CAPITOLUL 17SCREENING-UL DE MARE CAPACITATE ŞI ANALIZA MICROARRAY

17.1. Screeningul sistemelor de analiză de mare capacitate în testarea preclinică a medicamentelor

17.1.1. Introducere

Screeningul sistemelor de analiză de mare capacitate (high throughput

screening - HTS) conţine o combinaţie de robotică modernă, procesare de date şi

software pentru control, dispozitive de manipulare a lichidelor şi detectori sensibili

care permit prelucrarea eficientă şi fără probleme a milioane de teste biochimice,

genetice sau farmacologice într-un timp scurt. Acesta oferă o metodă rapidă, cu un

cost eficient pentru screening-ul potenţialelor surse de molecule noi, folosite frecvent

în producţia medicamentelor.

Spre deosebire de procedurile de screening convenţionale sau manuale, HTS

permite manipularea unei largi varietăţi de probe de intrare; fiecare probă este

etichetată cu un set propriu de date şi de urmărire a rezultatelor şi produce noi

rezultate experimentale. HTS face posibilă obţinerea unor cantităţi mari de date

experimentale, legate de observaţii în ceea ce priveşte reacţiile biologice la expunerea

la compuşi chimici diferiţi. În toxicologia competitivă şi farmaceutică, intervalul de

timp pentru dezvoltarea medicamentelor şi testarea preclinică în trialuri clinice este

deosebit de importantă.

Abordările tradiţionale ale cercetătorilor din industria farmaceutică nu

îndeplinesc cerinţele actuale ale programelor de dezvoltare a medicamentelor. HTS

foloseşte automatizări de laborator pentru a colecta cantităţi mari de date toxicologice

şi farmacologice şi profiluri fiabile pentru o serie de activităţi biologice, în cele din

urmă informaţia fiind încorporată în biblioteci/arhive de produse chimice mari.

Disponibilitatea acestor biblioteci şi sisteme robotizate pentru bioteste permite sinteza

şi testarea a mii de compuşi zilnic.

17.1.2. Proceduri

În pregătirea pentru un test, godeurile microplăcilor sunt umplute cu o ţintă

biologică cum ar fi o proteină, celule intacte sau un embrion de origine animală. Ţinta

absoarbe, se leagă de, sau reacţionează cu compuşii din godeuri după un timp de

incubare prestabilit. Măsurătorile sunt înregistrate manual sau automat în toate

godeurile plăcii*. Analizele automate se desfăşoară pe mai multe probe simultan

folosind indicatori, cum ar fi reflexivitatea sau transmisia luminii polarizate prin

intermediul ţintei. Datele rezultate sunt înregistrate ca o grilă de valori numerice, cu

fiecare număr identificându-se valoarea obţinută dintr-un singur godeu.

Echipamentele pentru analizele de mare capacitate măsoară zeci de plăci în minute,

generând astfel rapid mii de puncte de date experimentale.

17.1.3. Echipament

Staţia de lucru HTS conţine un manipulator de lichide, o placă de replicare şi

dispozitive de umplere şi etanşare a plăcii. O varietate de microplăci cu godeuri sunt

utilizate; majoritatea au de la 96 la 384 godeuri. Fiecare godeu este marcat cu ţinte

experimentale, compuşi chimici sau este blanc/liber. În plus, există dispozitive

automate de manipulare a lichidelor, de detectare şi alte sisteme robotizate.

Cititoarele de absorbanţă a plăcilor şi detectoarele sunt utilizate pentru măsurători

cinetice în teste enzimatice sau celulare.

Citometrele cu scanare laser a fluorescenţei pentru microplăci oferă un

screening cu conţinut înalt la o capacitate compatibilă cu protocoalele primare şi

secundare de screening pentru testele bazate pe fluorescenţă.

Caracteristicile robotice îndeplinesc sarcini autonome sau preprogramate şi

sunt capabile de screening-ul de biblioteci combinatorice faţă de screening-ul ţintelor,

utilizând teste pe bază de celule. Capacităţile medii zilnice a celor 480 de microplăci

pot genera peste 180 000 de date punctuale.

* Măsurătorile manuale sunt deseori necesare atunci când examenul microscopic este utilizat pentru a detecta modificări în dezvoltarea embrionară, cauzate de compuşii de test.

