7/24/2019 Cap 12 Final

1/28

CAPITOLUL 12METODOLOGIA CULTURILOR DE CELULE

12.1. Laboratorul de culturi de celule

12.1.1 Echipametele laboratorului

Laboratorul de culturi de celule este un mediu sofisticat, meticulos, orientat

ctre detalii care se bazeaz pe caracteristici ale biologiei celulare ndelung utilizate

cu includerea concomitent a ultimelor descoperiri ale biotehnologiei.

Echipamentele, consumabilele i instrumentele analitice sunt aspecte importante ale

laboratorului de culturi de celule i sunt destinate detectrii sensibile a evenimentelor

celulare. Pe msur ce tehnologia a avansat, au evoluat i condiiile din laborator. n

consecin, vom prezenta n subcapitolele urmtoare cteva caracteristici importante

ale laboratorului de culturi de celule care includ principalele dotri necesare pentru

culturile de celule i esuturi!

". punct de lucru steril cu flu# de aer,

$. incubator cu controlul temperaturii,

%. autoclav,

&. sistem de numrare a celulelor,

'. cabin cu gaz,

(. surs de ap ultrapur.

)otele de protecie biologic *+lasa - reduc contaminarea microbian i

proteeaz operatorul de e#punere *figura "$."-. /ceste uniti sunt utilizate pentrumanipularea celulelor provenite de la mamifere i a microorganismelor poteniale

infectante, ndeprtnd astfel microbii dintr0o atmosfer steril i protend operatorul

de e#punere. /lternativ, hotele cu flu# prezint un flu# de aer unidirecional care

izoleaz spaiul de lucru prin suflarea aerului steril pe suprafaa de lucru, operatorul

fiind vulnerabil la e#punere. /cest aparat este utilizat pentru prepararea mediilor de

cultur sterile, substanelor farmaceutice inectabile i a soluiilor.

"

7/24/2019 Cap 12 Final

2/28

1ispozitivele de splare automat a sticlriei, incubatorul cu umiditate stabilit

digital i controlul temperaturii, i un microscop cu inversie faciliteaz desfurarea

e#perimentelor cu mai puine manevre de rutin, dificile *figura "$.$-. /stfel,

dispozitivele adecvate pentru culturile de celule ndeplinesc un rol important n

investigaiile to#icologice. n general, pentru a menine sterilitatea, viabilitatea,

identificarea i integritatea celulelor din culturi, ncperea n care se afl aparatura

trebuie s ndeplineasc aceste funcii. +u toate acestea, separarea complet a acestor

funcii nu este ntotdeauna posibil i necesar. 1e e#emplu, o balan analitic, un

p)0metru, o plit electric, un agitator magnetic pot fi comune mai multor

laboratoare, n timp ce dispozitivele pentru prepararea mediilor, echipamentul pentru

culturi de celule i sticlria se gsesc numai n laboratorul de culturi de celule *2utler,

$33'-.

!i"ura 12.1 #ot$ de protec%ie biolo"ic$&",'$ m, !i"ura 12.2 Icubator cu CO2 purificare digital, clasa , tipul /$ *dup 2arile,$33&-

4aoritatea consumabilelor i a materialelor plastice utilizate pentru culturile

de celule sunt sterile i de unic folosin. /cestea includ pipete i sticle din plastic

sau sticl borosilicat, flacoane pentru culturi tisulare din polietilen, plci Petri, tuburi

pentru centrifug din polipropilen sau polietilen, materiale pentru filtrare. 4aterialele

de unic folosin reduc contaminarea microbian i integrarea altor celule din culturi

prezente n laborator. n plus, mediile sterile, preparate pot fi achiziionate ca atare iau avantaul economiei de timp.

$

7/24/2019 Cap 12 Final

3/28

12.2. Celulele di culturi

12.2.1. Culturile primare

n general, realizarea unei culturi de celule din e#plante5 tisulare viabile este

facilitat de vrsta tnr a donatorilor6 astfel cu ct este mai tnr donatorul 7 omsau mamifer 7 cu att mai multe replicaii au loc n celulele rezultate i cu att este

mai scurt replicarea. n plus, celulele din esutul embrionar sunt realizate rapid, de

obicei progresnd prin mai multe dublri ale numrului de celule in vitro dect

celulele de la un donator adult. 8nele celule derivate din esutul neoplazic sunt

similare, n ceea ce privete acest aspect, celulelor embrionare *9im, $33'-.

+lasic, cultura celulelor ncepe cu prelevarea n condiii de asepsie a

e#plantului *":$ # " mm- dintr0un organ sau esut. +elulele sunt separate mecanic sau

chimic de matricea e#tracelular *E+4- i sunt crescute n mediul de cultur, n

contact cu suprafaa inferioar a vasului de cultur. n timp ce regiunea central a

e#plantului se atrofiaz de obicei datorit difuziei mai sczute a substanelor nutritive

n esut, celulele periferice migreaz i prolifereaz. +elulele care migreaz din esut

constituie o cultur primar. n timpul acestei transformri apar dou procese

paralele importante! *"- celulele difereniate ale e#plantului original se pot divide, n

funcie de organul de origine6 de asemenea, pe msur ce cultura progreseaz,

celulele primare i pierd succesiv unele funcii specializate 7 proces denumit

dedifereniere6 $- celulele mai puin specializate precum celulele mezenchimale *de

e#. fibroblastele- se divid rapid i n final depesc celulele specializate *figura "$.%-.

