Licenta Final

Universitatea Politehnica Bucureti

Facultatea de Automatic si Calculatoare

LUCRARE DE DIPLOM

Absolvent, Conductor tiinific,

Adrian Filip Prof. univ. dr. ing. Ctlin Buiu

Bucureti, 2013

Universitatea Politehnica Bucureti

Facultatea de Automatic si Calculatoare

Catedra de Automatic si Ingineria Sistemelor

LUCRARE DE DIPLOM

STRUCTURA GLICOPROTEINELOR HIV CORELAII CU IMAGINI DE TOMOGRAFIE

ELECTRONIC

Absolvent, Conductor tiinific,

Adrian Filip Prof. univ. dr. ing. Ctlin Buiu

Bucureti, 2013

Cuprins

CAPITOLUL 1 INTRODUCERE ...................................................................................................... 1

CAPITOLUL 2 NOTIUNI SI CONCEPTE DE BAZ .......................................................................... 4

2.1 Structurile atomice .......................................................................................................... 4

2.1.1 Aminoacizii ................................................................................................................ 4

2.1.2 Proteinele .................................................................................................................. 5

2.1.3 ARN ........................................................................................................................... 9

2.2 Virusul ............................................................................................................................ 10

2.2.1 Definiie i caracteristici .......................................................................................... 10

2.2.2 Evoluia virusurilor .................................................................................................. 11

2.3 HIV .................................................................................................................................. 12

2.3.1 Etiologie .................................................................................................................. 13

2.3.2 Structur i funcionare .......................................................................................... 13

2.4 Determinarea structurii proteinelor .............................................................................. 14

2.4.1 Segmentarea ........................................................................................................... 16

2.4.2 nregistrarea ............................................................................................................ 16

2.4.3 Metode de filtrare ................................................................................................... 17

2.4.4 Tipuri de filtre ......................................................................................................... 17

2.5 Determinarea structurii nveliului (anvelopei virale) HIV ............................................. 18

2.6 Prezentarea programului UCSF Chimera ....................................................................... 20

2.6.1 Caracteristici ........................................................................................................... 20

CAPITOLUL 3 STUDIU DE CAZ: GLICOPROTEINELE HIV- simulri, fitari, rezultate ................... 22

3.1 GP120 ............................................................................................................................. 22

3.2 Fitari de GP120 n hri EM ............................................................................................ 26

3.2.1 Monomerul GP120 .................................................................................................. 26

3.2.2 Trimerul GP120 ....................................................................................................... 31

3.2.3 Concluzii privind fitarea .......................................................................................... 35

3.3 GP 41 .............................................................................................................................. 35

CAPITOLUL 4 CONCLUZII .......................................................................................................... 39

BIBLIOGRAFIE: .......................................................................................................................... 41

ANEXE ....................................................................................................................................... 42

1

CAPITOLUL 1

INTRODUCERE

Complexele macromoleculare stau la baza organismelor biologice. Un

complex macromolecular este compus din componente, cum ar fi proteinele i acizii ribonucleici (ARN). Obinerea structurilor att de complexe este critic pentru o mai bun nelegere a modului de functionare a acestora i de asemenea, pentru a nelege de ce uneori nu reuesc s funcioneze n mod corespunztor, aceasta fiind o cauz comun a multor boli.

O metod bine cunoscut utilizat pentru a determina structura complexelor

macromoleculare este cristalografia cu raze X. Cu aceast metod, hrile 3D de densitate de electroni sunt reconstruite din difracia pe tipare de cristal, de obicei, la o

rezoluie suficient de nalt astfel nct poziia fiecrui atom n parte s poat fi determinat. Totui complexele trebuie s fie cristalizate nainte de a fi aplicat aceasta metod. Astfel, aceasta nu poate fi aplicat n mod universal, de exemplu la complexele foarte mari, complexele care au structuri dinamice, sau complexele care

sunt ncorporate n membranele celulare.

Crio-microscopia electronic (crio-EM) este o form de microscopie electronic de transmisie (EM) pentru probe care sunt studiate la temperaturi criogenice (temperatura azotului lichid, n general).

Popularitatea crio-microscopiei provine din faptul c permite observarea de probe n mediul lor nativ, n contrast cu cristalografia cu raze X, care n general

necesit introducerea probelor n medii non-fiziologice, care poate duce uneori la

modificri funcionale. n practic, rezoluia harilor de crio-microscopie nu este suficient de mare pentru a permite construcia fr echivoc a modelului, de aceea modelele obinute prin cristalografierea proteinelor sunt folosite pentru a interpreta hrile crio-EM. Cu toate acestea, rezoluia harilor crio-EM se mbuntete n mod constant, iar unele structuri de virus obinute de sunt deja la o rezoluie care pot fi interpretate n termeni de model atomic.

O versiune a crio-microscopiei electronice este crio-tomografia de electroni

(CET), unde o reconstrucie 3D a unui eantion este creat din imagini 2D nclinate. O crio-tomografie poate fi folosit pentru a obine detalii structurale ale organizaiilor complexe celulare la rezoluii subnanometrice.Cu toate acestea, analiza unor subtomografii a unei singure particule poate mbuntii rezoluia pn la 15-30 Angstromi.

2

Structura virusului imunodeficienei umane (HIV) i a unor componente din alctuirea sa au fost dificil de a fi studiate n 3D, n primul rnd, din cauza

variabilitii structurilor intrinseci ale acestuia. Descoperirile recente crio-tomografie cu electroni (CET) au furnizat o nou abordare pentru determinarea structurilor 3D a

virusului intact, a capsidei HIV i a nveliului de glicoproteine localizat pe suprafaa virusului.

Lucrarea de fata abordeaz structura glicoproteinelor HIV, acestea reprezentnd un obiectiv major n obinerea unui vaccin. Infecia cu virusul imunodeficienei umane (HIV- human immunodeficiency virus) este o afeciune contagioas, specific uman, caracterizat printr-o evoluie stadial, cu semne iniiale de infecie acut, clinic reversibile, urmate de o lung perioad de laten, cu o stare de sntate aparent i cu reexprimare clinic final, progresiv.

Virusul distruge progresiv mecanismele de aprare ale gazdei i determin, dup un interval de timp variabil, instalarea sindromului de imunodeficien dobndit (SIDA/AIDS syndrome dimmunodepression acquise/acquired immune deficiency syndrome) stadiul final al bolii, caracterizat prin apariia infeciilor i/sau neoplaziilor oportuniste i afectarea n grade diferite a sistemului nervos i a altor aparate i sisteme.

Motivaia alegerii acestei teme este deci implicaia din ce n ce mai mare pe care o are HIV-ul n cadrul sistemului public de sntate att la nivel mondial, ct i la nivel naional, dar mai ales pentru studiul structurii i a modului n care acesta funcioneaz la nivel molecular.

Obiectivele generale urmrite n aceast lucrare sunt:

nelegerea modului de formare a proteinelor;

studiul glicoproteinelor HIV;

acumularea de cunotine privind tomografia electronica;

generarea unor imagini de tomografie electronic i formularea de concluzii pe baza acestora

Astfel n Capitolul 2. Noiuni i concepte de baz, vor fi prezentate acele noiuni i concepte referitoare la structura i sinteza proteinelor, noiuni despre virusul HIV, dar i mai multe informaii despre cristalografia cu raze X i crio-microscopia electronic. Toate acestea ne vor ajuta pentru o mai bun nelegere a studiului efectuat in capitolului 3.

Capitolul 3 , dup cum am menionat, este un Studiu de caz: glicoproteinele HIV , n care sunt efectuate diferite simulri i fitari n urma crora vor fi generate anumite rezultate. Pe baza acestor rezultate vor exista i comparaii i discuii pentru o mai bun nelegere a acestora. Principalul obiectiv al studiului fiind ce se ntmpl la nivel molecular cnd de un monomer sau trimer de GP120 se leag de CD4 i un anticorp.

3

Ultimul capitol este rezervat Concluziilor acestei lucrri, sintetiznd ideile principale referitoare la HIV, mai precis la structura glicoproteinelor din componena sa i important care o au acestea n realizarea unui vaccin n viitor.

4

CAPITOLUL 2

NOIUNI I CONCEPTE DE BAZ

2.1 Structurile atomice

O structur atomic este definit prin specificarea unei poziii 3D pentru fiecare atom care aceasta l conine, mpreun cu o list de legturi covalente ntre atomi. ntr-o molecul, fiecare atom este legat de cel puin un alt atom care este, de asemenea, n molecul. O structur poate consta dintr-o singur molecul sau poate

consta din mai multe molecule care sunt legate mpreun prin fore van der Waals i fore electrostatice. Structurile care sunt compuse din dou sau mai multe molecule sunt de obicei numite complexe moleculare. Macro-complexele moleculare sunt

compuse din dou sau mai multe molecule mari, cum ar fi proteinele sau acizii ribonucleici (ARN).

2.1.1 Aminoacizii

Aminoacizii sunt compui organici cu funciuni mixte care conin n molecula

lor grupa carboxil (-COOH) cu caracter acid i grupa amino ( ) cu caracter bazic, legate de un radical hidrocarbonat.

Dup poziia pe care o ocupa grupa amino fata de grup carboxil se deosebesc: , , , , aminoacizi. Poziia este vecina grupei carboxil.

