DEPARTAMENT MICROBIOLOGIE LABORATOR SYENVO ROMANIA MEDGIDIA

PROCEDURA SPECIFICA PENTRU TESTAREA SENSIBILITATII LA ANTIBIOTICE PRIN METODA DIFUZIMETRICA

COD: PS-MG-01VERSIUNEA 1.1 martie 2012EXEMPLAR NR.

Nota asupra dreptului de proprietateAcest document este proprietatea SC Synevo Romania SRL.

Reproducerea integral sau parial a prezentului document n orice publicaii i prin orice procedeu (electronic, mecanic, fotocopiere, microfilme, etc.), este interzis dac nu exist acordul scris al Synevo Romania

Acest document este elaborat pentru utilizarea de catre personalul Laboratorului Synevo Romania. Reproducerea integral sau parial a prezentului document n orice publicaii i prin orice procedeu (electronic, mecanic, fotocopiere, microfilme etc.), este interzis, dac nu exist acordul scris al Synevo Romania.

Nu se permite modificarea acestui document de catre utilizator. Synevo Romania nu i asum responsabilitatea, nu garanteaz explicit sau implicit caracterul complet, nealterat i gradul de utilitiate a documentului n cazul n care utilizatorul a operat modificri i nu poate fi fcut responsabil de orice fel de pagube rezultate n urma utilizrii sale. Utilizatorul, isi asuma intreaga responsabilitate pentru desfasurarea, finalizarea si implementarea corespunzatoare a documentului.

Indicatorul actualizarilorVersiunea (#)Persoana care a elaborat documentulMentiuni asupra documentului elaboratData elaborarii

1.0Dr Eugen StefanescuDocument initialian. 2009

1.0Dr Eugen StefanescuNu necesita revizieIan 2010

1.0Dr. Sorin TomasianNu necesita revizieIan 2011

1.1Dr Sorin TomasianPrima revizieMartie 2012

ELABORATVERIFICATAPROBAT

NUMEDr Sorin TomasianMihaela VladutDr Sorin Tomasian

FUNCTIEMedic LaboratorSpecialist CalitateSef Laborator

SEMNATURA

DATA

1. NOTIUNI INTRODUCTIVE1.1. ScopStabilirea procedurii pentru determinarea sensibilitatii la antibiotice a germenilor patogeni.

1.2. Documente de referinta:- Metode de laborator de uz curent Ministerul Sanatatii vol. II pg. 187 - 199, - Tratat de Microbiologie clinica Ed Medicala 2008, D. Buiuc, M Negrut - CLSI 2012: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eeighteenth Informational Supplement 2008- Instructiuni de lucru cu micropipeta- Instructiuni pentru elaborarea procedurii specifice - Ghidul serviciilor medicale ale Laboratorului Synevo, ultima editie in vigoare- Ghidul national de biosiguranta pentru laboratoarele medicale, Ed. I, Bucuresti, Ed. Medicala, 2006, pg. 47 71

- Diagnostic Microbiology, B. Forbes, D. Sahm, A. Weissfeld

1.3. Termeni, definitii si abrevieri: QC control de calitate MRSA Staphylococcus aureus meticilino-rezistent

MRSE Stafilococ coagulazo-negativ meticilinorezistent ESBL beta-lactamaza cu spectrul extins CTX cefotaxim

AMC amoxicilin/clavulanic acid

CAZ ceftazidim

CRO- ceftriaxona

AZT aztreonam ANC, TAZ, TIM, CES

1.4. Domeniu de aplicareProcedura este stabilita pentru a fi utilizata in Departamentul de Microbiologie de catre personalul tehnic atunci cand este necesar;Sensibilitatea la antibiotice a unui agent bacterian poate fi apreciata din punct de vedere clinic in: rezistent, intermediar si sensibil.

1.5. Informaii generaleDeterminarea sensibilitatii bacteriei la antibiotice este fondata pe studiul multiplicarii bacteriene fata de un gradient de concentratie a antibioticului realizat intr-un mediu de cultura. Un procedeu pentru obtinerea unui gradient de concentratie a antibioticului in mediu de cultura consta in a face sa difuzeze un antibiotic intr-un mediu gelozat pornind de la o sursa (biodisc). Apare o competitie intre difuziunea antibioticului si cresterea bacteriana.

