Laborator Microbiologie speciala_2010-2011

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA

L.0. Protec ţia muncii. Prezentare lucr ări.

L.1. Tehnici de e șantionare, recoltare şi preg ătire a probelor pentru analiza microbiologic ă

Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de microorganisme de alterare din alimente

L.2. Determinarea numărului total de bacterii aerobe mezofile

L.3. Determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri

L.4. Determinarea bacteriilor sporulate aerobe şi anaerobe

L.5. Determinarea microorganismelor osmofile

L.6. Determinarea bacteriilor de putrefacţie

Metode rapide, clasice şi moderne de evaluare a calit ăţii microbiologice a alimentelor

L.7. Proba reductazei

L.8. Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor

Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari

L.9. Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli

Analiza bacteriilor care induc risc biologic în ali mente

L.10. Determinarea numărului de bacterii Staphylococcus aureus (coagulazo pozitivi)

L.11. Genul Listeria

L.12. Genul Bacillus. Genul Clostridium

L.13. Colocviu de laborator

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

Pag 1

TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGICĂ

1. Eșantionarea probelor

Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie să reflecte condiţiile microbiologice existente în momentul recoltării și să reprezinte fidel lotul din care provine. De modul în .care se face recoltarea și transportuI probelor la laborator depinde de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etapă foarte importantă constă în stabilirea eșantioanelor, a condiţiilor de recoltare a probelor și de transport în condiţii corespunzătoare la laboratorul de analize.

În activitatea de prelevare a probelor există o terminologie generală, și anume:

! lotul - reprezintă cantitatea de produse cu aceleași caracteristici, realizate în condiţii tehnologice uniforme, într-o şarjă, schimb de producţie sau într-o perioada limitată de timp;

! elementul - este partea indivizibilă a lotului;

! eșantionul global - reprezintă probă formată prin mai multe prelevări din același lot;

! eșantionul redus - este fracțiunea reprezentativă dintr-un eșantion global;

! eșantionul de laborator - este fracțiunea din eșantionul global sau redus destinată analizelor de laborator;

! prelevarea (recoltarea) - reprezintă tehnica de recoltare a unui eșantion elementar dintr-un lot sau a unui element indivizibil.

Sunt posibile două tipuri de recoltare a eșantioanelor:

prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenţia cauza producerii acestora;

prelevarea la întâmplare a unor elemente care aparţin unor condiţii normale de producţie, pentru controlul calităţii microbiologice. În acest caz sunt aplicate metode statistice, astfel încât eșantionul să fie statistic semnificativ.

Eşantioanele se aleg prin tragere la sorţi, după scheme prestabilite, pe baza tabelelor de recoltare ce conţin numere echivalente numărului de probe din lot, dar dispuse la întâmplare (tabelul 1). După numerotarea elementelor lotului, se corelează aceste numere cu cele din tabel, şi, apoi, se prelevează probele corespunzătoare numerelor din tabel în succesiunea stabilită de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct şi într-o ordine arbitrar aleasă se compune eşantionul cu elementele corespunzătoare. De exemplu, dacă se doreşte ca dintr-un lot de 80 bucăţi să se preleveze la întâmplare 5 probe, se vor


Pag 2

preleva elementele corespunzătoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46 (valoarea 97 este exclusă pentru că nu există).

Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot în vederea eşantionării

07 59 66 97 63 46 18 42 62 56 68 93 43 12 48 68 87 45 01 64 32 48 85 43 84 10 24 32 26 62 65 90 57 06 32 36 52 26 54 28 95 13 08 32 92 24 87 91 13 18 72 62 44 03 61 09 37 48 42 28 49 58 54 36 07 15 68 12 84 88 65 64 14 01 20 79 16 11 22 54 46 39 79 14 89 96 44 92 77 26 52 29 34 45 04 45 37 23 66 02 05 92 74 50 33 45 66 25 42 27 25 09 39 18 08 90 72 75 26 54 41 90 46 51 73 98 35 84 59 78 96 05 59 89 61 38 80 95 01 67 22 84 05 97 09 46 62 73 17 63 46 45 83 96 47 23 51 45 37 83 09 17 71 96 79 58 92 78 70 80 53 62 97 78 95 08 84 61 71 59 49 20 83 56 61 85 88 52 50 28 59 26 29 62 89 83 10 13 25 32 72 83 58 75 45 53 94 02 22 22 08 91 36 76 59 69 05 89 14 98 14 98 26 99 26 14 91 52 01 85 24 45 52 95 27 25 94 63 89 39 07 26 11 26 45 52 63 65 79 03 12 93 28 37 45

Alegerea elementelor pentru analiză (x) se poate stabili pe baza formulelor:

n

Nx = sau Nx =

în care: N = numărul elementelor unui lot;

n = numărul eşantioanelor de prelevat.

După stabilirea valorii x se numerotează şi se asociază în grupe diferite elemente ale lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grupă elementul notat cu x.

Aceste tehnici sunt aplicabile atât loturilor de produse finite din depozite, cât şi pe fluxul de fabricaţie sau în momentul livrării. Pe fluxul de fabricaţie prelevarea se efectuează, de obicei, după terminarea unei etape de procesare.

Pentru a fi semnificativă, eşantionarea trebuie să fie realizată în timp, deoarece un eşantion constituit exclusiv din elemente succesive este puţin reprezentativ pentru ansamblul unei producţii sau al unui lot.

Frecvenţa prelevărilor şi a controlului depinde în general de nivelul producţiei, riscurile de contaminare, sau de apariţia defectelor de fabricaţie. În cazul unei producţii mari, frecvenţa prelevărilor va fi mai mare. Este de asemenea important să se efectueze analize ori de câte ori au loc variaţii la nivelul fabricaţiei, generate de:

- schimbarea lotului de materie primă;

- fluctuaţiile generate de modificarea schimbului;

- modificări sau reparaţii ale utilajelor, ş.a.


Pag 3

Prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pachete mici, cutii, ş.a.), din produse ambalate în vrac, sau părţi dintr-un element de dimensiuni mari.

Pentru acest domeniu se recomandă analize în cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare prelevare trebuie să fie compusă din 5 probe (n=5).

2. Tehnici de prelevare

De cele mai multe ori prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (cutii de conserve, sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici ş.a.). În alte cazuri, probele se recoltează din produse în vrac sau parţi dintr-un element de dimensiuni mari.

Prelevările ce corespund primului caz sunt simple și nu necesită masuri de precauţie suplimentare.

Condiţii generale de prelevare (recoltare)

Cantitatea de probă recoltată depinde de natura analizei și de planul de eşantionare.

Omogenizarea

Repartizarea microorganismelor în produsul analizat nu este întotdeauna omogenă, mai ales în cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. În asemenea cazuri se recomandă ca prelevările să se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte important să se cunoască zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune omogenizarea produselor vrac înainte de prelevarea probelor.

Măsuri aseptice

Este absolut necesar să se evite contaminarea suplimentară a probelor în timpul recoltării sau după această etapă. Pentru aceasta recipientele utilizate și instrumentele de recoltare trebuie să fie sterile și protejate în ambalaje sterile.

Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare.

Recoltarea produselor lichide

Se realizează apelând la diferite tehnici, în funcţie de natura produsului, de forma și volumul recipientului. Înainte de recoltare se recomandă omogenizarea probei, care se poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril, precum și prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanică cu care sunt prevăzute recipientele. În funcţie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). În cazul în care recoltarea se face de la reţea, se flambează gura robinetului, se lasă ·să curgă o parte din produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conductă și apoi se face recoltarea propriu-zisă.

Recoltarea produselor solide

În funcţie de natura produsului, pentru recoltare se foloseşte scalpelul, sonda (de exemplu, pentru brânză), pipeta tip harpon, etc.


Pag 4

Instrumentele trebuie să fie sterilizate.

În general, microorganismele de la suprafaţa produsului,.expusă contactului cu aerul, se analizează prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizează prin recoltare de probe după ce s-a îndepărtat o porţiune de produs de la suprafaţă sau s-a cauterizat suprafaţa cu ajutorul unei spatule încălzite la roşu. În cazul în care structura produselor este neomogena semisolida sau semilichidă este absolut necesară omogenizarea probelor.

3. Pregătirea probelor pentru analiză

Prepararea eşantionului presupune deschiderea aseptică a recipientelor închise (produse ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea și pregătirea extractelor lichide (în cazul produselor solide).

Etichetarea

O mare atenţie trebuie să se acorde etichetării eșantioanelor·. Eticheta trebuie să cuprindă toate elementele necesare, și anume: numărul lotului, numărul de ordine, data, ora, locul exact de unde s-a realizat recoltarea, modalitatea de recoltare (metoda eșantioanelor, tehnica de recoltare ş.a.).

Stabilitatea eșantioanelor

Calitatea microbiologică a eşantionului nu trebuie să se modifice în intervalul de timp de la recoltare până în momentul analizei. Principalii factori care influenţează stabilitatea sunt: temperatura și durata de păstrare, protecţia fata de contaminările externe.

Omogenizarea și măcinarea

În cazul produselor lichide proba ca atare reprezintă suspensia iniţială . Pentru produsele solide este necesară obţinerea şi standardizarea suspensiei iniţiale, prin stabilirea raportului de diluţie (în general 1:10 sau 1:5) între proba de analizat şi lichidul de extracţie (diluare). Astfel, în cazul produselor dense se procedează în două moduri:

- se cântăreşte în condiţii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g), direct în sistemul de mărunţire, apoi se adaugă un volum cunoscut de lichid de diluţie (40 ml pentru diluţia 1/5; 90 ml pentru diluţia 1/10);

- se introduc în recipientul de mărunţire o cantitate aproximativă de probă şi se cântăreşte tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscută), apoi se adaugă lichidul de diluţie, în funcţie de cantitatea de probă.

În ambele cazuri concentraţia suspensiei iniţiale este perfect definită în raport cu produsul de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Rezultatele analizei se raportează la 1 ml suspensie sau 1 g produs.

După cântărire în condiţii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene sunt omogenizate, în paralel cu extracţia microorganismelor în lichidul de diluţie, aplicând


Pag 5

diverse tratamente precum: mojarare manuală cu nisip steril sau bile de sticlă sau mărunţire mecanică .

Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticlă se utilizează un mojar care conţine 5-20 g nisip special, steril, sau bile din sticlă (Φ=0,5 mm). Mojararea se realizează manual în apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mărunţirii se adaugă 2-5 volume de apă sterilă. Proba se lasă în repaus timp de 5 minute, apoi se colectează supernatantul într-un vas steril. Această metodă nu este întotdeauna practică, dar este simplă şi nu necesită aparatură specială.

Tehnicile moderne de omogenizare prevăd utilizarea sistemelor performante, care permit menţinerea condiţiilor aseptice şi o bună eliberare a microorganismelor în lichidul de extracţie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system, Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc.

În cazul utilizării omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionată, g) şi un volum corespunzător de lichid de extracţie (diluţie) sunt introduse într-o pungă de plastic sterilă (de unică folosinţă), care se închide ermetic şi se montează în aparat pentru omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic trebuie să aibă o capacitate suficientă pentru a permite amestecarea corectă a probei cu o cantitate echivalentă de lichid de diluare. În general, volumul recipientului trebuie să fie egal cu aproape de două ori volumul probei plus volumul soluţiei de diluare.

Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcţionează după un principiu similar cu aparatul tip Stomacher, la care însă s-a îmbunătăţit tehnica de omogenizare prin vibraţii (fig.1). Acest tratament (viteză vibratorie mare) oferă o eliberare a microorganismelor (în general a bacteriilor) în lichidul de diluare similar cu cazul prelucrării probei în stomacher (grad de similaritate a rezultatelor de 96%), însă asigură obţinerea unui extract clar cerinţă impusă de analizele moderne precum: evaluarea cantitativă a microbiotei prin ATP bioluminiscenţă, teste imunologice şi analize PCR (din limba engleză Polymerase Chain Reaction) (Fung 1999).

Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier

Pentru unt şi margarină protocolul de pregătire a probelor prevede o serie de etape preliminare, particulare, în concordanţă prevederile impuse de unele normative (adaptare după Tofan şi colab, 2002):


Pag 6

1) Proba este topită pe baie de apă la 45oC şi omogenizată. Se prepară diluţia 1:10 prin prelevarea a 10 ml produs topit şi transferare într-un flacon de 200 ml, care conţine 90 ml soluţie Ringer ¼ cu 0,1% geloză, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul şi pipetele trebuie să aibă temperatura de 45oC. Alte diluţii şi analizele microbiologice trebuie realizate în următoarele 10 minute.

2) Se prelevează în condiţii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate într-o eprubetă de analiză conţinând 2,1 ml de soluţie Ringer ¼, şi se termostatează la 45oC până la topire. După omogenizare, amestecul este menţinut pe baie de apă (la 45oC) până la separarea celor două faze. Faza apoasă este utilizată pentru analiza microbiologică .

3) O cantitate de 50 g de probă se suspendă în 42 ml de soluţie 0,1 M tampon fosfat (pH=7,5–8,0), apoi se termostatează la 40…45oC până la topire (timp de maximum 1 h, cu agitare intermitentă ). Separarea fazelor este realizată în final prin centrifugare în condiţii aseptice, timp de 1÷10 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoasă este utilizată pentru examen microbiologic.

O altă îmbunătăţire a vizat tehnica de realizare a diluţiilor. Prin realizarea unui instrument de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat şi aseptic a unui volum cunoscut de lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniţiale sau a diluţiilor decimale.

Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid de diluţie, cuprinse între 0,1 ml şi 100 ml, direct în pungi sau vase sterile, în care s-a introdus în prealabil aseptic proba de analiză .

Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluţii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de diluţie, realizând transferul automat a unui volum corespunzător de lichid, în funcţie de greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate în analiză (fig. 2).

Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniţiale

În general, condiţiile particulare de eşantionare şi pregătire a probelor de analiză sunt precizate în standardele specifice pentru evaluarea calităţii microbiologie a fiecărui produs. În absenţa unor standarde specifice disponibile, sau în cazuri speciale, metodologia se adaptează la condiţiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de analiză.

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

DEFINIŢII

Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa lichidelor, a mediilor solide.

Bacteriile mezofile reprezintă grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20°C, temperaturi optime în intervalul 30 - 40°C și maximum la temperaturi peste 45°C

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMĂRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

Numărul de bacterii aerobe mezofile se apreciază indirect, pe baza numărului de colonii generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat, care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv, după termostatare la 37°C, timp de 48 de ore.