12.2.2 Liiile celulare 'iite

Pe msur ce prolifereaz celulele din cultura primar ocup n final ntreaga

suprafa a vasului de cultur e#pus mediului. /stfel, cultura atinge stadiul de

confluen, ce are microscopic aspectul unui strat de celule uniform bine ataat

denumit monostrat.n acest moment celulele pot fi transferate ntr0un nou vas de

cultur cu mediu proaspt.

5 E#plantele sunt specimene anatomice prelevate de la un donor mamifer i preparate pentru ocultur celular, de obicei cu diametrul de "0% mm. Ele au capacitatea de a genera culturi primare.

%

7/24/2019 Cap 12 Final

4/28

n urma acestei manipulri, cultura nu se mai afl n stadiul primar i este

denumit linie celular continu. ;ubcultivarea sau pasajul, este realizat prin

detaarea celulelor de pe suportul de plastic sau sticl cu autorul unei soluii

chelatoare de calciu precum E1

7/24/2019 Cap 12 Final

5/28

Este posibil selectarea unei singure celule dintr0o cultur primar confluent

i transferarea ei ntr0un flacon de cultur. Proliferarea celulelor pornind de la o

singur celul primar este denumit clon celular.

+onform definiiei, clonarea culturilor celulare permite selecia unui tip de

celule *de e#emplu, o celul cu un marAer funcional specific- i stabilirea unui

subculturi n care caracteristica dorit este transmis generaiilor urmtoare.

12.2.(. Liii celulare cotiue imortaliate

Liniile celulare care nu mbtrnesc n culturi n urma pasaelor repetate sunt

transformate n linii celulare continue imortalizate, n special datorit caracteristicilor

creterii acestor culturi care nu manifest semnele mbtrnirii.

7/24/2019 Cap 12 Final

6/28

Tabelul 12.1 Criterii "eerale de +iabilitate3to4icitate petru liiile celulare

Idicator Metode petru determiarea "radului to4icit$%ii4orfologia celular /nalize histologice, utrastructurale i imunohistochimiceProliferarea celular Bumrarea celulelor, frecvena mitozelor, sinteza /1B,

analiza cariotipului

1iviziunea celular Eficiena formrii monostratului, formarea de clone4etabolismul celular /bsorbia precursorilor fluoresceni sau marcai izotopic,teste de fluorescen pentru activitatea enzimatic

4embrana celular 1ispersia enzimelor *L1)-, ncorporarea albastrului detripan

+olorarea celulelor +olorani imunohistochimici sau citochimici pentru marAeriicelulari

1iferenierea celular /naliza P+@ pentru marAeri genetici4itocondriile @educerea activitii mitocondriale *testul 4

7/24/2019 Cap 12 Final

7/28

*

7/24/2019 Cap 12 Final

8/28

la membrana bazal a organului. /stfel, o singur celul stem migreaz i d natere

tuturor liniilor celulare embrionare.

12.2.0.1. I'lue%a mediului de cultur$ a)upra celulelor E5

/tunci cnd celulelor E; le este permis s se diferenieze ntr0o cultur n

suspensie sau n absena unei suprafee nutritive, acestea formeaz agregate

multicelulare sferice sau corpi embrionari *E2- care conin o varietate de tipuri de

celule. Prin utilizarea unor combinaii de factori de cretere *D- n prezena

componentelor matricei e#tracelulare, se induce e#presia genelor epitelial sau

epidermic specifice i diferenierea. 4ecanismul prin care factorii de cretere i

componentele matricei e#tracelulare influeneaz diferenierea celular sau e#presia

marAerilor de difereniere este un subiect de interes. n prezena factorilor de cretere

n cultur, celulele E; de oarece dobndesc profiluri de e#presie diferite i manifest

caractere ale onciunilor strnse. Este cunoscut faptul c n lipsa factorilor de

cretere, factorului inhibitor leucemic *LD- sau a suportului nutrivit, celulele stem se

difereniaz spontan ntr0o varietate de colonii celulare necontrolate i proprietile

pentru diferenierea celular sunt ntrziate. /stfel, factorii de cretere i

componentele matricei e#tracelulare sunt capabile s direcioneze diferenierea

specific.

1e e#emplu, factorul de cretere epidermic *ED- este un polipeptid mitogenic

care permite diferenierea n ectoderm *inclusiv a tegumentelor- i mezoderm, n timp

ce factorul de cretere Aeratinocitar *9D- este un mitogen specific epitelial

responsabil pentru proliferarea i diferenierea normal a celulelor epiteliale. nconsecin, diferenierea celulelor E; n cultur n linii celulare specifice poate fi

mediat prin mbogirea mediului de cultur cu factori de cretere care influeneaz

e#pansiunea celular, supravieuirea crescut sau diferenierea.