Aminoacizii naturali sunt, cu puine excepii, aminoacizi. n compoziia

proteinelor intra, n mod constant, circa 20 de aminoacizi. Acetia sunt: alanin,

valin, leucin, izoleucin, prolin, triptofan, fenilalanin, metionin, glicocol, serin,

treonin, tirozin, asparagin, glutamin, cistein, acid aspartic, acid glutamic,

arginin, lisin, histidin (acesta din urm constituie un aminoacid esenial pentru

copiii cu vrsta sub 1 an). Dintre acetia, 8 sunt eseniali, adic nu pot fi produi de

organismul uman i trebuie adui din exterior, prin alimentaie (valina, leucina,

izoleucina, triptofanul, fenilalanina, metionina, lisina i treonina). (Figura 1)

5

Figura 1 - Tabel de aminoacizi naturali

Dintre cele dou grupe funcionale, amino i carboxil, prioritar n stabilirea denumirii este grupa carboxil. De aceea, denumirea unui aminoacid se obine prin adugarea prefixului amino la numele acidului.

Aminoacizii sunt substane cristaline care se topesc la temperaturi ridicate (peste 250 C) prin descompunere. Aminoacizii sunt solubili n ap i insolubili n solveni organici. Muli aminoacizi au gust dulce.

2.1.2 Proteinele

2.1.2.1 Definiie i etimologie

Proteinele sunt substane organice macromoleculare formate din lanuri simple sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente n celulele tuturor organismelor vii n

proporie de peste 50% din greutatea uscat. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, n care secvena acestora este codificat de ctre o gen. Fiecare protein are secvena ei unic de aminoacizi, determinat de secvena nucleotidic a genei.

Prima menionare a cuvntului protein a fost fcut de ctre Jakob Berzelius, descoperitorul acestora, n scrisoarea sa ctre Gerhardus Johannes Mulder din 10 iulie 1838, scrisoare n care menioneaz:

6

"The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted

to derive from [the Greek word] , because it appears to be the primitive or principal substance of animal nutrition".

(Numele de protein pe care l propun pentru denumirea compusului organic rezultat prin oxidarea fibrinei sau albuminei, l-am derivat din grecescul (proteios) deoarece pare a fi substana primitiv sau principal din nutriia animalelor).

2.1.2.2 Sinteza proteinelor

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celul i sintetizeaz proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza

ncepnd cu procesul de transcripie i terminnd cu procesul de translaie. (Figura 2)

Procesul de transcripie necesit prezena unei singure molecule de ADN dublu catenar, numit ADN ablon, molecul care intr n procesul de iniiere. Aici acioneaz enzima ARN polimeraza, enzim care se leag de o anumit regiune din molecula de ADN, regiune (denumit promoter), de unde va ncepe transcripia. Pe msur ce ARN polimeraza se leag de promoter, lanurile de ADN vor ncepe s se desfac. Urmtorul proces n care intr ADN este procesul de elongaie (alungire a catenei). Pe msur ce ARN polimeraza se mic de-a lungul catenei de ADN, are loc sinteza ribonucleotidelor complementare (ARNm - ARN mesager). Acest ARN, dup

cum i arat i numele, se poate deplasa i n alte pri ale celulei cum ar fi reticulul endoplasmatic sau citoplasm.

n timpul translaiei ARNm transcris din ADN este decodat de ribozomi pentru sinteza proteinelor.Acest proces este divizat n 3 etape:

Iniierea

Elongarea

Faza terminal.

Ribozomul are situsuri de legare care permit altei molecule de ARNt (ARN de

transfer), s se lege de o molecul de ARNm, proces nsoit de prezena unui anticodon. Pe msur ce ribozomul migreaz de-a lungul moleculei de ARNm (un

codon o dat) o alt molecul de ARNt este ataat ARNm. Are loc eliberarea ARNt primar, iar aminoacidul care este ataat de acesta este legat de ARNt secundar, care l leag de o alt molecul de aminoacid. Translaia continu pe msur ce lanul de aminoacid este format. La un moment dat apare un codon de stop

[4], o secven

format din 3 nucleotide (UAG, UAA), care semnaleaz sfritul lanului proteic. Chiar dup termminarea translaiei lanurile proteice pot suferi modificri post-translaionale i plierea lanului proteic, responsabil de structura secundar i cea teriar. Modificrile post-translaionale se refer la posibilitatea formrii de legturi disulfidice, sau de ataarea la scheletul proteic a diferite grupri ca rol biochimic: acetat, fosfat etc.

7

Figura 2 - Sinteza proteinelor

2.1.2.3 Structura proteinelor

Structura primar tipul, numrul i succesiunea aminoacizilor n caten. (Figura 3) Secvena aminoacizilor este rezultatul informaiei genetice. Indiferent de numrul aminoacizilor dintr-o protein, fiecare lan va avea la unul din capete un aminoacid cu gruparea NH2 liber (captul N terminal), iar la cellalt capt un aminoacid cu gruparea COOH liber (captul C terminal. Prin convenie, secvena aminoacizilor ntru-un lan polipeptidic se considera ntotdeauna de la captul N-terminal spre captul C-terminal.

Figura 3 - Structura primara a proteinelor

Structura secundar corespunde unor structuri spaiale regulate: a helix, pliata. Aceste structuri sunt realizate prin legturi disulfurice, ionice, de hidrogen, hidrofobe (Figura 4). Aceste tipuri de structuri se datoreaz proprietilor spaiale a legturii peptidice. Structurile a helix sunt stabilizate prin legturile de hidrogen intracatenare. Pe fiecare spir a a-helixului se afla 3, 6 resturi de aminoacizi. Legtur

8

de hidrogen se realizeaz ntre gruparea C=O i NH2 din dou spire vecine. Legturile de hidrogen sunt paralele cu axul helixului. n proteinele naturale sensul de rotire al helixului este spre dreapta (sensul acelor unui ceasornic).Structurile pliate sunt stabilizate prin legturi de hidrogen intracatenare. Poate fi cu lanuri paralele sau antiparalel. Triplul helix al colagenului este realizat prin intermediul

legturilor de hydrogen intra i intercatenare. Acest tip de structura se datoreaz prezenei prolinei i hidroxi-prolinei. Aceti aminoacizi nu pot participa la legturi de hidrogen. Structura colagenului prezint serii de trei aminoacizi n care glicina ocupa aceeai poziie. Glicina este poziionat n interiorul helixului. Fiecare spir conine un astfel de triplet.

Figura 4 Structura secundara a proteinelor

Structura teriara se refer la aranjarea spaial a acestor structuri secundare (poziionarea n spaiu a fiecrui atom). Este rezultatul unor legturi diverse (hidrogen, hidrofobe, electrostatice, covalente) ntre aminoacizii aceleiai catene dar care nu sunt vecini n structura primar (Figura 5). Datorit acestor interaciuni, lanul polipeptidic nu poate adopta o structur ordonat n spaiu, pe toat lungimea sa, ci structurile ordonate sunt separate de coturi sau bucle n care lanul polipeptidic nu adopta o structur ordonat. Structura tridimensional a unei proteine native n mediul su fiziologic este aceea pentru care energia liber a sistemului este minim. n funcie de structura teriara, proteinele se clasifica n: fibrilare i globulare. Legturile din cadrul structurii teriare sunt mai mult sau mai puin stabile, sunt influenate de mediu. De exemplu acizii i bazele tari intervin n legturile electrostatice ceea ce determina denaturarea proteinelor. Legturile disulfurice se realizeaz preponderent ntre resturi de cisteina. Agenii oxidani i reductori puternici pot oxida cisteina sau pot reduce legturile disulfurice denaturnd proteina.

9

Figura 5 Structura tertiara a proteinelor

Structura cuaternara se ntlnete la proteinele formate din mai multe subuniti.Este rezultatul unor legturi diverse (hidrogen, hidrofobe, electrostatice, covalente) ntre aminoacizii din catene diferite dar care sunt unite ntr-o singur molecul. Fiecare caten este denumit protomer. Structura cuaternara poate fi definit ca numrul, tipul i modul de legare a subunitilor (protemerilor) dintr-o entitate proteic cu activitate biologic bine definit. Ruperea legturilor dintre catene duce la denaturarea proteinei. (Figura 6)

Figura 6 Structura cuaternara a proteinelor

2.1.3 ARN

Acidul ribonucleic (ARN) este, ca i ADN-ul, un polinucleotid format prin copolimerizarea ribonucleotidelor. Un ribonucleotid este format dintr-o baz azotat

10

(adenin A, guanin G, uracil U i citozin C), o pentoz (D-2-dezoxiriboz) i un fosfat. n molecula de ARN uracilul nlocuiete timina. (Figura 7)

Molecula de ARN este monocatenar (este alctuit dintr-un singur lan polinucleotidic). Este un complex macromolecular similar, structural i funcional, n multe privine ADN-ului. ARN-ul rezult din copolimerizarea ribonucleotidelor, care determin formarea unor lanuri lungi, monocatenare.