Numărul de bacterii aerobe mezofile reprezintă un indicator valoros pentru aprecierea calităţii generale şi a stabilităţii la păstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU

Se iau două cutii Petri sterile. Cu o pipetă sterilă se introduc, în fiecare cutie, câte 1 cm2

probă de analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială, în cazul altor produse. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală.

Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 45±5°C.

Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.

Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face termostatarea.

Plăcile ce conţin mediul solidificat se plasează cu capacul în jos, pentru 48 de ore, în termostat cu temperatura de 37°C.

PARTICULARITĂŢI PRIVIND NUMĂRAREA COLONIILOR

După termostatare, se aleg pentru numărare plăcile care conţin un număr colonii cuprins între 25 şi 250, acestea trebuie să fie repartizate pe o suprafaţă mai mare de 25% din suprafaţa totală a mediului de cultură. Pentru numărare se poate adopta:


Pag 2

numărarea manuală, cu ajutorul unui numărător electronic (care la atingerea fiecărei colonii o contabilizează în memoria sa), pentru a evita erorile de numărare;

numărare automatizată, utilizând instrumente speciale de numărare, când se consumă numai 10% din timp, comparativ cu numărarea manuală. Există totuşi şi unele limitări ale acestui procedeu şi anume: pot să apară erori de numărare în cazul prezenţei în mediu a unor impurităţi solide sau bule de gaz; nu se obţin rezultate bune când coloniile au diametru mare şi sunt răspândite pe o suprafaţă mare etc.

La numărare pot fi întâlnite următoarele tipuri de colonii:

lanţuri de colonii, care aparţin unei singure surse (celule asociate, în perechi, lanţuri, pachete etc.). În acest caz se va număra întregul lanţ ca o singură colonie;

colonii dezvoltate în filmul de apă dintre baza mediului de cultură şi suprafaţa capacului inferior;

colonii dezvoltate în filmul de apă de la suprafaţa mediului cu agar.

Rezultatele se exprimă, după caz, în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs, astfel:

1) Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă:

( )dnn

Cmlgufc

⋅⋅+= ∑

)1,0(/

21

în care: ∑C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;

n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie;

n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă;

d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii

Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1,0 ÷9,9)·10x, unde x este puterea atribuită numărului 10.

Exemplu: Dacă la numărare au fost alese câte 2 plăci corespunzătoare diluţiilor a doua şi a treia, iar numărul de colonii din cele 4 plăci reţinute este:

la prima diluţie reţinută, 10-2: 232 şi 244 colonii;

la a doua diluţie reţinută, 10-3: 33 şi 28 colonii.

( ) ( )[ ]4

221

104,224409022,0

537

1021,02

2833244232

)1,0(/ ⋅⇒==

⋅⋅++++=

⋅⋅+= −

∑dnn

Cmlgufc

(prin rotunjire la două cifre semnificative*)


Pag 3

* Exemplu:

ufc calculat ufc estimat

12700 13000 12400 12000 15500 16000 14500 14000

Prin analiză statistică s-a stabilit că în 95% din cazuri limitele de încredere ale acestei metode variază de ± 12% la ± 37% (pentru numărul total de microorganisme aerobe) şi între ± 16% la ± 52%. În practică însă se pot obţine variaţii mai mari ce derivă din condiţiile de analiză aplicate şi experienţa analistului.

2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai puţin 25 colonii. Se aplică modul de calcul prezentat mai sus. Plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1, produse solide), conţin mai puţin de 25 colonii:

( )d

Cmlgufc

⋅= ∑

2/

Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie pătratică r2=0,95, intervalele de variaţie a numărului posibil de ufc, pentru plăcile în care se dezvoltă mai puţin de 15 colonii, sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Limite de încredere pentru estimări în cazul unui număr de colonii sub baremul minim

Număr de colonii/placă

Interval posibil de variaţie a ufc

Număr de colonii/placă

Interval posibil de variaţie a ufc

1 <1÷2 9 4÷14 2 <1÷4 10 4÷16 3 <1÷5 11 5÷18 4 1÷6 12 6÷19 5 2÷9 13 7÷20 6 2÷10 14 7÷21 7 2÷12 15 8÷23 8 3÷13

3) În plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1, produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie:

ufc/ml < 1 (produse lichide)

ufc/g < 1 ·10-1 (produse solide)


Pag 4

4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numărarea se poate realiza:

pe anumite sectoare delimitate ale suprafeţei plăcii ⋅=⇒ tornn sec nr. sectoare

delimitate (4, 8 sau 16)

pe o suprafaţă delimitată (pătrat) de 1 cm2, astfel: când numărul de colonii pe un pătrat este mai mare de 10 se numără la întâmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se determină media aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri; când numărul de colonii distribuite pe un pătrat este mai mic decât se numără coloniile de pe 12 pătrăţele reprezentative, se determină media aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri.

5) Când numărul de colonii pe placă este foarte mare rezoluţia este imposibilă numărarea, concentraţie de celule mult mai mare decât diluţia estimată.

6) Când se produce contaminarea accidentală sau se obţin rezultate neconcludente rezoluţia este analiză efectuată necorespunzător.


REZULTATE LUCRARE nr. __________

Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE

MEZOFILE

1. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în

plăcile selectate pentru numărare)

Proba Diluţia

Nr. colonii/placă

1

2

3

4

2. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare

de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________

Proba 4 _______________


Pag 1

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

DEFINIŢII

Drojdii – microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat prin înmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat (meioză). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite şi multe dintre ele au activitate fermentativă.

Mucegaiuri – microorganisme eucariote, care prezintă organe de reproducere diferenţiate. Sunt agenţii mucegăirii.

Tipuri de produse alimentare pentru care se recoman da analiza (Anexa 1)

PRINCIPIUL METODEI

Prin această metodă, numărul de drojdii şi mucegaiuri se apreciază indirect, pe baza coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat, care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat, după termostatare la 25°C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE

� Omogenizator

� Balanţă analitică

� Termostat reglat la 25°C

� Baie de apă pentru fluidificarea mediului de cultură reglată la 45°C

MATERIALE ŞI STICLĂRIE

� 25g produs alimentar

� 225 ml 0.1% apa peptonată

� Cutii Petri Φ10 cm sterile

� Pipete de 1 cm3 şi 10 cm3 sterile

� Eprubete cu ser fiziologic steril, câte 9 cm3 per eprubetă

� Baloane cu ser fiziologic steril


Pag 2

� Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide

� Numărător de colonii

Reactivi pentru determinare

Mediu de diluare: Soluţie ser fiziologic

Mediu de cultură: Anexa 2

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Se cântăresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaugă 225 ml apa peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.

Pentru diluarea probei se aplică schema de diluţie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluţiilor si inocularea probelor

*Toate probele se realizează in duplicat.

Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare cutie Petri sterila, câte 1 cm2 probă de analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială, în cazul altor produse. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală (Fig.1).

Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 45±5°C.

Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.

* Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face termostatarea.


Pag 3

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, pentru 3-5 zile la temperatura de 25-28°C.

REZULTATE

Se reţin cutiile care conţin 15…300 de colonii. Numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri per ml sau gram de produs se calculează ca medie ponderată, cu formula următoare:

dnn

Cmlgufc

⋅⋅+= ∑

)1,0()(/

21

unde

ΣC – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute;

n1 – numărul de cutii reţinute dintr-o diluţie

n2 – numărul de cutii reţinute din diluţia succesivă

d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii din care s-a realizat reţinerea plăcilor.

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative.

Se exprima gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuită lui 10.

Dacă cele două cutii Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii, se face media aritmetică, m, a coloniilor numărate în cele două cutii.

Rezultatul se exprima sub forma:

- num ăr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per ml:

NE=m (produse lichide)

- num ăr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per gram

NE=m·d-1 (alte produse), în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale (alte produse).

Dacă cele două cutii Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:

- mai puţin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);

- mai puţin de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)


Pag 4

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOM ANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Pâine şi produse de panificaţie

2. Produse lactate acide si brânzeturi

3. Carne şi produse din carne

4. Uleiuri, grăsimi şi seminţe oleaginoase

5. Fructe. Legume şi produse prelucrate

6. Băuturi alcoolice

7. Băuturi nealcoolice

8. Făinuri proteice, furaje , şroturi

9. Zahăr şi produse zaharoase

10. Cereale şi produse din cereale

11. Produse de cofetărie şi patiserie

12. Condimente, supe, sosuri, salate


Pag 5

ANEXA 2

CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Condiţiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele româneşti adaptate la condiţiile ISO (SR ISO) sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Condiţii de cultivare pentru numărarea microorganismelor impuse de normativele ISO

Grup de microorganisme Medii de cultur ă Condi ţii de termostatare Temperatur ă/timp

� Număr total de microorganisme aerobe, care se dezvoltă la 30ºC (bacterii, drojdii şi mucegaiuri)

- PCA 30ºC/72h ± 3h

� Drojdii şi mucegaiuri - YGC - OGA (OGYE)

25ºC/5 zile

Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2 . Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compozi ţie medii de cultur ă, g·l-1

Număr total de microorganisme PCA (engl. Plate count agar1); SMA- Standard methods agar2)) Triptonă ..................... 5,0g Extract de drojdie ...... 2,5g Glucoză anhidră .......... 1,0 Agar-agar ........ 12,0-18,0g Apă până la .......... 1000ml pH=7,2 Mediul este disponibil comercial.

Drojdii şi mucegaiuri YGC (Extract de drojdie, glucoză, cloramfenicol agar ) Extract de drojdie ......... 5g Glucoză ...................... 20g Cloramfenicol ............ 0,1g


Pag 6

Agar-agar ................... 15g Apă până la .......... 1000 ml pH=6,6 OGA (OGYE) (Oxitetraciclina glucoză agar) Extract de drojdie ......... 5g Glucoză ...................... 20g Agar-agar ................... 16g Apă până la ........... 1000ml pH=7,2 În momentul utilizării, în mediul fluidificat se adaugă 100 ml soluţie 1mg/ml oxitetraciclină.

Geloză nutritiv ă (geloză alba) Agar-agar ......................... 12…18g Apă până la ...................... 1000 ml


REZULTATE LUCRARE __________

Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII ŞI

MUCEGAIURI



Proba

Diluţia

Nr. colonii/placă

1

2

3


de colonii (ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________


Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI ANAEROBE

DEFINIŢII

Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparţin genului Bacillus. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau terminal.

Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparţin genului Clostridium. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus, singure sau in lanţuri, care formează endospori dispuşi central sau terminal, care dau celulelor forma de suveică sau paleta.

Tipurile de produse alimentare pentru care se recom andă analiza sunt prezentate în Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI

Determinarea microorganismelor sporulate aerobe şi anaerobe estimează numărul microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs.

Proba de analizat sau diluţii succesive se supun pasteurizării la 80°C timp de 10 minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se răceşte si se inoculează in medii specifice, cultivarea realizându-se in condiţii particulare in condiţii aerobe sau anaerobe.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE SPECIALE

1. Baie de apă reglabilă la 45°C şi la 80°C

2. Stomacher pH-metru.

3. Plăci Petri.

4. Termostat reglabil la 37°C

5. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare in anaerobioza

6. Numărător de colonii

7. Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (apă peptonată), medii de cultură: (Anexa 2),.


Testul se efectuează în conformitate cu instrucţiunile de mai jos:


Pag 2

Manipularea eşantioanelor

În laborator, înainte de analiză, cu excepţia produselor alimentare care nu necesită condiţii speciale de depozitare, probele se păstrează fie la frigider la temperatura de 0-5°C, fie congelate, în funcţie de natura produsului.

Prepararea mediilor de cultură

Se pregăteşte mediul Trypticase Soy Agar în cantităţi corespunzătoare şi se sterilizează.

Se temperează mediul de cultură într-o baie de apă la temperatura de 45°C, asigurându-se că nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete.

Se curăţă zona de lucru cu un dezinfectant adecvat.

Se marchează în mod clar plăcile Petri cu numărul probei, diluţia şi data termostatării.

Pregătirea diluţiilor

Se prepară un raport de diluţie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a de 10g (ml) produs în 90 ml apă peptonată. Probele se omogenizează:

- timpul de amestecare nu trebuie să depăşească 2.5 min, în scopul prevenirii supraîncălzirii.

- în cazul produsele alimentare care au tendinţa de a spuma, este indicată agitarea moderata.

- diluţiile se omogenizează prin menţinere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc de 30 cm, în aproximativ 7 sec).

Pentru fiecare probă de analizat, se pipetează 20-25 ml din diluţia 10-1 într-o eprubetă sterilă. Se plasează eprubetele în baia de apă la 80°C. si se menţin timp de 20 de minute. După răcire se prepară diluţii (diluţii recomandate sunt de 10-1,10-2, şi 10-3).

Inocularea si termostatarea probelor

Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 ml probă de analizat.

Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de 45±5°C.

Mediile se uniformizează rapid, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea.

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos.

Pentru bacteriile aerobe sporulate, plăcile se termostatează la 35oC ± 0.5oC timp de 48 ± 2 ore.


Pag 3

Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plăcile se termostatează 35oC ± 0.5oC timp de 48 ± 2 ore. într-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack (Anexa 3).

Numărarea coloniilor

Coloniile se numără imediat după perioada de termostatare.

Dacă este posibil, se selectează plăcile cu 20-200 colonii.

REZULTATE

Numărul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculează cu următoarea formula:

Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă:

( )dnn

Cmlgufc

⋅⋅+= ∑

)1,0(/

21

în care: ∑C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;

n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie;

n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă;

d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii

Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1,0 ÷9,9)·10x, unde x este puterea atribuită numărului 10.


Pag 4

PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRU PE DE PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahăr

Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5 prin cântărire a 20g zahăr şi dizolvarea în 80 ml apă sterilă.

Pentru inactivarea termică a formelor vegetative se face pasteurizarea prin menţinerea diluţiei 1/5 pe baie de apă la 80°C, timp de 20 minute şi răcire în jet de apă rece.

Din proba pasteurizată si răcită, cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 ml probă de analizat. Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de 45±5°C.

Plăcile se termostatează la 32oC ± 1oC timp de 48 ± 3 ore.

Numărul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raportează la 10 g zahăr.

Bacterii anaerobe sporulate din lapte

Se execută prin metoda Weinyirl în probe de lapte destinat fabricării brânzeturilor.