2

17.1.4. Aplicaţiii

Aplicaţiile biologice şi chimice pentru descoperirea medicamentelor şi

analizele toxicologice sunt aplicabile pentru identificarea compuşilor activi

toxicologic sau farmacologic, a anticorpilor şi genelor care modulează căi

biomoleculare speciale. Aceste rezultate furnizează puncte de plecare pentru design-

ul de medicamente şi pentru înţelegerea mecanismelor sau interacţiunii moleculelor

ţintă în procesele biochimice (Cummins, Velculescu, 2006).

În plus, tehnologia este utilă în identificarea medicamentelor candidate noi faţă

de cele existente în bibliotecile de substanţe chimice pentru abilitatea lor de a

modifica ţinte (de exemplu, capacitatea unui agent chimic de a modifica o protein

kinază ţintă).

Ca metodă folosită pentru producţia unor medicamente, HTS, depistează

proprietăţile biologice şi fizice ale ţintelor şi construieşte un model de predicţie

pentru a clasifica substanţele chimice care interacţionează cu un situs activ (sau

receptor) de interes.

Odată ce o serie de molecule active sunt stabilizate cu suficientă potenţă a

ţintei, selectivitate şi proprietăţi favorabile asemănătoare medicamentelor, unul sau

mai mulţi compuşi desemnaţi principali sunt propuşi pentru dezvoltarea

medicamentelor; alţi compuşi sunt consideraţi "back-up-uri" (de rezervă). Nu este

neobişnuit pentru sectoarele de cercetare şi dezvoltare să realizeze screening-ul a

100000 până la 300000 de compuşi per screening pentru a genera 100 - 300 "reuşite".

În medie, una sau două reuşite sunt atribuite seriilor de compuşi activi. Screening-uri

mari de la 2 milioane la 3 milioane compuşi [screening-uri de ultracapacitate

(UHTS)] sunt necesare pentru a genera 7–10 compuşi activi/lead compounds

(compuşi chimici care au activitate biologică sau farmacologică).

Aceştia sunt folosiţi ca puncte de plecare pentru modificări chimice cu scopul

de a îmbunătăţii potenţa, selectivitatea şi parametrii farmacokinetici. Îmbunătăţirile în

generarea de compuşi activi vin de asemenea, din optimizarea diversităţii

bibliotecilor.

3

17.1.5. Direcţii viitoare în HTS

Candidaţii pentru dezvoltarea unor medicamente utilizate în intervenţii

terapeutice şi identificarea agenţilor toxici au crescut interesul pentru a produce

candidaţi clinici pentru noi medicamente şi respectiv construcţia de modele pentru

analiza riscului uman. Cererea a stimulat identificarea compuşilor activi cu o rată

mult mai rapidă decât cea disponibilă în prezent. Acest imperativ a forţat o schimbare

tehnologică faţă de formatul plăcilor de mare densitate (1536 şi 9600 godeuri),

pipetarea de ordinul nanolitrilor şi imagistică simultană.

Testele de miniaturizare pot fi capabile să faciliteze screening-ul de până la

500000 compuşi per săptămână, în timp ce se minimizează costurile reactivilor.

Chimia combinatorie a oferit oportunităţi duble în dezvoltarea bibliotecilor mari de

compuşi pentru screening-ul cu analogi rapizi ai compuşilor activi.

În cele din urmă, HTS s-a extins spre identificarea ţintei, validarea şi conversia

testelor pentru substanţe active definite pe calea generării informaţiei, fie pe calea

screening-urilor sau prin testarea în aval, ADME de mare capacitate (absorţie,

distribuţie, metabolism şi excreţie) şi a toxicităţii.

17.2. Sisteme microarray

17.2.1. Introducere

Microarray-urile sunt teste în miniatură ale fragmentelor de gene ataşate

lamelor de sticlă. Prezentarea a mii de fragmente de gene într-un singur test permite

detectarea modificărilor expresiei genelor într-o fracţiune semnificativă din totalitatea

genomului. Array-urile/aranjamentele lineare de molecule sunt imobilizate în locaţii

discrete, pe o suprafaţă inertă care permite analize simultane.

