Microbiologie medicală Microbiologia = ansamblul de discipline experimentale care studiază

microorganismele şi activităţile lor Microorganism = organisme unicelulare care pot fi puse în evidenţă numai cu

ajutorul microscopului (optic sau electronic ) Puse în evidenţă pentru prima dată de Anton van Leeuwenhoek (1632-1723)

William G.Morton (1846) Francesco Redi (1626-1697) Lazaro Spallanzani (1729- 1799) Loius Pasteur (1822-1895) Girolamo Fracastoro (1468-1553) – “seminaria morbi” Agostino Bassi - muscardina Robert Koch (1843) Charles Sédillot (1804- 1833) Luis Pasteur (1822-1895)

Descoperă natura microbiană a proceselor de fermentare anormală a vinului

Face legatura între “bolile vinului” şi unele boli infecto-contagioase la animale şi om

Descoperă numeroşi agenţi etiologici ai acestora Realizează vaccinuri prin inactivarea sau atenuarea patogenităţii unor

microorganisme (rabie, antrax, holera găinilor) Pune bazele sterilizării şi metodicii lucrului aseptic.

Robert Koch (1843-1910)- A descoperit noi agenţi etiologici ai infecţiilor la om şi animale (tuberculoză,

holeră, antrax);- A examinat microorganismele în preparate fixate prin caldură şi colorate cu

coloranţi bazici;- A introdus mediile solide în practica diagnosticului microbiologic;- A reprodus experimental boli infecţioase prin inocularea agentului etiologic la

animale de laborator;- A descris secvenţe experimentale pentru susţinerea relaţiei cauzale între un

microorganism şi manifestările de boală:• este depistat la toţi bolnavii iar distribuţia în organism corespunde leziunilor

caracteristice bolii• poate fi izolat în cultură pură şi subcultivat pentru a fi studiat• cultura pură inoculată la animalul receptiv reproduce boala cu leziuni specifice

di care poate fi reizolat.

Lumea microorganismelor- Microorganisme cu structură celulară

• eucariote, constituite din celule cu structură evoluată: fungi şi protozoare;• procariote, constituite din celule cu structură primitivă: bacterii

- Entităţi acelulare, la limita viului: virusuri, viroizi- Prionii

Conexiuni interdisciplinare Biochimia Chirurgia - Oliver Wendell Holms

- J.F. Semmelweiss - Joseph Lister - Alphonse Guérin - John Tyndall

Morfopatologia - primul tratat de bacteriologie” Bacteriile şi rolul lor în etiologia, anatomia şi histologia patologică a bolilor infecţioase ” Victor Cornil, Victor Babeş

Patologia experimentală – 1901 Ioan Cantacuzino - 1912 Alexandru Slătineanu

Epidemiologia Imunologia – Ilya Mecinikov

- Emil von Behring - Shibasaburo Kitasato

Genetica moleculară – 1944 O.T. AveryAnatomia funcţională a bacteriilor

Semnificaţia biologică a structurilor bacteriene – structurile celulei bacteriene care controlează creşterea, multiplicarea, supravieţuirea în condiţii variate de mediu

Semnificaţia taxonomică - structuri importante pentru clasificarea şi identificarea bacteriilor

Semnificaţia patogenică – structuri care le permit să acapareze învelişurile, ţesuturile, umorile organismului

Structuri bacteriene ţinte selective ale efectorilor imunitari sau ale antibioticelor Celula bacteriană :

I. protoplastul bacterian II. peretele bacterian III. glicocalixul procariot IV. organitele de locomoţie V. pilii bacterieni VI. endosporii bacterieni

Citoplasma - conţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, metaboliţi cu greutate mică - se află permanent în stare de gel şi menţine poziţia structurilor interne în absenţa membranelor intracelulare

- în microscopia optică, pe preparatele colorate uzual vedem numai citoplasma şi uneori incluziuni citoplasmatice - cuprinde – nucleoplasma - ribosomi - incluziuniNucleoplasma - echivalent al nucleului celulei eucariote

- nu prezintă membrană nucleară şi nucleol- formată dintr-un cromozom unic, o moleculă de ADN circulară, dublu catenară, cu

lungimea de 1000-2000 µm- în microscopia optică este observată numai după hidroliza ARN-ului, ca un corpuscul

oval, alungit în halteră sau V, în funcţie de stadiul diviziunii.Electronomicrografii ale secţiunilor ultrafine - apare ca un ghem sau scul de fibre cu diametrul de 2-6 nm.