În 5 eprubete sterile ce conţin parafină (cca. 1ml in stare fluida) se introduc câte 5 ml proba de analizat (lapte destinat fabricării brânzeturilor). După pasteurizare (menţinere 10 minute la 80°C) şi termostatare 48 ore la 24-48°C se apreciază eprubetele pozitive, în care s-a produs deplasarea dopului de parafină.

Interpretarea rezultatelor

Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative

Lapte calitate satisfăcătoare – 1 eprubeta pozitiva din 5

Lapte de calitate nesatisfăcătoare – 2 până la 5 eprubete pozitive.


Pag 5

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOM ANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Făinuri

2. Lapte

3. Produse lactate acide şi brânzeturi


5. Conserve alimentare


7. Produse deshidratate

8. Condimente şi plante aromate


Pag 6

ANEXA 2

CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2 . Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea numărului de unităţi formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compoziţie medii de cultură, g/l

Bacterii sporulate aerobe BD Trypticase Soy Agar

Extract pancreatic de cazeină….15,0 g Clorură de sodiu …………5,0

Extract papaic de soia …………..5,0 Agar ………………….15,0

pH 7,3 ± 0,2*Ajustată şi/sau completată în funcţie de necesităţi

pentru a corespunde criteriilor de performanţă.

Bacillus cereus MYP

Mediu de bază ................. 90 ml

Soluţie polimixină B ......... 1,0ml

Emulsie de gălbenuş de ou10,0ml

Se lichefiază mediul de bază, se temperează la 50ºC, apoi se adaugă

aseptic celelalte componente.

Mediul de bază Soluţie de polimixină B

Extract de carne ..................1,0g

Peptonă ............................10,0g

D-manitol ..........................10,0g

Clorură de sodiu ..............10,0g

Roşu de fenol ................. 0,025g

Agar-agar .................. 12g-18g 3)

Apă până la ................... 900 ml

pH=7,2, la 25ºC

Sulfat de polimixină B ...... 106 UI

Apă până la ..................... 100 ml

Agar glucozat

Triptonă ............................10,0g

Extract de drojdie ...............1,5g

Glucoză .............................10,0g

Clorură de sodiu .................5,0g

Purpur de bromcrezol .... 0,015g

Agar-agar ................... 12g-18g 3)

Apă până la .................. 1000 ml

pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare)

Mediul Voges-Proskauer (VP)

Peptonă ..............................7,0g

Glucoză ...............................5,0g

Clorură de sodiu .................5,0g

K2HPO4 ................................ 5,0g

Apă până la .................. 1000 ml


Mediul cu nitrat

Peptonă ..............................5,0g

Extract de carne ..................3,0g

Azotat de potasiu................1,0g

Apă până la .................. 1000 ml



Pag 7

ANEXA 3

SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA

1. Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei controlate (anaerobioza, microaerofilie, îmbogăţita in CO2).

Figura a . Sisteme anaerobioza (GASPACK)

Containerele sunt rezistente la şocuri si sistemul perfect de etanşeizare transforma sistemele GasPak EZ in condiţii ideale de stocare si transport. Noua tehnologie, bazata pe un sistem rectangular de termostatare, etanşeizare uşoară si rezistenţă la şocuri, minimizează riscul apariţiei condensului, asigurând astfel o vizibilitate perfecta a coloniilor bacteriene. Structura sistemului anaerob si indicatorii CO2 asigura metoda optima de obţinere a condiţiilor anaerobe.

2. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost îndepărtat sau înlocuit cu un amestec controlat de alte gaze.



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI

ANAEROBE

1. Înregistraţi in tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


Proba

Diluţia

Nr. colonii/placă

1

Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii

(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

2. Înregistraţi in tabelul de mai jos eprubete pozitive şi negative,

stabilind in funcţie de rezultatele obţinute calitatea probei

analizate

Proba Eprubetele testate

1 2 3 4 5

1

Proba 1 _______________


Pag 1

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

PRINCIPIUL METODEI

Drojdiile, mucegaiurile şi bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile să se crească într-un mediu cu concentraţii ridicate de zahăr sau sare producând alterări care conduc la modificarea calităţii senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1).

Prin această metodă, numărul de microorganisme osmofile se apreciază prin examen cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente în proba de analizat, sau o diluţie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate, suplimentate cu 10% zahar sau sare, după termostatare optimă.

Tipuri de produse alimentare pentru care se recoman da analiza: zahăr şi produse derivate, produse conservate prin adaos de zahar, lapte condensat, amestecuri de sărare, saramuri şi produse conservate prin sărare.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE

1. Mediu de baza (Anexa 2):

• Pentru bacterii : dextroză, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, apă distilată, 1.000 ml.

• Pentru drojdii şi mucegaiuri : mediu hiperglucidic

2. Mediul de diluare:zaharoză sau NaCl 400 g; apă distilată 1000 ml.


Pentru obţinerea diluţiilor decimale pot fi folosite două tehnici pentru orice tip de probă luată în analiză. Numărul de diluţii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in analiza, şi anume:

Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5, prin transferul a 20g probă în 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezintă diluţia iniţială - 1:5 (proba martor). Se transferă aseptic 20 ml din proba martor în 80 ml mediu de diluare, proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25.

Se cântăresc in condiţii aseptice 10 g probă de analiza şi se transfera în 90 ml mediu de diluare, obţinând diluţia întâi, din care se obţin alte diluţii decimale prin diluare succesiva.


Pag 2

Cu o pipetă sterilă se transferă în 2 placi Petri in paralel, câte 1ml probă de analizat. Se repartizează în fiecare cutie Petri câte cca. 15ml mediu de cultură fluidificat şi temperat la temperatura de 45±5°C.

Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor1.

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos in următoarele condiţii:

A. Bacterii osmofile

Plăcile Petri se termostatează la 35-37°C timp de 48 ± 3 ore (2 zile). Se reţin plăcile care conţin 25…250 de colonii. Se numără colonii formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de produs.

B. Drojdii şi mucegaiuri osmofile

Plăcile Petri se termostatează la 25-30°C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se numără colonii formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de produs.

Se înregistrează numărul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs

REZULTATE

Numărul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculează cu următoarea formula:

ufc/g(ml) = n·d

unde

n este numărul mediu de colonii/placă

d este factorul de diluţie.

Se aplica aceeaşi formula de calcul ca şi la bacterii aerobe mezofile sau drojdii şi mucegaiuri

1 Pe capacul plăcilor Petri se notează: denumirea şi numărul probei, mediul de cultura, diluţia din care se realizează inocularea, temperatura la care se realizează termostatarea.


Pag 3

ANEXA 1

MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE

Microorganism

Drojdii

aW min

Saccharomyces rouxii 0.62

Saccharomyces bailii 0.80

Saccharomyces cerevisiae 0.90

Debaryomyces 0.83

Bacterii

Genul Hallobacterium (H. salinarium, H. morrhnae)

Genul Hallococcus

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Saccharomyces_rouxii&action=edit&redlink=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_bailii

http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae

http://en.wikipedia.org/wiki/Debaryomyces


Pag 4

ANEXA 2

COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ

Tabelul 1 . Compoziţia mediilor de cultură recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

PCA

(engl. Plate Count agar)

Triptonă ......................... 5,0g

Extract de drojdie .......... 2,5g

Glucoză anhidră ............... 1,0

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Apă până la .............. 1000ml

pH=7,2

Mediul este disponibil comercial.

Mediu hiperglucidic Extract de drojdie ........... 10g

Glucoză ......................200,0 g

Uree .............................. 1,0 g

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Apă până la .............. 1000ml



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE



Proba

Diluţia

Nr. colonii/placă

1

2


de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________


Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE

PRINCIPIUL METODEI

Bacteriile de putrefacţie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine animală până la produşi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compuşi indolici.

Primele semne ale alterării prin putrefacţie sunt formarea de mucus, apariţia mirosului neplăcut şi modificarea gustului.

Bacteriile de putrefacţie aparţin următoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc.

Determinarea lor are la bază două principii:

I. Evidenţierea hidrolizei substratului de natură proteică, astfel se determină bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei).

II. Evidenţierea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste biochimice reunite in testul HIL (H - evidenţierea producerii de hidrogen sulfurat; I - evidenţierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia gelatina)

Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea, preparatele din carne sau peşte, brânzeturile.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE1

1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazeină sau 10% lapte;

2. Mediul de diluare: apă peptonată;

3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.


Se pregăteşte suspensia iniţială prin cântărirea a 10 g probă, peste care se adaugă 90 ml apă peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.

a. determinarea bacteriilor cazeinolitice

Se realizează diluţii decimale. Prin tehnica culturală Koch se fac inoculări in mediu PCA suplimentat cu 1% cazeină sau 10% lapte.

1 Anexa 1

http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae


Pag 2

Mediile se uniformizează rapid în plăci Petri sterile, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor2.

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, timp de 48h, la temperatura de 37°C.

Bacteriile care prezintă capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta în jurul coloniilor o zonă clară incoloră comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece, bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzează în exteriorul coloniilor şi hidrolizează cazeina.

b. determinarea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL

Testul H – evidenţiază prezenţa hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor

Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Se plasează deasupra lichidului o hârtie sterilă îmbibată în acetat de plumb. Proba se termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h. Proba este pozitivă dacă hârtia se înnegreşte, ca urmare a formarii de sulfura de plumb, prin reacţia dintre acetatul de plumb si H2S care se degaja.

Testul I – evidenţiază prezenţa indolului

Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Proba se termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h, apoi se adăugă 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich. Proba se consideră pozitivă prin apariţia unui inel de culoare roşie la interfaţa mediu-reactiv, care indică prezenţa indolului.

Testul L– evidenţiază bacteriile care lichefiază gelatina

Se recoltează cu ansa celule din suspensia iniţială şi se înţeapă un tub de gelatină într-o eprubetă sterila. Se termostatează la temperatura de 20˚C, timp de 7 zile3.

Proba este pozitivă dacă se produce lichefierea parţială sau totală a tubului de gelatină.

REZULTATE

Stabilirea numărului de bacterii cu activitate cazeinolitică se aplica aceeaşi formula de calcul utilizata pentru stabilirea numărului de unitatea formatoare de colonii (metoda indirecta de numărare)

2 Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face termostatarea.

3Înainte de analiza, probele se menţin timp de 30 min la frigider


Pag 3

ANEXA 1

COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ SI A REACTIVILOR UTILIZATI

Tabelul 1. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

PCA

(engl. Plate count agar)

Triptonă ......................... 5,0g

Extract de drojdie .......... 2,5g

Glucoză anhidră ............... 1,0

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Apă până la .............. 1000ml

pH=7,2

Mediul este disponibil comercial.

Tabelul 2. Compoziţia soluţiilor si a reactivilor utilizaţi

Reactiv - Soluţie/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

Apă peptonată Peptonă ....................... 10,0g

Apă până la .............. 1000ml

Soluţie de acetat de plumb Acetat de plumb .......... 10,0g

Apă până la ................ 100ml

Reactiv Kovacs p dimetilnanobenzaldehida…………..10,0g

HCl………………………………………………….25,0ml

Alcool amilic până la ……………………….100ml



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE



Proba

Diluţia

Nr. colonii/placă

1

2

Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii

(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

2. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive şi negative, prin

aplicarea testului HIL

Proba Testul HIL

Testul H Testul I Testul L

1

2

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Pag 1

PROBA REDUCTAZEI

PRINCIPIUL METODEI

Proba reductazei este o metodă indirectă de apreciere a numărului de microorganisme vii dintr-un produs, in funcţie de corelaţia dintre gradul de contaminare si durata în care se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen şi resazurina), sub acţiunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente în produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta reductazelor) se transforma in leucoderivaţi incolori. Analiza se pretează cel mai bine pentru evaluarea calităţii microbiologice a laptelui materie prima.

In funcţie de tipul indicatorului si concentraţia acestuia variază durata analizei si culoarea probei, parametrii in funcţie de care se poate aprecia gradul de contaminare si calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizării albastrului de metilen, iniţial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina îşi schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi apoi incolor.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE

1. Soluţie de albastru de metilen 1%

2. Soluţie de resazurină 0,05%


a. Proba reductazei cu albastru de metilen

Pentru analiza laptelui, se transferă 20 ml lapte într-o eprubeta sterilă peste care se adaugă 1 ml soluţie de albastru de metilen. Eprubeta se menţine în baie de apa termostatată la temperatura de 38-40°C, astfel încât nivelul apei să fie superior probei. Se fac notaţii asupra modificării culorii la intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute.

Există şi varianta rapida a acestei metode când se utilizează aceeaşi tehnică de lucru utilizând următoarele cantităţi: 10 ml lapte şi 1 ml soluţie albastru de metilen, diluţie 1/10.

b. Proba reductazei cu resazurina

În eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaugă 1 ml soluţie de resazurina 0,05%, apoi proba se termostatează la temperatura de 38-40°C, urmărindu-se modificarea culorii in intervalul 20 şi 60 minute.


Pag 2

REZULTATE

a. Proba reductazei cu albastru de metilen

Aprecierea calităţii laptelui se face in conformitate cu specificaţiile din tabelul 1.

Tabelul 1. Aprecierea calităţii laptelui în proba reductazică cu albastru de metilen

Durata decolorării probei, minute Număr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria

Metoda clasica Metoda rapida

330 180 5·105 Buna I

120-330 60-180 5·105 - 4·106 Satisfăcătoare II

20-120 8-60 4·106 – 20·106 Slaba III

20 8 20·106 Foarte slaba IV

b. Proba cu resazurina

In proba cu resazurina aprecierea calităţii laptelui si a gradului de contaminare se face realizează in conformitate cu datele înscrise în tabelul 2.

Se apreciază că la temperaturi de 38-40°C, o capacitatea reductazică superioară o au lactobacilii, streptococii şi bacteriile coliforme. Dacă probele se menţin la temperatura de 22°C la reducere participă şi bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus, Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numărului de bacterii din proba de lapte

Timp de modificare a culorii

Culoare proba

Număr de bacterii per ml

Calitatea laptelui

Categoria

După 1h Albastru 5·105 Buna I

După 1h Albastru violet 5·105 - 4·106 Satisfăcătoare II

După 1h Roşu-alb 4·106 – 20·106 Slaba III

După 20 min. Alb 20·106 Foarte slaba IV



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

PROBA REDUCTAZEI

1. Înregistraţi în tabelele de mai jos variaţia culorii probelor

analizate, stabilind în funcţie de rezultatele obţinute calitatea

acestora

1.1. Proba reductazei cu albastru de metilen

PROBA Durata decolorării probei, minute Metoda rapida

Număr bacterii per ml Calitatea laptelui

1.