1.6. Recomandri pentru determinare- stabilirea antibioticului necesar pentru tratarea infectiei cu anumit germene patogen.

1.7. Masuri de securitate in munca si prevederi in caz de accidenteInainte de desfasurarea oricarei activitati in laborator personalul trebuie sa se asigure ca poseda cunostinte de protectia si securitatea muncii in laboratorul medical. Este obligatoriu sa purtati echipament de protectie;Toate echipamentele de diagnostic in vitro, probele pacientilor, trebuie tratate ca materiale cu potential risc biologic. Toate materialele care intra in contact cu produsele mai sus mentionate sunt considerate materiale infectioase.

Echipamentele si instructiunile de protectie constau in: manusi chirurgicale, halat/ costum incheiat, parul strans, ochelari de protectie sau hote de siguranta biologica, fara bijuterii sau accesorii mari.Riscuri in cazul nerespectarii normelor de securitate in munca - Contaminrea cu probe biologice, riscul de expunere la aerosoli, stropiri si inoculari accidentale.Aerosolii sunt produsi de orice activitate care determina aparitia de miniparticule sau stropi de material lichid sau semilichid, cum ar fi agitarea, turnarea, amestecarea sau picurarea unui lichid pe o suprafata sau intr-un lichid. Activitatile de laborator precum insamantarea placilor de agar prin efectuarea de striuri paralele, inocularea flacoanelor de culturi prin folosirea unei pipete pentru a distribui suspensii de agenti infectiosi, efectuarea de dilutii in tuburi sau placi, omogenizarea si agitarea prin producerea de vartej a materialelor infectioase, centrifugarea lichidelor contaminate pot genera aerosoli infectiosi. Particulele de aerosoli cu diamentru sub 5 micrometri si picaturile mici cu diametrul 5-100 micrometri nu sunt vizibile cu ochiul liber. Contactul cu toate acestea poate duce la infectii. Tehnicianul de laborator trebuie avertizat asupra formarii acestor particule si asupra faptului ca ele pot fi inhalate sau pot contamina suprafete si materiale. Atunci cand manipulati probele si deseurile asigurati-va ca purtati echipament de protectie. Daca probele/deseurile vin in contact direct cu pielea, spalati-o imediat cu apa si aplicati dezinfectant. Consultati de urgenta un medic. Exista posibilitatea de perforare a manusilor de protectie. De aceea, este necesara o atentie sporita atunci cand se lucreaza. Daca proba biologica este varsata pe o suprafata de lucru, aceasta se acopera cu o solutie dezinfectanta, se lasa sa actioneze pentru inactivarea microorganismelor si apoi se indeparteaza. - Contactul cu reactivii si solutiile de curatenie si dezinfectare: Folositi intotdeauna manusi de protectie (rezistente chimic) si ochelari de protectie atunci cand manipulati solutiile de colorare . Exista posibilitatea de perforare a manusilor de protectie. De aceea, este necesara o atentie sporita atunci cand se lucreaza .

In cazul reactivilor tineti cont de atentionarile existente la nivelul cutiilor de reactivi.- Socul electric La orice echipament electric, poate surveni socul electric. NU incercati sa accesati nici o componenta a echipamentului marcata corespunzator. NU incercati sa lucrati in nici un compartiment electronic. Instalarea, service-ul si repararea trebuie efectuate doar de catre personal autorizat si calificat.- Manipularea in siguranta a probelor de laboratorContainerele pentru probe pot fi din sticla sau preferabil din plastic. Ele trebuie sa fie rezistente si nu trebuie sa permita scurgerea materialului din ele cand dopul sau capacul sunt corect aplicate. Nimic din materialul recoltat nu trebuie sa ramana inafara containerului .Containerele trebuie corect etichetate pentru o identificare usoara . Documentele de insotire nu trebuie infasurate in jurul containerului ci plasate separat Transportul probelor in laborator. Pentru evitarea scurgerilor accidentale sau a varsarii probelor, trebuie utilizate containere secundare cum sunt cutiile cu stative pentru ca probele sa ramana in picioare atunci cand sunt transportate. Containerele secundare pot fi din metal sau plastic, pentru a putea fi autoclavabile sau rezistente la actiunea dezinfectantilor chimici. Ele trebuie decontaminate regulat.Primirea probelor. Laboratorul care primeste un numar mare de probe trebuie sa aiba o incapere separata sau un spatiu special pentru acest scopDeschiderea pachetelor. Personalul care primeste si despacheteaza probele trebuie sa fie constient de potentialul pericol si trebuie instruit sa adopte precautiile standard in special cand se confrunta cu spargerea sau varsarea containerelor. Containerele primare cu probe trebuie deschise intr-o hota. Trebuie sa existe dezinfectante la indemana.