Un ribonucleotid este format dintr-o baz azotat (adenin A,guanin G,uracil

U i citozin C),o pentoz (D-2-dezoxiriboz) i un fosfat. n molecula de ARN uracilul nlocuiete timina). Polimerizarea ribonucleotidelor se realizeaz prin legturi fosfodiesterice n poziiile 3-5

Compoziia nucleotidic (sau secvena, ordinea nucleotidelor n molecul) definete structura primar a moleculei de ARN. Datorit complementaritii bazelor n unele regiuni mai mari sau mai mici ale moleculei de ARN, n soluie i n funcie de temperatur, prin pliere i aparierea regiunilor complementare, molecula poate capta, formnd o bucl, o structur parial bicatenar. Aceast structur secundar este deosebit de important n funcia unor tipuri de ARN, ca, de exemplu, ARN-ul de transfer. Molecula de ARN poate adopta o structur tridimensional numit structur

teriar ce rezult din aparieri ntre bazele azotate diferite de aparierile clasice A-T i C-G.

Figura 7 - ARN

2.2 Virusul

2.2.1 Definiie i caracteristici

n biologie, un virus este un agent patogen inframicrobian, invizibil la

microscopul optic, care se reproduce numai n interiorul celulelor vii i provoac diverse boli infecioase numite viroze. Virusurile sunt parazii intacelulari, lipsii de metabolism propriu, motiv pentru care nu sunt considerate vii. (Figura 8)

11

Ca structur, virusul este o particul submicroscopic, alctuit dintr-o parte central

numit genom viral, format din material genetic, care poate fi ADN sau ARN, i o teac sau nveli protector de natur proteic, numit capsid. Capsida i genomul viral alctuiesc nucleocapsida. La virusurile mai complexe mai apare un nveli exterior de natur proteic numit pericapsid, peplos sau anvelop viral. Din punct

de vedere al prezenei nveliului pericapsidal, virusurile se mpart n dou categorii: nude i nvelite n peplos. The History of Vaccines: Viruses and Evolution, n.d., http://www.historyofvaccines.org/sites/default/files/inline-

pdfs/History_of_Vaccines_Viruses_and_Evolution.pdf.

Figura 8 - Virusul

Caracteristici:

dimensiuni foarte mici (de ordinum nm) ;

structura simpl;

parasitism dezvoltat (multiplicare doar n celule vii)

unitate morfofuncionala infecioasa = virion (corpuscul elementar)

2.2.2 Evoluia virusurilor

a) Virusuri ARN

Prima molecul vie a fost un ARN auto catalitic cu dubla aciune: codificare i enzimatica. Formele existente provin din ARN-ul primordial sau din interaciuni genetice intre virusurile ARN.

Mecanisme:

mutaii: defecte de transcriere cu rata mare i cu evoluie genetic rapid; pot fi punctiforme (virusul gripal = drift antigenic) sau mari (blocuri de gene) care

determin genotipuri noi

12

recombinarea (reorganizarea genetica): copierea alternativa cu rata mare ntre virusuri omologe (virusul polio intreserotipuri) i neomologe (virusul hepatitei oarecului / sens pozitiv i virusul gripal / sens negativ);

reasortarea: doar la virusurile cu genom segmentat prin schimburi de gene intre tulpini circulante animale i umane. Ex: virusurile gripale printr-o infecie mixt a virusurilor animale (aviare, porcine) cu virusurile umane determin apariia de tulpini noi cu potenial pandemic

b) Virusuri ADN

Evolutiv sunt superioare fa de virusurile ARN: transcripia se face cu sisteme celulare, sinteza ADN viral este concomitenta cu replicarea celulei prsite, au enzyme care stimuleaz sinteza de dezoxinucleotide, fac schimb de gene cu structure celulare. Provin din repliconi mobile: plasmide, transpozoni,

retrotranspozoni.

Mecanisme:

mutaii: rata mai mic, unele apar la presori de selecie (antivirale)

recombinarea: acapararea de gene noi de la alte virusuri sau gene celulare (inclusive de la plasmide sau epizomi)

2.3 HIV

HIV (Figura 9) reprezint prescurtarea n limba englez a Human

Immunodeficiency Virus (Virusul Imunodeficienei Umane). De fapt, acest termen denumete dou virusuri nrudite, din categoria retrovirusurilor, HIV-1 i HIV-2, care cauzeaz la om sindromul imunodeficienei dobndite (SIDA). Aparinnd retrovirusurilor, nu poate fi ndeprtat complet din organism pentru c acest tip de

virusuri are capacitatea de a-i nscrie codul n codul genetic al celulei gazd. O infectare cu HIV duce dup o perioad lung de incubare, de ani, chiar zeci de ani, la

declanarea bolii SIDA.

Figura 9 Virusul HIV

13

2.3.1 Etiologie

Iniial boal misterioas, cunoscut sub numele de GRID (gay related immunodeficiency) SIDA s-a dovedit a nu fi limitat numai la homosexuali i nici asociat efectului imunosupresor al spermei sau al drogurilor. n 1983 echipa profesorului Luc Montagnier, de la Institutul Pasteur comunic izolarea unui nou retrovirus, de la un bolnav cu limfadenopatie tipic asociat cu SIDA i iniial l-a denumit LAV (lymphadenopathy associated virus). n 1984 echipa de cercettori condus de profesorul Robert Gallo a descoperit un virus ce s-a dovedit a fi agentul etiologic al SIDA, confirmndu-se i identitatea acestuia cu LAV. n 1986 un comitet internaional de nomenclatur a dat virusului denumirea sa definitiv de HIV (virusul imunodeficienei umane).

Exist dou tipuri antigenic distincte: HIV-1 i HIV-2, ambele grupate ntre lentivirinae. HIV-2, izolat mai trziu (1986) i rspndit n Africa de Vest, n fostele colonii portugheze, s-a dovedit a fi mai puin patogen.

HIV-1 este cel mai rspndit i virulent retrovirus uman. El este probabil originar din Africa central de unde a diseminat pandemic. Variaia genetic este caracteristica major a HIV-1. Dou izolate de HIV- 1 nu sunt niciodat identice chiar dac ele provin de la acelai pacient. Analiza filogenetic a izolatelor de HIV- 1 a permis identificarea a cel puin 10 subtipuri agregate n dou grupuri:

- grupul M (major) cuprinznd subtipuri de la A la J i - grupul O (outlier - deviat), gsit n Camerun.

n Europa de Vest i n SUA subtipul B este cel mai rspndit, n Romnia subtipul F, iar n Asia subtipul E. n ultimul timp este frapant diseminarea unor noi subtipuri (africane, asiatice) n regiunea European. ntre arealele de rspndire african ale HIV- 1 i HIV- 2 exist o zon de suprapunere (Ghana, Coasta de Filde) unde infecia dubl este comun.

2.3.2 Structur i funcionare

HIV este un retrovirus circular, din specia lentivirusurilor. Infeciile cu acest tip de virus decurg de regul cronic, cu o perioad lung de laten, afectnd i sistemul nervos. Diametrul este de 100-200 nm este nconjurat de un nveli de lipoproteine.

n interiorul acestui nveli se gsesc circa 72-100 de complexe glicoproteice, formate dintr-o parte extern (GP 120) i o parte transmembranar de nveli (GP41). GP120 are rolul de legare de receptorii CD4 a celulei int. nveliul virusului se formeaz din membran celulei gazd i are deci o parte din proteinele membranare ale celulei gazd, de exemplu molecule HLA I i I i proteine de adeziune (legare). Copia ARN-ului viral se afl n interiorul a dou capside alturi de enzimele reverstranscriptaz, intergraz i proteaz, necesare pentru multiplicarea viral.

Genomul virusului HIV este mai complex dect cel a altor retrovirusuri.

Genele accesorii (vif, vpu, vpr, tat, rev, nef) au alturi de genele uzuale (gag, pol, env)

ndeplinesc mai ales funcii regulatoare. HIV este format din 2 lanuri scurte de ARN, compuse din 9200 nucleotide precum i enzime virale, clasificate astfel:

14

proteine structurale/enzime virale. Produii genelor gag, pol, env: revers-transcriptaza, proteaza, ribonucleaza i integraza, toate ncapsulate ntr-o anvelop lipidic, care conine antigenul GP120 cu rol foarte important n legarea de CD4 a genomului HIV.

proteine reglatoare Tat i Rev (HIV) i Tax/Rex (HTLV) moduleaz transcripia i sunt eseniale pentru propagarea virusului.

proteine auxiliare: Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Nef, unele cu rol nc neelucidat.

Dup intrarea n corpul uman, particulele virale sunt atrase datorit tropismului ctre cel mai apropiat receptor CD4, de a crui membran celular se

ataeaz prin fuziune sau prin endocitoz, dup care are loc intrarea n celul. Probabilitatea infectrii la ambele tipuri de HIV este determinat de capacitatea de

legare ct mai rapid de CD4, dar i de numrul de receptori CD4 aflai n jurul locului de penetrare a virusului n organism. n interiorul celulei are loc eliberarea

RNA din anvelopa viral. Enzimele ncep s produc gena pol, care la rndul su codeaz revers transcriptaza, enzima care transcrie fragmentul de ARN ntr-un

model de ADN proviral, utiliznd aparatul metabolic i de sintez proteic a celulei parazitate. Acest ADN proviral va fi integrat n ADN-ul celulei gazd prin intermediul integrazei, eliberat n citoplasm dup distrugerea anvelopei virale. Odat ce ADN-ul proviral este integrat n ADN-ul celulei gazd, nu mai poate fi

eliminat sau distrus dect prin distrugerea celulei nsi. ncepe replicarea HIV-ului n celula gazd. Celulele infectate pot elibera virionii prin fenomenul de nmugurire, sau eliberarea acestora dup liza celulei, fenomen care duce la

infectarea altor celule. Anticorpii anti HIV nu apar organismul mpotriva infeciei, iar infectarea viral poate persista foarte mult n ciuda unui titru nalt al anticorpilor.