2.

1.2. Proba reductazei cu resazurină

PROBA Timp de modificare a culorii

Culoare proba

Număr bacterii per ml

Calitatea laptelui

1.

2.


Pag 1

METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR

Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale, denumite Petrifilme (în limba engleză, Petrifilms), în care mediul de cultură specific (în general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uşor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru şi grosime variabilă) pe un suport din carton plastifiat şi acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidratează mediul şi prin termostatare este posibilă dezvoltarea microorganismelor.

Petrifilmele au fost concepute în vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza hazardului, punctele critice de control), care prevăd aplicarea unor măsuri corective, pe tot parcursul procesului de producţie, fără ca acesta să stagneze, ceea ce impune analiza unui număr mare de probe, cu obţinerea unor rezultate prompte şi în scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic (Bahrim, 2003).

Practica a demonstrat că Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiză microbiologică, aplicabile mai ales pentru evaluarea calităţii materiilor prime şi controlul în punctele critice pe parcursul procesării acestora, oferind numeroase avantaje, care se regăsesc în reducerea timpului de analiză, reducerea costului analizei per probă, creşterea numărului de probe analizate, asigurarea inocuităţii alimentelor şi îmbunătăţirea substanţială a productivităţii (Jordano şi Medina, 1999).

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor în analiza microbiologică este extrem de simplă şi presupune parcurgerea următoarelor etape:

Se pregăteşte proba, conform metodologiei clasice, şi se diluează prin tehnica diluţiilor decimale, până la o concentraţie de celule de aproximativ 104 celule per ml.

Se ridică filmul superior.


Pag 2

Se inoculează 1 ml suspensie dintr-o diluţie corespunzătoare în centrul Petrifilmului aşezat pe un suport special.

Se eliberează filmul superior, care se lasă să cadă liber.

Cu ajutorul dispozitivului de răspândire se presează uşor deasupra zonei inoculate pentru distribuţia uniformă a celulelor din suspensie pe toată suprafaţa circulară a mediului de cultură.

Se îndepărtează dispozitivul de răspândire şi se aşteaptă un minut pentru solidificarea mediului.

Se termostatează (pachete de până la 20 Petrifilme) în condiţii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, în funcţie de recomandările din instrucţiunile de utilizare a Petrifilmului.


Pag 3

Se realizează numărarea coloniilor (pragul optim de detecţie 25-250 colonii/petrifilm); faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care împarte suprafaţa mediului în pătrate cu suprafaţa de 1cm2, uşurează mult numărarea.

Se calculează ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficienţa oferită de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizării acestora pentru evaluarea calităţii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv în industria de panificaţie pentru analiza făinii, a pastelor făinoase, a cerealelor şi a cerealelor pentru micul dejun.

În tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe piaţă şi principalele lor caracteristici.


Pag 4

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim, 2003b)1

Tip Petrifilm Grup de microorganisme

analizate

Condiţii de termostatare

Particularităţi

PYM (Petrifilm yeast/mould)

Drojdii şi mucegaiuri

72-120 ore, 25ºC

• determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri; • nu necesită adăugarea de antibiotice sau acid tartric.

PAC (Petrifilm aerobic count)

Bacterii aerobe mezofile

48 ± 2 ore, 30 ± 1ºC

• determinarea numărului total de bacterii aerobe; • analiza este eficientă prin prezenţa unui indicator care colorează coloniile în roşu.

PCC (Petrifilm coliforms count)

Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, 35 ± 1ºC sau 37 ± 1ºC

• evidenţierea coliformilor totali; • analiza este înlesnită de prezenţa unui indicator ce colorează coloniile în roşu; • filmul superior reţine gazele rezultate prin fermentaţia substratului lactoză, cu apariţia specifică a bulelor de gaz în jurul coloniilor.

PHSCC (Petrifilm high sensivity coliforms count)

Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, 32...35ºC

• evidenţierea bacteriilor coliforme la diluţii mari în probele de analizat (1-2 celule g-1); • permite inocularea a 5 ml probă, sau diluţii ale acesteia; • evaluare similară ca şi în cazul utilizării Petrifilmelor tip PCC.

P 2000 CC (Petrifilm rapid coliforms count)

Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, 35 ± 1ºC

• dezvoltarea rapidă a bacteriilor coliforme; • indicator de pH foarte sensibil, cu evidenţierea producerii de acid, chiar de la începutul formării coloniilor; • reducerea timpului de analiză prin asigurarea unei creşteri accelerate; • rezultate test prezumtiv în 6-14 h, cu confirmare în 18 -24 h.

PEC (Petrifilm E. coli)

Escherichia coli 48 ± 2 ore, 35 ± 1ºC sau 24 ± 2 ore, 42 ± 1ºC

• două teste în unul singur: evaluarea cantitativă a coliformilor fecali şi a lui E. coli; • conţine indicator β-glucuronidază pentru evidenţierea selectivă a tulpinilor de E. coli; • rezultate pozitive în 24 - 48 ore; • înaltă selectivitate.

Petrifilm Kit HEC Escherichia coli tip enterohemoragic

48 ± 2 ore, 35 ± 1ºC sau 24 ± 2 ore, 42 ± 1ºC

• evidenţierea serotipurilor E. coli enteropatogene (O157: H7), care produc glucuronaze; • se bazează pe utilizarea membranei active ELISA, care se menţine 2 minute în contact cu Petrifilmul, iar după 18 ore de termostatare testul pozitiv se evidenţiază prin apariţia unor pete gri pe membrană.

Petrifilm Enterobacteriaceae

Enterobacterii 24 ± 2 ore, 30 ± 1ºC sau 37 ± 1ºC

• evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae; • producerea de acid este pusă în evidenţă cu ajutorul unui indicator de pH, ce virează în galben în mediu acid; • evidenţierea formării de gaz prin fermentaţia heterolactică a lactozei.

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk)

Staphylococcus aureus

24 ± 2 ore, 37 ± 15ºC

• evidenţierea selectivă a tulpinilor de Staphylococcus aureus prin formarea de colonii de culoare roşu-violet; • confirmarea prezenţei lui Staphylococcus aureus, cu ajutorul discului, care conţine albastru-toluidină-O, ce facilitează developarea unei zone de culoare roz (reacţie DN-ază pozitivă), în jurul coloniilor specifice.

1 |Anexa 1


Pag 5

Garanţia utilizării Petrifilmelor este validată oficial de numeroase asociaţii de renume din întreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de bază: reproductibilitate, repetabilitate şi precizie.

Tabelul 2. Validarea oficială a utilizării Petrifilmelor pentru evaluarea calităţii microbiologice a alimentelor

Organizaţia internaţională*

Produse pentru care s-a realizat validarea

Indicator microbiologic

AOAC Majoritatea alimentelor Drojdii şi mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru

determinarea rapidă a bacteriilor coliforme ANFOR Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile

Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapidă a bacteriilor coliforme

Enterobacterii NMKL Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile

Bacterii coliforme şi Escherichia coli

VDIA Lapte şi produse lactate Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme

HPB Lapte şi produse lactate Alte alimente Evaluarea calităţii mediului

Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii şi mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme şi Escherichia coli Test Kit HEC

* AOAC – Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR – French Standardization Association (Franţa); NMKL – Nordic Committee of Food Analysis; VDIA – Victorian Dairy Industry Authority (Australia); HPB – Health Protection Branch, Compendium of Analytical

Analiza comparativă a fidelităţii evaluărilor cantitative, pentru patru indicatori microbiologici: drojdii şi mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme şi Escherichia coli, realizată pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea Petrifilmelor, în paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizează medii selective (OGYE, PCA, VRBL, EMB), a evidenţiat că evaluările privind numărul total de drojdii şi mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, în variantele analizelor realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenţionale.

Explicaţia constă probabil în existenţa unei suprafeţe insuficiente pentru creşterea extinsă a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce în multe cazuri la suprapunerea coloniilor, generând erori în evaluarea corectă a unităţilor formatoare de colonii (ufc). De remarcat este faptul că la Petrifilmele destinate evaluării drojdiilor şi mucegaiurilor, suprafaţa mediului de cultură este de 30 cm2, comparativ cu 20 cm2, în cazul majorităţii Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano şi colab., 1995).


Pag 6

Evaluările statistice, realizate pe baza coeficienţilor de corelaţie şi a pantei ecuaţiilor de regresie liniară, oferă certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici şi recomandă utilizarea Petrifilmelor ca o alternativă la metodele microbiologice convenţionale pentru controlul microbiologic, realizat atât pe faze de fabricaţie, cât şi în cazul materiilor prime şi al produselor finite (tabelul 3).

Tabelul 3. Evaluări statistice privind acurateţea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenţionale (Jordano 1995, 1999)

Parametrul statistic Indicatorul microbiologic Petrifilme/ Metode culturale clasice*

Coeficient de corelaţie Bacterii aerobe mezofile 0,897 Bacterii coliforme 0,861 Drojdii şi mucegaiuri 0,981

Panta ecuaţiei de regresie

Bacterii aerobe mezofile 0,599 Bacterii coliforme 1,051 Drojdii şi mucegaiuri 0,998

* Valori medii pentru 5 probe în paralel (n = 5)

Datele obţinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru cinci probe în paralel (n = 5), certifică fidelitatea şi acurateţea analizelor realizate cu Petrifilme, amplificarea preciziei realizându-se prin asigurarea condiţiilor selective de cultivare şi interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corectă şi distinctivă a speciilor analizate (fig. 5).

1 2

3 4

Fig. 5. Dezvoltarea selectivă a microorganismelor în funcţie de natura Petrifilmelor

1 – drojdii şi mucegaiuri; 2 – bacterii aerobe mezofile; 3 – enterobacterii; 4 – bacterii coliforme/ Escherichia coli


Pag 7

În concluzie, implementarea utilizării Petrifilmelor în controlul calităţii microbiologice a alimentelor oferă numeroase facilităţi care se reflectă în:

� uşurinţa în exploatare; analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare, termostatare şi evaluare cantitativă şi calitativă;

� simplitate în utilizare şi în interpretarea cu acurateţe a rezultatelor, prin crearea unor condiţii selective de creştere şi de evaluare a microorganismelor testate. Evaluările cantitative sunt facilitate, chiar în cazul dezvoltării unui număr mare de colonii, prin caroiajul tipărit pe filmul inferior, care delimitează suprafeţe de 1 ml;

� reducerea semnificativă a costului manoperei per analiză;

� reducerea la jumătate a timpului necesar pentru realizarea analizelor microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice, optimizării strategiilor de control, creşterii numărului de analize efectuate, eficientizării procesării, îmbunătăţirii calităţii şi asigurării inocuităţii produselor finite;

� impact pozitiv asupra organizării laboratorului de microbiologie, prin eliminarea operaţiilor de pregătire şi sterilizare a mediilor de cultură şi a ustensilelor de laborator, impuse de metodele convenţionale de analiză microbiologică;

� riscuri reduse pentru mediul înconjurător după utilizare; volum redus de produse reziduale la finalul analizei care pot fi uşor anihilate pin incinerare;

� economie de spaţiu la transport, păstrare şi termostatare (un pachet de 50 de Petrifilme ocupă un spaţiu similar cu cel ocupat de 2 plăci Petri clasice);

� valabilitate prelungită (mai mult de un an, prin menţinere la 4ºC).

Practica a demonstrat că există şi unele limitări în utilizarea Petrifilmelor generate de (Williams şi Busta, 1999b):

capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de solidificare, ceea ce conduce la răspândirea şi suprapunerea coloniilor;

unii compuşi din alimente (acizi, săruri etc.) pot exercita efect inhibitor asupra dezvoltării coloniilor în cazul utilizării Petrifilmelor, comparativ cu tehnicile clasice.

Studii efectuate în 85 de companii producătoare de alimente, privind eficienţa economică a tehnicilor de evaluare a calităţii microbiologice, au demonstrat că manopera se reflectă în proporţie de 70,7 % în costul tot al analizelor, iar prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calităţii şi creşterea numărului de analize (Jordano, 1999).


Pag 8

ANEXA 1

Tipuri de Petrifilme comerciale

Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate

Exemple Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme

analizate

Exemple

Petrifilm yeast/mould

Drojdii şi mucegaiuri

Petrifilm high sensivity coliforms

count)

Bacterii coliforme

Petrifilm aerobic count

Bacterii aerobe mezofile

Petrifilm rapid coliforms count

Bacterii coliforme

Petrifilm coliforms count

Bacterii coliforme

Petrifilm E. coli

Escherichia coli

Petrifilm E. coli / Coliform count plate

Bacterii coliforme şi E. coli

Petrifilm Enterobacteriaceae

Enterobacterii

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm

Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express

Disk)

Staphylococcus aureus

Petrifilm Environmental Listeria plate

Listeria

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

Pag 1

BACTERII COLIFORME.

COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI

Bacteriile coliforme conform definiţiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate, oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot să se înmulţească în prezenţa sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu proprietăţi echivalente), capabile de a produce fermentaţia heterolactică a lactozei cu producere de acid lactic şi gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37°C.

Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica

Tipuri de produse alimentare pentru care se recoman da analiza sunt: lapte şi produse lactate, carne şi produse din carne, peşte şi produse din peşte, băuturi alcoolice, băuturi nealcoolice, produse de cofetărie şi patiserie

PRINCIPIU METODEI

Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare şi testul complet, bazate pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, în timp de 48 ore la 35°C.

Testul prezumtiv constă in inocularea probei în mediu nutritiv cu lactoză. Aprecierea probelor pozitive se face fie în funcţie de prezenţa gazelor acumulate în tubul Durham, fie ca urmare a scăderii pH-ului prin acumularea de acid lactic.

Testul de confirmare constă in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv in medii selective care favorizează dezvoltarea bacteriilor coliforme de origine fecala.

Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme şi se bazează pe testarea unor proprietăţi biochimice caracteristice.

Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o contaminare fecală recentă.

MODUL DE LUCRU

� DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI

Analiza se efectuează în două etape, după cum urmează:

1. Etapa de îmbog ăţire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezenţa bacteriilor coliforme şi multiplicarea acestora, dacă sunt în concentraţii reduse, în vederea evidenţierii lor facile în etapa următoare.


