PARTEA II. METODE DE STUDIU ALE CITOTOXICITĂŢII IN VIVO

CAPITOLUL 6TESTAREA CITOTOXICITĂŢII ACUTE

6.1. Obiectivele testelor toxicologice acute

Informaţiile obţinute din studiile de toxicologie acută la animale sunt esenţiale

pentru determinarea potenţialului toxic al unui produs chimic la om şi alte forme de

viaţă. Obiectivul imediat al studiilor este de a identifica potenţialul toxicologic al

produşilor chimici, atât a celor disponibili comercial, cât şi a celor în dezvoltare.

Premisa de a folosi animale în testarea acută este aceea că efectele administrării unui

agent sintetic pe un animal mimează posibilele rezultate pe care agentul le poate

produce la om sau alte mamifere. Sistemul presupune de asemenea testări pe termen

scurt pe animale, paralel cu expunerea acută în populaţia umană (Botham, 2004).

În general, timpul de expunere, doza substanţei chimice, selecţia speciilor de

animale şi parametri biologici utilizaţi în studiile acute sunt flexibile. Pentru a fi

considerat un test acut, un studiu trebuie să fie organizat pentru comparaţie cu situaţii

umane similare. Substanţa este administrată pe cale orală, la nivel local, parenteral

sau prin inhalare, şi efectele toxice trebuie corelate cu creşterea dozelor. De fapt,

studiile citotoxicologice acute sunt concepute pentru a exprima potenţialul unei

substanţe toxice ca o corelaţie doză-răspuns.

6.2. LD50 şi testele citotoxicologice acute

În conformitate cu reglementările Food and Drug Administration (FDA) U.S.

care stabilesc substanţa chimică admisă şi protocoalele pentru testarea

medicamentelor folosind experimentele pe animale, trebuie să se precizeze cât

reprezintă 50% din doza medie letală (LD50) dintr-o substanţă. LD50 reprezintă doza

estimativă care determină moartea a 50% din populaţia speciei expuse în anumite

1

„condiţii specifice” de testare. Fiecare test LD50 efectuat pentru un produs chimic

trebuie să includă cel puţin două căi de expunere, calea orală şi parenterală. În funcţie

de natura unei substanţe, căile pot fi modificate pentru a include testarea pentru

inhalare, dermică sau altă expunere selectivă. Pentru inhalare sau studii acvatice,

toxicitatea unei substanţe chimice reprezintă concentraţia medie letală (LC50),

concentraţia estimată a expunerii într-un mediu care produce 50% mortalitate în

populaţia animalelor experimentale.

Valoarea LD50 reprezintă letalitatea şi nu reflectă proprietăţile toxice acute ale

unui compus şi nici nu sugerează suficiente informaţii pentru a clasifica în mod

adecvat un compus. De asemenea, LD50 nu se corelează bine cu informaţiile privind

diferite mecanisme de acţiune a agenţilor toxici, în special în cazul în care agenţii

sunt din categorii toxicologice diferite. Comparaţiile sunt semnificative doar atunci

când agenţii sunt omologi şi au mecanisme de acţiune similare sau aceleaşi. De fapt,

analiza valorii LD50 traduce pur şi simplu o valoare într-un indicator comparativ al

toxicologiei imediate pentru un anumit agent dintr-o anumită tulpină, grup de vârstă,

sex al unei specii de animal (Barile, 2004).

Conceptul de LD50 s-a dezvoltat în primii ani ai secolului XX, atunci când

mulţi agenţi medicamentoşi au fost disponibili ca mixturi/amestecuri, extracte, sau

tincturi ale materialelor biologic derivate, lipsite de puritate şi frecvent toxice. Testul

a fost utilizat pentru a standardiza potenţialul unor astfel de agenţi medicali biologic

derivaţi. Calcularea potenţialului letal al unei substanţe poate teoretic ajuta la

evaluarea potenţialului său terapeutic. În consecinţă, metodologia LD50 s-a dezvoltat

pentru a oferi o relaţie doză-răspuns pentru standardizarea preparatelor biologice în

conformitate cu potenţialul letal.

În general, evaluarea proprietăţilor letale ale unui produs chimic (şi în

consecinţă, determinarea LD50) şi-a pierdut valoarea integrală a procesului de

evaluare în siguranţă pentru faza toxicologică acută. Valoarea şi semnificaţia

determinării LD50 pentru orice agent de mediu, comercial, sau clinic oferă informaţii

puţine pentru a explica mecanismul de toxicitate sau de acţiune. Motivele pentru care

se realizează protocoale LD50 nu mai sunt valabile, având în vedere starea actuală a

2

biotehnologiei avansate. Cunoştinţele despre gradul de letalitate al unui agent chimic

dintr-o anumită categorie obţinute pe baza unor ghiduri de testare specifice, nu

implică în mod necesar măsuri de protecţie la oricare altă specie, inclusiv la om.

Este mult mai important să cunoaştem nuanţele subtile, detaliile leziunilor

chimice rezultate din expunerea la diverse trasee, doze nocive şi durată de expunere.