Trebuie respectate precautiile de siguranta

2. FAZA PREANALITICA2.1. Efectuarea comenzii se realizeaza conform PG-02, Procedura generala de analiza a comenzii, ofertei si contractului

2.2. Pregatirea pacientului pentru recoltare: - nu este cazul

2.2. Recipient: nu se aplica

Specimen recoltat: cultura izolata si identificata

2.3. Etichetarea recipientilor se folosesc eprubete sterile, transparente, numerotate

2.4. Transportul probelor - nu este cazul

2.5. Conditii de prelucrare si pastrare a probelor patologice pana la examinare - respectand normele de securitate in departament pentru evitrea contaminarii incrucisate

2.6. Volumul minim necesar: 2-3 colonii din cultura pura ( in functie de germenul izolat )

2.7. Criterii de respingere a probei: daca cultura nu este pura sau identificata

3. FAZA ANALITICA3.1. Echipamente si consumabile3.1.1. Echipament principal de masurare: nu este aplicabila3.1.2. Ustensile si consumabile necesare:- Termostat

- Bec Bunsen

- Ansa bacteriologica

- dispenser

- placi Petri

- densimat

- rigla gradata

- lupa

- eprubete sterile

- tampoane de bumbac pentru uz bacteriologic de unica folosinta

3.2. Reactivi (prelucrare, conditii de pastrare, stabilitatea)- cultura pura pe mediu solid a tulpinii de testat

- solutie salina NaCl 0.9% sterila

- Mediile utilizate pentru culturi: amestec reducator, Muller-Hinton, Muller Hinton cu 5% sange de berbec, agar chocolate;- Microcomprimate de antibiotice, selectate in functie de germenul izolat conform recomandarilor CLSI

3.3. Conditii de mediu si de operare:

Mediu:- Mediu fara praf cu o ventilatie adecvata- Temperatura trebuie sa fie 18-26C; - Umiditatea 45-70%;Apa apa distilata pentru prepararea mediilor Electric: La termostate nu se deconecteaza de la sursa de energie in timpul utilizarii acestuia.

3.4. Specificatii de performanta: - nu este aplicabil

3.5. Principiul Metodei Testarea sensibilitatii la antibiotice se face prin metoda difuzimetrica (KIRBY-BAUER).Metoda se bazeaza pe urmatoarele mecanisme fizico-chimice si biologice:

1. Antibioticul continut intr-un vehicul (disc de hartie, tableta, benzi), aplicat pe suprafata unui mediu de cultivare adecvat cresterii agentului bacterian pentru care se face testarea, difuzeaza in jurul discului pe o raza depinzand de : - cantitatea de antibiotic continuta in vehicul (incacatura); - solubilitatea antibioticului; - greutatea moleculara, sarcina electrica si structura chimica a antibioticului; - grosimea stratului de mediu de cultura; - vascozitatea, structura si ph-ul mediului de cultura; - temperatura de incubare.

2. Daca cultura bacteriei de testat este insamantata pe suprafata unui mediu definit, iar placa este incubata in conditii definite, ea nu creste in zona in care a difuzat antibioticul, in cazul in care este sensibila fata de acesta.

Aria in care nu a avut loc cresterea este numita zona de inhibitie si variaza in functie de : densitatea inocului; compozitia si ph-ul mediului; conditiile de incubare.Interpretarea testului necesita compararea zonelor masurate cu valori acceptate (puncte de rupere, respectiv valori cutt-off), specifice standardului utilizat, pentru fiecare pereche antibiotic/microorganism.