Tehnologia microarray este utilizată frecvent pentru că este conceptual simplă,

uşor de pus în aplicare şi este bine controlată având în vedere interesul tot mai mare

pentru studiile paralele de mare capacitate. În ultimul deceniu, microarray-urile au

evoluat de la array-uri bazate pe membrane cu densitate joasă la cipuri de siliciu cu

mare densitate.

4

17.2.2. Tipuri de aray-uri

Microarray-urile ADN au moleculele ADN imobilizate în locaţii specifice, pe

suprafaţa de sticlă sau de siliciu. Acestea sunt dezvoltate ca platforme pentru

studierea expresiei genice şi detectarea mutaţiilor şi vor fi analizate mai jos. În mod

similar, microarray-urile pentru proteine care încorporează anticorpi la nivelul

poziţiilor imobilizate nu au fost încă utilizate pe scară largă.

17.2.3. Designul microarray-urilor ADN

Microarray-urile ADN sunt fabricate în două formate, în funcţie de tipul de

moleculă imobilizat. Array-urile conţinând produşi PCR de 200 - 2000 kilobaze

perechi sunt imobilizate de-a lungul lungimi moleculelor prin legături încrucişate

uşoare la suprafaţa arrayului/membranei (adesea menţionată ca un ADN

complementar sau array ADNc ). Alternativ, sonde oligonucleotidice pot fi sintetizate

in situ pe array sau pre-sintetizate şi apoi fixate prin legături covalente terminale.

Figura 17.1 prezintă o procedură pentru un protocol asociat cu plăcile microarray

ADNc.

Figura 17.1. Producţia şi paşii în tehnologia ADNc microarray (Sursa: National Human Genome Research Institute, U.S. National Institutes of Health, http://www.genome.gov/10000533.)

5

Protocolul în tehnologia microarray ADNc începe cu marcarea fluorescentă a

moleculelor de ARNm prezente în celule mamiferelor de interes. ARNm marcat este

apoi pipetat în godeurile lamei de microarray şi hibridizează cu secvenţele

complementare de ADNc pe microarray. Intensitatea fluorescenţei este proporţională

cu numărul de molecule ARNm produse de gradul de activitate al genei de interes,

indicând hibridizarea corepunzătoare a ADNc (Lettieri, 2006).

17.2.4. Obţinerea microarray-urilor

Microarray-urile sunt produse pe baza unor tehnologii diferite, inclusiv

fotolitografia, spoturile robotice şi imprimarea (metode pe bază de pini/ace şi metode

piezoelectrice cu pini). Fotolitografia este metoda cea mai utilizată pe scară largă

pentru sinteza ADN in situ pe array-uri pentru a forma microarray-uri

oligonucleotidice (Gibson, 2006). Tehnica permite sinteza unui număr mare de array-

uri cu densitate înaltă.

Spoturile robotice folosesc un braţ robotic pentru a depozita oligonucleotidele

presintetizate şi fragmentele ADN amplificate prin PCR pe suprafaţa array.

Dispozitivul conţine o piesă intermediară pentru oprirea lamelor imprimate şi un braţ

robotic care utilizează pini speciali pentru a ridica soluţiile de la o sursă, de obicei

plăci cu 384 de godeuri.

În metoda de imprimare bazată pe pini, un exemplu de sistem cu două căi de

imprimare prin contact, pinii de oţel sunt utilizaţi pentru a transfera volume fixe de

soluţie ca spoturi pe suprafaţa array. Vârful plat al pinilor formează spoturi de un

diametru corespunzător diametrului vârfului. Cantitatea de soluţie absorbită de către

vârful pinului este proporţională cu tensiunea superficială a lichidului. Ulterior, când

pinul atinge suprafaţa array, volume fixe de soluţie sunt eliberate. Volumul soluţiei

eliberate depinde de mulţi factori, în special de chimia suprafaţei lamei şi a timpului

de contact între cele două suprafeţe.

Imprimarea piezoelectrică pe bază de pini este un exemplu de metodă non-

contact care conţine un rezervor pentru soluţia de imprimare şi un capilar pentru

6

distribuire.Cristalele piezoelectrice sunt dispuse aproape de capilar. Atunci când la

nivelul cristalelor este aplicată o tensiune, ele se deformează, comprimând împreună

pereţii capilarului şi forţând lichidul să iese prin orificiu.