În plus, sunt necesare mai multe informaţii despre reacţiile adverse brute şi gama

largă de doze a unui produs chimic care induce astfel de reacţii, atunci când se

cunosc, pe baza relaţiilor activitate –structură. Măsuri adecvate de protecţie şi de

securitate sunt în continuare bazate aproape în întregime pe alte teste citotoxicologice

mecaniciste pentru a se asigura în condiţii de siguranţă, manipularea, transportul, şi

tratamentul din timpul expunerii. Prin urmare, mai multe informaţii valoroase cu

privire la fiziopatologia expunerii la toxic pot fi obţinute prin noi cercetări efectuate

pe animale şi prin teste toxicologice acute ca modele de screening.

În consecinţă, este de înţeles că au apărut controverse asupra folosirii LD50 ca

o metodă de determinare toxicologică ce este considerată acum arhaică. Testul a luat

naştere, atunci când alţi indicatori de toxicitate nu au fost disponibili sau nu au fost

foarte sensibili şi când tehnologia de început nu a putut susţine cerinţele. În plus,

numărul de animale necesare pentru validarea protocolului este mare şi s-a sugerat că

metoda distruge inutil un număr mare de animale. Unele sugestii pentru actualizarea

testului include: (1) utilizarea unui număr mai mic de animale în estimarea dozelor de

început pentru testările ulterioare (a se vedea secţiunea 6.4.1), (2) luarea în

considerare a mai puţine căi de expunere, şi (3) obţinerea de informaţii suplimentare

în timpul unui studiu care se adaugă la baza cunoştiinţelor disponibile despre un

produs chimic.

În plus, cantitatea extraordinară de date toxicologice acute deja existente

despre substanţele chimice şi clasele chimice disponibile în prezent nu permit

generarea repetată de valori ale LD50 cu introducerea unei noi formulări pentru

aceelaşi compus, un nou derivat al aceleaşi clase chimice sau o altă combinaţie de

substanţe chimice cunoscute. De fapt, a fost sugerată chiar completa eliminare a

testului.

3

Uniunea Europeană consideră că LD50 trebuie să fie eliminat pentru toate

produsele chimice până anul 2009 (Directiva OECD, 2001). În plus, aşa cum testele

pe animale sunt mereu perfecţionate şi se dezvoltă teste alternative este de anticipat

că testul LD50 va prezenta doar interes istoric.

6.3. Organizarea cercetărilor

Selecţia şoarecilor sau şobolanilor de laborator pentru studiu depinde mai mult

de considerente practice decât de necesităţile biologice sau aplicabilitatea la om.

Speciile de rozătoare sunt mai avantajoase din punct de vedere economic decât

celelalte animale, deoarece prezintă mai puţine variaţii interspecii, sunt uşor

accesibile, şi din punct de vedere tehnic sunt mai uşor de manipulat. În plus,

adăpostirea şi îngrijirea rozătoarelor sunt mai facile şi mai practice decât pentru alte

specii.

Valoarea LD50 pentru non-rozătoare este necesară atunci când valorile LD50

pentru şoarece şi şobolan sunt semnificativ diferite. Deşi acest lucru sugerează

diferenţe de specie în absorbţia, distribuţia, biotransformarea sau eliminarea unui

toxic, această informaţie este obţinută mai degrabă prin studii mecaniciste decât pe

baza performanţelor testelor LD50 suplimentare. Dezavantajele asociate cu speciile

nonrozătoare le constituie tocmai factorii care descurajează utilizarea altor specii de

animale non-rozătoare: costul, manipularea şi măsurile tehnice. Protocoalele pentru

obţinerea şi aclimatizarea animalelor sunt importante pentru a se asigura un studiu de

succes. Animalele ar trebui să fie achiziţionate de la crescători demni de încredere şi

plasate în zone de carantină care facilitează îngrijirea animalelor, timp de 7 până la 14

zile înainte de iniţierea unui experiment. Ele sunt examinate în anumite etape privind

patologia macroscopică şi starea generală de sănătate.

Un protocol trebuie să includă eutanasierea unei subpopulaţii de animale

selectate aleatoriu pentru teste biochimice sanguine şi examene histopatologice ale

organelor. De obicei sunt achiziţionate animale în plus deoarece procesele de

screening necesită eliminarea unor animale. Aclimatizarea şi îngrijirea animalelor

4

este importantă pentru a reduce stresul asociat cu transportul şi adaptarea la noul

mediu.

Tabelul 6.1 rezumă alte considerente organizatorice în studiile de

citotoxicologie. Acestea includ planuri asociate cu programarea şi performanţa

înainte, în timpul şi după studiu. În general, reproductibilitatea datelor intra-sau inter-

laborator depinde de propriul control al factorilor înainte de începerea protocolul

(tabelul 6.1), la fel de mult ca şi de performanţa tehnică din timpul unui experiment.

Tabelul 6.1 .Măsurile necesare pentru achiziţionarea animalelor şi de manipulare înainte de iniţierea unui experiment

Organizaţia Consideraţii Descriere Înainte de cumpărare

Selecţia speciilor, numărul, sexul şi vârsta animalelor

Selecţia comercială a sursei animale

Tipul studiului

Domeniul de studiu

Calcule biologice şi economice; aplicabilitate de evaluare a riscurilor la om; sex diferit sau acelaşi; cerinţe de adăpost; animale în plus/extranumărReputaţia crescătorului, costul, disponibilitatea animalelor, suportul tehnic Acut, cronic, toxicologia unui organ ţintă Testare toxicologică de bază sau aplicată