2.4 Determinarea structurii proteinelor

Proiectele de secventializare a genomului produc un numr mare de secvene nucleotidice i acestea prin traducere genereaz un numr mare de secvene de aminoacizi. Oricum, este dificil predicia structurii unei proteine pornind d e la secvena sa de aminoacizi cnd nu sunt cunoscui omologi apropiai.

Din acest motiv, cercettorii determina structurile proteice experimental prin difracie cu raze X (cunoscut ca i cristalografie cu raze X) sau prin spectroscopie cu rezonana magnetic nuclear (RMN), ambele procedee foarte laborioase.Ambele metode ofer informaii cu poziiile relative ale atomilor din molecul (coordonate atomice).Cristalografia cu raze X nu ofer poziiile pentru atomii de hidrogen spre deosebire de RMN.

Produsul final al unei determinri structurale cristalografice l reprezint o hart a densitii electronilor, care este de fapt un contur punctat ce indica acele regiuni din cristal unde pot fi gsii electronii din molecul. Aceast hart trebuie interpretata n sensul unui model atomic cu ajutorul unor proceduri de calcul

semiautomate. Produsul final al unei determinri structurale prin RMN este de obicei un set de distane ntre nucleii atomilor care definesc att legturile atomice ct i contactele apropiate din interiorul moleculei. Interpretarea se face

prin metode automate.

15

n primul rnd, proteina trebuie cristalizat. Acesta este adesea un proces limitativ n determinarea structurii, n special n cazul proteinelor membranare. Apoi

trebuie nregistrat modelul de difracie din cristal. Spre deosebire de cristalografie, determinarea structurii prin RMN se face n soluii apoase, dar proteina trebuie s fie solubila fr s agrege la concentraii apropiate de cele ale unei proteine n structur cristalin. Determinarea prinRMN necesita dou tipuri de date. Primul tip este reprezentat de msurarea rezonantei magnetice nucleare a protonilor, atomilor de carbon i azot marcai radioactiv din molecul. Al doilea tip de date este reprezentat de distanele internucleare deduse prin perturbarea rezonantei diferiilor atomi i observarea rezonantei la care rspund; numai la atomii aflai la o distan mai mic de 5 unul de altul se observa acest efect, iar magnitudinea efectului variaz cu distana dintre atomi. Setul de distane internucleare aproximative este folosit apoi pentru construcia unui model structural consecvent datelor. Spre deosebire de difracia cu raze X, care ofer o imagine static (o medie n timp i spaiu) a structurii proteice, RMN are capacitatea de a msura anumite proprieti dinamice ale proteinelor n timp.

Crio-tomografia de electroni (crio-ET) permite vizualizarea structurilor

celulare n condiii aproape de-viata la o rezoluie molecular. Printre tehnicile utilizate n biologia celular, crio- tomografia de electroni (crio-ET) este una relativ

recent. Combina avantajele unei imagini 3D conservare aproape de via i permite studierea materialului biologic la rezoluie molecular. Congelarea rapid, urmat de investigarea probelor congelate-hidratate evit obiecte cunoscute pentru procedurile

Wxation i de deshidratare chimic. n plus, materialul biologic este direct observat, fr ncrcare cu metale grele, evitarea problemelor de interpretare cauzate de acumularea imprevizibil de material. Prin urmare, crio-ET a celulelor ntregi are avantajul c arhitectura supramolecular poate fi studiat n medii celulare neperturbate.

Microscopia electronic (EM) n general, i crio-ET, ofer imagini statice pentru un sistem biologic, la fel ca cristalografia cu raze X. n ciuda acestei limitri

aparente, ambele metode pot oferi un cadru structural pentru o mai bun nelegere a mecanismului de funcii moleculare i celulare. Crio-ET a mpins deja limitele rezoluiilor i a crescut fidelitatea imaginilor, i ne putem atepta ca aceast tendin s continue.

Diferite abordri au fost folosite pentru a ajuta la detectarea sau identificarea

de structuri i, de asemenea, pentru a permite imaginilor stucturilor intracelulere crio-ET s fie anlizate. Aceasta este o ramur foarte tnr, i, prin urmare, literatura de specialitate nu este extins. Am acordat o atenie deosebit la metodele folosite i la dezvoltarea de metode care ar putea fi relevante pentru viitor. Metodele au fost

separate n dou categorii principale. Pe de o parte sunt manipulri genetice i farmacologice, care sunt folosite de-a lungul liniilor de paradigm de baz Cnd se aplic pe crio-ET, un numr de tomografii sunt nregistrate pentru mostre din fiecare

grup i o valoare este asociat cu fiecare tomogram a cu scopul de a evalua efectul unui tratament. Microscopia optic corelativ (LM) i metodele de EM se ncadreaz n a doua categorie. Avantajul acestei abordri este c LM furnizeaz informaii despre un mediu mai mare i strile funcionale ale structurilor vizualizate n crio-ET, sau, alternativ, se extinde rezoluia.

16

Rezoluia relativ sczut a harilor de densitate crio-EM face ca extracia de informaii structurale s fie o provocare. Instrumentele folosite pentru a construi modele atomice ntr-o harta de densitate de electroni de la cristalografia cu raze X nu

au fost nc aplicate succes, deoarece aceste instrumente necesit rezoluii mai mari. Prin urmare, segmentarea i metodele de nregistrare sunt de obicei folosite pentru a extrage informaii structurale din hri de densitate Crio-EM.

Segmentarea i metodele de nregistrare utilizate n prezent n analiza hrilor de densitate crio-EM au limitri serioase, aa cum va fi descris mai jos. Aceste limitri vor fi accentuate n mai ru cu ct dimensiunea i complexitatea hri de densitate obinute continu s creasc.

2.4.1 Segmentarea

n timpul procesului de segmentare, scopul este de a identifica regiuni ntr-o

hart de densitate care aparin componentelor moleculare individuale. Acest lucru ne ajut s nvm ce componente alctuiesc un complex, i cum compoziia s pot fi legat de funcia care o ndeplinete. Metodele actuale de segmentare aplicate hrilor de densitate crio-EM necesit o mulime de ndrumri de la utilizator, i, prin urmare, necesita o fora de munc intensiv. Rezultatele depind n mare msur de abilitile i cunotinele utilizatorului, i prin urmare, ele pot fi foarte subiective.

Segmentarea hrilor de densitate Crio-EM este o problem grea din mai multe motive. n primul rnd, regiunile care urmeaz s fie segmentate sunt de natura

3D, i interacionnd cu stucturi 3D pe dispozitivele de afiare 2D nu este o sarcin uoar. n al doilea rnd, formele moleculare sunt foarte complexe, i, astfel, nu este uor pentru utilizatorii cu mai puin experien i mai puine cunotine s identifice aceste forme. n al treilea rnd, graniele dintre componentele moleculare nu sunt foarte clare atunci cnd vizualizezi o hart de densitate, i astfel, sunt greu de identificat. Pentru a rezolva aceste probleme, metoda de segmentare trebuie fie n

msur s se ocupe eficient de date 3D, i de a fi n mare msur automat, astfel nct utilizatorii s nu fie nevoii s identifice singuri formele 3D.

2.4.2 nregistrarea

Procesul de nregistrare implic luarea dintr-o structur cunoscut a unei componente moleculare, de exemplu obinut folosind cristalografia cu raze X, i plasarea acestuia, ca si cum ar suprapune cel mai bine o component similar n harta de densitate. nregistrarea unei structuri pe o hart de densitate este un instrument util

de analiz. Deoarece hrile Crio-Em au o rezolutie redusa, ele nu pot fi folosite entru a determina n mod direct poziiile atomice a fiecrei componente. nregistrarea structurilor cu harta poate fi folosita ca o modalitate de a construi modele structurale

la nivele atomice ale complexele capturate n harta de densitate folosind Crio-Em.

Mai mult, procesul de nregistrare poate fi folosit pentru a descoperi relaiile dintre

17

majoritatea structurilor cunoscute n prezent i hrile de densitate realizate de Crio-Em.

2.4.3 Metode de filtrare

Aplicarea unui filtru pentru o imagine este, de obicei, un pas important nainte

de aplicarea unei metode de segmentare. Filtrele pot fi n general mprite n filtre liniare i filtre neliniare. Filtrele liniare includ filtre trece-jos, care pstreaz doar frecvenele joase dintr-o imagine i, astfel, au un efect de netezire, i filtre trece-sus, care pstreaz doar frecvene mai mari, subliniind deobicei contururi n jurul obiectelor. Un filtru pe baza funciei Gauss, de exemplu, este un filtru trece-jos, n timp ce un filtru care calculeaz magnitudini de nclinare este un filtru trece-sus. (Figura 10)

Filtrele trece sus sunt standard n procesarea imaginii pentru viziulizarea

computerizata i analiza imaginilor medicale, deoarece acestea evidentieaza conturul n jurul obiectelor. Filtrele trece-jos netezesc imaginea, reducnd astfel zgomotul de

nalt frecven i n acest sens au de asemenea tendina de a estompa contururile n jurul obiectelor. Pentru a reduce neclaritatea contururilor obiectelor, pot fi utilizate

filtre trece-jos anizotrope, care ncearc sa netezeasca n direcii perpendiculare pe contururi , reducnd astfel efectul de neclaritate pe contur.

