Dr. Geta Hilma Medic primar microbiolog, Dr. St. Med.

DEFINITIIAntibiograma (ABG) = testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolata dintr-un produs patologic la agentii antimicrobieni.

Antifungigrama (AFG)= testarea sensibilitii fungilor la antifungice.Prin antibiograma selectam antibioticele cele mai active fata de microorganismul testat.

Conditiile efectauarii antibiogramei1. ABG se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen.2. Prin antibiograma alegem antibioticul cel mai eficace fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.3. Daca tratamentul cu antibiotice este de lunga durata ABG se repeta ( microorganismul poate dobandi rezistenta pe parcursul tratamentului si se pot produce dismicrobisme care pot duce la infectii supra adaugate).

PRINCIPIUL ANTIBIOGRAMEI

Anibiograma se bazeaza pe efectul bactericid( omoara bacteria) sau bacteriostatic(opreste multiplicarea) al antibioticelor fata de speciile bacteriene.

Metoda difuzimetricaSe efectueaza pe medii solide turnate in placi Petri pe care s-a insamantat in panza cultura bacteriana.Pe suprafata mediului se dispun rondele de antibiotice astfel incat in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a Ab ( in imediata vecinatate a rondelei se realizeaza o concentratie care scade pe masura indepartarii de rondela.)Metoda da informati asupra sensibilitatii speciei testate fata de Ab utilizate, dar nu stabileste CMI ( cc. minima inhibitorie).

TESTAREA DIFUZIMETRIC

Deoarece metoda de testare difuzimetric a sensibilitii bacteriene este cea mai uzitat n toate laboratoarele clinice din lume.Metoda difuzimetric de testare a sensibilitii permite caracterizarea tulpinilor bacteriene drept sensibile, intermediare sau rezistente, la o varietate de ageni antibacterieni.Pentru realizarea testrii, se comercializeaz discuri din hrtie de filtru, impregnate cu cantiti specifice de AB, gata preparate, care se aplic pe suprafaa unui mediu gelozat, ce a fost n prealabil inoculat cu microorganismul de testat. AB din disc va difuza n mediul de cultur. Cu ct distana fa de disc crete, cu att concentraia de AB scade logaritmic, realiznd astfel, n mediul din jurul fiecrui disc, un gradient de concentraii ale agentului AB. Concomitent cu difuzia AB-ului, germenii inoculai pe suprafaa mediului de cultur, i care nu sunt inhibai de concentraia de AB, vor continua s se multiplice, pn cnd creterea va deveni vizibil. n zonele n care concentraia de AB este inhibitorie, creterea nu se va produce, formnd o zon de inhibiie n jurul fiecrui disc.

InocululProcedeele de inocularePentru a asigura reproductibilitatea testrilor sensibilitii prin metoda difuzimetric, inoculul trebuie standardizat.Inoculul se prepara direct prin suspensia ctorva colonii n SF, sau bulion Muller-Hinton, pn la o turbiditate de 0,5 U Mac Farland (corespunztor cu 1-2 x 108 UFC), .Standardizarea turbiditii inoculului la 0,5 U Mac Farland se realizeaza cu un nefelometru standardizat produs de BioMrieux, sau cu densitometrul electric DENSIMAT (BioMrieux).Inocularea gelozei Muller-Hinton cu aceast suspensie se va realiza n rstimpul a 15 min. de la preparare, pentru a preveni modificarea turbiditii prin nceperea creterii bacteriene.

Insamantarea culturiiInocularea se va realiza cu tampoane de vat sterile mbibate n suspensia bacterian, bine stoarse de excesul de lichid, prin tergerea ntregii suprafee a mediului gelozat n 3 direcii, prin rotarea plcii Petri , acoperind astfel ntreaga suprafa. Geloza Muller-Hinton astfel inoculat va fi lsat s absoarb toat cantitatea de inocul depus cca 5 min.( nu se vor depi 15 min. pentru a nu ncepe multiplicarea bacterian), dup care se pot aplica discurile cu AB.Scopul final al inoculrii mediului este realizarea unei creteri bacteriene uniforme, sub form de colonii confluente (sau semiconfluente dup standardul francez, ce utilizeaz un inocul mai slab).

Discurile de antibiotice

n rstimpul celor 15 min. de la inoculare discurile de antibiotice vor fi aplicate ferm pe mediul gelozat, pstrnd o distan ntre discuri de minimum 24 mm (de la centru la centru) pentru a evita suprapunerea zonelor de inhibiie. Unele antibiotice ncep s difuzeze n mediu imediat dup aplicare, astfel c odat aplicate pe mediu ele nu mai pot fi mutate.Aplicarea discurilor se poate face fie individual, cu pense sterile, fie cu dispensere speciale care permit aplicarea concomitent a 8-16 discuri, n funcie de mrimea placii Petri utilizate (pe o plac Petri rotund de 90 mm ncap 6 discuri, pe una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm, 12 discuri, iar pe plcile ptrate de 120/120 mm, 16 discuri).