Imediat după achiziţionare şi înainte de iniţierea experimentului

Carantină şi screening

Examinare fizică

Pregătirea

Aclimatizarea animalelor la noile condiţii de mediu (centru de îngrijire a animalelor); Observarea stării generale de sănătate sau patologice; Reducerea stresului; Observaţii macroscopice; analize de sânge şi biochimie, analize histopatologice Procurarea de bunuri şi suport tehnic; asigurarea cerinţelor de habitat, adăpostire, locuire

Imediat înainte de începerea experimentului

Pregătirea

Examinare fizică

Pregătirea soluţiilor, diete speciale, bunuri perisabile; alocarea corespunzătoare a timpului Eliminarea animalelor nesănătoase

În timpul experimentului

Menţinerea constantă a condiţiilor experimentale

Asigurarea adecvată de bunuri, ajutor tehnic; menţinerea cerinţelor de locuit, habitat Menţinerea constantă şi consistentă a protocoalelor experimentale

5

6.4. Teste focalizate

Determinarea valorilor LD50 nu este întoteauna precisă. Procedura originală a

fost descrisă prima oară de Trevan în anul 1927 folosind 50 de animale (sau mai

multe) şi a constituit un punct de reper pentru compararea toxicologiei substanţelor

chimice. Caracteristic LD50 este că un anumit procent de animale supravieţuieşte

unei anumite doze; următoarea doză mai mare arată, de asemenea, un procent de

animale care supravieţuiesc, chiar dacă procentul este mai mic. Incompatibilitatea

apare odată cu supravieţuirea animalelor, care nu ar fi trebuit neapărat să

supravieţuiască după ce ulterior au primit o doză mai mare din substanţa chimică

respectivă. Astfel, există posibilitatea ca un animal să moară la o doză mai mică şi un

alt animal să supravieţuiască la următoarea doză mai mare. Pentru a evita astfel de

anomalii, dozele trebuie să aibă valori suficient de apropiate pentru a evidenţia

concentraţiile precise letale. Alternativ, o concentraţie adecvată a unui toxic selectată

arbitrar este administrată la câteva animale, urmată de observare atentă după 24 de

ore. Ulterior grupurile de animale primesc de 0,75-1,25 de ori doza originală,

administrarea fiind dependentă de concentraţie, care poate fi letală sau bine tolerată.

Administrarea este ajustată pe măsură ce experimentul evoluează şi permite

micşorarea numărului de animale sacrificate. Au fost stabilite diverse tehnici, care

sunt tradiţional utilizate pentru determinările LD50 cu intenţia de a reduce numărul de

animale. Acestea includ:

procedura sus şi jos (Up-Down Procedure) sau metoda gradată,

abordare de tip doză fixă (FDP, Societatea Britanică de Toxicologie),

metoda de clasă toxică acută (ATCM).

6.4.1 Procedura sus şi jos/metoda gradată

Metoda de testare UDP revizuită (ICCVAM, Publicaţia NIH 02-4501) include

trei componente:

un test primar care oferă o mai bună estimare a toxicologiei orale acute,

cu o reducere a numărului de animale utilizate în comparaţie cu

metodele clasice,

6

un test limită pentru substanţele anticipate care să aibă o toxicitate

minimă,

un test suplimentar pentru a determina panta şi intervalul de încredere

(CI) pentru curba doză-răspuns.

În testul primar revizuit UDP, se administrează unui animal pe cale orală o

doză adecvată (de obicei 175 mg/kg, în lipsa dozei de începere) şi animalul este

observat timp de 14 zile. În cazul în care supravieţuieşte 48 ore după tratament, la un

al doilea animal se administrează pe cale orală o doză mai mare prestabilită. În cazul

în care primul animal moare, la cel de-al doilea animal se administrează o doză mai

mică stabilită anterior. Administrarea se opreşte atunci când este satisfăcut unul din

trei criterii*, cu mai puţin de 6, dar nu mai mult de cincisprezece animale folosite pe

test.

În testul limită UDP revizuit, un animal primeşte o doză limită (2,0 sau 5,0 g /

kg). Dacă animalul moare, testul primar UDP este efectuat. În cazul în care animalul

supravieţuieşte, alte două animalele sunt dozate concomitent la doza limită. Dacă

ambele animale sunt vii (şi anume, trei animale supravieţuisc), testul limită UDP este

oprit. Dacă unul sau ambele dintre cele două animale mor, suplimentar animalele sunt

dozate consecutiv la doza limită până când trei animale supravieţuiesc sau trei

animale mor, numărul maxim de animale testate fiind stabilit la cinci. Dacă trei

animale supravieţuiesc, LD50 este peste doza limită. Dimpotrivă, în cazul în care trei

animale mor, LD50 este sub nivelul dozei limită.

În testul UDP suplimentar pentru determinarea pantei şi CI, trei programe de

tratament cu creşterea nivelului dozei sunt iniţiate la niveluri de 10 - 30 de ori mai jos

de estimarea LD50 obţinută în testul primar. Administrarea continuă, în fiecare

secvenţă, până cînd un animal moare. Toate informaţiile, inclusiv cele obţinute în

testul primar sunt apoi integrate într-un model statistic care estimează panta şi CI

pentru calcularea LD50.

* Criteriile includ: 1) 3 animale consecutive supravieţuiesc la nivelul superior al dozei ; 2) 5 inversări, modificări ce apar la oricare din cele 6 animale testate consecutiv, 3) cel puţin 4 animale după prima inversare, în proporţii asemănătoare, depăşesc valoarea critică statistică.