Pag 2

2. Etapa de confirmare certifică prezenţa bacteriilor coliforme prin cultivare în condiţii selective specifice.

Pornind direct de la eşantionul de analiză (în cazul unui produs lichid) sau de la suspensia iniţială (10-1) (în cazul unui produs solid), în funcţie de gradul de contaminare presupus se pot adopta două modalităţi de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru inoculare câte 10 ml de probă (pentru probele cu grad de contaminare mai redus) utilizând mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat, sau câte 1 ml de probă prin inoculare în mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat. Pentru acest din urmă caz, se inoculează serii de câte trei eprubete în paralel pentru şi pentru următoarele diluţii succesive: 10-1, 10-2,…..ş.a.

Probele inoculate se termostatează la temperatura de 37°C, timp de 24-48 h. Se înregistrează eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz în plutitor), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 h şi se înregistrează din nou eprubetele pozitive.

Pentru confirmare , din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă şi se inoculează eprubete cu bulion lactoză bilă verde briliant; după termostatare la temperatura de 37°C, timp de 48 h, în condiţiile în care se produc gaze în plutitor, tulburare, si virajul culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirma ca în produsul analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. 1).

� EVIDENTIEREA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIG INE FECALA

Testul constă în transferul cu o ansă a probelor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv, în eprubete cu mediu E.C. şi termostatare la temperatura de 45.5°C, timp de 24 de ore.

� CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli

Din eprubetele pozitive ce conţin mediu E.C., după termostatare la temperatura de 45.5°C, timp de 24 de ore, se fac trasări aplicând metode scarificate pe suprafaţa mediului Levine cu agar, repartizat în plăci pentru a obţine colonii distincte. Se termostatează apoi la temperatura de 35°C, timp de 18-24 de ore.

Din coloniile caracteristice se fac inoculări pentru testele biochimice denumite generic IMViC*, care permit diferenţierea a lui E. coli de Enterobacter aerogenes.

*I – producere de indol din triptofan

M – reacţia faţă de roşu de metil

V – reacţia Vages Proskauer de producere a acetoinei

C – utilizarea citratului.

Diferenţiere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmează :

Specii I M V C Mobilitate Escherichia coli + + - - + Enterobacter aerogenes

- - + + -


Pag 3

Suspensie iniţială (produs solid) Eşantion de analiză (produs lichid)

Etapa de îmbog ăţire

10-

1/10-2 10-2/10-3

10 ml 10 ml 10

ml 1 ml 1 ml 1 ml Idem Idem

+ + + + + + 10 ml

Mîdc1)

10 ml Mîdc

1) 10 ml

Mîdc1)

10 ml

Mîsc2)

10 ml Mîsc

2) 10 ml

Mîsc2)

Termostatare 24h Termostatare 48h4) Idem Idem

Etapa de confirmare

+* + -

10 ml

BLBV3) 10 ml BLBV

10 ml

BLBV

10 ml

BLBV

10 ml BLBV

Idem Idem

Termostatare 48h ±

2h 4) Termostatare

48h ± 2h 4)


+** + - +** - Idem Idem

Calculul MPN

Fig. 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativă a bacteriilor coliforme prin tehnica numărului probabil

Legendă: 1) Mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat (Mîdc) + tub Durham 2) Mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat (Mîsc) + tub Durham 3) Mediu selectiv de confirmare + tub Durham 4) Temperatura de termostatare poate fi 30ºC, 35ºC sau 37ºC şi este stabilită în funcţie de scopul analizei şi anume: scop

tehnologic sau evaluarea riscului privind siguranţa alimentară; în anumite cazuri testul pozitiv poate fi evidenţiat şi după o perioadă de termostatare de 24 h ± 2h

* Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz în tubul Durham ** Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; virajul culorii mediului din verde în galben; acumularea de gaz în tubul Durham


Pag 4

CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR

Folosind, metoda titrului , in funcţie de numărul eprubetelor pozitive se stabileşte cifra caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunzător cifrei caracteristice si numărul de eprubete inoculate in paralel, se determina numărul probabil de coliformi (MPN)

Pentru a calcula numărul probabil de coliformi/cm3 probă, valoarea din tabel se înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzător primei cifre din cifra caracteristică.

Tabel Mac Cready

Cifra caracteristica

Număr probabil de microorganisme

Cifra caracteristic ă


Cifra caracteristica


000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110 130 1.6 300 2.5 333 140 200 0.9 301 4.0


Pentru fiecare eşantion examinat se reţin trei diluţii consecutive, care, după caz, corespund uneia dintre situaţiile următoare:

1) Cel puţin o diluţie prezintă trei eprubete pozitive. Se alege diluţia cea mai mare (adică cea care corespunde celei mai mici concentraţii de eşantion inoculat) care prezintă trei eprubete pozitive, şi încă două diluţii succesive. Dacă schema de diluţie adoptată este necorespunzătoare, adică nu există diluţii la care să se fi înregistrat şi probe negative, se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată).

2) Nu există cazuri e să prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat. Se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată), care conţin cel puţin un răspuns pozitiv.

3) Cazuri particulare. În toate cazurile în care mai mult de una dintre cele trei diluţii de la pct. 1) şi 2) nu prezintă eprubete pozitive (adică cea în care s-a inoculat cea mai mare cantitate de probă) şi cele două diluţii consecutive mai mici (adică cele în care concentraţiile de probă inoculată sunt de 10 şi respectiv 100 de ori mai mici decât în prima diluţie aleasă), excluzând cazul în care se înregistrează probe pozitive, doar la prima diluţie preparată, pornind de la eşantion. În acest ultim caz, se vor reţine primele trei diluţii, chiar dacă seria include două diluţii care nu prezintă nici o probă pozitivă.


Pag 5

Calcul MPN 1

Pentru a stabili MPN/g sau ml probă se recomandă utilizarea aproximaţiei propusă de Thomas, stabilită prin formula:

( ) 21

)(/TN

PmlgMPN

+=

în care: P – numărul de eprubete pozitive; N – cantitatea de probă inoculată în probele negative, g sau ml T – cantitatea totală de probă luată în analiză (inoculată în toate seturile de

probe realizate în paralel), g sau ml

Pentru fiecare analiză trebuie să se decidă categoria de rezultate acceptată, adică 1, 1 şi 2, sau 1, 2 şi 3. Astfel, gradul de contaminare va corespunde cu MPN calculat, conform specificaţiilor din tabelul 1.

Tabelul 1. Măsuri privind interpretarea şi acceptabilitatea rezultatelor analizei

Categoria Defini ţie

1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare şansă de a fi obţinute. Şansa de a obţine acest rezultat (care este mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil) este de cel mult 5% în această categorie.

2 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 1. Există şansa de cel mult 1% de a obţine un rezultat mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil în această categorie.

3 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 2. Există şansa de cel mult 0,1% de a obţine un rezultat care este mai puţin probabil decât cel mai puţin probabil în această categorie.

0 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar decât cel mai puţin probabil din categoria 3. Nu există decât o şansă de 0,1% de a obţine un rezultat în această categorie, fără erori de analiză

După alegerea setului de trei diluţii reprezentative pentru stabilirea MPN, care, conform uneia din situaţiile de mai sus, sunt acceptabile din punct de vedere statistic. Acceptabilitatea depinde totodată de numărul de eşantioane analizate şi de decizia de a accepta sau refuza rezultatele din categoria 2.

Un exemplu de alegere a diluţiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat în tabelul 2.

Acceptarea rezultatelor va ţine seama de categoria impusă. Astfel, atunci când sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1, combinaţia 221 nu poate fi

1 numărul cel mai probabil (MPN)


Pag 6

reţinută decât dacă au fost examinate 10 probe în paralel (din lotul considerat). În cazul când sunt acceptate mai puţin probabile (din categoria 2), combinaţia 221 va fi reţinută în cazul în care au fost examinate 2, 3 sau 5 probe în paralel. Dacă combinaţia 221 este rezultatul unei singure analize, acesta nu poate constitui o bază pentru stabilirea MPN.

Tabelul 2. Stabilirea valorii MPN în funcţie de diagrama probelor pozitive (adaptare după SR ISO 4831, 1992)

Exemplu Numărul de eprubete pozitive corespunz ător seturilor de trei eprubete termostatate, corespunzând urm ătoarelor cantit ăţi de eşantion inoculate în fiecare eprubet ă1)

MPN2)

Produs lichid

10 ml 1ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN/ml MPN/g

Alt produs 1 g 10-1g 10-2 g 10-3 g 10-4 g 1 3 3 2 1 0 1,5·101 1,5·102 2 3 3 3 0 2,4·101 2,4·102 3 2 2 1 1 0 7,4 7,4·10 4 3 3 0 0 0 2,4 2,4·10 5 2 2 0 1 1 2,1·10-1 2,1

1) Seria (combinaţia) de eprubete aleasă 2) Conform datelor din tabelele întocmite pe baze statistice


Pag 7

ANEXA 1

COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ

Etapa

Denumirea mediului

Compozi ţie Instruc ţiuni de preg ătire

Etapa de îmbog ăţire

Bulion -tripton ă şi lauril sulfat (mediul selectiv de îmbogăţire)

Mediu dublu concentrat: Triptonă ............................... 40,0gLactoză ................................ 10,0gK2HPO4 ................................ 5,5 gKH2HPO4 ............................. 5,5 gNaCl..................................... 10,0gLauril sulfat de sodiu ............. 0,2gApă .................... până la 1000 mlpH=6,8; la temperatura de 25ºC (după sterilizare)

Se dizolvă componentele sau mediul comercial în apă, încălzind dacă este nevoie. Se ajustează pH-ul dacă este nevoie. Se repartizează câte 10 ml de mediu dublu concentrat în eprubete mari (20mm x 200mm), fără tub Durham. Se repartizează câte 10 ml de mediu simplu concentrat în eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizează în autoclav la 121ºC, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie să conţină bule de aer după sterilizare.

Mediu simplu concentrat Triptonă ............................... 20,0gLactoză .................................. 5,0gK2HPO4 ............................... 2,75gKH2HPO4 ............................ 2,75gNaCl....................................... 5,0gLauril sulfat de sodiu ............. 0,1gApă .................... până la 1000 mlpH=6,8; la temperatura de 25ºC (după sterilizare)

Etapa de confirmare

Bulion lactozat cu bilă şi verde briliant (BLBV) (mediul de confirmare)

Peptonă ............................... 10,0gLactoză ................................ 10,0gBilă....................................... 20,0gVerde briliant ................... 0,0133gApă ...................... până la 1000mlpH=7,2; la temperatura de 25ºC (după sterilizare)

Se dizolvă componentele sau mediul comercial în apă, încălzind dacă este nevoie. Se ajustează pH-ul dacă este nevoie. Se repartizează câte 10 ml de mediu în eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizează în autoclav la 121ºC, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie să conţină bule de aer după sterilizare.

Mediu Levine Peptonă ............................... 10,0gLactoză ................................ 10,0gK2HPO4 .................................. 2,0gEozină .................................. 0,4gAlbastru de metilen ........... 65,0mgGeloză ................................ 15,0gApă ...................... până la 1000mlpH=7.1;

Se sterilizează în autoclav la 121ºC, timp de 15 minute.

Mediu EC (mediul selectiv confirmare)

Triptoză .............................. 20,0gLactoză .................................. 5,0gSăruri biliare .......................... 1,5gFosfat dipotasic ..................... 4,0gFosfat monopotasic ............... 1,5gClorură de sodiu .................... 5,0gApă ...................... până la 1000mlpH=6.9;

Se sterilizează în autoclav la 121ºC, timp de 15 minute. Se repartizează câte 10 ml de mediu în eprubete mici, cu tub Durham.



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

BACTERII COLIFORME.

COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli

1. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive:

a. Etapa de îmbog ăţire (testul prezumtiv)

Proba

Diluţia

1

2

b. Etapa de confirmare

Proba

Diluţia

1

2

Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in numărul probabil de bacterii coliforme/cm3

probă:

Proba 1 _______________________

Proba 2 _______________________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA NUMĂRULUI DE BACTERII Staphylococcus aureus (COAGULAZO POZITIVI)

Staphylococcus aureus (stafilococi coagulazo-pozitivi) - bacterii care formează colonii caracteristice şi/sau necaracteristice la suprafaţa unui mediu de cultură selectiv şi care dau o reacţie puternic coagulază pozitiv.

Prezenta procedură de lucru stabileşte modul de evidenţiere şi numărare a stafilococilor coagulazo-pozitivi din produsele alimentare (Anexa 1).

PRINCIPIUL METODEI

Prin această metodă, numărul de bacterii aparţinând speciei Staphylococcus aureus se apreciază indirect, pe baza numărului de colonii generate de celulele acestei bacterii prezente în proba de analizat, care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat (inoculat în două probe în paralel), după termostatare la temperatura de 35°C sau 37°C, timp de 24-48 de ore.

MATERIALE ŞI STICLĂRIA PENTRU DETERMINARE

� Plăci Petri Φ10 cm sterile; � Pipete de 1 cm3 sterile; � Eprubete sterile; � Eprubete cu câte 10 ml mediu Baird-Parker cu geloză; � Eprubete cu câte 10 ml bulion inimă-creier steril; � Baloane cu ser fiziologic steril; � Ansă cu buclă cu diametrul de 3 mm; � Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide; � Numărător de colonii.

MEDII DE CULTURĂ ŞI REACTIVI PENTRU DETERMINARE

Mediile de cultură utilizate pentru determinare sunt (Anexa 2):

� Mediu cu geloz ă Baird-Parker

� Bulion de inim ă-creier

� Plasmă de iepure


Pag 2

Cerin ţe:

� Apa folosită trebuie să fie distilată sau demineralizată, lipsită de substanţe care să inhibe dezvoltarea celulelor de Staphylococcus aureus în condiţiile analizei;

� Reactivii chimici utilizaţi trebuie să fie de calitate recunoscută;

� Pentru prepararea soluţiilor de diluare şi a mediilor de cultură se vor utiliza componente de bază deshidratate sau medii comerciale deshidratate;

� Pentru emulsia de gălbenuş de ou se recomandă utilizarea unui preparat comercial, respectând cu stricteţe instrucţiunile fabricantului.

MODUL DE LUCRU

Pentru evidenţierea bacteriilor Staphylococcus aureus se fac inoculări în mediul Baird-Parker cu geloză, prin metoda încorporării în mediul nutritiv. Din probele lichide se pot realiza diluţii decimale direct în eprubete, în timp ce pentru probele solide sau semisolide se realizează o omogenizare şi suspendare în ser fiziologic steril.