12.2.0.2. Cultura celulelor E5 umae )au de 6oarece

/cum, e#ist numeroase celule stem derivate e#perimental din blastocisteumane sau de oarece. +elulele se difereniaz spontan n structuri embrionare n

G

7/24/2019 Cap 12 Final

9/28

absena unui suport nutritiv sau a mediului comple#. Ele sunt meninute n stare

nedifereniat fie prin subcultivarea frecvent *la fiecare $ zile- pe suporturi tratate cu

mitomicin + sau n mediu de cultur format din fibroblaste iradiate din embrioni de

oarece *4EDs-0 folosit mai ales pentru meninerea liniilor de celule stem0 fie n

mediu de cultur complet la care este adugat factorul inhibitor leucemic 5*LD-, fie

prin ambele metode.

n figura "$.', culturile nedifereniate din celule E; de oarece se disting de

populaiile difereniate i de 4ED subiacent prin formarea E2. /ceste agregate sunt

straturi de &0"3 celule deasupra suportului nutritiv, ovale sau rotunde, cu margini

rotunite. Pe msur ce coloniile de celule E; de oarece se propag, i menin

morfologia de agregat *sgeata mic, Digura "$.(- i sunt distincte n continuare de

suportul nutritiv *asterisc-. Digura "$.> prezint culturi de celule E; difereniate

atunci cnd celulelor le este permis contactul, formnd monostraturi confluente 7 o

transformare care apare n lipsa suportului nutritiv i a LD. Digura detaliaz pierderea

morfologiei de agregat a celulelor E;.

!i"ura 12.7Ima"ie cu cotra)t de 'a$ a corpilor embrioari ,E- di celule E53D(de 6oarece dup$ 8dep$rtarea LI!. /gregatele sunt rotunde i au margini bine definite. Ele imenin morfologia de agregat i sunt distincte de suportul nutritiv subiacent *mrire &33 #- *dup2utler,$33'-.

5LD recombinant uman este un factor limfoid care promoveaz meninerea pe termen lung acelulelor E; de oarece prin suprimarea diferenierii spontane6 nu este eficient asupra celulelor E;umane.

H

7/24/2019 Cap 12 Final

10/28

12.2.7. Cre6terea cloal$ 6i

me%ierea culturilor

Liniile celulare finite nalt difereniate din e#plante tisulare sau din esuturi

tratate enzimatic sunt meninute n cultura primar prin manipularea mediului lichid.

/semenea tehnici includ utilizarea mediului fr ser i arginin i acoperirea

suprafeei de cultur cu E+4 *laminin sau fibronectin- care promoveaz creterea

i adeziunea celulelor epiteliale sau mezenchimale. n plus, celulele de diferite tipuri

sunt separate mecanic prin manipulri de tip cretere clonal sau adeziune

difereniat n esuturile intacte, celulele epiteliale sunt separate de fibroblaste pe

baza capacitii celor din urm de a adera la suprafa mai rapid. La "0% ore de la

inocularea iniial a culturii cu suspensia celular, mediul este ndeprtat i celulele

epiteliale care nu au aderat sunt transferate ntr0un alt vas. n acest moment, cultura

primar servete ca o cultur de meninere a celulelor specializate.

Proliferarea i creterea culturilor de meninere depinde de civa factori printrecare organul de origine, vrsta donorului i tipul celular. 1e e#emplu, culturile

primare normale de celule specializate, inclusiv celule derivate din ficat de roztor

adult, pot fi meninute cteva sptmni, n timp ce celulele derivate din ficat, sistem

nervos sau epiteliu pulmonar de embrion, pot fi meninute cteva luni. = cultur

stabilizat are ntotdeauna tendina s0i piard funciile specifice cu timpul, dar acest

proces poate fi contracarat prin cultivarea celulelor specifice pe suporturi nutritive4ED sau prin utilizarea mediului de cultur fr ser. zolarea culturilor primare

"3

!i"ura 12.9. : ab)e%a )uportului utriti+ 6i aLI! E- edi'ere%iate di coloii de celule E5de 6oarece )e propa"$ 86i pierd mor'olo"ia dea"re"at 6i mi"rea$ la peri'erie pe m$)ur$ cecotiu$ )$ )e di'ere%iee ,dup$ -utler 2//7.

!i"ura 12.; Celule E5di'ere%iate 8 ab)e%a ME! )auLI! ,dup$ -utler 2//7.

7/24/2019 Cap 12 Final

11/28

necesit repetate prelevri de e#plante de la animale, costurile acestor procedee fiind

descrise n +apitolele ( i > din Partea a 0a.

12.2.9. Criterii petru ideti'icarea 6i moitoriarea celulelor di culturi

Bumeroase criterii, precum marAerii celulari i indicatorii sunt utilizai pentru

identificarea i clasificarea celulelor din culturi. /ceste metode sunt utilizate n

momentul realizrii liniei celulare, i apoi periodic pentru a monitoriza puritatea

genetic a celulelor6 ele sunt descrise n subcapitolele urmtoare.