In situ cromozomul bacterian este helicat şi suprahelicat în jurul unui miez ARN care îl menţine în forma compactăElectronegativitatea ADN neutralizată prin proteine (asemănătoare histonelor), ioni Mg2+, poliamine Ribosomii bacterieni

- prezenţi în toată citoplasma cu excepţia nucleoplasmei- constanta de sedimentare 70s- pot disocia în 2 subunităţi: 30s ( ARN16s+20 molecule proteice) - 50s (ARN 23s şi 5s+30 molecule proteice)- ARN ribosomal are o mare stabilitate fiind bine conservat în cursul evoluţiei poate fi

utilizat drept criteriu de clasificare filogenetică- pe electronomicrografii apar dispuşi ca polisomi (şir de ribosomi) în lungul moleculei

de ARNm pe care îl citesc şi traduc rapidIncluziunile citoplasmatice - au caracter de specie- sunt caractere taxonomice primare sunt formate din: - polimetafosfat (Corynebacterium diphtheriae ) - amidon (Clostridium, Neisseria) - lipide (Pseudomonas)Membrana citoplasmatică- lipsită de steroli (bacteriile nu-i sintetizează); excepţie molicutele, încorporează colesterolul preformat de celulele eucariote.

- excretă enzime hidrolitice necesare digestiei extracelulare.- are funcţii de biosinteză.

Mezozomii - invaginaţii anfractuoase ale membranei citoplasmatice care îi măresc suprafaţa funcţională. În mezozomii laterali îşi au sediul enzimele implicate în autoreplicarea nucleoplasmei, iar în mezozomii septali enzimele implicate în sinteza peretelui.

- asigură transportul transmembranar prin fosfotransferaza membranară- unicul sediu al citocromilor, enzimelor, componentelor lanţului respirator implicate în

transportul de electroni şi fosforilarea oxidativă; analog funcţional al mitocondriei din celula eucariotă. Mitocondriile sunt descendenţi ai bacteriilor endosimbionte.

- creşterea bacteriilor este posibilă numai când cel puţin 50% din membrana citoplasmatică este semifluidă

- poartă receptori pentru semnale ale mediului extern atractanţi, repelenţi, feromoni (sistem molecular de integrare a acestor informaţii)

II. Peretele bacterian- înveleşte protoplastul- este format dintr-o structură de bază + structuri speciale care diferenţiază grupe mari

de bacterii

Peptidoglicanul structura de bază a eubacteriilor, grup mare de bacterii din care fac parte şi bacteriile patogene. LIPSEŞTE din peretele: 1. Arheobacteriilor – bacterii adaptate la condiţii de viaţă extreme (temperatură, salinitate) şi care nu sunt niciodată prezente în corpul uman (nepatogene). Similitudini genomice şi de sinteză proteică atestă filiaţia organismelor eucariote din arheobacterii 2. Molicutelor şi al oricărei celule eucariote

- este un heteropolimer de dizaharide aminate - N-acetilglucozamina

- N-acetilmuramic aşezate alternativ în lanţuri liniare de galactan şi solidarizate între ele prin subunităţi şi punţi peptidice.