Figura 10 Graficul unui filtru gaussian

2.4.4 Tipuri de filtre

a) Filtrare-spaiala

Teoria de scalare spaiala este un cadru de reprezentare semnal multi-scal dezvoltat pentru vizualizarea computerizat, pentru prelucrarea imaginii i pentru comunitile de procesare a semnalului cu motivaiile complementare de la fizic i vizualizare biologice. Este o teorie formal pentru manipularea structurilor de imagine la scri diferite, prin reprezentarea unei imagini ca o familie monoparametru de imagini netezite.

Filtrarea spaial a imaginilor digitale este o operaie care se aplic local, la nivelul fiecrui pixel din imagine, nlocuind valoarea pixelului curent cu o valoare ce depinde de valorile pixelilor vecini (de aici i denumirea lor de filtre spaiale se considera o vecintate spaial n sistemul de coordonate asociat imaginii). Aceste filtre opereaz pe vecinti mici, intre 3x3 i 11x11.

18

b) Filtrele de mediere sunt n general filtre liniare aplicate printr-o operaie de convoluie a imaginii cu un nucleu (masca) de convoluie. Ele determina o mediere ponderat a vecinilor. Sunt mai eficiente pentru imagini cu zgomot uniform sau zgomot gaussian.

c) Filtrele ordonate sunt filtre neliniare implementate prin ordonarea

cresctoare a valorilor pixelilor din vecintatea pixelului curent. Aceasta ordonare se folosete pentru a selecta una dintre valori. Filtrele ordonate (n special filtrul median) sunt mai eficiente pentru imaginile cu zgomote salt-and-

peper, zgomote exponenial negative i zgomote Reyleigh.

Un filtru care i schimba comportamentul bazndu-se pe caracteristicile nivelelor de gri ale vecinilor este numit filtru adaptativ, i aceste filtre sunt des folosite n multe aplicaii practice.

2.5 Determinarea structurii nveliului (anvelopei virale) HIV

nveliul de glicoproteine trimerice al HIV-1, compus din subunitile GP120

i GP41, rmne un obiectiv major pentru dezvoltarea unui vaccin. Structurile din regiunile centrale ale monomerului GP120 i GP41 au fost determinate anterior prin cristalografie cu raze X. Perspective noi n structura nveliului de glicoproteine trimerice HIV-1 vin acum de la tomografiile i studiile crio-electronice asupra

GP120/GP41 din virui intaci. Cunoaterea structurii moleculare a nveliului trimeric pe virusuri intacte este

importanta att pentru nelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza

interaciunilor virus-celula ct i pentru proiectarea de imunogeni eficieni de combatere a HIV / SIDA. S-au luat mai multe msuri importante de-a lungul ultimilor

doi ani fa de nelegerea structurii nveliului trimeric al glicoproteine i baza structural de intrare a HIV-ului i neutralizarea acestuia.

S-au efectuat studii ce au dus la o prim determinare a structurii de GP120

trimeric pe suprafaa membranei HIV-1 n stare neliganda, n complex cu anticorpii cu spectru larg de neutralizare b12 i ntr-un complex ternar cu CD4 i anticorpi 17b. S-a demonstrat c legturile CD4 rezultate determin o reorganizare major a

nveliului trimeric, provocnd o rotaie exterior i deplasarea fiecrui monomer GP120. Aceast descoperire a strilor nchise i deschise ale trimerului GP120 a oferit o nou paradigm de a interpreta i de a nelege schimbrile conformaionale ale nveliului de glicoproteine relevante pentru infecia viral. Prelungirea acestor studii

pentru un numr de tulpini HIV furnizeaz perspective noi i neateptate n organizarea molecular a nveliului trimeric din strile fr liganzi i n complexul cu anticorpi de neutralizare ct i non-neutralizani. Virusuri CD4-independente sunt adesea gsite n zonele imun-privilegiate ale corpului, cum ar fi sistemul nervos

central. Descoperirile sugereaz o explicaie structural pentru mecanismul molecular de infectare viral independentaCD4 i folosirea n continuare a tomografie crio-electroni pentru a descoperi structuri distincte, relevante din punct de vedere a

funciei ndeplinite, cuaternare a nveliurilor de pe viruii intaci. Folosind microscopia electronic cu scanare a ionilor de uzur, tomografia de

electroni, i microscopia la super-rezoluie, s-au analizat arhitecturile spaiale a

19

contactelor celula-celula i distribuia virionilor HIV la sinapse virusologice formate

ntre celulele dendritice mature i celulele T.. Viruii sunt detectai la suprafaa membranei att celulelor dendritice ct i celulelor T, dar virionii nu sunt eliberai pasiv la sinapse; n loc transferul virusului necesit angajamentul receptorilor celulelor T CD4.Izolarea relativ a celulelor T din mediul extracelular, ngroparea

locului transferului HIV i iniierea receptor-dependent a transferului virion prin celule T evidenia noi aspecte de transmitere celul-celul HIV, i sugereaz noi abordri pentru limitarea rspndirea HIV / SIDA

Infectarea celulelor int cu virusul imunodeficienei umane (HIV), o particul cu dimensiuni de la 100 nm pn la 150 nm, urmrete interaciunea nveliului sau de suprafaa de glicoproteine cu receptorul CD4 celular i co-receptori, cum ar fi CCR5 i CXCR4. Aa cum este afiat pe suprafaa membranei virale, nveliul este un trimer, compus din trei copii de heterodimeri necovalenti asociai ai GP120,

component care interacioneaz cu receptorii celulari, i GP41, component transmembranara necesar pentru realizarea fuziunii dintre membrana viral i int. nveliul trimeric, este heterogen n aproape toate privinele posibile: n plus fa de mutaiile constante care altereaz compoziia genetic a virusului n gazdele infectate i numrul variabil de nveliuri trimerice afiate pe suprafaa membranei, fiecare virus circulant poate fi mpnzit cu alte proteine din membran gazd, de dimensiuni diferite, care sunt glicolizate diferit.

Primele descoperiri n structura de HIV-1 GP120 au fost raportate ntr-o

lucrare , care prezenta structur cristalin a unui nucleu monomer GP120 legat de o

CD4 solubil construi i de un fragment Fab de anticorpi monoclonali 17b. Dei GP120 folosit pentru cristalizare a fost dintrun nucleu trunchiat diglicolizat,

reprezentnd 60% din polipeptide, aceast structur a lansat arhitectura de ansamblu,

precum i interfeele moleculare implicate n legarea de CD4 i simularea co-receptorilor 17b. Cunotinele dobndite din aceast structur au fost utilizate pentru a mbunti eficacitatea i simularea micro-moleculelor CD4 i pentru a proiecta o sond pentru izolarea mai multor linii mari de anticorpi de neutralizare, cum ar fi

VRC01 .n urma acestui raport iniial, s-au publicat peste dou duzini de structuri cristaline de nuclee de monomer GP120 din HIV-1 n stare liber, sau n complex cu

diferii anticorpi i / sau reactivi.

Crio-tomografia de electroni a aprut ca un instrument puternic pentru a

reduce decalajul dintre biologia structural i celule prin furnizarea de hri de rezoluie intermediar ale ansamblurilor moleculare complexe i heterogene, care nu pot fi analizate prin cristalografie. Metodele tomografice permit reconstrucia tridimensional a structurilor ntregii de virioni HIV-1 prini ntr-o stare aproape nativ. Mai mult, analiza tomografica a virusurilor care au fost incubate cu diferii

anticorpi i / sau liganzi pot furniza structurile native complet glicozilate de trimeri funcionali din nveliul de glicoproteine, captate ntr-o serie de stri conformaionale.

Prin combinarea tomografiei crio-electronica cu imaginea medie i montarea de structuri de raze X ale structurilor selectate de GP120 conjugate, au fost

determinate conformaia cuaternar de complexe trimerice afiate pe virui intaci i rezolvate controversele timpurii cu privire la posibilitatea formrii unei singure tulpini

de nveli de glicoproteine trimerice. Cristalografia cu raze X i crio-tomografia de electroni, fiecare ofer informaii necesare pentru a nelege mecanismele molecular GP120. De exemplu, studiile cristalografice de raze X asupra nveliului legat fie de

20

CD4 (care iniiaz infecia), fie de anticorpul de neutralizare VRC01 (care blocheaz infecia) sunt extrem de asemntoare, cu interfee moleculare aproape identice implicate n contact a GP120 cu aceti doi liganzi . Cu toate acestea, atunci cnd aceste structurile sunt determinate folosind tomografia crioelectronica, exist

diferene dramatice n structura cuaternara care ajuta la explicarea un aspect mecanic important al anticorpului VRC01. Astfel, VRC01 nchide nveliul de glicoproteine

ntr-o conformaie nchisa, n care GP41 i componentele sale fusogenice sunt ngropate la nucleu, n timp ce legarea CD4 induce o conformaie deschis, care permite expunerea GP41 i iniierea n trepte consecutive din procesul de infecie.

