ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA\PROCEDURA

Generalitati

Prin depunerea microcomprimatelor (discurilor) cu antibiotice/antifungice pe suprafata unui mediu solid insamantat cu suspensia bacteriana de testat, substanta antimicrobiana/antifungica activa impregnata in acestea difuzeaza in mediu si realizeaza in jurul discului, o zona de inhibitie a culturii, in functie de sensibilitatea culturii testate.

Germenele insamantat nu creste in aria in care concentratia de antibiotic/antifungic depaseste concentratia minima inhibitorie .

Proba

Proba de inocul reprezentat de 5 colonii identice, din cultura pura a microorganismului izolat si identificat ca agent etiologic, suspendate in aproximativ 5 ml bulion simplu steril pentru bacterii, sau Sabouraud lichid pentru fungi.

Insamantarea probei se face pe mediu Mueller Hinton (MH) pentru bacterii si Sabouraud solid pentru fungi.

Pentru germenii sensibili (enterococi si streptococi), determinarea sensibilitatii la antibiotice se poate realiza pe geloza sange.

Echipamente :

Termostat Aparat pentru masurarea densitatii inoculului bacterian

Resurse:Frigider;Ansa cu bucla de 2,5mm;Bec de gaz ;Cutii Petri cu medii de cultura:Eprubete

REACTIVI SI ALTE SUBSTANTE

- mediu de cultura Sabouraud solid (pentru antifungigrama) - mediu de cultura Muller-Hinton (pentru antibiograma) - bulion simplu si Sabouraud solid;- truse cu discuri de antibiotice/antifungice ;

FORMULAREA PROCEDURII

1

Indicatiile si contraindicatiile antibiogramei/ antifungigramei difuzimetrice :- se supun testarii numai germenii al caror rol in producerea imbolnavirii este

absolut cert si care au fost izolati in cultura pura . - se testeaza numai acele specii a caror concentratie minima inhibitorie nu este

considerata ca o constanta dinainte previzibila (este considerat ca fiind inutila efectuarea antibiogramei pentru streptococul b hemolitic grup A).

- se testeza doar germenii cu dezvoltare rapida, nu se testeaza germenii cu dezvoltare lenta sau cu pretentii deosebite.

- este o contraindicatie absoluta, indiferent de solicitarea clinicianului efectuarea antibiogramei direct din produsele pluricontaminate: exsudat faringian, secretie vaginala.

PrelevareaProba este reprezentata de tulpini de referinta/culturile pure de germeni patogeni

care au fost obtinute in prealabil din produsele biologice ale pacientilor prelucrate anterior.

Pregatire

- Se pregateste tulpinile/ culturile- Se scot microcomprimatele, mediile lichide si solide din frigider si se lasa pe

masa timp min 30 de minute, pentru echilibrare termica .

Tehnica de lucruTehica de lucru este reprezentata de metoda difuzimetrica standardizata Kirby –

Bauer, conform următoarelor etape: - prepararea inoculului- insamantarea acestuia- depunerea microcomprimatelor- incubarea

- Prepararea inoculului :

Cateva colonii bine izolate si identice din punct de vedere morfologic (aproximativ 5 colonii), se suspenda direct in 5 ml bulion simplu  steril pentru bacterii / Sabouraud lichid pentru fungi.

Turbiditatea inoculului se controleaza nefelometric si se ajusteaza la 0.5 Mc Farland (1.5 x 10 8 CFU/ml) cu ajutorul echipamentului Densimat, conform IL - LAM - 31.

- Germenele de cercetat Trebuie sa fie germenele responsabil de boala in cauza si fata de care se doreste

instituirea unui tratament.Testarea se face cat mai curand dupa izolare din cultura pura. Se testeaza numai

germenii aerobi care cresc repede pe mediul de cultura utilizat, in conditii obisnuite de incubare (fara CO2).