12.2.9.1 Aalia cariotipului

/tunci cnd o linie celular este derivat dintr0un esut normal, setul de

cromozomi trebuie s fie identic cu cel al celulelor de origine sau al speciei. n acest

mod, linia celular este clasificat ca diploid *$n-. =rice alt model clasific linia ca

aneuploid sau heteroploid. Liniile celulare continue derivate din tumori sau celule

transformate sunt incluse n cea de0a doua categorie.

12.2.9.2 :mb$tr*irea culturilor

1urata de via a celulelor din culturi este msurat n funcie de nivelul de

dublare a populaiei de celule *pdl population doubling level-. /ceste calcule

monitorizeaz frecvena evenimentelor mitotice caracteristice celulelor care

prolifereaz dup stabilirea lor n culturi primare. Dormula general pentru evaluarea

pdl este!

pdlf= %,%$ *logF log- Ipdli

pdlf reprezintpdl final la momentul tripsinizrii sau la finalul unei subculturi6 D este

numrul final de celule6 este numrul iniial de celule utilizate la nceputul

subculturii6pdlieste nivelul de dublare a celulelor utilizate la iniierea subculturii.

+elulele cu o durat de via limitat prezint de obicei semnele mbtrnirii,

adic! pierderea morfologiei celulelor, scderea ratei de proliferare, creterea

coninutului citoplasmatic de lipide, i alte semne ale apoptozei. Jaloare pdle#primat de o line celular finit sau de o cultur primar depinde n mare msur de

""

7/24/2019 Cap 12 Final

12/28

vrsta organului de origine. /stfe,pdl este stabilit din datele din literatur sau este

determinat empiric. Liniile celulare continue imortalizate sunt capabile de

multiplicri nelimitate in vitro, datorit condiiilor optime n care sunt meninute.

4onitorizareapdl nu este ntotdeauna necesar pentru liniile celulare imortalizate.

12.2.9.(. Culturile depedete de ata6are

8nele celule sunt capabile de cretere ntr0o cultur n suspensie, n timp ce alte

celule necesit ataarea la un suport plastic. ;uportul plastic poate fi un suport de

polietilen sau polipropilen tratat, proprietile sale electrostatice permind celulelor

izolate s se ataeze i s migreze. /lte suporturi pentru ataare includ componente

ale matricei e#tracelulare precum laminina sau fibronectina. /ceste componente

mimeaz substratul prezent normal in vivola limita epiteliului i n interstiiu. /stfel,

aceste componente pot fi selective pentru celule de origine epitelial sau

mezenchimal. /lte suporturi utilizeaz membrane filtrante cu micropori care permit

att ataarea celulelor, ct i pasaul macromoleculelor prin membran ctre suprafaa

bazo0lateral a stratului de celule .

12.2.9.0 Ihibi%ia de cotact

Pe msur ce liniile celulare continue finite prolifereaz ntr0un mediu de

cultur rar, ele migreaz i ocup suprafaa disponibil care este inundat cu mediu.

Pe msur ce suprafaa devine congestionat, celulele vin n contact unele cu altele

prin intermediul membranelor. 1ei monostratul este viabil, proliferarea nceteaz i

celulele manifest inhibiia de contact caracterizat prin oprirea ciclului celular nfaza o. Digura "$.G ilustreaz ciclul celular specific celulelor care prolifereaz in

vitro sau in vivo.

+elulele care nu manifest inhibiia de contact cresc n multistrat, elibernd

succesiv celulele ataate pe suport, crend astfel un spaiu pentru ca proliferarea i

creterea s devin competitive. n consecin, dei culturile confluente n multistrat

nu manifest inhibiia de contact, deseori celulele plutesc n mediul de cultur.

"$

7/24/2019 Cap 12 Final

13/28

4aoritatea liniilor celulare continue imortalizate rezist la restriciile de cretere

evideniate la culturile celulare finite.

/lte metode pentru clasificarea celulelor nu sunt realizate de rutin, dar sunt

ncorporate n e#perimentele mecaniciste. /cestea includ analiza proprietilor

specifice esuturilor difereniate, precum secreia macromoleculelor sau prezena

enzimelor intracelulare, identificarea ultrastructural sau activitatea structur0funcie,

marcarea fluorescent pentru proteinele structurale identificabile, analize @

7/24/2019 Cap 12 Final

14/28

12.(. =ece)it$%ile uei culturi

12.(.1 Compoetele mediului de cultur$

+elulele sunt cultivate ntr0un mediu lichid ale crui componente trebuie s fie

perfect controlate i monitorizate. 4ediul este compus dintr0o soluie tamponat deioni fiziologici ce conine aminoacizi solubili, carbohidrai, vitamine, minerale, acizi

grai i ali co0factori. ngredientele opionale includ un indicator de p), sisteme de

tamponare separate precum )EPE;, i ali aminoacizi neeseniali care sunt

ncorporai atunci cnd sunt necesari unui anumit tip celular. Dormulele de medii sunt

disponibile rapid sub form de pulbere solubil sau sub form lichid.