- cuprinde protoplastul bacterian ca o plasă rigidă şi rezistentă- sinteza este controlată de enzime situate pe suprafaţa externă a membranei

citoplasmatice - transglicozilaze, leagă între ele 2 aminozaharuri - transpeptidaze, catalizează formarea subunităţilor şi punţilor peptidice (esenţial dipeptidul D-alanină-D-alanină)- Proteine de legare a penicilinelor (PLP,PBP) denumire generică a enzimelor care controlează sinteza. RIGIDITATEA peretelui bacterian este condiţionată de configuraţia sterică şi mărimea ochiurilor reţelei de peptidoglican Cu EXCEPŢIA spirochetelor care au perete flexibil, restul bacteriilor au perete rigid care le conferă anumite forme: sferice, bastonaş, filamentoase şi ramificate (actinomicete). Morfologia bacteriilor mai este caracterizată prin aşezarea lor care este condiţionată de modul de înmulţire (înmugurire, diviziune, fragmentare) Poziţia planurilor succesive de diviziune, numărul de generaţii după care se separă celulele surori. REZISTENŢA peptidoglicanului protejează protoplastul prin echilibrarea presiunii osmotice foarte mari (5-20atm) din citoplasma bacteriană. Sub acţiunea agenţilor muralitici (lizozim, penicilină etc.) apar defecte ale peretelui care duc la hernieri ale protoplastului sau la explodarea acestuia. Acţiunea agentului muralitic în mediu osmotic protector (soluţie 20% zaharoză, urină) face ca protoplastul să rămână integru, dar ia o formă sferică indiferent de forma avută anterior, devine sferoplast dacă mai păstrează urme de perete sau protoplast complet nud. Dacă agentul muralitic dispare din mediu, sferoplaştii revin la forma iniţială a bacteriei, dar protoplaştii nu. Este demonstrată autodeclanşarea sintezei şi asamblării peptidoglicanului de către resturile de perete. Bacteriile cu perete defectiv apărute în medii osmotic protectoare sunt numite forme L (1935, Klineberger Nobel le-a descris la Institutul Lister din Londra)

În cursul terapiei cu peniciline în focarul de infecţie pot să apară forme L -infecţia se cronicizează.Peretele bacterian trebuie să se adapteze permanent protoplastului în creştere - la bacteriile gram–negative enzimele autolitice rup limitat reţeaua de peptidoglican şi permit inserţia de noi molecule în puncte răspândite aleatoriu pe suprafaţa bacteriei - la bacteriile gram-pozitive inserţia se face predominant în vecinătatea septului de diviziune.Interes medical

- sensibilitatea la lizozim- interferarea sintezei de către peniciline- antigenitatea- proprietatea de adjuvant imunologic

STRUCTURILE SPECIALE ale peretelui bacterian Peretele bacterian condiţionează colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale Gram, Ziehl-Neelsen.Peretele bacterian de tip gram-pozitiv - Peptidoglicanul este organizat într-o reţea tridimensională, cu ochiuri strânse, groasă şi omogenă.

Unităţile tetrapeptidice ale lanţurilor glican adiacente sunt legate prin punţi transversale polipeptidice. Sunt variaţii importante ale acestor punţi interpeptidice de la o specie la alta. De acidul N-acetilmuramic se leagă un peptid scurt de 4 aminoacizi în forma L sau D (L-alanina, D-acid glutamic, L-lizina, D-alanina). Structurile speciale asociate:

- Acizii teichoci (teichos-perete) 50% din greutatea uscată a peretelui bacterian, polimeri hidrosolubili de ribitol sau glicerol fosfaţi; diferenţiem acizi teichoici de perete (legaţi covalent la peptidoglican) şi acizi teichoici de membrană (lipoteichoici) legaţi covalent de glicolipedele membranei citoplasmatice.

Funcţii – stabilizează şi întăresc peretele - leagă Mg2+ şi asigură mediul ionic necesar activităţilor enzimatice în membrana celulară. - sunt antigene majore de suprafaţă utile subtipării serologice a bacteriilor gram–pozitive.

- Acizii teichuronici – acid uric+polizaharide neutre - permit subtiparea lactobacililor, streptococilor. - GlicolipidePeretele de tip gram–negativ- subţire

- structură neomogenă, complexă- Peptidoglicanul dispus profund, în reţea bidimensională laxă (15-20% din greutatea

uscată a peretelui). Tetrapeptidul legat la acidul N-acetil muramic diferă de gram–pozitivi doar prin acidul diaminopimelic care înlocuieşte L-lizina.