2

- Insamantarea

Insamantarea se face cu ,, tamponul ud ‘’. Un tampon de vata steril, este inmuiat in suspensia microbiana / fungica este stors bine prin rotirea lui apasata pe peretele interior al tubului cu suspensie pentru indepartarea excesului de lichid si apoi insamintat, prin descarcarea tamponului in mod uniform pe suprafata mediului de 3x.

- Aplicarea microcomprimatelor Aplicarea microcomprimatelor se face cu pensa, presind usor fiecare

microcomprimat pe suprafata mediului. Se va respecta o distanta de ~15 mm de la marginea placii si ~30 mm intre microcomprimate.

Se utilizeaza truse diferite de substante antimicrobiene/ antifungice in functie de tipul germenelui identificat: coc sau bacil, fung si de natura produsului din care a fost izolat microbul.

Substantele antimicrobiene / antifungice.Discurile impregnate cu o cantitate fixa de substanta activa sunt marcate clar pe

ambele fete cu simbolul antibioticului/ antifungicului respectiv.Conservarea microcomprimatelor se face prin mentinerea lor la adapost de

caldura, lumina si umiditate.Preparatele sunt folosite strict in intervalul termenului de valabilitate .Prin depunerea microcomprimatelor cu antibiotice la suprafata unui mediu solid

insamantat cu suspensia bacteriana/fungica de testat, substanta antimicrobiana/antifungica activa difuzeaza in mediu si realizeaza in jurul discului o zona de inhibitie a culturii in functie de sensibilitatea culturii bacteriene/ fungice.

Germenele insamantat nu creste in aria in care concentratia de antibiotic depaseste concentratia minima inhibitorie.

Fiecare din etapele care concura la efectuarea antibiogramei, pot influenta diametrul zonei de inhibitie si deci criteriile de interpretare. In acest sens, metodologia recomanda urmatoarele perioade de timp optime:

- etalonare inocul=15 min- aplicare discuri=5-15 min.- plasarea placilor la termostat=15 min..

- Incubarea

Incubarea se face in termosat la 37 ° C. Placile se plaseaza in pozitie rasturnata, nu mai mult de trei placi una deasupra alteia, in conditii de aerobioza. Durata incubarii este de 16-18 ore; numai in cazuri urgente se va face o citire cu caracter preliminar, dupa 4-6 ore, cu obligatia de a reincuba si de a efectua o citire definitiva la sfirsitul perioadei reglementare de incubare.

6.5.4.1 Citirea si exprimarea rezultatelor

3

Se citesc numai placile care prezinta o crestere a culturii corespunzatoare din punct de vedere al puritatii si al densitatii (cultura densa aproape confluenta) .

Citirea se face cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie in mm, de 2-3 ori in directii diferite, cu ajutorul unei rigle. Daca mediul este transparent , citirea se poate efectua direct pe fundul placii, iar pe placile cu geloza sange masurarea diametrelor zonei de inhibitie se face la suprafata mediului.

Se iau in considerare diametrele zonelor de inhibitie: zona lipsita de colonii microbiene vizibile cu ochiul liber, inclusiv diametrul discului cu antibiotic. Se iau in considerare coloniile bine dezvoltate aparute in interiorul zonei de inhibitie. Acestea pot reprezenta mutante rezistente, in cadrul unei populatii microbiene predominant sensibile; ele se vor repica si retesta .

DOCUMENTE DE REFERINTA

Metode de laborator de uz curent - Ministerul Sanatatii, volumul II / 1977Bacteriologie medicala, volumul I si II / 1985 - Balbaie si Poszgi.Microbiologie clinica – Editura Medicala - 1999 D. Buiuc , M. Negut.NCCLS-MIC Testing-M100-S13(M7) - Ianuarie 2003.Medical Laboratory Manual for Tropical Countries: Vol. I si II - Microbiology

/ Monica Cheesbrough.Manualul de operare –aparat masurari densitati

4