8nele dintre cele mai utilizate medii sunt mediul Eagle modificat *4E4-,

mediul de baz Eagle *24E-, mediul Eagle modificat 1ulbecco *14E4- i mediul

D"$ )am. /ceste soluii sunt n general utilizate cu ser sau proteine din ser, cu adiia

serului fetal de mamifer dac este necesar.

;erul este o mi#tur comple# de componente biologice, ce conine factori de

cretere solubili, proteine de transport, hormoni, metale eseniale, lipide i factori de

adeziune ai matricei e#tracelulare. n absena adugrii unui procent mic de ser *'0

$3K- ca parte integrant a formulei, proliferarea celular nu are loc la parametrii

optimi.

n cultura de celule, soluia salin echilibrat funcioneaz ca o soluie de

splare, irigare, transport i diluare, n timp ce menine balana osmotic intracelular

i e#tracelular. n plus, soluiile le ofer celulelor apa i ionii anorganici eseniali

pentru metabolismul celular normal i sunt create astfel nct s ofere un sistem

tampon care menine lichidul n limitele fiziologice de p) *>,$ 7 >,(-. /ceste soluii

sunt de asemenea combinate cu carbohidrai precum glucoza, suplimentnd astfel

sursa de energie pentru metabolismul celular. +ele mai utilizate soluii saline includ

soluia tampon fosfat salin 1ulbecco *P2;-, srurile echilibrate Earle, i soluiile

echilibrate )anA *)2;;-. n plus, pentru a satisface necesarul de substane nutritive,

celulele trebuie plasate ntr0un mediu care mimeaz condiiile in vivo.

7/24/2019 Cap 12 Final

15/28

carbon, tamponarea, osmolaritatea, umidifierea, i absena contaminrii microbiene.

/ceti parametrii variaz uor, n funcie de tipul de celule.

Tabelul 12.2 Codi%iile miime ece)are petru me%ierea 6i proli'erarea celulelor culti+ate

Codi%ii Parametrii+ondiiile din cultur p), mediu de cretere tamponat i soluii de splare, temperatur,umiditate, osmolaritate, ap ultrapur

o+. +elulele rezist mai uor scderii temperaturii

dect creterii temperaturii. 1e fapt, temperaturi de pn la & o+ pot reduce activitatea

metabolic fr inhibarea ireversibil a funciilor biologice. ,$0>,&6 unele

celule cresc la p) e#trem, ntre >,3 i >,(. 8nele celule sunt mai tolerante la condiii

de scdere uoar a p)0ului dect la o cretere corespunztoare a acestuia, iar celulele

transformate sunt mai rezistente la modificrile de p) dect celulele diploide. n plus,

celulele care prolifereaz rapid, cu necesiti metabolice crescute, elimin surplusul

acid mai rapid, ceea ce determin o scdere rapid a p)0ului, chiar i n condiiile

prezenei unei soluii tampon tari. /ceste tipuri de celule necesit adeseori splri mai

frevente ale mediului. n general, p)0ul este rapid monitorizat ntr0un incubator, dar

i n timpul manoperelor de rutin cu adiia indicatorilor de p) *de e#emplu rou

"'

7/24/2019 Cap 12 Final

16/28

fenol- n mediul de cretere i n soluiile saline. ndicatorii nu interfer cu stabilitatea

culturii.

12.(.0. Dio4idul de carbo

4aoritatea mediilor de cultur conin bicarbonat ca parte a sistemului tampon

pentru a preveni modificrile rapide de p). La temperatura camerei i n incubatoare

cu presiuni standard, bicarbonatul i acidul carbonic sunt n echilibru n soluie la p)

fiziologic. La %>o+, dio#idul de carbon solubil este eliminat din soluie, afectnd

echilibrul stabilit ntre bicarbonat, acidul carbonic i +=$. /ceast condiie perturb

balana concentraiilor de acid carbonic i bicarbonat n mediul de cultur.

/stfel, tensiunea +=$ echilibrat i meninerea p)0ului sunt ndeplinite prinmeninerea unei presiuni pariale a +=$ crescute n faza gazoas. ncubatoare

moderne cu +=$ sunt proiectate pentru a menine faza gazoas ntr0o camer la

niveluri controlate. /stfel, maoritatea mediilor de cultur sunt create pentru a fi

utilizate cu $0"'K +=$, astfel nct s fie meninut p)0ul adecvat.

12.(.7. Tampoarean momentele cnd cutiile Petri, flacoanele sau plcile sunt ndeprtate din

incubator, +=$iese din acesta i din mediul de cultur lichid cald. /cest fenomen

determin incapacitatea meninerii p)0ului n absena fazei gazoase. /cest fenomen

nu reprezint de obicei o problem atunci cnd culturile sunt ndeprtate din

incubator n timpul etapelor de splare cu soluii fiziologice de sruri sau n timpul

nlocuirii mediului. Pentru e#perimentele care necesit manipularea pentru perioadendelungate n afara incubatorului este necesar un sistem de tamponare. 4ulte

laboratoare ncorporeaz de rutin soluii tampon organice precum )EPE; n mediile

de cultur pentru a preveni modificarea rapid a p)0ului atunci cnd culturile sunt

ndeprtate din incubatorul cu +=$. n plus, este adugat hidro#id de sodiu sau

bicarbonat de sodiu.