Profundele diferene observate n cazul legrii de CD4 sau VRC01, n ciuda faptului c acetia se leag de pri similare ale monomerului GP120, sublinieaza importanta metodei folosite, cum ar fi crio-ET pentru a determina structurile de

cuaternale. Aceste diferene sunt, de asemenea, reflectate prin studii biochimice care arat c nveliul exterior legat de VRC01 nu afieaz modificri conformaionale ample, care sunt observate atunci cnd se leag de CD4, n conformitate cu concluziile de la crio-ET.

2.6 Prezentarea programului UCSF Chimera

UCSF Chimera (sau pur i simplu Chimera) este un program extensibil pentru vizualizare interactiv i analiz a structurilor moleculare i date aferente, inclusiv hri de densitate, ansambluri supramoleculare, aliniamente de secvene, traiectorii, i ansambluri conformaionale. Pot fi create att imagini ct i filme de nalt calitate.

Chimera include documentaia complet i poate fi descrcat gratuit pentru utilizare non-comercial.

Chimera este dezvoltat de departamentul de Resurse pentru Bioinformatica,

Vizualizare i Informatic (RBVI), de la Universitatea din California, San Francisco. Dezvoltarea este finanat de Naional Institutes of Health (NIGMS acorda P41-GM103311).

2.6.1 Caracteristici

a) Analiza general a structurii

identificare automat a tipurilor de atomi

msurtori: distanta, unghiuri, suprafa, volum

calculul centroidelor, axelor, planurilor i msurtori associate

poate s ncarce proteine din baze de proteinte (PDB), hri de densitate (EMDB), etc.

crearea uoar de atribute personalizate

set bogat de comenzi

b) Prezentare de imagini i filme

imagini de rezoluie nalt

efecte vizuale, inclusive umbre, margini de siluet, fundaluri multicolore

reprezentri molecular standard (bastoane, sfere, panglici, suprafee moleculare)

interfa grafic simpl pentru crearea de filmulee interactive

21

scenele pot fi plasate ca cadre cheie de-a lungul unei cronologii animate

c) Instrumente de date de volum

multe formate a harilor de volum de date (exemplu: densitatea de electroni)

ajustare prag interactive

hrile de densitate pot fi create de la coordonatele atomice

multe instrumente pentru segmentarea i editarea harilor de densitate

filtrare Gaussiana, transformat Fourier

O list a comenzilor de referin din cadrul programului UCSF Chimera o putei gsi la Anex 1.

22

CAPITOLUL 3

STUDIU DE CAZ: GLICOPROTEINELE HIV- simulri, fitari,

rezultate

3.1 GP120

Prima parte a studiului a constat din identificarea ultimelor structuri de GP 120

din baza de date proteice PDBE, obinute prin cristalografia cu raze X. Acestea sunt: 1gc1, 1yyl, 2b4c, 2i5y, 2nxy, 2ny4, 2ny7, 2qad, 3dnl, 3dnn, 3dno, 3fus, 3hi1, 3idx,

3idy, 3jwd, 3jwo, 3lqa, 3ngb, 3rjg, 3rjq, 3se8, 3se9, 3tgg, 3tgq, 3tgr, 3tgs, 3tgt, 3tih,

3u7y, 4dko, 4dkp, 4dkq, 4dkr, 4dku, 4dkv, 4i3r, 4i3s, 4i53, 4i54, 4j6r, 4jan, 4jb9,

4jdt, 4jkp, 4jm2, 4jpj, 4jpk, 4jpv, 4jpw. Pentru a oferi o comparaie a asemnrilor i diferenelor dintre diferitele structuri GP120 am realizat o suprapunere i aliniere a tutoror n funcie de 1GC1 (Figura 11):

Figura 11 Suprapunerea si alinierea actuala a structurilor GP120

Spre deosebire de aceast suprapunere i aliniere, n studiile anterioare unde s-au folosit doar structurile: 3ngb, 3tgt, 3se9, 3se8, 4dkr, 4dkq, 4dkp, 4dko, 3u7y, 3rjq,

3tgs, 3tih, 3tgq, 3jwd, 2b4c, 2qad, 3hi1, 1gc1, 2i5y, 1yyl, 3lqa, 3idx, 2ny7 (Figura 12)

23

Figura 12 Suprapunerea si alinierea veche a structurilor GP120

Pentru a evidenia aceast diferen de imagine ct i multitudinea de mutaii care le sufer virusul HIV la nivel de glicoproteine am redus studiul la o comparaie ntre structura 1GC1 descoperit n anul 1998 i 4I54 descoperit n anul 2013.

Cod PDB 1gc1

Nume molecula HIV-1 GP120 CORE COMPLEXED

WITH CD4 AND A NEUTRALIZING

HUMAN ANTIBODY

Rezolutie 2.5

Data publicare 1998

Metoda X-ray

Publicata in Structure of an HIV GP120 envelope

glycoprotein in complex with the CD4

receptor and a neutralizing human antibody.

Imagine

Harta de densitate simulata

24

Cod PDB 4i54

Nume molecula Crystal structure of clade A/E 93TH057

HIV-1 GP120 H375S core in complex with

DMJ-II-121

Rezolutie 2.5

Data publicare 2013

Metoda X-ray

Publicata in Structure-Based Design and Synthesis of

an HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-

Ray and Thermodynamic

Characterization

Imagine


Aa cum se poate observa i din tabelele de mai sus metoda folosit pentru determinarea structurilor a fost cristalografia cu raze X la o rezoluie de 2.5 . Detaliile suplimentare referitoare la aceste dou structuri ar fi acelea ca 1GC1 este alctuit din lanurile G, C, L, H iar 4I54 din lanurile A i B.

25

Am efectuat o aliniere a celor 2 structuri rezultnd figura 13:

Figura 13 Suprapunerea si alinierea structurilor 1GC1 si 4I54

n urma acestei alinieri am fcut un studiu cantitativ reprezentat n procente a gradului de asemnare la nivel de aminoacizi a lanurilor din 1GC1 cu cele din 4I54. De exemplu comparnd lanul G din 1GC1 cu lanul A din 4I54 am ajuns la o asemnare de 61,37% . Figur de mai jos artnd exact prile comune fiecruia, dar i prile distincte. (Figura 14)

Figura 14 Rezultate analiza la nivel de aminoacizi a lanturilor din 1GC1 cu 4I54

26

Dac cu lanul G a existat o asemnare de 61,37% , cu lanul C gradul de asemnare este de 0.00 % , acest lucru arata ntocmai diferententele mari existente.

3.2 Fitari de GP120 n hri EM

n urma acestora vom reui s nelegem detaliile la nivel molecular care stau la baza ncercrilor de a dezvolta un vaccin, care s reueasc s provoace reacia unor anumitor tipuri de anticorpi. Una din cele mai promitoare locuri int n dezvoltarea vaccinului este locul unde se leag CD4 de anvelop viral. Virusul folosete acest loc pentru a intra n celulele care le infecteaz. n teorie anticorpii care acioneaz n blocarea acestui lucru ar putea proteja celulele de la infecie. n practic ns, civa anticorpi indentificati de la indivizii infectai cu HIV acioneaz asupra intrrii virale, dar din motive necunoscute, nu se pot lega, prin urmare nu reuesc s opreasc rspndirea virusului. Doar unul , anticorpul fab 17b, pare a fi efficient, neutraliznd aproximativ jumtate din circulaia virusului; doar fab 17b se poate lega de trimerul GP120, dar imediat ce GP120 este izolat din aceast formaie de trimer se leag de acesta pn i anticorpii ineficieni. Teoretic efortul vaccinului poate localiza fab 17b, dar trimerul GP120 nu este suficient de stabil pentru a fi folosit ca imunogen

ntr-un vaccin. Ca rezultat ns, efortul vaccinului de a localiza fab 17b folosete n cele mai multe cazuri doar monomerul GP120, care din nefericire provoac i legarea altor anticorpi, majoritatea ineficieni.

n cele ce urmeaz am realizat diferite simulri pentru a vedea ce se ntmpl la nivel de molecular atunci cnd de monomerul GP120 este n stare liber, n comparaie cnd de acesta se leag doar de CD4, dar i de CD4 i de fab 17b. Dar i simulri privind trimerul GP120 n stare liber n comparaie cnd de acesta se leag doar de fab 17b, dar i de CD4 i fab 17b.

Pentru a descrie calitatea fitarii (potrivirii) unui model atomic n hrile EM se folosete un coefficient de corelaie dintre acestea. Fitarea raporteaz de asemenea numrul de atomi aflai n afar suprafeei hrii, dar i matricea de rotaie i translaie, i unghiul de rotaie n grade.

3.2.1 Monomerul GP120

a) Monomerul n stare liber

n simulare am folosit monomerul GP120 din structura 1GC1 fitat pe harta de

densitate EM-5020.

