LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA L.0. Protecia muncii. Prezentare lucrri. L.1. Tehnici de eantionare, recoltare i pregtire a probelor pentru analiza microbio logic Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de microorganisme de alter are din alimente L.2. Determinarea numrului total mezofile L.3. L.4. L.5. L.6. de bacterii aerobe Determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri Determinarea bacteriilor sporu late aerobe i anaerobe Determinarea microorganismelor osmofile Determinarea bacte riilor de putrefacie Metode rapide, clasice i moderne de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor L.7. L.8. L.9. Proba reductazei Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor Bacte rii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari Analiza bacteriilor care induc risc biologic n alimente L.10. Determinarea numrului de bacterii Staphy lococcus aureus (coagulazo pozitivi) L.11. Genul Listeria L.12. Genul Bacillus. Genul Clostridium L.13. Colocviu de laboratorMICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR PENTRU ANALIZA MICROBIOLOG IC 1. Eantionarea probelorPentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie s reflec te condiiile microbiologice existente n momentul recoltrii i s reprezinte fidel lotul din care provine. De modul n .care se face recoltarea i transportuI probelor la l aborator depinde de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etap foarte import ant const n stabilirea eantioanelor, a condiiilor de recoltare a probelor i de transpo rt n condiii corespunztoare la laboratorul de analize. n activitatea de prelevare a probelor exist o terminologie general, i anume: ! lotul - reprezint cantitatea de pr oduse cu aceleai caracteristici, realizate n condiii tehnologice uniforme, ntr-o arj, schimb de producie sau ntr-o perioada limitat de timp; ! elementul - este partea in divizibil a lotului; ! eantionul global - reprezint prob format prin mai multe prelevr i din acelai lot; ! eantionul redus - este frac iunea reprezentativ dintr-un eantion g lobal; ! eantionul de laborator - este frac iunea din eantionul global sau redus des tinat analizelor de laborator; ! prelevarea (recoltarea) - reprezint tehnica de re coltare a unui eantion elementar dintr-un lot sau a unui element indivizibil. Sun t posibile dou tipuri de recoltare a eantioanelor: prelevarea elementelor cu defec te pentru a evidenia cauza producerii acestora; prelevarea la ntmplare a unor eleme nte care aparin unor condiii normale de producie, pentru controlul calitii microbiolo gice. n acest caz sunt aplicate metode statistice, astfel nct eantionul s fie statist ic semnificativ. Eantioanele se aleg prin tragere la sori, dup scheme prestabilite, pe baza tabelelor de recoltare ce conin numere echivalente numrului de probe din lot, dar dispuse la ntmplare (tabelul 1). Dup numerotarea elementelor lotului, se c oreleaz aceste numere cu cele din tabel, i, apoi, se preleveaz probele corespunztoar e numerelor din tabel n succesiunea stabilit de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct i ntr-o ordine arbitrar aleas se compune eantionul cu elementele cor espunztoare. De exemplu, dac se dorete ca dintr-un lot de 80 buci s se preleveze la nt lare 5 probe, se vor Pag 1MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR preleva elementele corespunztoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 6 3; 46 (valoarea 97 este exclus pentru c nu exist). Tabelul 1. Exemplu de ordonare a leatorie a elementelor unui lot n vederea eantionrii 07 45 32 62 84 96 74 54 80 96 53 52 45 98 89 59 01 36 44 88 44 50 41 95 47 62 50 53 26 39 66 64 52 03 65 92 33 90 01 23 97 28 94 99 07 97 32 26 61 64 77 45 46 6 7 51 78 59 02 26 26 63 48 54 09 14 26 66 51 22 45 95 26 22 14 11 46 85 28 37 01 52 25 73 84 37 08 29 22 91 26 18 43 95 48 20 29 42 98 05 83 84 62 08 52 45 42 84 13 42 79 34 27 35 97 09 61 89 91 01 52 62 10 08 28 16 45 25 84 09 17 71 83 36 8 5 63 56 24 32 49 11 04 09 59 46 71 59 10 76 24 65 68 32 92 58 22 45 39 78 62 96 49 13 59 45 79 93 