele sunt patogene prin multiplicare.Produc boala numita Leptospiroza,care este o antropozoonoza.

Borrelia sunt patogene prin multiplicare si invazivitate.Produc borrelioze,care sunt boli generalizate.

Caractere morfologice

Treponema. Are 10-15 spire regulate, rigide cu capetele drepte. Intre perete si membrana are fibrile, care ii confera mobilitate,prezinta miscari de rotatie si flexie. Se coloreaza Giemsa slab,dar se coloreaza prin impregnare argentica, coloratia Fontana-Tribondeau, germenii apar bruni pe fond bej.

Leptospira. Corpul are 10-12 sppire,nedeformabile,mici,regulate,cu capete rasucite. Aparatul locomotor este alcatuit dintr-o singura fibrila dispusa intre membrana si perete,care este foarte elastic. Se coloreaza Giemsa,dar foarte greu. Nu se coloreaza cu Gram

Borrelia. Corpul alcatuit din 5-6 spire neregulate sideformabile in cursul miscarilor,avind capete drepte.

Aparatul locomotor este alcatuit dintr-un manunchi de 30 de fibrile dispuse intre membrana si perete

Se coloreaza Gram,fiind Gram-negative

19. Morfologia si ultrastructura micoplasmelor si chlamidiilor. Metodele de studiere. Speciile patogene.

Micoplasmele sunt bacterii:

Delimitate numai de o membrana trilaminata si lipsite de perete celular rigid ca si de informatia genetica necesara sintezei precursorilor specifici peretelui.

Forme mici si polimorfe

Se cultiva pe medii acelulare ,iar cultura este inhibata de anticorpii specifici.

Se inmulteste intr.un ciclu care include alternativ,elongarea si fragmentarea unor forme filamentoase in forme cocoide si diviziunea acestora.

Se examineaza in functie de localizarea infectiei,sputa sau exudatul nazofaringian,urina,prelevate prin laparoscopia pelvina. Microscopia directa este fara valori,coloratiile uzuale nu pot depista micoplasmele din cauza dimensiunilor reduse...iar coloratia imunofluorescenta nu a dat rezultate satisfacatoare.

Izolarea si identificarea. Coloratia Dienes,coloniile de micoplasme se coloreaza in violet si acoperite cu o lamele pot fie examinate cu imersie.

Specii patogene. Din cele 80 de specii de Mzcoplasme,gazduite de cele mai diverse vertebrate,omul gazduieste numai 10,din care doar 3 sunt patogene. Din cele 3 specii= M. Genitalum (tractul urogenital inferior) M. hominis, M. Pneumoniae (cai respiratorii).

Chlamidiile sunt minuscule bacterii cocoide, parazite energetic, total dependente de ATP-ul oferit de celula gazd, dar capabile de biosinteze proprii. Nu cultiv pe medii artificiale. Se reproduc lntr-un ciclu complex In care identificm: forma infectiva extracelular, corpul elementar cu diametrul de 200300 nm i perete gros, endocitat de

celula gazd, unde se transform in forma vegetativ, corpul reticulat. Acesta crete pn la 6001000 nm in diametru i se divide repetat, formnd microcolonii (incluziuni citoplasmice) in care corpii reticulai se matureaz in noi corpi elementari eliberai prin liza celulei gazd.

Microscopia este cea mai uzual metoda de diagnostic direct al infeciilor cu C.trackomatiSybiovarul trahomului. Se urmrete prezena incluziunilor citoplasmice prin coloraia Giemsa, coloraia cu iod sau coloraia imunofluorescent.

Coloraia Giemsaare sensibilitate bun pentru diagnosticul trahomului in faza acut i al conjunctivitelor neonatale. Este mai puin satisfctoare pentru diagnosticul trahomului In faza cronic, a conjunctivitei, uretritei i cervicitei cu incluziuni. Nu are valoare pentru diagnosticul limfogranulomatozei veneriene i a infeciilor cu C. pneumoniaesauC. psittaci.Coloraia cu soluie Lugoleste cel mai puin sensibil, pentru c glicogenul apare in matricea incluziunilor numai lntr-o anumit faz a ciclului evolutiv. Poate da rezultate fals pozitive din cauza prezenei glicogenului n celulele scuamoase. Are indicaii pentru triajul suspecilor in zonele cu trahom endemic.

Coloraia imunofluorescent cu anticorpi monoclonali specifici de specieeste cea mai sensibil i specific metod. Depisteaz nu numai incluziunile citoplasmice, ci i corpii elementari prezeni in exsudate sau epicelular.

20. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu vapori fluizi si sub presiune. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii.

Sterilizarea este distrugerea sau indepartare tuturor microorganismelor,inclusiv a sporilor.

Sterilizarea prin caldura umeda,se face cu ajutorul autoclavului prin vapori sub presiune,care realizeaza 115C,la 0,5atmosfere,121C la o atmosfera si 134c la 2 atmosfere.

Autoclavul este un cazan cu pereti rezistenti in care dupa inchiderea cu un capac masiv,presat cu buloane sau sistem cabestan,vaporii de apa se comprima la presiunea necesara sterilizarii.