27

Figura 15 Coeficient de corelatie: monomer GP120 in stare libera pe harta EM-5020

Figura 16 Unghiul de rotatie: monomer GP120 in stare libera pe harta EM-5020

Rezultatele obtinute:

Fit molecule 1gc1.ent (#0) to map emd_5020.map using 2702 atoms

average map value 4.299

steps 148

shifted from previous position 80.5

rotated from previous position 52.7 degrees

atoms outside contour 403

contour level 1.8319

28

Position of 1gc1.ent (#0) relative to emd_5020.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.28545666 -0.90942686 -0.30241905 226.42613178

0.54662832 0.41368477 -0.72805383 223.47707605

0.78721787 0.04251700 0.61520756 154.62319381

Axis 0.39013446 -0.55167531 0.73719024

Axis point -139.95849055 325.03730265 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

80.95706829

Shift along axis 79.03655961

b) Monomerul GP120 legat cu CD4

Figura 17 Coeficient de corelatie: monomer GP120 legat cu CD4 pe harta EM-5020

29

Figura 18 Unghiul de rotatie: monomer GP120 legat cu CD4 pe harta EM-5020

Rezultate obtinute:

Fit molecule 1gc1 (#1) to map emd_5020.map using 4230 atoms


steps 108





Position of 1gc1 (#1) relative to emd_5020.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

-0.02647369 -0.77387965 -0.63277913 245.92483034

-0.94566369 -0.18581873 0.26681750 208.53161308

-0.32406685 0.60545990 -0.72691058 248.12947598

Axis 0.69198406 -0.63082467 -0.35102462

Axis point 0.00000000 195.61424380 202.41450991

Rotation angle

(degrees)

159.36651815

Shift along axis -48.47037963

c) Monomerul GP120 legat de CD4 si fab 17b

Figura 19 Coeficient de corelatie: monomer GP120 legat cu CD4 si fab 17b pe harta EM-5020

30

Figura 20 Unghiul de rotatie: monomer GP120 legat cu CD4 si fab 17b pe harta EM-5020

Rezultate obtinute:

Fit molecule 1gc1 (#1) to map emd_5020.map using 7877 atoms


steps 120

shifted from previous position 24




Position of 1gc1 (#1) relative to emd_5020.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

-0.14807590 0.55687307 -0.81729181 288.40830500

-0.92261467 -0.37540283 -0.08862774 191.54884444

-0.35616807 0.74092179 0.56936738 179.07595898

Axis 0.47193932 -0.26233808 -0.84169591

Axis point 256.09869473 -44.89492774 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

118.49327965

Shift along axis -64.86683780

31

3.2.2 Trimerul GP120

a) Trimerul GP120 in stare libera

Pentru rezultate cat mai precise am folosit structura 3dnn pe harta de densitate EM-

5019

Figura 21 Coeficient de corelatie: trimerul GP120 in stare libera pe harta EM-5019

Figura 22 Unghiul de rotatie: trimerul GP120 in stare libera pe harta EM-5019

32

Rezultate:

Fit molecule 3dnn (#0) to map emd_5019.map using 6738 atoms


steps 48





Position of 3dnn (#0) relative to emd_5019.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99999989 0.00039121 -0.00026892 -0.03732896

-0.00039130 0.99999987 -0.00034018 0.11553294

0.00026879 0.00034028 0.99999991 -0.73464496

Axis 0.58253071 -0.46032657 -0.66989358

Axis point 785.81421066 716.89174567 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

0.03346368


b) Trimerul GP120 legat de fab 17b

In aceasta simulare am folosit structura 3dnl pe harta de densitate EM-5018

Figura 23 Coeficient de corelatie: trimerul GP120 legat cu fab 17b pe harta EM-5018

33

Figura 24 Unghiul de rotatie: trimerul GP120 legat cu fab 17b pe harta EM-5018

Rezultate obtinute:

Fit molecule pdb3dnl.ent (#1) to map emd_5018.map using 6738 atoms


steps 48





Position of pdb3dnl.ent (#1) relative to emd_5018.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99903530 -0.04389329 -0.00135927 9.43196879

0.04389362 0.99903619 0.00020797 -8.90859972

0.00134883 -0.00026743 0.99999905 1.47906789

Axis -0.00541272 -0.03083344 0.99950988

Axis point 206.38673224 210.55789957 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

2.51695239


34

c) Trimerul GP120 legat de CD4 si fab 17b

Strutura folosita a fost 3dno fitata pe harta de densitate EM-5020

Figura 26 Coeficient de corelatie: trimerul GP120 legat cu CD4 si fab 17b pe harta EM-5020

Figura 27 Unghiul de rotatie: trimerul GP120 legat cu CD4 si fab 17b pe harta EM-5020

35

Rezultate:

Fit molecule 3dnn (#0) to map emd_5019.map using 6738 atoms


steps 48





Position of 3dnn (#0) relative to emd_5019.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99999989 0.00039121 -0.00026892 -0.03732896

-0.00039130 0.99999987 -0.00034018 0.11553294

0.00026879 0.00034028 0.99999991 -0.73464496

Axis 0.58253071 -0.46032657 -0.66989358

Axis point 785.81421066 716.89174567 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

0.03346368


3.2.3 Concluzii privind fitarea

n urma studiului am realizat c dup ce GP120 se leag de CD4, are loc o

schimbare la nivel de structur, provocnd o rotaie exteriora i deplasarea fiecrui monomer GP120. Acesta este strns legat de o rearanjare a regiunii GP41 de-a lungul

axei centrale a trimerului, ceea ce duce la un contact mai apropiat ntre membranele

celulelor virale i int.

3.3 GP 41

Primii pai efectuai pentru studiul GP120 i-am repetat i pentru urmtoarele structuri de glicoproteine GP41: 1aik, 1df4, 1dlb, 1env, 1f23, 1i5x, 1i5y, 1k34, 1qr9,

1szt, 2cmr 2ot5, 2x7r, 2xra, 2z2t, 3aha, 3cp1, 3cyo, 3k9a, 3ma9, 3mac, 3p30, 3vie,

3vtp. Suprapunerea i alinierea s-a fcut n comparaie cu 1AIK i a rezultat figura 28:

36

Figura 28 Suprapunerea si alinierea noua a structurilor GP41

Studiile anterioare s-au rezumat doar la structurile: 1aik, 2x7r, 2xra, 3mac,

3ma9, 2cmr, 3vie, 1f23, 3aha, 2z2t, 3p30, 1env, 1k34, 1dlb, 1szt, 1dfa, 3cp1, 3cyo,

2ot5, 1qr9, 1l5x, 1l5y, 3vpt i 3k9a, alinierea fcndu-se tot n comparaie cu 1AIK (Figura 29):

Figura 29 Suprapunerea si alinierea veche a structurilor GP41

La fel ca i n studiul precedent referitor la structurile GP120 i aici am selectat dou structuri de GP41 pentru o analiz la nivel de lanuri de aminoacizi. Structurile alese au 1AIK din anul 1997 i 3VTP determinat n anul 2012.

37

Cod PDB 3VTP

Nume molecula HIV fusion inhibitor MT-C34

Rezolutie 1.9

Data publicare 2012

Metoda X-ray

Publicata in The M-T hook structure is critical for design of

HIV-1 fusion inhibitors

Imagine


Cod PDB 1AIK

Nume molecula HIV GP41 CORE STRUCTURE

Rezolutie 2.0

Data publicare 1997

Metoda X-ray

Publicata in Core structure of GP41 from the HIV

envelope glycoprotein.

Imagine


38

Din tabele se poate observa c amndou s-au determinat prin cristalografie cu raze X la rezoluii relative apropiate: 1AIK la 1.9 , iar 3VTP la 2 . Alte asemnari i diferene sunt i la nivel de lanuri: 1AIK fiind alctuit din lanurile N i C, iar 3VTP din lanurile C i D.

Ca urmare a alinieri celor dou structuri a rezultat figura 30:

Figura 30 Suprapunerea si alinierea structurilor 1AIK si 3VTP

din cadrul creia am comparat lanul C din 1AIK cu lanul D din 3VTP. Rezultatul acestei comparri fiind un procent de 71,43%, celalate perechi avnd un procent de 0.00%. (Figura 31)

Figura 31 - Rezultate analiza la nivel de aminoacizi a lanturilor din 1AIK cu 3VTP

39

CAPITOLUL 4

CONCLUZII

Ultimul capitol, destinat concluziilor acestei lucrri, ncearc o sintetizare principalelor idei referitoare la HIV, la modul cum acesta interacioneaz cu celula inta, la schimbrile molecular care acesta le sufer i importanta studiului efectuat n ncercrile viitoare de a dezvolta un vaccin.

nelegnd att structura avelopei de pe suprafaa virusului ct i variaia acestei structuri, la o rezoluie ct mai mare posibil rmne una dintre cele mai importante provocri pentru biologia structurilor anvelopelor virale.

mbunatirile recente din cadrul acestei ramuri a biologiei ne arat ca combinnd informaiile provenite din cristalografiile cu raze X, cu cele din crio-EM i crio-ET pot fi o unealt puternic n nelegerea mecanismelor de infecie viral. Deoarece cristalografia cu raze X are nevoie de cristale 3D pentru a obine informaii legate de structur, este folosit pe un numr restrns de modele proteice. n general crio-EM i crio-ET au potenialul de a descrie intact, structura anvelopei virale. Totui aceste metode nu s-au dovedit folositoare pentru a obine informaii la rezoluii de 3 - 4 , care ar fi necesare pentru o nelegere adecvat.

Avnd n vedere limitrile acestor metode, provocarea pentru viitor este aceea c odat cu dezvotarea tehnologiei i biologii i bioinginerii care se ocupa cu studiul virusului HIV s depeasc i ei barierele. Analizele oferite de modelarea pe calculator trebuie s gseasc modaliti noi n a integra toate aceste informaii experimentale viitoare n modele de structure pline de neles.