26 24 54 54 37 18 96 73 79 20 25 69 52 03 43 62 87 36 46 23 08 05 17 58 83 32 05 95 12 12 65 91 07 39 66 90 59 63 92 56 72 89 27 93 48 90 13 1 5 79 02 72 89 46 78 61 83 14 25 28 68 57 18 68 14 05 75 61 45 70 85 58 98 94 37 87 06 72 12 89 92 26 38 83 80 88 75 14 63 45 Alegerea elementelor pentru analiz (x) se poate stabili pe baza formulelor: x= N sau x = N n n care: N = numrul elementelor unui lot; n = numrul eantioanelor de prelevat. Dup stabilirea valorii x se numeroteaz i se asociaz n grupe diferite elemente ale lot ului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grup elementul notat cu x. Acest e tehnici sunt aplicabile att loturilor de produse finite din depozite, ct i pe flu xul de fabricaie sau n momentul livrrii. Pe fluxul de fabricaie prelevarea se efectu eaz, de obicei, dup terminarea unei etape de procesare. Pentru a fi semnificativ, ea ntionarea trebuie s fie realizat n timp, deoarece un eantion constituit exclusiv din elemente succesive este puin reprezentativ pentru ansamblul unei producii sau al unui lot. Frecvena prelevrilor i a controlului depinde n general de nivelul produciei , riscurile de contaminare, sau de apariia defectelor de fabricaie. n cazul unei pr oducii mari, frecvena prelevrilor va fi mai mare. Este de asemenea important s se ef ectueze analize ori de cte ori au loc variaii la nivelul fabricaiei, generate de: schimbarea lotului de materie prim; - fluctuaiile generate de modificarea schimbu lui; - modificri sau reparaii ale utilajelor, .a. Pag 2MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR Prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pach ete mici, cutii, .a.), din produse ambalate n vrac, sau pri dintr-un element de dime nsiuni mari. Pentru acest domeniu se recomand analize n cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare prelevare trebuie s fie compus din 5 probe (n=5). 2. Tehnici de prelevare De cele mai multe ori prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (cutii de c onserve, sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici .a.). n alte cazuri, pro bele se recolteaz din produse n vrac sau pari dintr-un element de dimensiuni mari. Prelevrile ce corespund primului caz sunt simple i nu necesit masuri de precauie sup limentare. Condiii generale de prelevare (recoltare) Cantitatea de prob recoltat de pinde de natura analizei i de planul de eantionare. Omogenizarea Repartizarea micr oorganismelor n produsul analizat nu este ntotdeauna omogen, mai ales n cazul produs elor voluminoase sau cu structuri eterogene. n asemenea cazuri se recomand ca prel evrile s se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte important s se cunoa sc zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune omogenizarea produselor v rac nainte de prelevarea probelor. Msuri aseptice Este absolut necesar s se evite c ontaminarea suplimentar a probelor n timpul recoltrii sau dup aceast etap. Pentru acea sta recipientele utilizate i instrumentele de recoltare trebuie s fie sterile i pro tejate n ambalaje sterile. Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de reco ltare. Recoltarea produselor lichide Se realizeaz apelnd la diferite tehnici, n fun cie de natura produsului, de forma i volumul recipientului. nainte de recoltare se recomand omogenizarea probei, care se poate realiza manual, cu ajutorul unei bagh ete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril, precum i prin utilizarea siste melor de omogenizare mecanic cu care sunt prevzute recipientele. n funcie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile sau instrumente spe ciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). n cazul n care recoltarea se face de la reea, se flambeaz gura robinetului, se las s curg o parte din produs pen tru a elimina microorganismele stagnante pe conduct i apoi se face recoltarea prop riu-zis. Recoltarea produselor solide n funcie de natura produsului, pentru recolta re se folosete scalpelul, sonda (de exemplu, pentru brnz), pipeta tip harpon, etc. Pag 3MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR Instrumentele trebuie s fie sterilizate. n general, microorganismele de la suprafaa produsului,.expus contactului cu aerul, se analizeaz prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizeaz prin recoltare de probe dup ce s-a ndeprtat o poriun e de produs de la suprafa sau s-a cauterizat suprafaa cu ajutorul unei spatule nclzit e la rou. n cazul n care structura produselor este neomogena semisolida sau semilic hid este absolut necesar omogenizarea probelor. 