Autoclavele cu peretele simplu pot fi verticale si orizontale.Se sterilizeaza sticlaria pentru culturi de celule si aparatele de filtrare.

Procedura

Se toarne apa in cazan,pina la 2-3 cm,prin incinta de sterilizare

Se aseaza pe suport obiectele de sterilizat in ambalajul lor.(flacoane,eprubete,cosuri din sirma,cutii,casolete...)cu capacele semideschise

Se inchide etans capacul autoclavului

Se conecteaza sursa de caldura

Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului.dupa ce aerul este complet evacuat din incinta de sterilizare...

Se inchide robinetul de evacuare a aerului

Cind presiunea ajunge la valoarea aleasa se regleaza sursa de caldura,pentru a mentine o presiune constanta,pe toata durata timpului de sterilizare.

Se intrerupe sursa de caldura,pentru a se raci aparatul,se deschid lent robinetul de vapori,apoi capacul.

Se lasa materialele pentru uscare in autoclava deschisa

21. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu aer fierbinte. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii.

Sterilitate este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv al sporilor.

Obiect steril- obiect care a fost prelucrat special si au fost distruse sau indepartate toate microorganismele(inclusiv sporii) de pe el si la insamantare prezinta lipsa cresterii.

Obiect nesteril- obiect care a intrat in contact cu mediul inconjurator sau cu bolnavul si care la insamantare prezita prezenta crestii

Sterilizarea cu aer fierbinte(cald):

Indicatii: Obiecte din sticla (eprubete, flacoane, pipete) sau din portelan (mojare, pistile), seringi Luer din sticla, instrument chirurgical, substante grase, pulberi termostabile.

Se realizeaza in etuva la temperature de 160-180 grade Celsius timp de o ora. Suplimentar inca o ora in cazul ambalajelor voluminoase sau obiectelor care se incalzesc greu. Etuva e o incinta cilindrica cu pereti dubli din table termoizolati.Un thermostat care mentine temperature. Un sistem de ventilare care uniformizeaza temperature.

Procedura: Obiectele sterilizarii se pun pe rafturi cu spatii intre ele pentru libera circulatie al aerului cald. Se inchide etuva. Se deschid orificiile de ventilare si se conecteaza la retea. Se marcheaza timpul de sterilizare. Obiectele se scot numai dupa racirea aparatului.

Controlul eficientei sterilizarii: 3 tipuri de indicatori; fizici (manometru, termometru), chimici (floare de sulf (autoclave) se topeste la 115 grade C, acid benzoic(autoclava) se topeste la 121-122 grade C, tiouree (etuva) se topeste la 180 grade) si biologici: tuburi cu fire de bumbac cu spori, dupa sterilizare se insemanteaza.

22. Notiuni de sterilizare, aseptica si antiseptica. Metoda mecanic de sterilizare. Aplicarea practica. Tipurile de filtre. Conservantii.

Asepsia inseamna manipularea la adapost de microorganism. Antisepsia inseamna distrugerea microorganismelor de pe instrumentele de manipulare.

Filtrarea este trecerea unui fluid printr-un corp poros filtru.Filtrele cu porozitati convenabilepot debarasa de microorganism fluidul filtrate, acestea fiind retinute mechanic si electrostatic in porii filtrului.

Se aplica pentru sterilizarea aerului, a unor medii de cultura pentru microbe, a medicamentelor care nu suporta incalzirea.

Tipuri de filtre: Clasice Din portelan, sau pamant de infuzorii cu forma unor lumanari goale pe dinauntru si inchise la un capat (bujii filtrante) placi filtrante din azbest impregnate cu caolin (filter Seitz sau sticla poroasa (filter Schott). Sau membrane filtrante din acetat de celuloza cu porozitati intre 8 si 0,025 m. Filtrarea se face prin aspiratie sau presiune pozitiva(adaptata la o seringa). Pentru a evita colmatarea porilor suspensiile cu densitate mare a particulelor sunt prefiltrate printr-un material fibros sau granular.

Conservanti (agenti chimici) Substante utilizate la pastrarea preparatelor

SubstantaDomeniu de utilizareConcentratia%

FenolSeruri immune, Vaccinuri0.3-0,5 %

Mertiolat de SodiuSeruri immune, preparate injectabile0,004-0,02

Feniol +mertiolatSeruri immune, Colire0,2+0,005 ; 0,002+0,01

Benzoat de sodiumUnguente, Emulsii, Alimente0,2-1

Conservarea prin agenti fizici: Pasteurizarea - Incalzirea la 62-85 distruge formele vegetative si nu sporii. Refrigerarea imediata la 4C prin soc termic completeaza efectul microbicid. Refrigerarea la 4c se foloseste pe larg.

Congelarea - Efect antimicrobian minim la racirea sub punctual eutectic (-21,3C) se evita formarea cristalelor de ghiata. Sau in azot lichid (-196C). Liofilizarea - Desicarea se foloseste in microbiologie pentru conservarea indefinite al tulpinilor unor bacteria sporulate. Liofilizarea se foloseste pentru conservarea microorganismelor, serurilor immune si al unor reactivi biologici. In esenta e o criodesicare.