17.2.5. Tehnologia de detectare

Cele mai multe dintre sistemele actuale se bazează pe detectarea fluorescenţei.

Sistemele sunt sensibile pentru transcripţii biologic activi, mai sigure de manipulat

decât metodele bazate pe radionuclizi şi permit detectarea de probe multiple.

Cele două tipuri principale de sisteme de detecţie disponibile pentru

microarray-uri sunt scanerele şi camerele optice mai puţin utilizate pe scară largă.

Scanerele utilizează mişcarea optică sau substraturi pentru a colecta semnale de la

zone mici de pe lamă pentru forma o imagine întreagă. Alternativ, camerele optice

preiau producţia de pe întregul array, adică de pe întreaga membrană simultan. Ca şi

alte detectoare de fluorescenţă utilizate frecvent în testele de citotoxicologie,

aparatura este programată pentru a evalua controalele, blancurile, normalizarea

datelor (egalizarea datelor din experimente comparative) şi autofluorescenţa.

Datele generate de obicei, sunt analizate ca puncte dispersate care reprezintă

comparaţia profilelor expresiei genelor din diferite condiţii experimentale. De obicei,

intensităţi fluorescente de la diferiţi coloranţi corespunzând la lungimi de undă

diferite sunt schiţate unul faţă de celălalt; culoare roşie este folosită pentru a descrie

supra-exprimarea şi verde este folosit pentru sub-expresie. Figura 17.2 prezintă o

lamă de sticlă microarray ADNc cu fluorescenţă tipică pentru detectarea datelor

rezultate fluorescente.

17.2.6. Aplicaţii ale tehnologiei microarray ADN

17.2.6.1. Expresia genică

Microarray-urile ADNc sunt cele mai utilizate pe scară largă pentru studiul

expresiei genelor. ARNm este izolat din celulele de interes, în absenţa sau prezenţa

unui agent toxic sau medicament. ADNc este preparat din cele două probe marcate

folosind coloranţi fluorescenţi roşu (cel mai frecvent verde fluoresceina şi rodamina).

7

Astfel cum este descris mai sus, după hibridarea moleculelor de ADNc cu sonda pe

membrană raportul de fluorescenţă roşu-verde este proporţional cu nivelurile relative

ale genei din test şi probele de referinţă. Expresia genei în protocoalele tradiţionale de

cercetare are multe aplicaţii în cercetare şi în clinică, dintre care unele sunt descrise

mai jos.

Figura 17.2 Exemplu de microarray imprimat pe lamă de sticlă format standard 1"×3". Lamele sunt accesibile scanerelor microarray 1"×3" standard (după Barile, 2004)

17.2.6.2. Genotipare / Detectarea SNP

De asemenea microarray-urile sunt folosite pentru dezvoltarea de cipuri pentru

detectarea şi screening-ul polimorfismelor mononucleotidice (SNPs). Un SNP este o

variantă a unei secvenţe de ADN, ce apare atunci când un singur nucleotid din genom

diferă între membrii unei specii sau între cromozomii pereche la un individ. Tehnica

este aplicabilă pentru detectarea diferenţelor mononucleotidice din fragmentele

8

secvenţelor de ADN în două alele de la persoane diferite (de exemplu, AAGCCTA la

AAGCTTA). Diferenţelor de hibridizare datorate schimbărilor unei singure perechi

de baze sunt detectate prin intermediul aranjmentelor oligonucleotidice, ceea ce

asigură condiţii pentru un control riguros al hibridizării.

Alternativ, sunt de asemenea folosite metode bazate pe extinderea primerilor

care exploatează incapacitatea mai multor ADN polimeraze să extindă catena unde

nucleotidul teminal 3' nu este potrivit perfect.

17.2.6.3. Detectarea agenţilor de mediu

Aplicaţiile toxicologice de mediu ale tehnologiei ADN microarray s-au

multiplicat, ca urmare a capacităţii sistemului de a monitoriza contaminanţi. De

exemplu, microarray-urile sunt utilizate pentru detectarea rapidă a microbilor în apa

contaminată, pentru indentificarea agenţilor patogeni în alimentele prelucrate, precum

şi pentru monitorizarea alterării produşilor alimentari şi medicamentoşi (Breitting,

2006).

9