Se cântăresc în condiţii aseptice 10 g din produsul de analizat, folosind drept suport o pungă sterilă. Se adaugă 90 cm3 ser fiziologic steril, se închide punga şi se introduce în omogenizator. Se omogenizează timp de 1 min în treapta a doua, după care se continuă diluarea în eprubetele cu ser fiziologic steril.

Inoculările se fac din 3 diluţii succesive ale probei, alese convenabil, în funcţie de gradul presupus de contaminare a probei. Pentru fiecare din diluţiile alese, se inoculează câte 1 cm3 în câte două plăci Petri. Pentru a obţine colonii uniform repartizate, după turnarea în plăci a mediului fluidificat şi răcit la 47±1°C, se omogenizează conţinutul cutiei Petri prin mişcări de rotaţie executate în plan orizontal, după care se lasă în repaus până la solidificare totală.

După inoculare, probele sunt termostatate timp de 24-48 de ore la temperaturi de 35± 1°C sau la 37±1°C, apoi se marchează pe reversul mediului coloniile caracteristice. Se continuă termostatarea la temperatura de 35± 1°C sau la 37±1°C, timp de încă 22-24 de ore şi se marchează toate coloniile caracteristice; se marchează şi coloniile necaracteristice eventual prezente. Se reţin pentru numărare plăcile Petri care conţin între 15-150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice.

Prin numărare se stabileşte numărul de ufc (unităţi formatoare de colonii) care reprezintă numărul prezumtiv de bacterii ale speciei Staphylococcus aureus, prezente în proba de analizat.

Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare cinci colonii caracteristice şi/sau necaracteristice (după caz).


Pag 3

Pentru confirmarea prin proba coagulazei se procedează astfel: din fiecare colonie reţinută se prelevează biomasă cu ajutorul unei anse sterile şi se inoculează în câte o eprubetă ce conţine 10 ml bulion inimă-creier. Probele inoculate se termostatează la 37±0,5°C, timp de 18-24 de ore. Se amestecă în eprubete sterile 0,1 ml cultură recoltată în condiţii sterile 0,3 ml plasmă de iepure şi se termostatează la temperaturi de 35-37°C, timp de 1-6 ore.

Se consideră că reacţia este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din volumul ocupat iniţial de lichid.

Pentru control, se adaugă 0,1 ml bulion inimă-creier steril în 0,3 ml plasmă de iepure şi termostatează în condiţii similare cu probele de analizat. Plasma din eprubeta martor nu trebuie să prezinte semne de coagulare.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

În interpretarea rezultatelor se vor ţine cont de următoarele recomandări:

- coloniile caracteristice sunt negre, strălucitoare şi convexe, diametrul de 1..1,5 mm, după 24 de ore de termostatare, şi de 1,5-2,5 mm, după 48 de ore de termostatare, şi sunt înconjurate de o zonă clară sau parţial opacă;

- coloniile necaracteristice au caractere culturale asemănătoare, dar sunt lipsite de zonă clară; coloniile necaracteristice sunt constituite adesea de tulpini de Staphylococcus aureus care contaminează produsele lactate;

- dacă la o diluţie predomină un tip de colonii, iar la o diluţie diferită predomină alt tip de colonii, se reţin plăcile corespunzătoare ambelor diluţii.

Pot fi întâlnite următoarele situaţii:

1) Dacă cel puţin 80% dintre coloniile selecţionate sunt coagulazo-pozitiv se ia ca număr prezumtiv de Staphylococcus aureus, numărul de ufc obţinut prin numărarea coloniilor selectate pentru numărare.

2) În toate celelalte cazuri, numărul se calculează pornind de la procentul de Staphylococcus aureus prezumtiv, care sunt coagulazo-pozitiv.

Calculul pentru determinarea bacteriilor Staphylococcus aureus prin num ărare

Pentru plăcile care conţin între 15 şi 150 de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice pentru două diluţii consecutive, numărul de ufc de Staphylococcus aureus se calculează media aritmetică a valorilor obţinute, exceptând cazul când raportul dintre valoarea cea mai mare şi valoarea cea mai mică este mai mare decât 2; în acest caz se reţine ca rezultat valoarea cea mai mică. Dacă în plăcile Petri alese pentru numărare sunt


Pag 4

prezente colonii caracteristice şi/sau necaracteristice, aceste colonii se numără separate. Se adună mediile obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice, luând în considerare, pentru fiecare, factorul de diluţie.

Nu se reţin decât două cifre semnificative, procedând după cum urmează:

- dacă numărul este mai mic de 100, se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5;

- dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 20;

- dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 10

Pentru a obţine ufc/ml produs lichid sau ufc/g produs solid, după caz, se multiplică valoarea obţinuta anterior cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul diluţiei eşantionului analizat.

Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10n, unde n este puterea corespunzătoare.

Pentru o estimare a numerelor mici, se face o medie din numărul coloniilor confirmate, caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai apropiat.

Dacă numărul mediu al coloniilor confirmate este mai mic de 15, rezultatul se exprimă sub forma:

a) pentru produse lichide:

- mai puţin de 15x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde ne = 1/volum de inocul

b) pentru alte tipuri de produse:

- mai puţin de 15x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde

Ne = 1/volum de inocul x 1/diluţia eşantionului analizat

c) estimarea numerelor mici în produsele lichide:

- m x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde m = numărul de colonii confirmate

d) estimarea numerelor mici în alte tipuri de produ se:

- m x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde m = numărul de colonii confirmate

Limitele de încredere ale estimărilor de numere mici sunt prezentate în tabelul de mai jos. Limitele de încredere cu o probabilitate de 95% din estimările de numere mici (variantele c) şi d)), atunci când numărul mediu de colonii confirmate în două plăci Petri


Pag 5

inoculate cu eşantionul de analiză sau o diluţie a acestuia este mai mic de 15 ufc sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Limite de încredere pentru estimări de numere mici

Staphylococcus aureus ufc/ml sau ufc/g

Limita de încredere la nivelul de 95% inferioară superioară

1 < 1 2 2 < 1 4 3 < 1 5 4 1 6 6 2 9 7 2 12 8 3 13 9 4 14

10 4 16 11 5 18 12 6 19 13 7 20 14 7 21 15 8 23

Dacă nu există nici o colonie confirmată rezultatul se exprimă sub forma:

a) pentru produse lichide:

- - mai puţin de 1 x ne Staphylococcus aureus per mililitru

b) pentru alte tipuri de produse:

- - mai puţin de 1 x Ne Staphylococcus aureus per gram


Pag 6

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE ALIMENTE

1. Pâine şi produse de panificaţie

2. Lapte şi produse lactate


4. Peşte şi produse din peşte

5. Uleiuri şi grăsimi

6. Ouă şi produse pe bază de ou


8. Fructe. Legume şi produse prelucrate

9. Băuturi alcoolice

10. Băuturi nealcoolice

11. Produse de cofetărie şi patiserie

12. Produse de catering

13. Semipreparate

14. Cereale şi produse din cereale

15. Condimente, supe, sosuri, salate

16. Îngheţate

17. Alimente cu destinaţie specială

18. Alte alimente


Pag 7

ANEXA 2

Prepararea mediilor de cultur ă şi a reactivilor pentru determinare

1. Mediul cu geloz ă Baird-Parker

Compoziţie: Mediu de bază ................................................. 90 ml Soluţie telurit de potasiu ..................................... 1ml Soluţie piruvat de sodiu .................................. 5,0 ml Emulsie de gălbenuş de ou ............................ 5,0 ml Preparare: Se solubilizează mediul de bază, apoi se răceşte la circa 50°C pe baia de apă. Se adaugă celelalte componente, omogenizând cu grijă după fiecare adaos.

1.1. Mediu de baz ă Compoziţie: Triptonă ........................................................... 10,0g Extract de drojdie .............................................. 1,0g Extract de carne ................................................ 5,0g Glicină ............................................................. 12,0g Clorură de litiu ................................................... 5,0g Agar-agar ..................................................... 12-20g Apă .............................................................. 1000 ml şi dacă este necesar: Soluţie de sulfamezatină .............................. 27,5 ml Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul gelozat comercial în apă distilată prin încălzire până la fierbere. Dacă este necesar, se adaugă 27,5 ml soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină, INN). Se ajustează pH-ul astfel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,2 la temperatura de 25°C. Se repartizează mediul câte 10 de ml în eprubete. Se sterilizează mediul la 121°C, timp de 15 minute. Mediul poate fi conservat timp de 1 lună, la temperaturi de 0°C-.5°C. Soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină, INN) se foloseşte numai în cazul în care se suspectă prezenţa bacteriilor din genul Proteus). Compoziţie: Sulfamezatină .............................................................. 0,2g Soluţie hidroxid de sodiu 0,1M .................................... 10ml Apă ............................................................................ 100ml Preparare: Se dizolvă sulfmezatina în soluţie de hidroxid de sodiu. Se completează volumul până la 100 ml cu apă.

1.2. Solu ţie de telurit Compoziţie: Telurit de potasiu (trioxotelurat dipotasic) .................... 1,0g Apă ........................................................................... 100ml Preparare: Se dizolvă teluritul de potasiu în apă, încălzind cât mai puţin posibil. Se sterilizează prin filtrare. Soluţia poate fi conservată mai multe luni la temperaturi de 0°C-.5°C.

1.3. Solu ţie de piruvat de sodiu Compoziţie: Piruvat de sodiu ......................................................... 20,0g Apă ............................................................................ 100ml


Pag 8

Preparare: Se dizolvă piruvatul de sodiu într-un volum de apă. Se completează cu apă până la volum final. Se sterilizează prin filtrare. Soluţia poate fi conservată maxim o lună la temperaturi de 0°C-5°C.

1.4. Emulsie de g ălbenu ş de ou (cu o concentraţie de circa 20%)

Este recomandată utilizarea preparatului comercial. În lipsa preparatului comercial emulsia se va prepara respectând cu stricteţe următoarea reţetă: Se folosesc două ouă proaspete de găină şi se separă gălbenuşurile de albuşuri. Se amestecă gălbenuşurile cu un volum de apă egal cu de patru ori volumul lor. Se încălzeşte amestecul pe baia de apă reglată la temperatura de 45±5°C apoi se menţine la temperatura de 0°C-5°C, timp de 18-24 de ore. Se lasă să se decanteze, apoi lichidul supernatant se sterilizează prin filtrare. Emulsia poate fi conservată maxim 72 de ore, la temperaturi de 0°C-.5°C. 2. Bulion de inim ă-creier

Compoziţie: Peptonă ............................................................................................ 10g Extract deshidratat din creier de viţel ............................................ 12,5g Extract deshidratat de inimă de bou ............................................... 5,0g Glucoză ........................................................................................... 2,0g Clorură de sodiu .............................................................................. 5,0g Ortofosfat disodic (Na2HPO4) .......................................................... 2,5g Apă ............................................................................................ 1000 ml Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul complet în apă, aducând la fierbere. Se ajustează pH-ul astfel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,4 la temperatura de 25°C. Se repartizează mediul de cultură, câte 10 ml, în eprubete. Se sterilizează mediul la temperatura de 121°C, timp de 20 de minute. Mediul poate fi conservat timp de mai multe luni la temperatura de 0°C-.5°C.

3. Plasmă de iepure Se foloseşte plasmă de iepure deshidratată din comerţ, care se rehidratează conform instrucţiunilor fabricantului. Se adaugă o soluţie de EDTA (acid etilen-diamino-tetra acetic) (plasma oxalată sau heparinizată nu necesita EDTA), astfel încât să se obţină o concentraţie de 0,1% EDTA în plasma rehidratată. Se poate utiliza plasmă de iepure proaspătă sterilă şi apă sterilă, în raport de 1:3. Înainte de a fi utilizat, fiecare lot de plasmă trebuie controlat cu tulpini de Staphylococcus aureus slab şi intens pozitive, precum şi cu tulpini de stafilococi coagulazo-negativi.


Pag 1

GENUL LISTERIA

Genul Listeria cuprinde 7 specii, dintre care cea mai importantă este L. monocytogenes.

TEHNICI DE ÎMBOGĂŢIRE

Îmbogăţirea se poate realiza cu o metodă la rece (metoda Gray), metodă bazată pe caracterul psihrofil. Produsul de analizat este menţinut la temperatura de 4°C (eventual în tampon PBS) sau preîmbogăţit într-un bulion cu triptoză la temperatura de 4°C. Se utilizează apoi (făcându-se eventual prelevări la timpi diferiţi) un bulion de îmbogăţire care conţine ramnoză, albastru de metilen, acid nalidixic, polimixină B şi acriflavină. Acest mediu se termostatează timp de 2 zile la temperatura de 25°C, apoi se realizează o repicare pe mediul de izolare. Se poate utiliza şi un bulion cu acridină sau mediul de îmbogăţire Feindt, care conţine acridină (tripaflavină) şi tiocianat de potasiu.

Alte medii permit să se efectueze o îmbogăţire la temperatură clasică de 30-37°C. Bulionul de îmbogăţire pentru Listeria (LEB) permite evidenţierea bacteriei Listeria monocytogenes: Cicloheximida, acidul nalidixic şi acriflavina sunt agenţii selectivi ai mediului. Mediul este termostatat timp de 24-48 h la temperatura de 30°C.

Bulioanele de îmbogăţire pentru Listeria, UVM I, II se bazează pe aceiaşi agenţi selectivi: acriflavina (12 mg/l pentru UVM I şi 25 mg/l pentru UVM II) şi acid nalidixic. Esculina (hidrolizată de Listeria) este în acest mediu un agent de diferenţiere. Îmbogăţirea se realizează de obicei în două etape: se termostatează mai întâi, timp de 4 h, pe UVM I, se izolează şi se retermostatează timp de 24 h la temperatura de 30°C, se reizolează şi se face repicarea pe UVM II. După o perioada de 24 h la temperatura de 30°C se face o ultimă izolare (pe geloza Oxford sau PALCAM).

Bulionul Fraser este un mediu asemănător mediului UVM, dar conţine clorura de litiu şi citrat de fier. Înnegrirea mediului indică posibila prezenţă a bacteriilor din genul Listeria.

TEHNICI DE IZOLARE

Izolarea bacteriei Listeria monocytogenes se realizează adesea pe geloza Oxford sau PALCAM.