23. Metabolismul microbian. Particularitile. Enzimele bacteriene. Clasificarea, rolul in fiziologia microbian. Aplicarea practic in microbiologie.

Metabolismul bacterian = ansamblu de reacii biochimice care au loc n celula vie, format din cata- si ana- bolism.

Particularitile metabolismului bacterian:

1. metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice intr-o singur celul)

2. foarte flexibil, diverse ci metabolice (adaptare rapida la condiiile mediului)

3. foarte intens (viteza reaciilor este mare)4. produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism)

5. prezenta catalizatori proteici specifici enzimeCaracter special al E bct: active n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9)

Clasificare E: Constitutive, permanente

Inductive, adaptive, se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza)

Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizateDup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)

Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)

Dup impactul asupra ma/o

Enzime metabolice

Enzime de patogenitate (hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza)Importana practic a studierii enzimelor

1. Identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor)

2. Substrat pt unele AB

3. Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei)

4. Aplicarea industrial a enzimelor

24. Nutriia bacteriilor. Tipul nutriiei si mecanismele transportului nutrienilor in celula bacterian. Clasificarea m/o dupa sursele de carbon. Notiune de m/o saprofite si parazite.

Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism.

Modul (tipul) de nutriie = absorbtiv.

Nutritii se obtin prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide).

Digestia: G+ extracelular; G- n spaiul periplasmicTransportul transmembranar:

1. Difuzie simpl: O2, CO2, AG, nutrieni liposolubili2. Difuzie facilitat (permeaze): molecule mari

3. Transport activ (proteine de transport specifice = ABCtransportori)

4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie.

5. transport Fe = secretie sideroforiExcreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacterieiNecesitile nutritive ale bacteriilor

Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo

Necesiti specifice: bct prototrofe = capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali bct auxotrofe - solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii. Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon

Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene)

Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc)

Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice)

Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le prejudiciiBacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte.

25. Clasificarea m/o dupa sursele de energie. Mecanismele de obtinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea m/o dupa tipul de respiratie. Exemple.

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie

fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint)

chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen.

chemolitotrofe donorul de H = substan anorganic

chemoorganotrofe donorul de H = substan organic (glucoza, lipide...)

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofeMecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H :

Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCt. Produs final H2O sau H2O2 .

Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2).

Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia.

Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon: fotoautotrofe (energie solar, CO2); fotoheterotrofe (en. sol., subst.org); chemoautotrofe; chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe).26. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicarii culturilor periodice (discontinue) de bacterii. Cultivarea bacteriilor si conditiile (principiile) necesare pentru cultivare.

Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez.

Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum.

Diviziune binar; nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme); Autoreproducere (virusuri); Spori (micete); Fragmentare (actinomicete)Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune.Faza C replicarea ADN

Faza G de laten, segregarea cromozomilor

Faza D de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd celula atinge o lungime limit.Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG). Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime ( vitez maxim).

Creterea bacteriilor n laborator cultivare ( izolare

Rolul izolarii bct:

1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)

2. Testatea sensibilitii lor fa de AB

3. Obinere produi de biosintez (AB, aa), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate.

Condiiile (principiile) de cultivare: Surs nutritiv adecvat; Surs de energie; Ap; Temperatura potrivit; pH adecvat; Concentraie optim a oxigenului i a CO2; Presiune osmotic adecvatTemperatura de cretere

Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim:

psichrofile t optim 10-20 C. Cresc i la 0 C.

mezofile optimum 30-37 C (limite 15-45 C)

termofile optimum 50-60 C (pn la 95 C)

hipertermofile (cresc la 70110 C)pH

neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5

acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)

alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotic

halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene

halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul

strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob

microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau fermentaie. Neisseria, Brucella, Campylobacter strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei. Clostridium, Bacteroides anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz Lactobacillus, streptococi facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie 27. Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Mediile uzuale. Componenta. Destinatia lor. Manifestarea cresterii bacteriilor in medii lichide si solide. MC = soluii/substrate solide, asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice pt cultivarea bct. Pot fi utilizate pt: cultivarea (izolarea) bacteriilor; testarea sensibilitii la AB; stocarea sau transportul culturilor bacreiene.Cerinele fa de MC:a. necesitile nutritive i energetice bctb. umiditate optimalc. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon) d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH210)e. izotonic (0,5% NaCl)f. steril i transparentClasificarea MC:

Dup provenien

Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia chimic precis nu poate fi controlat. Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate

Semisintetice

Dup consisten

Lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (AB, E, toxine)

Solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri ( izolarea culturilor pure; geloza nclinat (n pant) ( acumularea culturilor pure. Semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor. Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie Medii uzuale (universale, simple)

Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)

Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)

Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)

Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)

Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare

Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min Medii complexe: elective

selective:

pe mediu solid

pe mediu lichid = mediu de imbogatire

diferential-diagnostice (DD)

izolare cultura pura

multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara

identificare finala

speciale

de transport

Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)

Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)

a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit)

b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella

c. Bulion cu selenit Shigella, Salmonella

d. Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae

e. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobiMedii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)

Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)

Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietilor zaharoliticeEndo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)

Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)

Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea proprietilor de oxido-reducere

Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi)

Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae Studierea proprietilor lipolitice

Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Studierea proprietilor hemolitice

Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) in cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar

Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator

Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)

Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree

Indicatorul Andrede fucsin+NaOH

Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare).