7

6.4.2 Procedura de fixare a dozei (FDP)

FDP a fost pentru prima dată propusă în 1984 de către Societatea Britanică

de Toxicologie ca o alternativă la testul convenţional LD50 (Ghidul de teste 401

OECD) pentru determinarea toxicităţii acute orale (Gelbke şi colaboratorii, 2004).

FDP a folosit mai puţine animale şi a provocat mai puţină suferinţa decât testul LD50

şi a furnizat informaţii despre toxicologia acută, ceea ce a permis substanţelor să fie

clasificate în funcţie de sistemul de clasificare al riscului din Uniunea Europeană. În

1992, FDP a fost introdus ca ghid de testare 420 OECD. În anul 1999, ca urmare a

unei iniţiative de a scoate treptat ghidul de testare 401, a fost întreprinsă o revizuire a

FDP cu scopul de a oferi reduceri şi criterii suplimentare, şi clasificare în funcţie de

criteriile Sistemului Armonizat Global al Naţiunilor Unite (GHS) de clasificare şi de

etichetare a substanţelor chimice.

6.4.3. Metoda clasei toxice acute (ATCM)

Metodele tradiţionale de evaluare ale toxicologiei acute au ca obiectiv final

moartea animalelor testate. ATCM (Ghidul de teste 423 OCDE) evită acest criteriu ca

un indicator exclusiv prin încorporarea semnelor clinice de toxicitate evidente la unul

dintr-o serie de niveluri de doză fixă pe care se bazează clasificarea materialului de

testat (Schlede şi colab., 2005).

Subtilităţile acestui protocol au fost introduse cu scopul de a minimiza

suferinţa şi extenuarea animalelor testate. ATCM oral utilizează trei animale de

acelaşi sex într-o etapă încorporând considerabil mai puţine animale. Această metodă

oferă informaţii cu privire la proprietăţile periculoase, nocive ale unui produs chimic

şi permite ca el să fie considerat şi clasificat în funcţie de clasificările GHS a

produselor chimice care determină toxicologie acută.

O altă caracteristică a procedurii ATCM, cunoscută sub numele de metoda de

inhalare ATC se bazează pe cerinţele specifice pentru testarea toxicităţii prin

inhalare. ATCM se bazează pe o procedură în trepte, prin care sunt obţinute

suficiente informaţii despre toxicologia acută a unei substanţe de testat ce presupune

testarea simultană în doi paşi/două trepte folosind trei animale de acelaşi sex per

8

pas/treaptă. Dacă dovezile demonstrează că un sex este mult mai sensibil, testul este

continuat cu sexul cel mai sensibil. Absenţa sau prezenţa mortalităţii legate de

substanţa chimică la care sunt expuse animalele pe o anumită treaptă va determina

treapta/pasul următor (Stallard şi colab., 2004):

nu mai este nevoie de testare,

testarea doar a sexului mai sensibil,

testarea suplimentară a trei masculi şi trei animale femele la următorul

nivel crescut sau scăzut de concentraţie.

Atunci când există indicii că un material de testat este susceptibil de a fi non-

toxic, se efectuează un test limită după cum este descris mai sus. În afară de aceasta,

se subliniază în continuare standardele ATCM şi recomandările legate de: selecţia

speciilor de animale, locuire, adăpostire şi condiţiile de hrănire, de pregătire a

animalelor, precum şi modul de expunere.

6.5. LD50 clasic

O varietate de factori, ar trebui luaţi în considerare în planificarea şi

organizarea unui studiu pentru determinarea LD50, dar nu toţi dintre aceştia sunt

asociaţi cu calcularea limitei de încredere de 95%. Cele mai multe preparate

administrate prin diferite căi sunt similare, deşi unele modificări sunt necesare, aşa

cum este arătat mai jos (Risipin şi colab., 2002).

6.5.1. LD50 pe cale orală

Tabelul 6.2 rezumă unii dintre parametrii şi factorii care sunt monitorizaţi

pentru a începe un studiu LD50 clasic oral. Aceşti factori includ, dar nu sunt limitaţi

la: (1) randomizarea animalelor, (2) menţinerea unui spectru îngust de greutăţi

corporale, (3) număr de animale corespunzătoare pe grup, (4) identificarea de teste

individuale pentru subiecţi, (5) abstinenţa la mâncare şi (6) disponibilitatea de apă.

Gama/spectrul de dozare este determinat în conformitate cu tehnicile descrise mai

sus. Experimentele preliminare focalizate sunt iniţiate, pentru a minimiza extinderea

gradului de neletalitate sau 100% letalitate, reducând astfel numărul de grupuri din

9

studiu total. Această metodă îmbunătăţeşte de asemenea nivelul de precizie al

determinării LD50.