Geloza Oxford conţine amidon, esculină şi citrat de fier. Selecţia se datorează clorurii de litiu


Pag 2

şi amestecului de inhibitori CCCFA (cicloheximidă, colistină, cefotetan, fosfomicină, acriflavină). După o perioadă de termostatare de 24-48 h la temperatura de 37°C, Listeria monocytogenes formează colonii verde-oliv cu halou negru. Adaosul de CCCFA poate fi înlocuit de un amestec de colistină şi moxalactam.

Geloza PALCAM conţine glucoză, amidon, manitol, esculină şi citrat de fier. Selecţia este datorată prezenţei clorurii de litiu şi inhibitorilor: ceftazidină, polimixină şi acriflavină. După o perioadă de termostatare de 24 h la temperatura de 37°C, Listeria monocytogenes formează colonii verde-oliv cu halou negru. Aceste medii sunt foarte selective, dar pe ele pot creşte stafilococi şi enterococi (colonii galbene datorate fermentaţiei manitolului din mediul PALCAM). Se pot utiliza şi alte medii:

� geloză Mac Bride cu feniletanol şi cicloheximidă;

� geloză cu sânge suplimentată cu acid nalidixic, polimixină şi ramnoză;

� geloză Despierre, geloză cu sânge sau geloză Columbia sau tripticază soia conţinând acid nalidixic, polimixina şi ramnoză;

� geloză nutritivă cu acridină şi acid nalidixic, care conţine în plus tiamină;

� geloză LCA (geloză inima-creier conţinând clorura de litiu, glicină şi ceftazidină).

TEHNICI DE IDENTIFICARE

Identificarea este realizată după repicare timp de 24 h la temperatura de 35-37°C pe o geloză TSYEA. Pe acest mediu coloniile sunt mici (1-2 mm), translucide şi cu margini neregulate. Folosind un fascicul luminos oblic (lumină albă; unghi 45°) coloniile apar albăstrui şi granuloase (testul de iluminare Henry).

Bacteriile din genul Listeria sunt bacili mobili, aero-anaerobi, catalazo +, oxidazo -. Principalele caractere biochimice studiate pentru identificarea genului sunt: VP (+), RM(+), indol (-), urează (-), H2S (-) etc. Geloza cu esculină este inoculată prin înţepare şi termostatată timp de 48 h la temperatura de 37°C. Speciile genului Listeria şi, în particular, L. monocytogenes, dau un răspuns pozitiv (culoare neagră).

Caracterul hemolitic este studiat cu testul Camp. Tulpinile de studiat se inoculează prin metoda striilor pe o geloză cu sânge de oaie şi, perpendicular pe aceştia, se inoculează o tulpină de S. aureus şi de Rhodococcus equi. L. monocytogenes şi L. seeligeri produc hemoliza β cu S. aureus, în timp ce L. ivanovii produce hemoliza cu R. equi.

Pentru identificare rapidă se pot utiliza următoarele teste: API Listeria (Biomerieux), ID32 (Biomerieux), Micro ID (AES), sistemul VITEK Biomerieux (VITEK GPI), etc.


Pag 3

Pentru detectarea şi identificarea speciilor genului Listeria se folosesc şi metode imunologice:

� imuno-analiza ELFA (Vidas Biomerieux): identificarea genului Listeria şi L. monocytogenes

� kit-ul TECRA (3M) de detectare imunologica prin microplăci pentru Listeria;

� imunofluorescen ţă cu anticorpi fluorescenţi (Difco) poli Listeria;

� Liste Test (AES) : îmbogăţire prin captură imunomagnetică şi confirmare imunoenzimatică după izolarea în placă Petri şi replicare pe membrană (numărare în 24h);

� Listeria Micro ID Listeria (Organon-Technika);

� Kit Transia utilizând microplăci (ELISA sistem "sandwich");

� Listeria Tek Elisa (Sistem Organon Technika/AES);

� Clearview Listeria test (Unipath);

� Assurance IA pentru Listeria (Biocontrol).

În tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile bacteriilor din genul Listeria.

Tabelul 1 Caracteristicile bacteriilor incluse în genul Listeria

Caracteristica

L. g

rayi

L. i

nn

ocu

a

L. i

van

ovi

i

L.

mo

no

cyto

gen

es

L. m

urr

ayi

L. s

eelig

eri

L. w

elsh

imer

i ββββ-hemoliz ă - - + + - + - Testul Camp ( S. aureus) - - - + - + - Testul Camp ( R. equi) - - + - - - - Nitrat reductaz ă - - - - + V V Amidon + - - - + N N Ramnoză - V - + V - V Xiloză - - + - - + + Manitol + - - - - - - Hipurat - + + + V V

V - Variabil

N - Nedeterminat


Pag 1

GENUL BACILLUS

Bacillus cereus

Bacteriile aparţinând genului Bacillus sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de formă cilindrică, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate în unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau terminal.

Aptitudinea de a sporula poate fi pusă în evidenţa prin testul termorezistenţei (10 min la temperatura de 80°C). Bacteriile genului Bacillus sunt catalazo+, aerobe sau anaerobe. Se clasifică în funcţie de morfologia sporului studiat prin examen microscopic sau în funcţie de mai multe criterii, care includ caracterul respirator sau fermentativ, termofilia, etc.

Dacă se ţine cont de forma şi dispunerea sporului, se disting următoarele grupe:

grupa 1: spori ovali nedeformanţi, cu perete subţire (ex. Bacillus subtilis); grupa 2: spori ovali deformanţi cu perete subţire (B. stearothermophilus şi B.

polymyxa); grupul 3: spori sferici deformanţi (B. pasteurii, B. sphaericus), grup subdivizat în 6

subgrupe.

Dacă se consideră ansamblul caracterelor, după Priest, se definesc următoarele grupe:

grupa I sau grupa B. polymyxa: specii cu spori de tip 2, metabolism facultative anaerob cu fermentaţie acidă (include B. alvei, B. circulans, B. macerans etc.);

grupa II sau grupa B. subtilis: specii cu spori de tip 1, metabolism aerob cu fermentaţie acidă;

grupa III sau grupa B. brevis: specii cu spori de tip 2, metabolism strict aerob; grupa IV sau grupa B. sphaericus: specii cu spori de tip 3; grupa V sau grupa Bacillus thermophilus: specii cu spori de tip 2 (include B.

coagulans, B. stearothermophilus).

TEHNICI DE IZOLARE

Izolarea şi numărarea bacteriilor sporulate aerobe se pot aplica fie formelor sporulate singure, fie ansamblului de forme vegetative şi sporulate, astfel încât, de multe ori se realizează doar izolarea sau numărarea.

Principiul de selecţie al formelor sporulate este bazat pe proprietăţile de termo-rezistenţă ale sporilor şi pe caracterul aerob sau aero-anaerob al celulelor vegetative.

Proba plasată într-o eprubeta este supusă unei încălziri de 10 min pe baie de apă, la o


Pag 2

temperatură de 70-80°C. Aceasta serveşte apoi la efectuarea unei serii de diluţii destinate numărării bacteriilor pe mediu cu geloză, în plăci Petri. În unele cazuri particulare tratamentul termic se poate face prin menţinere timp de 10 min la temperatura de 100°C. În acest caz, sporii supravieţuitori corespund speciilor termorezistente.

Mediul de izolare şi de numărare al bacteriilor sporulate aerobe selectate prin tratament termic nu trebuie să fie specific, deoarece, practic, sporii de bacterii din genul Bacillus, care au rezistat tratamentului termic şi pot apoi să se dezvolte în condiţii aerobe, nu mai au concurenţi. În continuare, este necesar să se utilizeze un mediu bogat, care să favorizeze germinarea sporilor. Uneori, sporii manifestă fenomenul de repaus, ceea ce generează o întârziere a dezvoltării lor. Fenomenul este limitat prin adăugarea în mediu a amidonului, compus care poseda proprietăţi de stimulare a germinării şi de detoxificare.

Pentru numărare sau izolare pe mediu solid, cel mai frecvent folosite sunt geloza glucozată conţinând BCP sau laptele gelozat, aceste două medii fiind îmbogăţite cu 0.2% amidon solubil. Geloza nutritivă obişnuită cu gălbenuş de ou permite diferenţierea speciilor lecitinazo + şi -. Termostatarea diferenţiată a mediilor permite selecţionarea următoarelor grupe de bacili: bacili mezofili (termostatare la temperatura de 30°C) şi bacili termofili (termostatare la temperatura de 55°C).

Numărarea în mediu lichid pe bulion glucozat cu BCP sau bulion TSB (bulion triptonă soia) este mai puţin specifică, fiind urmarea unui anumit grad de anaerobioză care poate să existe la baza eprubetelor.

Pentru numărarea formelor vegetative (numărare realizată pentru anumite specii) trebuie să facă apel la medii mai selective sau de diferenţiere.

! Mossel a descris un mediu de izolare pentru Bacillus cereus, care este bazat pe prezenţa manitolului, clorurii de sodiu, roşului de fenol, gălbenuşului de ou şi polimixinei. Coloniile de Bacillus cereus sunt rugoase, uscate, roz (manitol -) şi înconjurate de un halou albicios (produşi de hidroliză insolubili formaţi pornind de la lecitină). Alte medii se bazează pe un principiu asemănător (geloză manitol - gălbenuş de ou - polimixina MYP). Mediul PEMBA (polimixina - gălbenuş de ou - manitol - albastru de bromtimol - agar), mediu selectiv pentru B. cereus, poate fi şi el utilizat: B. cereus formează colonii albastre, dantelate, înconjurate de un precipitat de gălbenuş de ou. Mediul Reuter conţine piruvat, tiocianat, actidionă şi gălbenuş de ou.


Capacitatea de sporulare

Bacilii sunt caracterizaţi prin capacitatea de sporulare şi prin producere de catalază. Prezenţa sporilor poate fi pusă în evidenţă direct prin examinare microscopică a unui frotiu colorat prin metoda Gram. Aceştia se prezintă sub forma de particule endocelulare, sferice sau ovale, necolorate şi alunecoase. În toate cazurile poate fi realizată o colorare


Pag 3

specifică. Capacitatea de sporulare poate fi pusă în evidenţă şi prin testul de termorezistenţă: o cultura în vârstă de 3-10 zile, inoculată pe un bulion nutritiv obişnuit conţinând 0.004% sulfat de mangan (agent ce favorizează sporularea), este supusă timp de 10 min la încălzire pe baie de apă la temperatura de 80°C. Cultura este apoi inoculată prin înţepare pe un bulion nutritiv şi termostatată la temperatura de 30°C, timp de 2-3 zile sau mai mult. Dacă există dezvoltare microbiană, se presupune că a existat sporulare, doar câteva specii rare nesporulate sunt capabile să reziste acestor condiţii; aceasta presupunere trebuie confirmată întotdeauna printr-un examen microscopic, eventual cu o colorare specifică. Diverse alte medii favorizează sporularea: mediul Duncan şi Strong, mediul Ellner, mediul Schaeffer, mediul glucozat obţinut cu carne fiartă, mediul SEC, etc.

Pentru caracterizarea sporilor sunt utilizate mai multe colorări specifice, dintre care citam doar două:

metoda Moeller modificată - preparatul uscat este fixat în alcool. Frotiul se acoperă cu câteva picături de acid cromic 5%. După 10 min de contact şi după o spălare abundenta cu apă, lama este acoperită cu fucsina şi este încălzită uşor la flacăra unui bec Bunsen, până la evaporare. Operaţia de colorare se repetă de doua ori. Frotiul este apoi decolorat cu alcool absolut, apoi cu acid clorhidric 1/3, după care este spălat cu apă. Frotiul este apoi recolorat cu câteva picături de albastru de metilen diluat timp de 30 s. După spălare, lama este uscată şi conservată. Sporii sunt coloraţi în roşu şi corpul bacterian în albastru;

metoda Bartholomew şi Mittwer - frotiul fixat termic (20 de treceri ale lamei prin flacără) este colorat timp de 10 min cu ajutorul unei soluţii apoase, saturate, de verde malahit, apoi spălat rapid, timp de 10 min, cu apă rece. Frotiul este recolorat cu safranină 25% timp de 15 min, apoi este spălat rapid cu apă, uscat şi examinat. Sporii sunt coloraţi în verde, iar corpul bacterian în roşu. Această metodă este mai practică, dar este mai puţin sigură decât precedenta.

Caractere fiziologice

În afara de prezenţa şi morfologia sporului, identificarea se bazează pe următoarele caractere (termostatarea are loc la temperatura de 30°C timp de 24 h sau mai mult):

termorezistenta sporilor - după cultivare pe un mediu de sporulare, se compară numărul sporilor care rezistă la un tratament de 10 min la temperatura de 80°C şi la un tratament de 5 min la temperatura de 95°C. Se spune că sporii sunt termorezistenţi dacă se observă o diferenţa mai mică de două reducţii decimale (∆ Iog10N < 2); când sunt sensibile, diferenţa depăşeşte 5 (∆ log10N > 5);

tipul respirator - este studiat prin inocularea unei geloze profunde VF sau pe mediu glucozat în anaerobioză. Acest test constă în inocularea unui bulion cu extract de drojdie şi glucoza (YG) dintr-o eprubetă, după regenerare. Suprafaţa mediului se acoperă cu un strat de parafină lichidă. După termostatare se observa dezvoltarea.