Producerea H2S nnegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea finalirul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)

Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori

Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi)

Medii de transport transportare/stocare material (prelevat). Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor. Mediul cu glicerin 30%; Soluie tampon-fosfat; Soluie NaCl 3%; Mediul Cary-Blair; Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).

n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).

M.tuberculosis 3-5 sptmni

V.cholerae 6-12 oreCultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii)

Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite

Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior.

Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celuleManifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor n mediu lichid

Turbiditate uniform

Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei)Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis)

n mediu solid formarea coloniilor

Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid. Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare).Caracteristica coloniilor

a. Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)

b. Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc

c. Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc

d. Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat

e. Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc

f. Densitate opac, transparent, etc

g. Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid

Tipurile de colonii: Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase; Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas

Caracterele de cultur ale bacteriilor = exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), viteza i manifestarea creterii pe medii lichide i solideDinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

Culturi discontinue

Culturi continue

Culturi sincrone

Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue

I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etc

II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore.III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore.IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv.Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent n faza exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue.

Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp. ???28. Metoda bacteriologic in diagnosticul bolilor infecioase. Scopul. Prelevate de la pacieni si din mediul ambiant. Principiile de recoltare, ambalare si transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatiile de laborator.

Examenul bacteriologic const n inocularea prelevatelor pe medii de cultur pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate.

Examenul bacteriologic const din cteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice pn la remiterea rezultatelor

Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului)

Prescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.

Prelevarea probelor

Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare a agentului patogen)

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: Secreii rino-faringiene, Sput, Puroi, Exudate, Snge, LCR, Urin, Mase fecale, Bioptate, Material cadaveric

Materiale de examinat din mediul extern: Ap, Alimente, Sol, Aer, Lavaje, Vectori

Modul de prelevare (recoltare)

n recipiente sterile

Respectnd regulile de autoprotecie

La debutul bolii

Pn la administrarea antibioticelor

Transportarea

Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitate

n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei.

29. Examenul bacteriologic. Etapele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Volumul de lucru la fiecare etapa. Principiile de identificare a culturii pure.

Examenul bacteriologic = inocularea prelevatel pe MC ( izolare cultura pura ( identificare, testare sensibilitate la AB, eventual conservare.Etape examen bacteriologic:1. Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului)

Prescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.

2. Prelevarea probelor

Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare a agentului patogen)

Modul de prelevare (recoltare) :

n recipiente sterile

Respectnd regulile de autoprotecie

La debutul bolii

Pn la administrarea antibioticelor

3. Transportarea

Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitate

n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)

n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei)

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: Secreii rino-faringiene; Sput; Puroi; Exudate; Snge; LCR; Urin; Mase fecale; Bioptate; Material cadaveric

Materiale de examinat din mediul extern: Ap; Alimente; Sol; Aer; Lavaje; Vectori, etcEXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE

Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare n diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc)

Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-.I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE

Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. Tehnici utilizate:

Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii).

Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...), apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.

Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie de TG).

Metode speciale de izolare n culturi pure: bct sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului 80 C 20 min; bct acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o baz; bct din asociaii cu numr minim de mi/o patogene: mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de mbogire; bct cu virulen nalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile

II etap ACUMULAREA CULTURII PURE

Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc)

Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte ( confirmarea puritii culturii

Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant ( acumularea culturii pure

Termostat, 37 C, 18-24 oreIII etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE

Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)

Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o familie, gen, specie, variant

Se studiaz caracterele: Morfologice; Tinctoriale; De cultur; Biochimice; Antigenice (seroidentificarea); De patogenitate; Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea); Sensibilitatea la ABIV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUI

Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri.

Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la ..... STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR

Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc)

Activitatea proteolitic

Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)

Evidenierea enzimelor specifice (ureaz, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea produsele finale ale reaciilor: H2S, NH3, indol Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia)

Depistarea indolului (produs al metabolizrii triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid oxalic. n prezena indolului indicatorul vireaz n roz.

Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru.

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator)

Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)

Oxidarea reactivului culoare violet-neagr

Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas

Oxidazo- : Enterobacteriaceae Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac n jurul coloniilor

Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)

Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n jurul coloniei

Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc

Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 hIdentificarea rapid

Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material)

Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari.Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat30. Metodele de creare a condiiilor de anaerobioz pentru cultivarea anaerobilor. Izolarea culturilor pure prin metoda Zeissler. Volumul de lucru la fiecare etapa. Particularitatile de identificare a culturilor pure.

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)

Condiia principal cultivare n absena oxigenului

Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin; nsmnarea n geloz n coloan)

Crearea condiiilor de anaerobioz

Metoda fizic utilizarea anaerostatului

Metoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor

Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilorRecoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale)

I etap MBOGIREA ANAEROBILOR

nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat nclzirea unui tub la 80 C, 20 min distrugerea florei nesporogene

Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc nmulirea anaerobilor)

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etc

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h

Metoda Weinberg diluii succesive a culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 h

III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE

Studierea macroscopic a coloniilor

Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte

Repicarea n mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure

Incubarea n termostat, 24 hIV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram)

Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz)V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI31. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Aplicarea practica. Eubioticele. Exemple.