Tabelul 6.2. Factori implicaţi în timpul pregătirii pentru studiu LD50 oral

Parametru Factori de luat în considerareRandomizarea animalelor Distribuţia imparţială în grupuri Interval îngust de greutăţi corporale Distribuţia uniformă a animalelor de dimensiuni

similareNumărul de animale Pentru LD 50 clasic media de 10 pentru fiecare

grup de tratament Identificarea animalelor individual Asigurarea observării şi monitorizării individuale;

adăpostirea pentru fiecare grup Abstinenţa de la hrană (16 la 24 h) Absorbţia GI optimă

Apă ad libitum Prevenirea deshidratării

6.5.2 LD50 dermic

Studiile dermatologice sunt efectuate pe substanţe toxice în cazul în care calea

probabilă de expunere este cea de absorbţie prin piele. Ca şi în cazul LD50 orale,

letalitatea este în general, evaluată în cadrul a două specii, dintre care una este non-

rozătoare. De asemenea, substanţa testată este aplicată pe pielea rasă în doze crescute

la câteva grupuri de animale de experiment, o doză per grup. Parametri implicaţi în

determinarea LD50 dermică sunt aceeaşi ca şi cei descrişi pentru LD50 orală (tabelul

6.2), iar unii dintre factorii care sunt unici în studiile dermatologice sunt rezumaţi în

tabelul 6.3.

Tabelul 6.3. Factorii implicaţi în studiul dematologic al LD50

Parametru Factori de luat în considerare

Formula Solid dizolvat în apă sau vehicul inert pe bază de ulei (dimetil sulfoxid, propilen glicol); lichide, paste, unguent, plasture

Aplicarea la nivelul pielii Blana rasă cu 24 ore înainte de test; aplicarea uniformă; zonă de 2 - 3 cm² pentru animale mici, 3 - 5 cm² pentru animale mari (10%); consistenţă; volum = 1 până la 2 ml / kg

Absorbţia toxicului Depinde de proprietăţile de solubilitate în apă sau lipide (mai rapid)

Solubilitatea Lichid solubil în lipide mai rapid absorbit; lichid solubil în apă necesită mai multe timp; înveliş impenetrabil dacă este necesar

Variabilitatea rezultatelor Studii dermatologice asociate cu un grad ridicat de variabilitate; determinarea LD50

10

Cea mai mare parte a variabilităţii în studiile LD50 dermice apare din aceşti

parametri. Incompleta absorbţie a unui toxic datorită solubilităţi sărace a vehiculului,

incapacitatea de a penetra pielea intactă, şi lipsa de uniformitate în aplicarea metodei

sunt în mare măsură responsabile pentru nepotriviri apărute în studiile LD50 dermice.

Datorită absorbţiei indecvate cunoscute sau suspectată ca indecvată, LC50 (50%

concentraţia medie letală) este determinată după absorbţie şi poate substitui lipsa

determinării unei doze de încredere.

De fapt, valorile limită a dozelor la care se observă efectul (valoare cut-off)

este de 1 g/kg şi reprezintă o limită superioară (sub limită efectul lipseşte). De

asemenea, animalele sunt pregătite cu cel puţin 24 de ore înainte de începerea

experimentului, şi zona de aplicare este pregătită pentru a cuprinde circa 10% din

suprafaţa totală a corpului.

Procedura de aplicare şi volumul materialului sunt consistente şi uniforme –

planificate în aşa fel încât să reducă la minimum variabilitatea tehnică. Dispozitivele

de blocare sau restricţiile mecanice sunt de evitat, dacă este posibil.

6.5.3. LD50 prin inhalare

Materialele toxice purtate de aer care sunt transportate prin intermediul

gazelor, aerosoli, fum de ţigară sau ventilaţie necesită determinarea prin inhalare a

LD50 acute. După cum este descris la LD50 clasică, rozătoarele şi speciile non-

rozătoare sunt expuse pentru 4 - 24 h la o substanţă de test în concentraţii crescute (o

concentraţie pe grup, cel puţin patru doze, plus un grup de control).

Studiile de inhalare bine controlate includ sisteme de presiune negativă,

sisteme de inhalare dinamică cu setări programabile de flux de aer. În prezent,

sistemele utilizate, după cum este arătat în figura 6.1, sunt capabile de a oferi

concentraţii precise ale materialului de testat, monotorizarea continuă a toxicului în

camerele de expunere ce includ conducte de evacuare capabile de şuntare a camerei

de aer prin orificii ductale de fum.

Unele sisteme presupun o expunere fie integrală a corpului , fie numai o

expunere oral-nazală. Gama/spectrul de doze este capabil de a produce o serie

11

corespunzătoare de efecte toxice şi rate de mortalitate, pentru a facilita evaluarea

toxicităţii acute pentru determinarea LD50 sau LC50.

Figura 6.1. Imaginea camerei de expunere a rozătoarelor pentru studii de toxicologie prin inhalare (fum). Este arătată maşina de fum TE-10, unitate de acoperire, compresor de aer, camere de expunere a şobolanilor, contorul şi controalele. (după Barile, 2008)

Tabelul 6.4 prezintă unele dintre dificultăţile unice întâlnite în studiile de

inhalare. Concentraţia toxicului se calculează ca sumă totală de substanţă de testare

eliberată prin sistemul de inhalare cu respectarea presiunii şi volumului de aer, aşa

cum a fost monitorizat prin cromatografia în mediu gazos (metoda headspace).

Concentraţiile sunt monitorizate şi ajustate, dacă este cazul.

Cu toate acestea, concentraţiile toxice net eliberate la animale sunt influenţate

de gradul, viteza fluxului de aer, dimensiunea particulelor de distribuţie, precum şi

temperatura şi umiditatea aerului, care pot fi monitorizate prin intermediul

detectoarelor seriale programabile.