/tunci cnd o atmosfer de gaz sau vapori trebuie meninut continuu, aa cum

este cazul e#perimentelor care utilizeaz gaze to#ice, celulele sunt cultivate n

"(

7/24/2019 Cap 12 Final

17/28

flacoane de cultur cu capac cu filet. Dlacoanele sunt apoi perfuzate cu mi#turi de

gaze de mediul din incubator i nchise cu capac cu filet, prevenind astfel scurgerea

fazei gazoase. 1ei laborioas, aceast metod este util atunci cnd se analizeaz

efectele lichidelor organice volatile sau gazelor n protocoalele de testare

to#icologic.

12.(.9. O)molaritatea

ntervalul optim al osmolaritii ntr0un mediu de cultur depinde de tipul de

celule, fiind n general cuprins ntre $'3 i %$' miliosmoli per Ailogram *m=sm:Ag-.

=smolaritatea unei soluii este standardizat n timpul preparrii mediului sub form

de pulbere. 1ificultile apar pe parcursul incubrii, cnd umiditatea relativ din

incubator nu este meninut la saturaie sau n apropiere de saturaie. /tunci cnd ua

incubatorului este deschis, aerul uscat ptrunde n camera incubatorului i o rcete,

aerul umidificat din camer evaporndu0se. 8n incubator care nu realizeaz un

transfer optim de cldura va rmne rece. 1ac mediul lichid are o temperatur nalt,

apa din mediu se evapor, soluia dobndind o osmolaritate crescut.

Pentru a preveni evaporarea i a menine osmolaritatea optim a mediului de

cultur, este necesar echilibrarea rapid a temperaturii n camer. ncubatoarele

moderne impermeabile sunt echipate cu sisteme de control intern al umiditii i

ventilatoare care distribuie cldura. /ceste camere sunt precis izolate, nclzite i

umidificate pentru a preveni formarea unor zone reci care ar putea preveni

umidificarea camerei.

/lternativ, umiditatea camerei este meninut printr0un recipient cu ap

*preferabil cu o suprafa mare- prezent n camer. La incubatoarele de generaii maivechi, umidificarea adecvat este determinat vizual prin prezena condensului pe ua

de sticl a incubatorului i lipsa condensului pe vasele de cultur. 8nele incubatoare

sunt echipate cu ui interioare nclzite care previn condensul.

8midificarea este de asemenea monitorizat prin msurarea osmolaritii

mediului de control incubat n paralel cu cultura de celule. Prin evaporare,

osmolaritatea crete n comparaie cu mediul proaspt la nceputul unui ciclu celular,indicnd faptul c umiditatea este inadecvat.

">

7/24/2019 Cap 12 Final

18/28

12.(.;. =ece)arul de ap$

= condiie fundamental a unui sistem de culturi de celule, care este adesea

omis n etapele iniiale ale dotrii unui laborator pentru culturi de celule, este

calitatea apei utilizate pentru prepararea mediilor i soluiilor de sruri. 1e obicei,

distilarea apei sau pasaul apei printr0o coloan deionizant nu sunt suficiente pentru

a ndeprta toate impuritile prezente n ap. +ontaminanii din ap pot fi metale,

substane organice, cantiti variabile de cationi bivaleni precum magneziu sau

calciu, i produi de metabolism ai microorganismelor. /semenea contaminani

interfer cu creterea celular i procesele funcionale.

mpuritile sunt ndeprtate prin sisteme care recircul apa printr0o serie de

coloane deionizante i care realizeaz i schimbul de substane organice. 4ulte dintre

aceste sisteme sunt echipate cu monitoare digitale care afieaz puritatea apei

colectate n megaomi *mega0-. Pe msur ce ionii i impuritile sunt ndeprtate n

coloanele de filtrare, rezistena apei crete.

= rezisten de cel puin "3 mega0 este adecvat pentru culturile de celule6

limita purificrii cu numeroase coloane de schimb al ionilor este de apro#imativ "G

mega0. 8nele sisteme de purificare a apei sterilizeaz apa prin iradiere cu radiaii

gamma.

12.(.

7/24/2019 Cap 12 Final

19/28

12.(.>. Medii '$r$ )er

n investigaiile care au ca scop nelegerea influenelor nanomaterialelor

asupra creterii i proliferrii, mecanismelor to#icitii, i aciunii factorilor de

cretere sau hormonilor asupra celulelor din culturi, utilizarea serului fetal sau de

animal nou0nscut nu este acceptat. ;erul este o mi#tur comple# i puin

caracterizat, a crui compoziie variaz n funcie de lotul comercial. n plus, serul

conine substane biologice naturale sau contaminani microbiologici *de e#emplu

micoplasme, virusuri, endoto#ine, prioni- care pot fi to#ice sau pot induce

transformri genetice sau structurale pentru maoritatea celulelor.