BIOTOP spaiu cu condiii de via particulare (conjunctiva, mucoasa intestinal, orofaringe, vagin, tegument, etc), populat i transformat de asociaii de fiine vii.

MICROBIOCENOZ (comunitate microbian) asociaii microbiene ce populeaz un biotop.Microorganismele prezente ntr-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanat, intestinal, etc). Aceasta joac un rol important n protejarea gazdei fa de o invazie microbian ulterioar, actionnd prin urmtoarele mecanisme:1. competiia pentru aceiai nutrieni; 2. competiia pentru aceiai R de pe celulele gazdei;3. producia de bacteriocine; vitamine;4. producerea de acizi grai volatili sau ali metabolii; 5. stimularea continu a sistemului imun;6. stimularea producerii unor factori imuni de protecie (anticorpii naturali). ntre microorganismele unui biotop se pot stabili relaii:

Indiferente (neutralism)

Favorabile (comensalism/satelitism, simbioz/mutualism, sinergism)

Defavorabile (parazitism, antagonism)

Antagonism o specie inhib sau omoar alt specie prin mecanisme specifice sau nespecificeMi/o care manifest activitate inhibitoare antagonist (A), mi/o care sufer concurent (C).

Antagonism nespecific:

Antagonistul este mai activ, utiliznd nutrienii, oxigenul.

Antagonistul produce metabolii toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc).Antagonism specific antagonistul produce substane cu aciune specific asupra unui sau mai multor concureni (AB, bacteriocine).Efectul aciunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic).

Utilizarea practic a antagonismului microbian:

1. depistarea mi/o produceni de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)

2. obinerea produselor biologice curative de origine microbian (probiotice, eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc

3. crearea biocenozelor favorabile organismuluiMETODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI

n mediu solid (metoda traneei) antagonistul se nsmneaz n centrul cutiei, concurenii perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea dup dimensiunea zonei de inhibiie a creterii culturii concurentului.

n mediu semisolid I strat antagonistul, II strat concurentul. Termostat 24h. Aprecierea zon clar ntre straturi.

nsmnarea n mediu lichid (BP) a unui numr egal de A i C. Dup 24 h de incubaie se rensmneaz 0,1 ml pe placa cu geloz. Se compar numrul coloniilor de A i C.

32. Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa producent, spectrul si efectul de actiune asupra celulei bacteriene. Mecanismele de actiune a antibioticelor. Exemple.

ANTIBIOTICE (AB) produse de origine natural (microbian, animal sau vegetal), derivai semi-sintetici sau produse sintetice care inhib sau omoar selectiv unele mi/o sau/i celule tumorale, fr a exercita ca regul efecte toxice asupra macroorganismului.

Clasificarea AB

Dup efectul asupra celulei

Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol)

Bactericid (streptomicina, polimixina)

Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine) Dup spectrul de activitate

spectru restrns (ngust) de aciune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, anti-micotice, anti-tumorale)

spectru larg de aciune (G+ i G-)

Dup producent (origine)

fungic (peniciline, cefalosporine,...)

actinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) microbian (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina din Bacillus polimyxa)

vegetal fitoncidele (alicina, rafanin, imanin)

animal (lizozimul din albu de ou, ecmolina din oase de pete, eritrina din mas eritrocitar, splenocitina din splin)

Dup compoziia chimic (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, poliene, sulfamide, chinolone i fluorochinolone, nitrofurani, etc)Mecanismul de aciune al AB

AB cu aciune asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului)

Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Deregleaz procesul de sintez a PG, inhibnd transpeptidazele (inta - PFP)

Vancomicina, teicoplanina (blocheaz transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)

Bacitracina (blocheaz reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)

Fosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat n sinteza acidului N-acetil muramic)

Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorte. Nu afecteaz celulele eucariote (lipsa PG). AB cu aciune asupra MEx i a MCtAB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixeaz pe membrane bacteriene (n special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocnd dezorganizarea lor. Efect bactericid.

AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixeaz pe sterolii MCP ale micetelor, perturbnd respiraia i dezorganiznd MCP (permeabilitate excesiv i moartea celulei).

Aceste AB acioneaz i asupra celulelor n repaos. Relativ toxice, n special nefro.

AB cu aciune asupra ribozomilor30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)

50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina).