12

Tabelul 6.4. Parametrii implicaţi în studiile LD50 prin inhalare

Parametru Factori de luat în considerareConcentraţia agentului de testare distribuit

Viteza, capacitatea fluxului de aer; temperatura aerului şi umiditatea; monitorizarea concentraţiei în cameră; verificarea integrităţii camerei de expunere

Dimensiunea particulelor Dimensiunea particulelor determină distribuţia la organul ţintă (tractul respirator superior sau inferior); dimensiunea influenţează solubilitatea toxicului în aer

Rata respiraţiei Ciclul lumină şi întuneric afectează rata respiraţiei; contactul cu iritanţii induce răspunsuri comportamentale, secretorii şi inflamatorii, modificând rata de expunere

Grupuri de control Influenţa co-solvenţilor, aditivilor, presiunii aerului

6.6. Alte consideraţii legate de determinările LD50

Planificarea adecvată a unui protocol experimental minimizează erorile şi

rezultatele neprevăzute. Luarea în considerare a mai multor factori, după cum s-a

discutat mai sus, reduce erorile experimentale, optimizează analiza rezultatelor şi

maximizează utilizarea resurselor. În plus, laboratoarele sunt încurajate să ia în

considerare utilizarea protocoalelor de screening pentru toxicologie in vitro şi teste

suplimentare pentru studiile in vivo. Studiile in vitro sunt deosebit de benefice ca

teste preliminare de screening înainte de studiile de toxicitate pe animale. De

asemenea, acestea sunt folosite pentru a suplimenta, reduce, sau îmbunătăţi testările

pe animale ca şi randamentul de date mecaniciste în sprijinul determinărilor LD50 .

6.6.1. Calea de administrare

Un agent de toxic este administrat în funcţie de condiţiile de mediu, condiţiile

profesionale, sau expunerea clinică „aşteptată” la oameni sau animale. Deşi cele mai

multe expuneri sunt pe cale orală sau pe cale locală (şi nu sunt limitate la calea

oculară, dermică sau pulmonară) după cum au loc în mod neaşteptat la expunere

profesională, unii agenţi, cum ar fi medicamentele şi agenţii biologici pot necesita

testare pe cale parenterală (Meyer, 2003).

13

Administrarea orală poate fi de asemenea reflectată în teste pe animale,

utilizând mai multe metode. De exemplu, administrarea acută orală se realizează prin:

adăugarea unei substanţe chimice în apa potabilă. Acest lucru necesită

distribuţia controlată a volumului de apă pentru a livra concentraţia

corespunzătoare a substanţei chimice de testat,

adăugarea unui reactiv chimic pentru hrana solidă. De asemenea, acest lucru

necesită monitorizarea volumului aportului alimentar şi include riscul de

absorbţie redusă a substanţei chimice, în prezenţa conţinutului stomacului,

administrarea prin gavaj gastric. Agentul se dizolvă într-un vehicul solvent şi

este administrat prin intermediul unui vîrf rotund de ac gastric şi o seringă.

Prin menţinerea constantă a volumelor (2 până la 5 ml/kg volum total pe

injecţie orală) sunt alocate doze precise (mg/kg greutate corporală),

suplimentarea dietei. Animalele au aversiuni naturale pentru astfel de produse

chimice lichide miscibile, cum ar fi alcoolii şi biterul, iritanţii, lichide organice

care se adaugă direct în apa potabilă pentru evaluarea măsurii în care animalele

se vor deshidrata înainte de a consuma destul din substanţa de testare. În

această situaţie, un regim alimentar complet lichid este preparat din diete

lichide fortificate, disponibile comercial sau reconstituite din formule de

pulbere. Lichidul folosit ca hrană este apoi completat cu ingredientul activ în

volume (% w / v), care să permită un bun control al distribuţiei materialului

de testat. După aclimatizarea iniţială şi scăderea în greutate, combinaţia de

foame şi de sete învinge aversiunea naturală faţă de ingredientul de testare

adăugat.

De asemenea, aplicaţiile dermatologice ale substanţelor toxice sunt dependente

de considerente de solubilitate, cum ar fi dizolvarea unui ingredient activ într-o

soluţie, sub formă de pulbere, unguent, cremă sau pastă. Obiectivul este de a asigura

o penetrare adecvată a vehiculului şi a ingredientului activ prin bariera dermică.

Acest lucru poate necesita tratament cu înveliş de ocluziune, care să acopere zona.

Substanţa rămâne în contact pentru un timp de expunere specificat, după care zona

este clătită şi curăţată de material.

14

Principala preocupare, legată de expunerea prin inhalare de substanţe chimice

sub formă de gaze, vapori, particule materiale sau aerosoli, o constituie distribuţia

concentraţiilor corecte. În plus, studiile de inhalare necesită plasarea unui număr

adecvat de animale în camera de toxic-infuzat, la momente diferite pentru a se potrivi

cu gama de concentraţii. Timpul de expunere variază de la 2 ore până la 96 h, după

care animalele sunt mutate din cameră.

6.6.2 Durata

Deşi studiile LD50 sunt în general efectuate în timpul primelor 24 de ore ale

perioadei de expunere, suferinţa inutilă este evitată prin eliminarea şi eutanasierea

animalelor istovite, bolnave sau moarte din grupurile de tratament. De asemenea,

rezultate eficiente sunt obţinute prin determinarea timpului morbidităţii sau al

mortalităţii, precum şi prin folosirea oricăror analize toxicologice.