/stfel, utilizarea mediilor fr ser nlocuiete serul din soluiile standard de

cretere prin ncorporarea unei mi#turi sintetice de factori care substituie necesarul

unei culturi. /ceti factori includ hormoni *insulin, transferin-, aminoacizi

neeseniali, metale *seleniu, mangan, zinc-, factori de cretere *factorul de cretere

epidermal, factorul de cretere fibroblastic, factorul de cretere Aeratinocitar-, i

componente ale matricei e#tracelulare *laminin i fibronectin-. 4ediile selective

fr ser faciliteaz adaptarea celulelor la atmosfera din cultur i permit

standardizarea mai bun a condiiilor e#perimentale.

8n mediu fr ser faciliteaz de asemenea izolarea tipului dorit de celule i

stabilizarea unei culturi primare de celule. Prin ncorporarea unui mediu fr ser se

evit creterea e#cesiv a fibroblastelor care de obicei prolifereaz rapid ntr0un

mediu suplimentat cu ser. 4ediul fr ser este preparat individual i adaptat la fiecare

tip celular. /vantaele integrrii mediilor fr ser *sau chiar cu coninut redus de ser-

sunt bine documentate i au fost descrise pentru utilizarea n meninerea culturilor decelule primare i specializate i pentru liniile celulare finite i continue.

12.0. Proceduri

12.0.1 5i)teme de celule )tatice 6i per'uabile

n general, condiiile din cultur n timpul unui e#periment difer de acelea

utilizate n timpul creterii i meninerii de rutin a culturilor stoc.

7/24/2019 Cap 12 Final

20/28

modificare a mediului celular nainte i n timpul subcultivrii. n timpul incubrii

normale, n mediul de cultur se produc fenomene precum depleia nutrientelor,

producerea de acizi de metabolism, i acumularea produilor de e#creie, ceea ce

nseamn condiii de cultur mai puin favorabile.

7/24/2019 Cap 12 Final

21/28

agitare magnetic sau vorte#are uoar. 1ispersia chimic implic ndeprtarea

calciului din soluia de dispersie prin adiia chelatorilor precum acidul etilendiamino

tetraacetic *E1Procedeu tipic petru iolarea mecaic$ 6i eimatic$ a celulelor aimale.

7/24/2019 Cap 12 Final

22/28

n general, aceast tehnic este tipic pentru izolarea celulelor din organe sau

viscere intacte sau din specimene de biopsie, i trebuie efectuat ntr0o hot de

protecie biologic.

E#plantele sunt de asemenea realizate prin plasarea esuturilor disecate ntr0o

pictur de mediu i lsarea specimenelor s adere. Pstrarea condiiilor de asepsie

este esenial pentru obinerea unei culturi reuite.

12.0.(. 5ubculti+area

;ubcultivarea, sau pasaul celulelor implic dispersia monostratului, separarea

celulelor i transferarea acestora n noi vase de cultur. Procedura este necesar

atunci cnd o populaie de celule a ocupat cea mai mare parte din aria suprafeei unui

vas de cultur.

La acest nivel de densitate, celulele normale diploide manifest inhibiia de

contact, proliferarea i migrarea ncetinesc sau nceteaz pe msur ce celulele vin n

contact unele cu altele. 4etodele comune utilizate pentru dispersia celulelor includ

dispersia mecanic i enzimatic.

'ispersia mecanicimplic utilizarea unei spatule sterile din silicon sau plastic

care s fragmenteze monostratul n agregate. 4etoda nu este adecvat meninerii

culturilor continue, ale cror celule au membranele sensibile la manipularea

mecanic, deoarece adeseori acest proces comprim sau lizeaz celulele. /ceast

tehnic este adesea utilizat la finalul e#perimentelor, pentru testrile preliminarii.

'ispersia enzimatic utilizeaz enzime proteolitice precum tripsina,

colagenaza i:sau 1B0azele, care duc la obinerea unui numr satisfctor de celule,cu o distrugere tisular redus. ;oluia de enzime este o soluie salin ce conine 3,'0

$K +a$I04g$I *P2;- suplimentat cu un chelator de cationi *E1

7/24/2019 Cap 12 Final

23/28

!i"ura 12.1/Dia"rama protocolului utiliat petru di)per)ia eimatic$ a moo)tratuluide celule.14E0"3 F mediu Eagle modificat 1ulbecco ce conine "3K ser fetal de viel. P2; Fsoluie tampon fosfat salin. 5 F diluie "!"3 n P2; a concentratului "3Q tripsin0E1

7/24/2019 Cap 12 Final

24/28

utilizate cteva crierii pentru a determina utilitatea potenial a celulelor pentru

investigaii to#icologice. /ceste criterii includ!

0 viabilitatea culturilor i aspectul celulelor la microscopul cu contrast de faz,

n special cnd o line celular finit se apropie de numrul ma#im anticipat de

diviziuni,

0 capacitatea celulelor de a pstra ct mai multe din caracteristicile

morfologice i biochimice ale celulelor originale sau culturii primare.