Se leag pe receptori specifici de pe subunitile 30S sau 50S, perturbnd sinteza proteic (inhibiia transpeptidazei, a translocaiei peptidelor, etc). Rezult inhibiia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele bactericid), doar asupra celulelor active metabolic. AB cu aciune asupra acizilor nucleiciRifampicina inhib ARN-polimeraza ADN-dependent. Rezult stoparea sintezei ARNm

Novobiocina , Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) blocheaz activitatea topo-izomerazelor, intervenind n conformaia ADN-ului. Efect bactericid. Sulfamidele i trimetoprimul perturb sinteza acidului folic i folailor (cofactori n sinteza AN). Activitate bacteriostatic.Producerea AB: Metoda biologic; Metoda sintetic; Metoda semi-sintetic

Etapele metodei biologice:

1. Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) n mediu lichid adecvat

2. Extragerea AB

3. Purificarea i concentrarea AB

4. Controlul toxicitii

5. Determinarea activitii AB

Activitatea AB se msoar n uniti de mas (g, mg, g) sau de aciune (UA). 1 UA cantitatea minimal de AB care inhib creterea unei tulpini de referin n condiii standarde. Penicilina 1UA = 0,6 g de substan pur

Cerinele fa de AB: Toxicitate selectiv; Efect terapeutic cu doze minime; Activitate de lung durat; Spectru restrns de aciune; S fie solubile i absorbite uor; S nu provoace efecte secundare; S nu se dezvolte rezistena contra AB; S fie ieftine

33. Rezistena microbilor la antibiotice, tipurile. Mecanismele rezistenei dobindite si manifestatea ei. Combaterea rezistenei.

Cauzele: Factori genetici, proprii bacteriilor; Factori ce favorizeaz selecia i difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente

Tipurile de rezisten:

Natural, ereditar, de specie, prezent la toi membrii unei specii sau gen

lipsa intei ex.: micoplasme, micete;

imposibilitatea de a atinge inta ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele mpiedic ptrunderea AB n citoplasm);

bacteriile nu efectueaz procesul inhibat de AB ex.: acidul folic este preluat din mediu rezisten la sulfamide Achiziionat, dobndit, afecteaz tulpinile unei specii sensibile. Depinde de aciunea de selecie exercitat de AB utilizate n tratament, urmat de rspndirea ei (ntre bacterii, interuman, transmisie de origine animal).

Diminuarea permeabilitii membranare

Modificarea intei moleculare

Eliminarea excesiv a AB

Inactivarea enzimatic a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinaz, cefalosporinaz) sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. Rezistena dobndit se poate manifesta fenotipic (bacteriile n faza de repaos, formele L de bacterii) sau genetic (genotipic)

Rezistena genetic poate fi:

Cromozomial, determinat de mutaii (10%)

Mecanisme: modificarea intei moleculare, diminuarea permeabilitii membranare

Plasmidic, epidemic, realizat prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezisten multipl).

Mecanisme: inactivarea enzimatic, modificarea intei, substituia/supraproducia intei, excreie excesiv a AB.Prevenirea rezistenei

1. Supravegherea epidemiologic a tulpinilor rezistente

2. Politic strict de prescriere a AB

3. Respectarea dozelor terapeutice corecte i a timpului de tratament necesar

4. Asocierea AB cu mecanisme de aciune diferite

5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utiliznd inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina amoxicilina+acid clavulanic

6. Reciclarea AB

7. Producerea AB noiEfectele negative ale antibioticoterapiei

1. Efect toxic (streptomicina surditate, cloramfenicolul toxic pentru mduva osoas, polipeptidele nefrotoxice, etc)

2. Efect teratogen

3. Aciune sensibilizant (penicilina, etc)

4. Disbacterioz

5. Dereglarea imunogenezei

6. Selecia suelor rezistenteBacteriocinele substane proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene i active asupra altor tulpini ale aceeai specii sau asupra speciilor nrudite. Producerea bacteriocinelor este determinat plasmidic (plasmide Col).

Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Escherichia coli), corinecine (Corynebacterium), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc.

Studiul sensibilitii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipia) se utilizeaz n scopuri epidemiologice.34. Notiuni de tulpini bacteriene sensibile, intermediare si rezistente la antibiotice. Metodele de determinare a sensibilittii microbilor la antibiotice: difuzimetrica (rondelelor), diluiilor succesive. Noiune de concentraie minim de inhibiie (CMI) si concentraie minim bactericid (CMB).

Sensibilitatea microbilor la AB

n funcie de rezultatele clinice, bacteriile se divizeaz n 3 clase: sensibile la AB (S), rezistente (R) i intermediare (I, moderat sensibile).

Tulpinile S efectul terapeutic este obinut cu doze terapeutice uzuale

Tulpinile R efectul terapeutic nu poate fi obinut cu doze terapeutice

Tulpinile I succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea local a AB.Fiecare tulpin izolat manifest sensibilitate particular. Ea poate fi studiat n laborator pentru determinarea profilului de sensibiliti al acestei tulpini, ceea ce constituie o antibiogram.

Testarea sensibilitii bacteriilor la AB

Metoda difuzimetric (rondelelor).

Utilizat uzual n infecii banale.

Condiii: mediu standard, concentraie standard de mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condiii standarde.

Mediul este inoculat cu suspensia bacterian. Dup uscare n termostat se aplic rondelele 24h, 37C.

Lectura diametrul zonei de inhibiie a creterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru tulpina este R, dac este depit S.

Metoda diluiilor

ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaug n fiecare tub (cu excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 105/ml. Termostat - 24h.