Structurile asociate- Membrana externă – formată dintr-un film intern, fosfolipidic

film extern, lipopolizaharidicÎn ea flotează diferite molecule proteice: - porine (Omp A,C,D,F, LamB, Tsx) care penetrează ambele feţe ale membranei şi formează pori (acces nutrienţi cu molecule mici hidrofile). OmpA – porină în cantitate mare cu molecule lungi, ancorează membrana externă la peptidoglican, receptor pentru bacteriofagi şi pilii sexuali. - proteine de transport (specifice) mai puţin numeroase, transport transmembranar vitamina B12, Fe3+ Lipoproteinele se leagă covalent prin polul hidrofil la peptidoglican, prin polul hidrofob la membrana externă, solidarizează cele 2 structuri.-Lipopolizaharidul (LPS) hetrepolimerliniar dispus pe suprafaţa distală a membranei externe, are - segment proximal, lipidul A format din unităţi dizaharidice fosforilate de glucozamină legate prin punţi pirofosfat de beta-hidroxiacizi graşi cu 10-17 atomi de carbon (caracteristici pentru grupe mari de bacterii, e.g., beta-hidroximiristic Enterobacteriaceae) - miez polizaharidic - partea profundă formată din glucoză-heptoză şi 2-ceto-3deoxioctonat (KDO) numită “coloana vertebrală” este comună tuturor bacteriilor gram–negative. Prin KDO se leagă la glucozamina lipidului A. Este antigenul R al bacteriilor gram–negative, important activator al complementului pe cale alternativă. - unităţi dizaharidice repetate (10-25x). Cel mai frecvent sunt trizaharide liniare, dar pot fi şi tetra sau pentazaharide ramificate. Maschează miezul polizaharidic prevenind activarea complementului. Important antigen al gacteriilor gram–negative, antigenul O, împarte speciile în grupe serologice,asigură încărcătura electronegativă şi hidrofilia implicate în stabilitatea suspensiilor bacteriene, aspectul neted, lucios, umed al coloniilor (S, smooth ) şi efect antifagocitar.

LPS – codificat de mai multe gene - pot apare mutaţii, prin care pierd capacitatea de sinteză a antigenului O şi a unor porţiuni distale ale miezului, dar niciodată a lipidului A şi KDO. Scade încărcătura negativă şi hidrofilia. Mutantele R sunt favorizate de repicări repetate pe medii artificiale, generează clone R care sunt autoaglutinabile, formează colonii rugoase R (rough).Spaţiul periplasmic - aflat între membrana citoplasmatică şi membrana externă - conţine peptidoglican, lipoproteine, enzime implicate în digestia extracelulară sau inactivarea unor antibiotice, fibrele axiale ale spirochetelor - avantaje selective – acapararea mediilor apoase minimale nutritiv, chiar în prezenţa unor substanţe antibacterieneBacteriile gram–pozitive au nevoie de medii bogate în nutrienţi şi sunt natural sensibile la acţiunea substanţelor antibacteriene, enzimele lor se diluează în mediul extracelular. III Glicocalixul procariot-înveliş, polizaharidic frecvent, mai rar polipeptidic (Bacillus), dispus distal , numai la unele tulpini bacteriene, nu este caracter taxonomic. Glicocalixul structurat dens – nu poate fi separat prin centrifugare - structura impenetrabilă la particulele de coloranţi, în microscopia optică evidenţiată prin coloraţie negativă cu tuş de India sau negrozină (capsula incoloră)Glicocalixul structurat lax (slime) poate fi separat prin centrifugare, penetrat de particulele de coloranţi, vizibilă la microscopul electronic după colorare cu roşu ruteniu.FuncţiiFuncţionează ca ligand la membranele mucoase, celulele eucariote, între procariote având rol în: -nutriţia şi virulenţa bacteriilor : citotoxinele şi enzimele bacteriene difuzează direct către celulele eucariote, prin liza celulară nutrienţii rezultaţi ajung direct către bacterie nu se diluează în mediu. IV Organitele de locomoţie- flagelii- fibrele axiale