3.6. Prelucrarea probei inainte de introducerea in aparat: nu se aplica

3.7. Mentenanta analizorului: nu se aplica

3.8. Etalonare analizor: - Etalonarea se face conform planului de etalonare, de catre institutii autorizate in domeniu (etalonarea termostatelor);

3.9. Calibrare: nu este aplicabila

3.10. Control de calitate QC:

Frecventa QC: - controlul recipientelor sterile la fiecare sarja de turnare, odata cu mediile; - controlul mediilor de cultura (testarea eficientei biologice) la fiecare sarja de turnare si verificarea microcomprimatelor cu ajutorul tulpinilor de referinta la schimbarea lotului si saptamanal; - controlul sterilitatii mediilor turnate se efectueaza la fiecare sarja de turnare; - controlul truselor de coloratie cu tulpini de referinta la schimbarea lotului si zilnic (coloratia Gram); - controlul sterilizarii la etuva la fiecare sterilizare (teste biochimice) si lunar (teste biologice); - verificarea sterilitatii la autoclavul de medii si infecte la fiecare autoclavare (teste biochimice) si lunar (teste biologice); - controlul suprafetelor saptamanal; - controlul aeromicroflorei saptamanal. Prepararea mediilor se efectueaza conform instructiunilor ILIdentificarea fractiunilor: nu se aplicaStabilitate la intuneric: nu se aplicaUtilizare: Controlul intern pentru mediile utilizate se efectueaza cu tulpinile de referinta de unica utilizare. Acestea se pastreaza la frigider la tenperatura de 2 8 C cu acces controlat.Descrierea modului de lucru pentru efectuarea controlului intern se efectueaza conform PG 18 Procedura generala de control intern de calitate.

3.11. Criterii de acceptare/respingere ale rezultatelor controlului intern.Nu se utilizeaza tulpini de referinta cu expirarea termenului de valabilitate si cu peste 4 pasaje.

3.12. Actiunile corective aplicate la incalcarea regulilor stabilite pentru controlul intern;

daca controlul sterilitatii si eficientei biologice a mediilor de cultura utilizate apar neconformitati, pentru controlul sterilitatii se toarna o noua sarja, iar pentru controlul eficientei biologice se schimba mediul.

la verificarea aeromicroflorei si suprafetelor pentru evitarea contaminarii incrucisate la aparitia neconformitatilor se face sterilizarea cu lampa UV si substante dezinfectante;

pentru sterilitatea recipientelor de recoltare se schimba lotul

3.13. Rularea probelor.

In prima zi:1. Prepararea inoculului: se repica cu tamponul de bumbac steril un numar de colonii izolate de pe mediu de cultura pura pentru obtinerea unei suspensii cu turbiditate comparabila cu cea a standardului McFarland 0.5. (pentru bacteriile cu crestere rapida 4-5 colonii pentru cele fastidioase un numar de colonii necesar realizarii turbiditatii dorite).

se amesteca continutul tubului cu suspensie. nu se va face niciodata repicarea de pe medii selective daca tulpinile sunt pastrate in cultura inainte de testare, ele trebuie subcultivate cu 24h inainte de testare.2. Standardizarea inoculului: se utilizeaza densimatul pentru masurarea densitatii optice sau se foloseste un standard de referita MC Farland; se agita bine standardul de referita MC Farland (prin rasturnarea tubului bine inchis); se agita bine cultura inainte de calibrare

se compara turbiditatea standardului cu cea a suspensiei folosind o sursa de iluminat adecvata, pentru vizualizarea suspensiilor se pun ambele tuburi in fata unui card Wickerham. Daca se vad mai usor liniile de pe cardul Wickeham prin tubul cu suspensia test decat prin tubul cu standard, suspensia este prea slaba, se mai adauga cate o colonie pana cand turbiditatea suspensiei este echivalenta cu cea a standardului. Daca se vad mai greu liniile de cardul Wickerham prin suspensia test decat prin test atunci suspensia este prea concentrata. Se dilueaza suspensia cu ser fiziologic steril pana cand este echivalenta cu standardul de referinta.3. Inocularea placilor: inoculul se insamanteaza pe placi cu mediu adecvat: Muller-Hinton pentru stafilococi si alte bacterii cu crestere rapida, Muller-Hinton cu 5% sange de berbec pentru Streptococcus pneumoniae, mediu geloza chocolate pentru H. influenzae. Placile se aduc la temperatura camerei si se usuca prin mentinerea cu capacul interdeschis timp de 10 30 minute; Se insamanteaza cu tamponul inmuiat in suspensia calibrata si apoi presata de peretii tubului pentru inlaturarea excesului de suspensie; Insamantarea se face in trei directii prin rotirea placii cu cate 60;