HIV-ul este virusul imunodeficienei umane care poate duce la sindromul

imunodeficienei dobndite, sau SIDA. tim c HIV-ul se poate ascunde pentru perioade lungi de timp, n celulele corpului i c acesta atac o parte cheie a sistemului imunitar celulele T sau celulele CD4. Corpul tu are nevoie de aceste celule s lupte mpotriva infeciilor i a bolilor, dar HIV le invadeaza, le utilizeaz

pentru a face mai multe copii de la sine, i apoi le distruge. De-a lungul timpului, HIV poate distruge att de multe de celule CD4 nct

organismul nu mai poate lupta mpotriva infeciilor i a bolilor. Cnd acest lucru se ntmpl, infectia cu HIV poate duce la SIDA.

Din pcate nu exista nc un vaccin impotriva HIV-ului, totui singura msur care poate fi luat este prevenirea. n acest sens trebuie s se realizeze cteva lucruri cum ar fi promovarea contientizrii cat mai extinse privind HIV si modul de rspandire a acestuia, dar si campaniile mass media si educaia in scoli sunt printre cele mai bune metode de a atinge acest lucru. O alt parte eseniala a programelor de prevenire HIV este consilierea si testarea la HIV. Persoanele care triesc cu HIV sunt mai puin predispui de a transmite virusul altora daca sunt contieni de faptul c sunt infectai si dac au beneficiat de consiliere privind abordarea unui comportament mai protejat.

n urma studiului efectuat am realizat c dupa ce GP120 se leag de CD4, are

loc o schimbare la nivel de structura, provocnd o rotaie exteriora i deplasarea

40

fiecarui monomer GP120. Acesta este strans legat de o rearanjare a regiunii GP41

de-a lungul axei centrale a trimerului, ceea ce duce la un contact mai apropiat ntre

membranele celulelor virale i int. Acesta identificare si schimbare de structura fiind un pas relevant de inceput pentru a furniza indicii importante in dezvoltarea unui

vaccin.

41

BIBLIOGRAFIE:

42

ANEXE

ANEXA 1 Comenzi de referinta in UCSF Chimera

2dlabels create labels with text, symbols, and arrows in 2D

ac enable accelerators (keyboard shortcuts)

addaa add an amino acid to a peptide N- or C-terminus

addcharge assign partial charges to atoms

addh add hydrogens

alias* create an alias or list the existing aliases

align align two atoms or sets of atoms along the line of sight

angle measure angles formed by atoms or by axes and planes

aniso* show thermal ellipsoids

aromatic* show ring aromaticity

background set background color, gradient, or image

bond* add/delete bonds

bondzone* make zoning tools use points along bonds

cd change the working directory

center center the view on specified atoms

changechains reassign chain identifiers

chirality report the R/S configuration of a chiral center

clip* move global clipping planes

close close a model

cofr* report or change the center of rotation

color* color atoms/bonds, ribbons, labels, surfaces

colordef define a new color

combine combine molecule models into a single model

coordset play through frames of a trajectory

copy save image files

coulombic color surfaces by Coulombic electrostatics

crystalcontacts identify clashes between PDB symmetry copies

defattr assign attribute values to atoms, residues, or models

define* calculate and display axes, planes, centroids

delete delete atoms and bonds

display* display specified atoms

distance* measure distances between atoms, axes, planes, centroids

echo send text to the status line and Reply Log

export save the graphical scene

fillring* show rings as filled

findclash* identify clashes and contacts

findhbond* (hbonds) identify hydrogen bonds

fitmap fit atoms or map into map

fly smoothly traverse a series of saved positions

focus* adjust the view and center of rotation

freeze stop all motion

getcrd report coordinates

help display the manual page for a command

43

hkcage create icosahedron as hexagon/pentagon mesh

intersurf generate and display interface surfaces

invert swap substituents of an atom

ksdssp determine secondary structure from protein coordinates

label* display atom labels

labelopt control the information in atom labels

linewidth control the width of wire bonds

longbond* show/hide pseudobonds representing missing segments

mask extract volume data bounded by surfaces

match perform least-squares fitting of specified atoms

matchmaker (mmaker) align models in sequence, then in 3D

matrixcopy apply the transformation of one model to another

matrixget write the current transformation matrices to a file

matrixset read and apply transformation matrices from a file

mclip* control per-model clipping

mcopy copy settings from one molecule model to another

measure perform calculations on structures, surfaces, maps

meshmol create a "molecule" to show surface mesh as sticks

minimize energy-minimize structures

modelcolor set color at the model level

modeldisplay* set display at the model level

molmap create a density map from atomic coordinates

morph morph (interpolate) between different structures

move translate models

movie capture image frames and assemble them into a movie

msc* color multiscale surfaces to match atoms

namesel* save and name the current selection

nucleotides* create special nucleotide representations

objdisplay* display graphical objects

open* read local files or fetch by ID

pause pause script execution until the user presses a key

perframe* specify commands to be executed at each display frame

play script various complex motions

preset apply a predefined combination of display settings

rainbow color residues, chains, or models over a range

rangecolor color over a range according to attribute values

read execute a command file, updating display at the end

represent control atom/bond style (wire, stick, bs, sphere)

reset restore default or saved orientations

resrenumber reassign residue numbers

ribbackbone* allow display of both ribbon and backbone atoms

ribbon* display ribbon

ribclass set ribbon residue class

ribinsidecolor* set a separate color for inside protein helix ribbons

ribrepr control ribbon style (flat, edged, rounded)

ribscale control ribbon scaling (Chimera default, licorice)

ribspline control ribbon path (B-spline or cardinal spline)

rlabel* display residue labels

rmsd evaluate the RMSD between specified sets of atoms

rock rock (rotate back and forth)

44

roll roll (rotate continuously)

rotation* make a bond rotatable

runscript run Python script with command-line arguments

save save the current Chimera session

savepos* save model positions

scale* scale the view

scene* save/restore scenes (positions, styles, colors, labels, etc.)

scolor color surfaces by volume data or geometry

section move global clipping planes in parallel

segment act on segmentation models

select* select atoms, (de)activate models for motion

set* set visual effects, individual model rotation

setattr* set an attribute to a specified value

shape create a surface of a specified geometric shape

show* display specified atoms, undisplay the others

sleep pause script execution for a specified time

solvate add solvent using AmberTools

sop adjust capping, edit surface models

split partition a molecule model into separate submodels

start start Chimera tools by name

stereo* switch amongst stereo options and mono viewing

stop exit from Chimera

surface* calculate and display molecular surfaces

surfcat (msms cat) group atoms for surface calculations

surfrepr (msms repr) control surface style (solid, mesh, dot)

swapaa mutate amino acids or swap rotamers

swapna mutate nucleic acid residues

sym* generate symmetry-related copies of a structure

system send a command to the system shell

thickness move global clipping planes in opposite directions

tile* arrange models in a plane

topography plot values in a volume data plane as surface heights

transparency* make atoms/bonds, ribbons, and surfaces transparent

turn rotate models

vdw* display van der Waals (VDW) dot surface

vdwdefine* set VDW radii

vdwdensity set VDW surface dot density

version show copyright information and Chimera version

viewdock start ViewDock and load docking results

volume display volume data such as electron density

vop edit volume data

vseries display an ordered sequence of volume data sets

wait suspend command processing until motion has stopped

window adjust the view to contain the specified atoms

windoworigin set graphics window location

windowsize* adjust the dimensions of the graphics window

write save atomic coordinates (pdb, mol2)

45

ANEXA 2 Exemple structuri GP120

Cod PDB 4jm2

Nume molecula Crystal Structure of PGT 135 Fab in Complex

with gp120 Core Protein from HIV-1 Strain JR-

FL Bound to CD4 and 17b Fab

Rezolutie 3.1

Data publicare 2013

Metoda X-ray

Publicata in -

Imagine


46

Cod PDB 4i54

Nume molecula Crystal structure of clade A/E 93TH057 HIV-1

gp120 H375S core in complex with DMJ-II-

121

Rezolutie 2.5

Data publicare 2013

Metoda X-ray

Publicata in Structure-Based Design and Synthesis of an

HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-Ray and

Thermodynamic Characterization

Imagine


47

Cod PDB 4i53

Nume molecula Crystal structure of clade C1086 HIV-1

gp120 core in complex with DMJ-II-12

Rezolutie 2.5002

Data publicare 2012

Metoda X-ray

Publicata in Structure-Based Design and Synthesis of an

HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-Ray and

Thermodynamic Characterization.

Imagine


48

ANEXA 3 Exemple de structuri GP41

Cod PDB 3K9A

Nume molecula Crystal Structure of HIV gp41 with MPER

Rezolutie 2.1

Data publicare 2009

Metoda X-ray

Publicata in Structural characterization of HIV gp41 with the

membrane-proximal external region

Imagine


49

Cod PDB 2X7R

Nume molecula Complex of 2 biomacromolecules, namely

TRANSMEMBRANE PROTEIN GP41.

Rezolutie 2.0

Data publicare 2010

Metoda X-ray

Publicata in Crystal Structure of HIV-1 Gp41 Including Both

Fusion Peptide and Membrane Proximal External

Regions

Imagine

Harta de densitate

simulata

Licenta Final

Documents

Transcript of Licenta Final