Pag 4

fermentarea glucidelor - studiul fermentării glucidelor este bine să se realizeze pe un mediu gelozat pentru studiul fermentaţiilor, specific bacteriilor. Acest mediu nu conţine peptonă (mediu semisintetic). După introducerea glucidului (0.5%) în mediile fluidificate, eprubetele sunt aşezate în poziţie semi-înclinată. După solidificarea mediilor, acestea sunt inoculate prin striere şi prin înţepare în zona centrala. Utilizarea glucidelor se manifesta prin virajul culorii indicatorului. Glucidele testate sunt glucoza, arabinoza, xiloza şi eventual lactoza, manitolul, ramnoza, celobioza şi zaharoza. De asemenea, este posibil să se utilizeze bulion nutritiv adiţionat cu 0.004% roşu de fenol în care se introduce un tub Durham. Acest ultim test permite studierea acidifierii şi producerii de gaz.

acidificare pe mediul glucoza amoniu - un mediu conţinând glucoza, amoniu ca singură sursa de azot şi un indicator de pH (mediu Knigh şi Proom) este inoculat, termostatat şi examinat;

întârzierea cre şterii ca urmare a prezentei glucozei - pe mediul peptonat, prezenţa glucozei inhibă parţial creşterea anumitor specii. Două medii cu geloză nutritivă obişnuită, unul cu glucoză (1%), altul fără glucoză, se repartizează în plăci Petri, după care se inoculează prin înţepare şi se incubează. Se observă diferenţele dintre culturi;

hidroliza cazeinei - este pusă în evidenţa în mod clasic pe geloză cu lapte;

hidroliza gelatinei - se studiază printr-o metodă clasică (Frazier);

hidroliza lecitinei - este studiată în mod clasic, prin inocularea unei geloze nutritive obişnuite cu gălbenuş de ou (10%) sau pe mediu McLung. Acest mediu termostatat în anaerobioză permite diferenţierea bacteriilor Bacillus şi Clostridium prin reacţia LV legată de haloul caracteristic obţinut: tulpinile LV+ formează precipitat şi o zonă luminoasă (reacţia Nagler la lecito-vitelina);

hidroliza amidonului - este pusă în evidenţă, în mod clasic, pe geloză nutritivă obişnuită conţinând 10 g/l amidon solubil, în plăci Petri;

producerea de acetoin ă (test Voges Paskauer: VP) - este evidenţiată prin reacţia O'Meara după o perioadă de 2-10 zile de cultivare pe mediul Smith;

comportamentul fa ţa de temperatur ă, pH şi clorura de sodiu – acest studiu este realizat pe bulion nutritiv sau geloză nutritivă obişnuită. Culturile sunt testate la temperatura de 60°C, pH 6 şi la temperatura de 65°C, pH 7, în prezenţa a 10% clorură de sodiu;

alte test ări: cultivare pe lapte turnesolat; producere de indol; reducere de nitraţi; utilizarea citratului; evidenţierea ureazei.

Aceste ultime teste sunt realizate cu medii şi metode clasice.


Pag 5

GENUL CLOSTRIDIUM

Clostridium perfringes

Bacteriile aparţinând genului Clostridium sunt bacterii Gram +, mobile, cu celule de formă cilindrică cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus, singure sau în lanţuri, care formează endospori dispuşi central sau terminal, care dau celulelor formă de suveică sau paletă.

Reprezentanţii genului Clostridium sunt catalazo - şi sunt strict anaerobi. Totuşi, câteva specii rare sunt aero-tolerante.

TEHNICI DE IZOLARE

Tehnici generale

Bacteriile sporulate anaerobe sunt cultivate pe medii foarte reducătoare, cum ar fi mediul VL sau VF (lichid sau semi-solid) sau chiar pe medii lichide protejate de oxigenul din aer printr-un strat de parafină: mediu Rosenow simplu sau cisteinat, eventual adiţionat cu amidon, sau mediu RCM (Reinforced Clostridium Medium sau mediul Hirch şi Grinsted). Acest ultim mediu este folosit ca diluant pentru operaţia de numărare.

Principiul de izolare şi numărare al bacteriilor din genul Clostridium este foarte apropiat de cel indicat pentru bacteriile genului Bacillus. În afara de termorezistenţa sporilor, selecţia este bazată pe cultivarea în anaerobioza strictă (sau în mediu foarte reducător). Sunt utilizate tehnicile clasice de cultivare în anaerobioză: condiţiile de anaerobioză trebuie respectate atât pentru cultivări, cât şi pentru diluări. Temperatura de termostatare variază între 30 şi 37°C, în cazuri particulare fiind mai mare.

Pentru numărare se utilizează fie tehnica pe mediu lichid sau solid în eprubetă, folosind un mediu reducător sau protejat de parafină, fie tehnica de numărare pe mediu solid în plăci Petri, termostatate în anaerobioză. Aceasta ultima metodă este preferabilă, deoarece facilitează prelevarea coloniilor izolate pentru studiile ulterioare.

Selecţia formelor sporulate este realizata prin încălzire timp de 10 min la temperatura de 80°C. Când termorezistenţa sporilor este scăzută sau când se doreşte să se tină cont de celulele vegetative, nu este posibilă utilizarea acestei tehnici. În acest caz, va trebui să se folosească medii conţinând compuşi inhibitori specifici, permiţând astfel dezvoltarea speciilor de Clostridium (de ex. antibioticele). Sporii tuturor speciilor de Clostridium pot fi


Pag 6

izolaţi şi număraţi după încălzirea necesară realizării selecţiei, prin inoculare în mediul RCM gelozat (geloză Hirch şi Grinsted) adiţionat cu amidon şi repartizat în eprubete sau plăci Petri (în acest caz, termostatarea trebuie să aibă loc obligatoriu în mediu anaerob).

Pentru numărări în medii lichide se poate utiliza mediul Rosenow sau alte medii lichide enunţate mai sus.

Izolări specifice

Există medii de izolare relativ specifice pentru grupele de Clostridium, adaptate sporilor şi, uneori, celulelor vegetative.

Sporii de Clostridium sulfito-reductori pot fi izolaţi şi număraţi utilizând medii conţinând sulfit. Cea mai bună concentrate de sulfit pe care trebuie să o conţină mediul este de 0.05%, însa ea elimină unele specii sulfito-sensibile. Mediul Wilson Blair pentru Clostridium permite punerea în evidenţă a sulfito-reductorilor, care formează colonii negre. Metoda este aplicată după realizarea pasteurizării. După inocularea mediului fluidificat şi omogenizare prin răsturnare, eprubeta este răcita imediat, prin imersie în apă rece, şi termostatată la o temperatura de 37°C, timp de 24-48 h. Pentru aceasta numărare este posibil să se utilizeze geloză VF sulfit.

Există medii bazate pe acelaşi principiu, care sunt specifice pentru Clostridium perfringens şi care, prin compoziţia lor chimică, permit evitarea pasteurizării şi selecţionarea deodată a formelor vegetative şi a sporilor. Este vorba de mediul TSN Marshall cu neomicina şi polimixină, care este termostatat la temperatura de 46°C, mediul SPS Angelotti cu polimixină şi sulfadiazină, care este termostatat la temperatura de 37°C, sau de mediul TSC triptoză - sulfit - cicloserină, care este termostatat la temperatura de 46°C. Termostatarea se efectuează în anaerobioză (eventual, cu îmbogăţire de CO2): coloniile colorate în negru sunt colonii prezumtive de Clostridium perfringens. Se poate confirma apartenenţa la specie prin teste simple: nitrat reductazo +, lactozo+, gelatino+. Confirmarea se poate face repicând coloniile pe geloza Willis şi Hobbs cu ou, plasată într-o placă Petri, pe a cărei jumătate din suprafaţă se depun câteva picături de ser anti - Clostridium perfringens (6000 unităţi/ml). Coloniile care nu se vor dezvolta pe mediul adiţionat cu toxine sunt desigur Clostridium perfringens.


Identificarea lui Clostridium este bazată pe studiul morfologiei sporilor şi caracterelor biochimice. Termostatarea are loc obligatoriu în mediu reducător sau în anaerobioză, în general la o temperatura de 30-37°C timp de 24-48 h. Unele specii trebuie termostatate la temperaturi superioare. Nu mai precizam că aceasta cultură trebuie să aibă loc în anaerobioză, deoarece acest fapt nu mai este necesar, ca urmare a puterii reducătoare a mediului utilizat. Mediile studiate sunt inoculate pornind de la o cultură pe mediu lichid reducător, de exemplu bulion VL sau VF , conţinând cistină (sau pe mediu Rosenow).


Pag 7

Ac ţiunea pe mediu Rosenow

Acesta este un mediu lichid reducător recomandat pentru cultivarea bacteriilor anaerobe. Conţine, printre altele, peptonă, glucoză, un indicator colorat, un fragment redus de creier şi o bucăţică de marmura albă. După o regenerare de 15 min realizată pe baie de apă la fierbere şi răcire, mediul este inoculat şi acoperit cu un strat de parafină sterilă, care asigură anaerobioza. După o termostatare de 24 h sau mai mult, examinarea acestui mediu permite studierea următoarelor caracteristici:

fermentaţia glucozei se indică prin virajul indicatorului de la roz la roşu: acest viraj trebuie să fie observat la începutul cultivării. Virajul indicatorului la verde indică prezenţa bacteriilor reducătoare;

producerea de gaz se indică prin deplasarea dopului de parafină;

puterea reducătoare se manifestă prin decolorarea mediului.

Mobilitatea

Mobilitatea este observată între lamă şi lamelă, pornind de la o prelevare efectuată din mediul Rosenow. Prelevarea trebuie efectuată la formarea biomasei de celule, iar examinarea trebuie realizată rapid, deoarece contactul cu aerul inhibă rapid mobilitatea.

Morfologia sporului

Morfologia sporului este studiată prin examen microscopic pe un frotiu colorat Gram sau prin colorarea specifică a sporilor. Examenul poate fi realizat pornind de la o cultură mai veche obţinută în mediul Rosenow. Sporularea nu intervine în toate mediile. Sporii nu se formează uneori decât pe medii uşor alcaline. Unele bacterii sporulează greu în mediu artificial: este cazul lui Clostridium perfringens care trebuie cultivat pe ser din carne de cal cu 0.5% extract de came şi 0.1% sulfat de magneziu.

Hidroliza gelatinei

Hidroliza gelatinei este studiată utilizând un disc de gelatină Kohn cu cărbune, care se plasează pe mediul Rosenow. După termostatare, degradarea gelatinei este indicată de eliberarea particulelor de cărbune. Anaerobioza se obţine cu ajutorul unui strat de parafină. Se poate efectua experimentul şi într-o placa Petri, în anaerobioză, folosind geloza Columbia îmbogăţită cu albumină serică bovină.

Ac ţiunea asupra laptelui cu cistein ă

Cultivarea este realizată în eprubete cu lapte cisteinizat după regenerare. Nu este absolut necesar să se parafineze eprubetele. După termostatare, se examinează aspectul laptelui şi se remarcă următoarele: coagulare (+/-); retracţia coagulului (+/-); coagul alveolar (+/-); peptonizarea eventuală a coagulului; peptonizarea fără coagulare.


Pag 8

Studiul fermenta ţiei glucidelor

Acest studiu este realizat cu ajutorul medii lor VL, VF sau TY semisolide. Mediul este regenerat înainte de folosire şi se completează cu unul din următoarele glucide, adăugate în proporţie de 1%: maltoză, lactoză, zaharoză, manitol, xiloză, glicerol, amidon şi eventual alţi compuşi. Nu este necesară parafinarea acestui mediu reducător, cu condiţia ca el să aibă o suprafaţă de contact cu aerul extrem de redusă (eprubetă mică). După 24 h sau mai mult de termostatare la temperatura de 37°C, se introduc în mediul de cultură 10 picături dint-un indicator de pH, pentru a sesiza dacă exista aciditate sau nu. Cu indicatorul universal Prolabo, acidifierea este indicată de virajul în roşu al mediului, când cantitatea de acid este mare, sau în galben, când cantitatea produsă este mică. Este recomandat să se inoculeze şi o eprubetă fără glucid, ca martor.

Producerea indolului

Este pusă în evidenţă prin cultivarea pe mediu VL sau VF semisolid în eprubete, apoi prin caracterizare cu reactivul Kovacs sau Ehrlich. Inocularea mediului este realizată în masă, după regenerare, dar fără amestecare, astfel încât inoculul să rămână pe fundul eprubetei, sau prin înţepare centrală profundă.

Producerea hidrogenului sulfurat şi eviden ţierea caracterului sulfito-reduc ător

Producerea de H2S este pusă în evidenţă pe mediul VL (sau VF) semisolid sau solid, îmbogăţit cu 0.2 g/l sulfat feros şi cu 0.3 g/l hiposulfit de sodiu. Producerea hidrogenului sulfurat provoacă înnegrirea mediului. Se pot utiliza geloze "sulfit" sau "sulfit-fier".

Caracterul hemolitic

Caracterul hemolitic este determinat prin inocularea pe suprafaţa unui mediu solid îmbogăţit cu 10% sânge de oaie sau de cal defibrinat sau cu citrat, care este apoi termostatat, în anaerobioză, la temperatura de 37°C.

Producerea acetoinei

Acetoina este evidenţiată după cultivare pe mediu lichid VL (sau VF) prin reacţia Voges Proskauer. Pe mediul gelatina-lactoză, după 24 h de termostatare la temperatura de 37°C, prezenţa gazului, acidifierea (îngălbenirea) şi lichefierea gelatinei sunt puse în evidenţă pentru C. perfringens.

TEHNICI DE EVIDENŢIERE A TOXINELOR

Enterotoxina de Clostridium perfringens

Enterotoxina produsă de Clostridium perfringens (CPE) poate fi pusă în evidenţa prin aglutinare pasivă pe reversul particulelor de latex: PET-RPLA (Oxoid).


Pag 9

Există o metodă indirectă de detectare a enterotoxinei de Clostridium perfringens (tip A) prin titrarea α-hemolizinei (toxina α sau fosfolipază C). Aceasta toxină este stabilă la frig şi rezistentă în condiţiile în care celulele mor (congelare). Concentraţia se poate considera direct proporţională cu numărul de bacterii producătoare.

Se mojarează, timp de 2 min, 5 g de aliment în 100 ml de tampon HEPES. După centrifugare timp de 10 min la 20 000 rpm la temperatura de 5°C, supernatantul este filtrat (pori de 0.45 µrn) apoi dializat faţă de polietilenglicol 20 000. Dializatul este diluat binar în proporţie de 1/256 în clorura de sodiu 0.85%. Se realizează un martor prin amestecarea a 0.25 ml de dializat, 0.25 ml de clorură de sodiu 0.85% şi 0.1 ml antitoxina α. Hemoliza este pusă în evidenţă pe o geloză cu sânge, în care se fac decupaje de 3 mm diametru. Din fiecare eşantion se introduce o cantitate mică în decupaje şi după 24 h de termostatare la temperatura de 35°C, se examinează apoi hemoliza: martorul îmbogăţit cu antitoxina a trebuie să fie negativ. Se poate evidenţia activitatea lecitinazei pe eşantioanele rămase, adăugând un volum de gălbenuş de ou (în clorura de sodiu 0.85%). După 20 min de centrifugare la 14 000 rpm la temperatura de 5°C şi filtrarea supernatantului, activitatea lecitinazei se manifestă prin limpezirea mediului (martorul îmbogăţit cu antitoxina α dă o reacţie negativă).

Laborator Microbiologie speciala_2010-2011

Documents

Transcript of Laborator Microbiologie speciala_2010-2011