Amplasarea rondelelorSe folosesc dispensere de 6 i respectiv 16 discuri, n funcie de setul de antibiotice utilizat pe grupe de germeni. Discurile preparate comercial se stocheaza la rece pentru evitarea degradrii AB-ului i folosite nainte de termenul de expirare, iar nainte de utilizare au fost echilibrate termic

Incubarea

Dup aplicarea discurilor de antibiotice i nedepind cele 15 min.(spre a se evita predifuzia AB), plcile sunt ntoarse cu capacul n jos (pentru a nu se umezi de la condens) i se introduc n incubator, la 350C, n atmosfer normal.Incubarea n atmosfer ce conine CO2 alteraz rezultatele testrii aminoglicozidelor, tetraciclinei i macrolidelor, deaceea germenii nepretenioi care nu au nevoie de o astfel de atmosfer pentru cretere, vor fi incubai n atmosfer normal; dealtfel, criteriile de interpretare sunt valabile pentru aceste condiii de incubare.Pentru germenii pretenioi care cresc numai n atmosfer cu CO2 n concentraie de 5%, ca i pentru germenii anaerobi, criteriile de interpretare au fost stabilite innd cont de aceste condiii de incubare.

Incubare anaerobiGermenii anaerobi se incubeaza n cutii ermetice cu plicuri generatoare de anaerobioz (Gen box, cu plicuri Anaer-gen, BioMerieux, Frana).Durata incubrii a fost de 16-18 ore .

Citirea i interpretarea rezultatelor

Diametrul zonei de inhibiie complet este msurat, incluznd i diametrul discului, cu ajutorul unei rigle gradate, sau ubler.Rezultatele se exprima in Sensibil(S), Intermediar sensibil ( I)Rezistent( R)

Antibiograma difuzimetrica

Antibiograma difuzimetrica

Antibiograma difuzimetrica

Metoda dilutiilor in medii lichideUrmareste derminarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data, indicand cc. de antibiotic necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale.Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in mediu de cultura lichid, se insamanteaza cantitati egale de cultura bacteriana , stabilindu-se dilutia maxima de antibiotic in prezenta careia tulpina este inhibata.-pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire- mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2%

Metoda dilutiilor in medii lichideSe utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al doi-lea tub si asa mai departe pana pana in tubul 9 din care se arunca 1 ml.Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din cultura de testat.Tubul 10 este martorIncubare 18-20 h la 370C,

Metoda dilutiilor in medii lichideCitireUltimul tub limpede reprezinta limita sensibilitatii germenului fata de antibioticul utilizat sau CMI= Concentratia Minima Inhibitorie.Daca se adauga un indicator de ph cresterea bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin virarea culorii indicatorului de ph-ului.

METODA AUTOMATA :

Se realizeaza cu analizorul MiniAPI conform indicatiilor din prospect specifice fiecarui tip de germene, respectiv utilizandu-se urmatoarele galerii de antibiograma: ATB Staph, ATB Strep, ATB GN, ATB Enterococ. Se urmaresc indicatiile de realizare a inocului, de incubare si de interpretare specifice, descrise in inserturi.Principiul este cel al unei antibiograme prin microdilutii cu puncte de ruptura.Citirea se face automat prin softul analizorului MiniAPI, inclusiv interpretarea in sistem EXPERT.

E-TestulEste varianta perfectionata a metodei difuzimetrice prin care se determina CMI a unui antibiotic.Metoda foloseste in locul microcomprimatelor cu antibiotic cate un epsilometru pentru fiecare antibiotic ( fasii de material plastic, gadate, imbibate cu cate un antibiotic). Gradatiile indica valorile CMI in mcg/ml. Pe suprafata mediului insamantat se depun radial la distante convenabile epsilometrele si se incubeaza.Zonele de inhibitie apar de-a lungul epsilometrului si au forma ovalara. Valoarea CMI se citeste pe epsilometru si corespunde gradatiei aflate la intersectia cu limita de inhibitie.

ANTIFUNGIGRAMA

Testarea sensibilitii la antifungice este n prezent standardizat numai pentru metodele cu macro i microdiluie i respectiv E-test. Deaceea n laboratoarele clinice obinuite se practic fie antifungigrama pe galerii automate de tipul celor MiniAPI, ce au ca principiu metoda microdilutiilor, fie E-testul.

E-test