4ulte criterii comune utilizate pentru monitorizarea proliferrii i viabilitii

celulelor includ numrarea celulelor6 e#cluderea colorantului vital albastru tripan6

capacitatea celulelor de a supravieui i a prolifera n condiii de cultur normale6

procentul celulelor inoculate n vasul de cultur care se vor ataa la suprafaa de

cultur. Diecare procedur este realizat ca parte a monitorizrii de rutin a statutului

culturii. 4aoritatea acestor caracteristici sunt determinate la microscopul cu contrast

de faz. Digura "$."" descrie metoda e#cluderii colorantului vital.

!i"ura 12.11 Dia"rama utili$rii coloratului +ital alba)tru tripa. P2; F soluietampon fosfat salin *dup 2utler, $33'-.

$&

E#aminarea celulelor

;electarea vaselor de cultur reprezentative

+ltirea i meninere n etanol >3K sauizopropanol, "3 minute

/dugare soluie albastru tripan "K:etanol>3K, "3 minute

+ltire de % ori cu P2;

Bumrarea unui eantion i calculareaprocentului de celule colorate

7/24/2019 Cap 12 Final

25/28

12.0.7. Crioco)er+area

4aoritatea liniilor celulare sunt ngheate pentru timp nedefinint i apoi

decongelate pentru continuarea cultivrii. +ulturile stoc congelate sunt indispensabile

pentru testarea to#icologic in vitro, n care stocuri congelate ale aceluiai pasa al

unei linii celulare sunt pstrate independent. n funcie de gradul utilizrii i

disponibilitatea altor investigaii, achiziionarea unui ultracongelator este util. /ceste

ultracongelatoare menin temperatura imediat sub punctul critic la care se formeaz

gheaa *0"%3o+- i sunt echipate cu alarme i sisteme de rezerv n cazul avariilor

mecanice. Pentru laboratoarele independente, un congelator cu azot lichid *LB$- este

convenabil, dar necesit aprobare pentru azotul lichid datorit evaporrii constante.

Liniile celulare i culturile primare sunt crioconservate atunci cnd sunt

obinute condiiile optime pentru cultur. Procedura pentru subcultivarea

monostraturilor este realizat dup tehnica descris mai sus i prezentat n figura

"$."$. 4onostraturile sunt dispersate prin imersia ntr0o soluie tamponat de tripsin,

neutralizat cu mediu de cretere ce conine ser *mediu de cretere complet-, i

centrifugate *&33gpentru "3 minute-. ;upernatantul este ndeprtat i sedimentul este

resuspendat n mediu de cretere complet ce conine o substana anti0nghe precum

dimetilsulfo#id *14;=- sau glicerin. +elulele sunt resuspendate n 14E0"3 plus

14;= >,'K la o la o concentraie de "0% # "3( celule:ml n criotuburi sterile de $

mL, cu capac cu filet. +riotuburile sunt marcate i ngheate lent la o rat controlat

de 0"3grade +:minut ntr0o camer de congelare automat.

/ceste camere sunt de obicei disponibile ca accesorii ale congelatoarelor cu

azot lichid. /lternativ, criotuburile sunt ngheate n vapori de LB$ prin plasarea lorntr0un recipient i poziionarea acestui recipient la nivelul poriunii care se

ngusteaz a congelatorului cu LB$. Este important ca nivelul azotului lichid s nu fie

foarte mare deoarece ar nghea celulele prea rapid. n ziua urmtoare, tuburile sunt

sigilate n criorecipiente i imersate n azot lichid.

$'

+ltirea monostratului de dou ori cu P2;

7/24/2019 Cap 12 Final

26/28

!i"ura 12.12 Dia"rama de a)amblu a liiilor celulare co"elate. 14E0"3 F mediuEagle modificat 1ulbecco ce conine "3K ser fetal de viel. 14;= F dimetilsulfo#id. P2; F soluietampon fosfat salin. 5F diluie "!"3 n P2; a concentratului "3Q tripsin0E13K, uscat , iar coninutul este adugat n mediu de cretere cald utiliznd o

pipet Pasteur steril. Pentru maoritatea tipurilor de celule, cultura poate fi meninut

fr a fi perturbat peste noapte n incubator n condiii adecvate, dup care mediul

este nlocuit.12.0.9. Ideti'icarea celulelor

$(

+ltirea cu soluie tripsin0E1,'K6 austarea pn la o

concentraie de "0% # "3(celule:ml

+ongelare n criotuburi sterile de $ mL, cucapac cu filet, la o rat controlat de

0"o+:minut

7/24/2019 Cap 12 Final

27/28

ntr0un laborator n care manipularea unor linii celulare se realizeaz de rutin,

este necesar verificarea unei linii celulare o dat iniiate, n special n cazul n care

e#ist riscul contaminrii ntre liniile celulare. 8nele metode utilizate pentru

identificarea unor marAeri celulari caracteristici includ marcarea cu anticorpi

fluoresceni, studii ale cariotipului, profilul izoenzimatic, i @

7/24/2019 Cap 12 Final

28/28

;ursa primar de linii celulare i alte organisme utilizate n studiile de biologie

celular i genetic sunt bncile de celule certificate precum /merican