3. Pregtirea probelor pentru analizPrepararea eantionului presupune deschiderea aseptic a recipientelor nchise (produs e ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea i pregtirea extractelor lichi de (n cazul produselor solide). Etichetarea O mare atenie trebuie s se acorde etich etrii eantioanelor. Eticheta trebuie s cuprind toate elementele necesare, i anume: num ul lotului, numrul de ordine, data, ora, locul exact de unde s-a realizat recolta rea, modalitatea de recoltare (metoda eantioanelor, tehnica de recoltare .a.). Sta bilitatea eantioanelor Calitatea microbiologic a eantionului nu trebuie s se modific e n intervalul de timp de la recoltare pn n momentul analizei. Principalii factori c are influeneaz stabilitatea sunt: temperatura i durata de pstrare, protecia fata de c ontaminrile externe. Omogenizarea i mcinarea n cazul produselor lichide proba ca ata re reprezint suspensia iniial . Pentru produsele solide este necesar obinerea i standa rdizarea suspensiei iniiale, prin stabilirea raportului de diluie (n general 1:10 s au 1:5) ntre proba de analizat i lichidul de extracie (diluare). Astfel, n cazul pro duselor dense se procedeaz n dou moduri: - se cntrete n condiii aseptice o cantitatea produs (de exemplu 10g), direct n sistemul de mrunire, apoi se adaug un volum cunos cut de lichid de diluie (40 ml pentru diluia 1/5; 90 ml pentru diluia 1/10); - se i ntroduc n recipientul de mrunire o cantitate aproximativ de prob i se cntrete tot an ul (tara recipientului fiind cunoscut), apoi se adaug lichidul de diluie, n funcie de cantitatea de prob. n ambele cazuri concentraia suspensiei iniiale este perfect def init n raport cu produsul de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g pro dus analizat. Rezultatele analizei se raporteaz la 1 ml suspensie sau 1 g produs. Dup cntrire n condiii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene sunt omogenizate, n paralel cu extracia microorganismelor n lichidul de diluie, apl icnd Pag 4MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELORdiverse tratamente precum: mojarare manual cu nisip steril sau bile de sticl sau mr unire mecanic . Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticl se utilizeaz un m ojar care conine 5-20 g nisip special, steril, sau bile din sticl (=0,5 mm). Mojara rea se realizeaz manual n apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mrunirii se adaug 2 -5 volume de ap steril. Proba se las n repaus timp de 5 minute, apoi se colecteaz sup ernatantul ntr-un vas steril. Aceast metod nu este ntotdeauna practic, dar este simpl nu necesit aparatur special. Tehnicile moderne de omogenizare prevd utilizarea sist emelor performante, care permit meninerea condiiilor aseptice i o bun eliberare a mi croorganismelor n lichidul de extracie. Pentru acest scop sunt comercializate dife rite tipuri de omogenizatoare peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblo ck-OSI-Prolabo), Digi-system, Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc. n cazul utilizrii omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionat, g ) i un volum corespunztor de lichid de extracie (diluie) sunt introduse ntr-o pung de plastic steril (de unic folosin), care se nchide ermetic i se monteaz n aparat pentru ogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material p lastic trebuie s aib o capacitate suficient pentru a permite amestecarea corect a pr obei cu o cantitate echivalent de lichid de diluare. n general, volumul recipientu lui trebuie s fie egal cu aproape de dou ori volumul probei plus volumul soluiei de diluare. Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcioneaz dup un principiu s imilar cu aparatul tip Stomacher, la care ns s-a mbuntit tehnica de omogenizare prin v ibraii (fig.1). Acest tratament (vitez vibratorie mare) ofer o eliberare a microorg anismelor (n general a bacteriilor) n lichidul de diluare similar cu cazul prelucrr ii probei n stomacher (grad de similaritate a rezultatelor de 96%), ns asigur obinere a unui extract clar cerin impus de analizele moderne precum: evaluarea cantitativ a microbiotei prin ATP bioluminiscen, teste imunologice i analize PCR (din limba engl ez Polymerase Chain Reaction) (Fung 1999). Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier Pentru unt i margarin protocolul d e pregtire a probelor prevede o serie de etape preliminare, particulare, n concord an prevederile impuse de unele normative (adaptare dup Tofan i colab, 2002): Pag 5MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR1) Proba este topit pe baie de ap la 45oC i omogenizat. Se prepar diluia 1:10 prin pre levarea a 10 ml produs topit i transferare ntr-un flacon de 200 ml, care conine 90 ml soluie Ringer cu 0,1% geloz, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul i pipetele trebuie s aib temperatura de 45oC. Alte diluii i analizele microbiologice trebuie re alizate n urmtoarele 10 minute. 2) Se preleveaz n condiii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate ntr-o eprubet de analiz coninnd 2,1 ml de soluie Ringer , i se rmostateaz la 45oC pn la topire. Dup omogenizare, amestecul este meninut pe baie de a p (la 45oC) pn la separarea celor dou faze. Faza apoas este utilizat pentru analiza mi crobiologic . 3) O cantitate de 50 g de prob se suspend n 42 ml de soluie 0,1 M tampo n fosfat (pH=7,58,0), apoi se termostateaz la 4045oC pn la topire (timp de maximum 1 h, cu agitare intermitent ). Separarea fazelor este realizat n final prin centrifug are n condiii aseptice, timp de 110 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoas este utiliz at pentru examen microbiologic. O alt mbuntire a vizat tehnica de realizare a diluiilo . Prin realizarea unui instrument de dispersie (dispersor) este posibil transfer ul automat i aseptic a unui volum cunoscut de lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniiale sau a diluiilor decimale. Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid de diluie, cuprinse ntre 0,1 ml i 100 ml, direct n pungi sau vase sterile, n care s-a introdus n prealabil as eptic proba de analiz . Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluii 1: 10, 1:50, 1:100 sau orice raport de diluie, realiznd transferul automat a unui vol um corespunztor de lichid, n funcie de greutatea probei solide sau volumul probei l ichide luate n analiz (fig. 2). Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniiale n general, condiiile par ticulare de eantionare i pregtire a probelor de analiz sunt precizate n standardele s pecifice pentru evaluarea calitii microbiologie a fiecrui produs. n absena unor stand arde specifice disponibile, sau n cazuri speciale, metodologia se adapteaz la cond iiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de analiz. Pag 6MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MIC ROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE DEFINIII Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt l a suprafaa lichidelor, a mediilor solide. Bacteriile mezofile reprezint grupul maj oritar cu temperaturi minime la 15-20C, temperaturi optime n intervalul 30 - 40C i m aximum la temperaturi peste 45C PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE Numrul de bacteri i aerobe mezofile se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii generate de ce lulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd pro ba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup termostatare la 37C, timp de 48 de ore. Numrul de bacterii aerobe mezofile reprezint un indicator valoros pentru aprecierea calitii generale i a stabilitii la pstrare a produselor alim entare.MODUL DE LUCRU Se iau dou cutii Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc, n fiec are cutie, cte 1 cm2 prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de anal izat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet st ril pentru fiecare diluie decimal. Se toarn n fiecare cutie Petri cte cca. 15 cm2 medi u PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 45 5C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci , prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidi ficarea lor. Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia in oculat, temperatura la care se va face termostatarea. Plcile ce conin mediul solidi ficat se plaseaz cu capacul n jos, pentru 48 de ore, n termostat cu temperatura de 37C. PARTICULARITI PRIVIND NUMRAREA COLONIILOR Dup termostatare, se aleg pentru numrare plc ile care conin un numr colonii cuprins ntre 25 i 250, acestea trebuie s fie repartiza te pe o suprafa mai mare de 25% din suprafaa total a mediului de cultur. Pentru numrar e se poate adopta: Pag 1MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MIC ROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTEnumrarea manual, cu ajutorul unui numrtor electronic (care la atingerea fiecrei colon ii o contabilizeaz n memoria sa), pentru a evita erorile de numrare; numrare automat izat, utiliznd instrumente speciale de numrare, cnd se consum numai 10% din timp, com parativ cu numrarea manual. Exist totui i unele limitri ale acestui procedeu i anume: ot s apar erori de numrare n cazul prezenei n mediu a unor impuriti solide sau bule d az; nu se obin rezultate bune cnd coloniile au diametru mare i sunt rspndite pe o sup rafa mare etc. La numrare pot fi ntlnite urmtoarele tipuri de colonii: lanuri de colon i, care aparin unei singure surse (celule asociate, n perechi, lanuri, pachete etc. ). n acest caz se va numra ntregul lan ca o singur colonie; colonii dezvoltate n filmu l de ap dintre baza mediului de cultur i suprafaa capacului inferior; colonii dezvol tate n filmul de ap de la suprafaa mediului cu agar. Rezultatele se exprim, dup caz, n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs, astfel: 1) Plcile din do u diluii succesive conin 25250 colonii pe plac: ufc / g (ml ) = n care: C (n1 + 0,1 n 2 ) d C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute; n1 = numrul de plci reinute din prima diluie; n2 = numrul de plci reinute din a doua d luie succesiv; d = factor de diluie corespunztor primei diluiiRezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atri buit numrului 10. Exemplu: Dac la numrare au fost alese cte 2 plci corespunztoare dilu lor a doua i a treia, iar numrul de colonii din cele 4 plci reinute este: la prima d iluie reinut, 10-2: 232 i 244 colonii; la a doua diluie reinut, 10-3: 33 i 28 colonii ufc / g (ml ) = C ( n1 + 0,1 n2 ) d = 232 + 244 + 33 + 28 537 = = 24409 2,4 10 4 2 0,022 [2 + (0,1 2)] 10 (prin rotunjire la dou cifre semnificative*) Pag 2MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MIC ROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE * Exemplu: ufc calculat 12700 12400 15500 14500 ufc estimat 13000 12000 16000 14 000Prin analiz statistic s-a stabilit c n 95% din cazuri limitele de ncredere ale aceste i metode variaz de 12% la 37% (pentru numrul total de microorganisme aerobe) i ntre 16% la 52%. n practic ns se pot obine variaii mai mari ce deriv din condiiile de an plicate i experiena analistului. 2) Plcile inoculate din dou diluii succesive conin ma i puin 25 colonii. Se aplic modul de calcul prezentat mai sus. Plcile inoculate n pa ralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniial (d =10-1 , produse solide), conin mai puin de 25 colonii: ufc / g (ml ) = C 2d Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie ptratic r2=0,95, intervalele de variaie a numrului posibil de ufc, pentru plcile n care se dezvolt mai puin de 15 colonii, s unt prezentate n tabelul 1.Tabelul 1. Limite de ncredere pentru estimri n cazul unui numr de colonii sub baremu l minim Numr de colonii/plac 1 2 3 4 5 6 7 8 Interval posibil de variaie a ufc