Dupa inoculare, placile se mentin 10-15 minute la temperatura camerei la uscare

Nu se intarzie insamantarea cu peste 15 minute de la calibrarea suspensiei

Suspensia se agita inante de inoculare4. Aplicarea discurilor se selecteaza antibioticele si incarcatura lor conform standardului; se aduc discurile la temperatura camerei cu 1 2 h inainte de aplicare;

nu se folosesc discuri expirate

numarul de biodiscuri/placa este in functie de diametrul placii utilizate (dispenserul utilizat in laborator permite asezarea a 8 biodiscuri pe placa de 90 mm); discurile se aplica pe placi cat de repede posibil dar nu mai tarziu de 15 minute de la inoculare; daca discul a cazut nu se schimba pozitia;

discurile de antibiotice trebuie pastrate la frigider (4-8C), betalactaminele si alate antibiotice cu labilitate mare (imipenem, cefaclor, combinatii cu acid clavulanic) se pastreaza congelate la -20C, iar discurile pentru lucrul curent se pot pastra o saptamana la frigider. Daca se utilizeaza dispenser, acesta trebuie pastrat in frigider bine inchis si adus la temperatura camerei inainte de utilizare. ( IL dispenser )5. Incubarea placilor: temperatura de incubare este de 35 370 C; timpul este in mod normal este 16 -20 h pentru bacteriile cu crestere rapida (in aerobioza) si pana la 24h pentru germenii fastidiosi in atmosfera cu 5% CO2;

placile se rastoarna si se introduc in termostat asezate cu capacul in partea inferioara.Teste speciale (efectuate la cererea clinicianului):

1. Testarea sensibilitatii la penicilinele M a Staphylococcus aureus rezistent la meticilina (MRSA)Rezistenta S. aureus la meticilina este incrucisata cu toate betalactaminele. De aceea testarea sensibilitatii se face in mod sistematic pentru fiecare izolat clinic

testarea se face prin inocularea tulpinii de testat pe agar Muller-Hinton si utilizand un disc de cefoxitin de 30 g, dupa care se incubeaza la 35 C timp de 24h.Pentru Staphylococcus aureus si S. lugdunensis: diametrul discului zonei de inhibitie la cefoxitin 19 mm = rezistent, 20 mm = sensibil Pentru stafilococii coagulazo-negativi exceptie S. lugdunensis: diametrul discului zonei de inhibitie la cefoxitin 24 mm = rezistent, 25 mm = sensibil 2. Testarea producerii de beta-lactamaze cu spectru extins (ESBL) la enterobacterii ESBL sunt enzime care inactiveaza cefalosorinele de generatia a treia (C3G) si pot fi sisntetizate de majoritatea enterobacteriilor Producerea de ESBL se poate observa la antibiograma difuzimetrica prin imaginea in in dop de sampanie intre un disc de C3G si un disc impregnat de inhibitori de beta-lactamaza, singur sau in asociere cu un alt antibiotic. Antibioticele utilizate sunt ceftazidimul (CAZ, 30 g) si augmentinul (AMC, 20/10 g)

Distanta recomandata intre CAZ si AMC este de 20 mm, la antibiograma difuzimetrica Imaginea in dop de sampanie este sugestiva pentru producerea de ESBL

3. Testarea producerii de beta-lactamaze inductibile antibiotice utilizate: CAZ 30 g si imipenem 10 g, discurile se dispun in vecinatete

se incubeaza timp de 18 h, la 37 C;

o aplatizare a zonei de inhibitie la nivelul discului de CAZ indica prezenta unei tulpini producatoare de beta-lactamaza inductibila;4. Detectarea tulpinilor de Streptococcus pneumoniae cu sensibilitate diminuata la beta-lactamine se face printr-un test prezumtiv prin metoda difuzimetrica se utilizeaza un disc de oxacilina de 1 g (recomandat de CLSI) sau de 5 g;

diametrele sunt de 19 mm (