Flagelii - organite filamentoase, lungi (6-20micrometri), flexuoase, cu structura proteică- Pot fi evidenţiaţi – preparate microscopice colorate prin impregnare - argentică

– preparat umed între lamă şi lamelă - cultivare în geloză moale prin înţepare- Prezenţa, numărul, dispoziţia flagelilor = caractere taxonomice primare

- Proteina flagelilor constitue antigenul H cu specificitate de tip (“hauch- creştere invazivă)

- Microscopia electronică – filamentul lung şi flexuos articulat pe un- - cârlig rigid terminat cu un corpuscul bazal format la

bacteriile gram-pozitive dintr-un inel M flotant în membrana citoplasmatică şi unul S supramembranar. La bacteriile gram–negative apar suplimentar un inel P (în stratul de peptidoglican) şi unul flotant în membrana externă L

- Atractanţii şi repelenţii pentru care există receptori membranari specifici generează un semnal care este transmis complexului bazal şi determină sensul rotaţiei inelelor, apropiere sau îndepărtare.

Fibrele axiale – analogi ai flagelilor la spirochete, sunt cuprinse în spaţiul periplasmic

Au inserţie polară cu extremitatea liberă spre porţiunea mijlocie a protoplastului. Treponemele şi boreliile – mai multe şi mai subţiri, înrulate în jurul protoplastului. Leptospirele – 2 fibre axiale mai groase ce formează un axistil în jurul căruia se înrulează protoplastul. V. Pilii bacterieni- organite rigide, filamentoase, mai scurte decât flagelii, vizibili numai la microscopul electronic

- pot fi: a. pili comuni (fimbriile) b. pili sexuali. - codificaţi plasmidic

- caracter de tulpină a. dispuşi peritrichi, funcţionează ca adezine la receptori specifici ai mucoaselor b. structuri tubulare prezente în număr redus pe suprafaţa bacteriilor gram–negative care poartă plasmide numite conjugoni. Implicaţi în conjugarea bacteriilorVI. Endosporii bacterieni - forme de rezistenţă prin care speciile genurilor Bacillus şi Clostridium supravieţuiesc în condiţii nefavorabile de mediu

Structurile codificate de gene represate în viaţa vegetativă a acestor bacterii:- protoplastul deshidratat, conţinut mare de dipicolinat de calciu, care îi conferă rezistenţă- învelişuri: peretele sporal, cortex gros (peptidoglican sensibil la enzimele autolitice) 2 tunici proteice bogate în cisteină şi legături disulfidice, care asigură rezistenţa la agenţi chimici şi radiaţii.

În stare deshidratată supravieţuiesc ani. Condiţiile favorabile (apa, nutienţi) semnal care declanşează germinarea: activarea unei autolizine a cortexului. Apa şi nutrienţii difuzează spre protoplastcare creşte în volum, rupe învelişurile sporale Sunt uşor observaţi în microscopia optică. Importante caractere taxonomice primare.În coloraţia Gram rămân incolori. În coloraţia Ziehl – Neelsen în roşu, bacteria în albastru.Structuri speciale ale peretelui la bacterii a.a.r.

arabinogalactan, polizaharid cu unele proprietăţi ale endotoxinei; acizi micolici – acizi graşi cu catene lungi (C70-C90) ce conferă

- proprietăţi hidrofobe- comportarea particulară în coloraţia Ziehl-Neelsen- rezistenţa la factori de mediu (desicaţie, dezinfectante, antibiotice)

• lipide de suprafaţă (sulfolipide, fosfolipide, cord factor), cu rol in patogenitate• micozide (peptidoglicolipide, glicolipide), ce contribuie la supravieţuirea in celule

fagocitare.