Lectura cea mai mic doz de AB care inhib creterea culturii dup 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a AB pentru tulpina testat. CMI msoar efectul bacteriostatic. Concentraia Minim Bactericid (CMB) cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din inoculum dup 18h de incubare. Determinarea CMB din ultimele tuburi fr cretere se repic 0,1 ml de mediu pe placa cu geloz. Dup 24h se compar numrul celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii (105/ml).

Corelaia dintre studii in vitro i rezultate in vivon studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc) nu se modific n timp. In vivo, la pacieni, concentraia AB variaz n timp i n funcie de esut.

Pentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaterea Concentraiei Terapeutice (CT) (cantitatea de AB prezent n focarul infecios n cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecrui AB testat.Tulpini Sensibile CMI/CT 1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil

Tulpini Intermediare CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor local

Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul infeciilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecii cronice sau la persoane cu imunosupresie.Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacitii antibioterapiei.

1. Determinarea concentraiilor umorale sau tisulare ale AB

Indicaii: Utilizarea unui AB toxic; n caz cnd bolnavul sufer de deficiene metabolice sau excretoare (renale, hepatice)

Se compar concentraiile obinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).2. Studiul activitii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)

Indicaii: infecii grave care nu rspund rapid la tratament.

Efectuarea: la diluii duble (1/2, ...) ale lichidului examinat (ser, LCR, urin) se adaug suspensia bacterian (din tulpina izolat de la bolnav).

Lectura: dup 24h de incubaie la 37 C se apreciaz diluia maxim cu efect bacteriostatic/cid.

NEI 1:8 reflect eficiena antibioticoterapiei35. Bacteriofagul. Natura. Caracterele morfobiologice. Profagul. Lizogenia. Aplicarea practica a bacteriofagului.

Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei tulpini - specificitatea fagului ( prezena R pt acest fag la suprafaa bct-gazd.Structura bacteriofaguluiStructura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor. 1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar).2. Inveli proteic = capsid ( protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa ( infecia gazdei. Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct, conferind forma fagului. 3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza). Exist 3 forme morfologice principale de fagi: Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei). Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie helicoidal a capsidei). Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul.

Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far coad. Exist i fagi filamentoi.Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd

Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la doua tipuri de infecii:

Infecie litic ( fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-formati.

Infectie nelitica sau lizogen ( fagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile fr a le distruge.INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent)Adsorbia. ciocnire intmpltoare ( fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput prin fibrele sale, apoi prin croete) de un R specific de pe PC bacterian (uneori flageli sau pili). Penetrarea. fixare ireversibil a fagului pe PC ( aciune E (ex. lizozim) ( perforare PC ( contracie manon ( apropiere cap de placa bazal ( canalul axial penetreaz MCt ( ADN fagic este injectat in bacterie.Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). penetrare ADN viral n bacterie (fag vegetativ) ( timp de aproximativ 12 minute virionul nu este depistat n bacteria infectat = faza de eclips. Ea coincide cu sinteza enzimelor virale care vor asigura ulterior:

replicarea ADN fagic;

sinteza proteinelor fagice;

asamblarea acestor elemente.Asamblarea fagilor. sinteza compui capsida i AN n cantiti suficiente ( asamblarea spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid.Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian cu enzime ale bacteriofaguluiTimpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul. INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN : FAGII TEMPERAIFagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot:

1. sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la liza bacteriei, 2. sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n cromozomul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare)3. sau sa ramn n Ct sub form de plasmid. In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral concomitent cu propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i transmite descendenilor capacitatea de a produce fagi n absena infeciei. Proprietile culturilor lizogeneInducia ciclului litic. Profagul pstreaz virulena potenial. Meninerea strii de lizogenie implic sinteza unui represor proteic, codificat de fag. Dispariia lui duce la inducia ciclului litic. Inducia se poate declana spontan la un numar limitat de celule sau poate fi provocat la majoritatea celulelor, de ex., la aciunea unor mutageni, ca razele ultraviolete sau mitomicina C.

Sistemul SOS activat ( prot. RecA scindeaza represorul proteic al fagului ( expresia ciclului litic. Pentru aceasta profagul trebuie sa fie excizat - operaie invers integrrii. Excizia este efectuat de ctre proteina xis, codificat de fag. Urmeaz replicarea genomului, sinteza componentelor fagului i fagii asamblai sunt eliberai prin liza celulei (profagul - gen potenial letal!).n timpul replicrii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale. Aceti fagi pot n continuare ntroduce n cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat = proces de transfer genetic = transducie. Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit: gene din apropierea locului de inserie a fagului (transducie specific) sau fragmente de ADN bacterian ntroduse din ntmplare n capsida fagului (transducie generalizat)Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene sunt imune la fagul virulent omolog profagului gzduit. Acest fag se adsoarbe, injecteaza ADNul, dar fr a se replica sau provoca liza.Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului). Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele caractere absente la celulele neinfectate. Conversie fagic cauzat de:

1. expresia unor gene ale fagului de ctre celule2. inactivarea unor gene cromozomale la integrarea profagului. De ex., tulpinile de Corynebacterium diphtheriae care provoac difteria sunt lizogenizate de un anumit tip de fagi care codeaza i exprim o toxin puternic; toxina eritrogen a Streptococcus pyogenes, etc Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor viruleni asupra culturilor bacteriene

Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de cultur lichid sau solid n prezena bacteriilor omologe. Cultivarea n mediu lichid: Bacteriile sensibile i fagii se ntroduc ntr-un bulion nutritiv (nr fagi < nr bct). Amestecul este incubat pentru a permite bacteriilor s se multiplice i de a fi infectate de ctre fagi ( numrul fagilor crete mai rapid dect cel al bacteriilor pn la un punct critic cnd numrul fagilor prezeni este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene sunt lizate n acelai timp, ce duce la dispariia complet a turbiditii culturii (clarificarea mediului).Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul bacterii-fagi poate fi adugat la geloza topit i rcit la 45 C i apoi turnat n cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic, formnd o pelicul fin, iar fagii continu s infecteze provocnd liza confluent a culturii bacteriene. Aceste colonii de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Numrul plajelor indic numrul fagilor infecioi n prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplicrii unui virion fagic).Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indic prezena bacteriilor sensibile.

IZOLAREA BACTERIOFAGILOR

Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc

Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare.

Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului cutat). Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. INDICAREA BACTERIOFAGILOR

Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de 24 ore.

Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se observ o zon de liz (colonie negativ de fag). Metoda FURT. Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37C 24 ore.Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog.

Metoda FISHER

Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi. TITRAREA BACTERIOFAGILOR

Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur.

Metodele de titrare a bacteriofagului

Titrarea bacteriofagului n mediu lichid (metoda Appelman)

Titrarea bacteriofagului n mediu solid (metoda Gratia)

APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i adugarea culturii bacteriene, coninutul fiecrui tub se amestec cu geloz topit i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore de incubare la 37C se numr plajele formate (coloniile negative de fagi). Numrul plajelor corespunde cu nr de fagi viruleni din materialul de examinat. APLICAREA PRACTIC A FAGILOR

n domeniul terapeuticTratamentul i profilaxia maladiilor infecioase

n domeniul diagnostic

Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc)Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a.

Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.

Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

36. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Principiile de clasificare. Forma si dimensiunile virusurilor. Metodele de studiu.

Virusuri = gene vagabonde = particule infectioase autonome, caracterizate prin:1. Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios2. Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)3. Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)4. Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari5. Nu cresc i nu se divid, se reproduc n celule vii 6. Nu cultiv pe medii artificiale, numai pe celule vii7. Rezisten natural la antibiotice

myxovirusuri: AN + capsida = nucleocapsida; reovirusuri: ARN dublu catenar

Rol capsida: protecia AN, rol antigenic, adeziune

Virusurile cu supercapsida realizeaza absorbtia prin intermediul ei ( utilizarea detergentilor pt inlaturararea supercapsidei ( inlaturare virulenta.

CLASIFICAREA VIRUSURILORDup tipul AN (cu genom ARN/ADN)

Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm)

Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt)

Dup gazd (om, animal, insect, bacterie)

Dup sensibilitatea n mediul extern, etc

Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae

Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae

Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae

Virusuri ARNd.c. : Reoviridae

Virion unitate structural infecioas a virusului

Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante

Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

COMPOZIIA CHIMIC I STRUCTURA VIRIONULUIVirusurile simple AN i nveli proteic capsida (nucleocapsid)

Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos)

AN ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat.

ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, ARNm) sau ARN- (caten fr sens)Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteic

Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric.

Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona

Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triungiulare i 12 vrfuri), eikos=20

Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile)

Funcia protecia AN, rol antigenic, adeziuneSupercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd (lipidele din membrana celular, glicoproteinele proprii)

Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune

Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc.

Aciunea factorilor fizici, chimici. Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu supercapsid. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 CREPRODUCEREA VIRUSURILORI ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism)

II PENETRAREA n celul: Pinocitoz (viropexis); Fuziunea membranelor; Translocare; Injectarea AN n citoplasm

III DECAPSIDAREA (enzime celulare)IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN)

Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN)

Biosinteza virusurilor ADN: ADNdc transcrierea ARNm, translaia (precoce, tardiv), replicarea, sinteza proteic

Biosinteza virusurilor ARN: ARN+ translaie, replicare, sinteza proteic; ARN- transcriere, ARNm, translaie, replicare, sinteza proteic; Retrovirusuri (ARN+) transcriere, ADN-, ADNdc, transcriere, ARNm, replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom)V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor

Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasm), glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apariia incluziunilor sau a corpusculilor elementari.

VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz)

Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent)37. Virusurile simple si complexe. Structura virionului. Etapele de interactiune a virionului cu celula gazda. RELAII VIRUS-CELULA GAZDInfecie viral productiv, citocid

Virusul este infecios iar celula permisiv. La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol)

Infecii virale persistente

Celulele infectate supravieuiesc cu producerea permanent sau intermitent a virusului.

Infecii abortive cu virioni defectivi infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic)Infecii integrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor)

Transformarea malign a celulei gazd

Manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a genomului viral (HIV-SIDA) infecii lente

Reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice virale (infecia herpetic) infecii latente

Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena simptomelor (hepatita viral B)38. Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si identificare a virusului izolat.Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic; Testarea infeciozitii