6.6.3 Aspectul general al animalelor

Deşi mortalitatea este obiectivul major al unui studiu LD50, colectarea datelor

poate fi optimizată prin efectuarea altor analize toxicologice. Observarea îndeaproape

a animalelor tratate pe parcursul unei perioade de studiu ar trebui să includă:

aspectul general (în comparaţie cu animalele de control),

debutul, intensitatea şi durata efectelor toxice,

modificări în comportamentul, activitatea, respiraţia, apetitul, aportul de

lichide sau retenţia alimentară,

monitorizarea greutăţii corporale, aportului alimentar, consumul de apă,

turgescenţa pielii sau blănii.

6.6.4. Colectarea, strângerea specimenelor şi patologia macroscopică

În funcţie de speciile de animale, probele de sânge sunt obţinute atât de la

rozătoare cât şi de la specii non-rozătoare în cursul unui experiment şi la încheierea

acestuia. Probele de sânge de ordinul microlitrilor sunt prelevate folosind puncţia sau

mici incizii la nivelul pielii. Probele de sânge de ordinul mililitrilor sunt obţinute prin

puncţie venoasă din coadă sau de la nivelul ochilor de la rozătoare sau prin puncţie

15

venoasă din ureche de la mamiferele mai mari. În plus, analiza urinii şi a fecalelor

sunt uşor de realizat din probe colectate de la animale plasate peste noapte în cuşti

metabolice adecvate. Evaluări neurologice non-invazive sunt efectuate cu aparate de

testare comportamentală (rotarod, labirint şi activităţi consolidate, şi sporite de

învăţare). În plus, studiul este conceput pentru a efectua în orice moment examinarea

patologică macroscopică, inclusiv examenul histologic al probelor din ţesut şi

analizele hematologice. Organele selectate sunt rapid şi precis disecate în secţiuni de

1-2 cm şi scufundate într-un fixativ adecvat pentru continuarea prelucrării

histologice.

6.6.5. Variaţia biologică

Diferenţele intra-şi inter-specii existente în metabolismul şi toxicologia

substanţelor chimice şi într-o populaţie de animale sunt selectate aleator pentru

studiu. Variaţia răspunsului este observată la speciile de animalele care se înmulţesc

în mod aleatoriu şi heterogen, la care există posibilitatea de a întâlni erori în

estimarea valorilor LD50. În plus, afectarea semnificativă a relaţiei doză-răspuns

poate fi întâlnită la animale înrudite, a căror origini comune genetic omogene

sugerează răspunsuri similare. În plus, extrapolarea datelor LD50 pentru

citotoxicologia umană şi carcinogenitate nu este neapărat liniară, pentru că oamenii

pot fi mai susceptibili decât maimuţele, şobolanii şi şoarecii la efectele toxicologice

în general şi la substanţele chimice cancerigene în special.

Variaţii uimitoare inter-specii în ceea ce priveşte susceptibilitatea la mai mulţi

agenţi cancerigeni sunt cunoscute; de exemplu, şobolanii sunt cele mai sensibile

specii la aflatoxină B1. Totuşi, la şoareci, conjugarea eficientă cu glutation conferă

rezistenţă la aflatoxina B1. Diferenţele extrem de mari inter-specii în ceea ce priveşte

toxicitatea indusă de ierbicide şi pesticide sunt cunoscute în rândul porcilor de guinea

(mai susceptibili) şi hamsterilor (cei mai rezistenţi).

Prin urmare, una dintre cele mai complexe provocări o constituie

conştientizarea variaţiilor biologice prezente la specii şi extrapolarea acestei

informaţii de la animalele de laborator la om.

16

6.6.6. Determinarea letalităţii acute

Aşa cum s-a arătat în capitolul 3, calea prin care o doză determină un anumit

răspuns este cunoscută sub numele de relaţie doză-răspuns (sau concentraţie-efect).

Răspunsul observat este un rezultat calculat, în ipoteza în care se presupune că

răspunsul este un rezultat al expunerii la un produs chimic ce se poate măsura sau

cuantifica. Răspunsul de asemenea depinde, de cantitatea produsului chimic de

expunere şi de administrarea într-o anumită perioadă.

Există două tipuri de relaţii doză-răspuns, în funcţie de numărul de subiecţi şi

dozele de test.

Relaţia gradată doză-răspuns (fig. 6.2) descrie răspunsul subiecţilor de testat la

creşterea logaritmică a dozei sau concentraţiei unei substanţe chimice. Concentraţia

unei substanţe chimice este proporţională cu numărul de subiecţi care au supravieţuit

în sistemul experimental sau orice alt parametru de morbiditate. În acest caz se

cuantifică răspunsul subiecţilor în funcţie de doza administrată.

Figura 6.2. Curba gradată doză-răspuns (sau efectul concentraţiei) pentru un produs chimic administrat peste o perioadă de timp. Pentru studiile LD50, parametru măsurat (procente) este de mortalitate. Diagrama ilustrează extrapolarea LD50 (0,43 mg/ml), precum şi LD75 (0,6 mg / ml), LD30 (0.3mg/ml) şi LD15 (0,15 mg / ml). Acestea din urmă reprezintă valori de referinţă corespunzătoare la 25, 70 şi 85 % din controale ( după Barile, 2008).

17

Relaţia cantitativă doză-răspuns (fig. 6.3) este determinată de distribuţia

răspunsurilor la creşterea cantităţii dozelor pe o populaţie (variabilă numeric) de

subiecţi testaţi. În acest caz se cuantifică numărul de subiecţi ce răspund la o anumită

doză. Această relaţie este în general, clasificată ca având efect total sau absent şi în

care se consideră că animalele răspund sau nu răspund.

Figura 6.3. Curba cantitativă doză-răspuns care arătă derivaţia experimentală şi estimarea grafică a LD50 (după Barile, 2008).

Figura 6.4 prezintă un grafic tipic pentru compararea ED50 ( 50% doza medie

efectivă) cu LD50. Pentru că LD50 este o doză statistic calculată a unui produs

chimic care provoacă moartea a 50% dintre animalele testate, este un exemplu de

curbă tipică doză- răspuns cantitativă. Dozele administrate sunt diferite mereu ca

nivel şi treaptă şi în general, răspunsul este de mortalitate ( cu toate că leziunea

macroscopică, formarea tumorală sau alt criteriu măsurabil este folosit pentru a

determina deviaţia standard sau valoarea cut-off).

Curbele gradate şi cantitative (graded and quantal curves) sunt generate pe

baza mai multor ipoteze. Timpul de la care răspunsul este măsurat este ales empiric

sau selectat în funcţie de practicile toxicologice acceptate. De exemplu, determinări

de timp empirice mai pot fi stabilite utilizând un toxic suspect sau doza letală a unei

18

substanţe, iar răspunsul este determinat de la 24 la 96 ore. Atunci când această

perioadă de timp este prestabilită este valabilă pentru toate determinările de LD50.

Frecvenţa de administrare presupune o singură doză administrată la începutul

perioadei de testare, atunci când subiecţii sunt aclimatizaţi la mediul înconjurător.

Figura 6.4 Curba reprezentativă doză-răspuns pentru doza medie efectivă (ED50) şi doza medie letală (LD50) (după Barile, 2008).

O alta ipoteză în determinarea LD50 este aceea că efectul observat este, de fapt

datorat prezenţei compusului chimic. Stabilirea unei astfel de realaţii de cauzalitate

este importantă dacă sunt deduse concluzii valide din curba doză-răspuns. De

asemenea, este presupus că produsul chimic în cauză este prezent la nivelul situsului

receptorului sau ţintei moleculare afectate de substanţă. Suportul pentru această

ipoteză provine din măsurarea concentraţiilor compusului chimic de testat la nivel de

organ sau în plasmă. De fapt, dacă concentraţia unui produs chimic în

compartimentul afectat creşte, gradul de răspuns trebuie să crească în mod

proporţional, în cazul în care această ipoteză este valabilă (de aici derivă termenul de

efect de concentraţie).

Următoarea determinare a LD50 presupune că răspunsul la un compus chimic

este în mod normal distribuit - cel mai mare număr de respondenţi sunt adunaţi la

19

mijlocul intervalului, gamei de dozare. Figura 6.5 prezintă o distribuţie cu frecvenţă

normală realizată prin creşterea dozelor unui produs chimic versus procentul cumulat

de mortalitate. Barele reprezintă procentul de animale care au murit la fiecare doză

fără procentul care au murit imediat, la doze mai mici. Aşa cum arată distribuţia

normală (Gaussiană), cel mai mic procent de animale au murit la cea mai mică şi cea

mai mare doză, datorită variaţiei biologice.

Figura 6.5

Distribuţia normală a frecvenţei mortalităţii (%) versus doză (după Barile, 2008).

Prin urmare, calcularea LD50 are în vedere panta liniei în ceea ce priveşte

răspunsul şi limitele de încredere de 95% . Panta este un indicator al spectrului, de

intensitate al toxicităţii substanţei chimice în cauză. De exemplu, o pantă abruptă

reprezintă în mod proporţional răspunsurile mai mari la creşterea concentraţiilor, iar

o pantă mai puţin adâncă sugerează mai puţine răspunsuri toxice proporţional la

creşterile dozei. Intervalul de încredere este o măsură relativă a gradului de eroare

prezentă într-un eşantion şi permite comparaţii intra- şi inter-laborator. Statistic,

determinările LD50, calculul răspunsului în procente, determinarea intervalelor de

încredere, analiza regresiei, precum şi coeficientul de corelare, toate componente

integrante pentru calculul LD50 se vor analiza în capitolul 8.

6.7. Aplicaţiile studiilor LD50

20

Pentru că valoarea LD50 este o estimare statistică a letalităţii acute a unui

produs chimic administrat în anumite condiţii şi circumstanţe, ea oferă o măsură

relativă a toxicităţii substanţelor chimice în condiţii similare sau identice. Astfel,

aplicaţia majoră a LD50 este comparativă, permiţând evaluări toxice semicantitative

în special, în vasta bază de date de toxicologie acută înregistrate pentru rozătoare de

laborator. În plus, testul oferă o metodă de screening pentru evaluarea toxicităţii,

deosebit de utilă pentru substanţe noi neclasificate. Cu toate acestea, determinarea nu

este fără limitări. Faţă de metodologiile ştiinţifice actuale, LD50 este o metodă

învechită, necesită un număr mare de animale, nu furnizează informaţii importante

privind efectele mecaniciste sau organele ţintă alese şi nu sugerează căi

complementare sau discriminatorii toxicologice. De asemenea, este limitată calea şi

durată de expunere. În consecinţă, utilizarea sa de rutină în testarea toxicologică a

devenit subiect de dezbatere continuă şi revizuire permanentă.

21