ABILITATI

23. Evidentierea acidului clorhidric si a acidului lactic in sucul gastric.

Rolul acidului clorhidric in digestie:

Pus in evidenta in mucoasa astfel:

- s-a injectat intravenous, la animal, ferocianura de potasiu si lactate de fier. Aceste substante dau reactia albastru de Prusia in prezenta acidului mineral.

- dupa injectie, mucoasa gastrica se coloreaza in albastru pe cand celulele glandulare sau in lumenul glandelor nu se observa aceasta culoare

ROL: - denaturare proteinelor si pregatirea lor pentru actiunea proteolitica a pepsinei si catepsinei- transformarea Fe3+ in Fe2+ absorbit- stimularea eliberarii de secretina in contact cu mucoasa duodenala- exercita un efect bactericid- solva colagenul - precipita cazeinogenul din lapte

Punerea in evidenta a acidului clorhidric liber:

MATERIALE NECESARE: - suc gastric- lama de sticla- bec Bunsen- reactiv Gunzburg- alcool absolut 30ml- vanilina 1g- fluoroglucina 2g

TEHNICA DE LUCRU:- o picatura de suc gastric- o picatura de rezctiv Gunzburg

Se incalzeste la flacara pana la evaporare. Se onserva aparitia unei coloratii rosii care ne indica prezenta acidului clorhidric liber in sucul gastric. Metoda are o sensibilitate la determinare de pana la 0,005% HCl.

Punerea in evidenta a acidului lactic:

Acidul lactic apare obisnuit in hipo- sau aclorhidrie, in conditii de staza si fermentatie gastrica.

Proba cu clorura de fier:

MATERIALE NECESARE:- apa distilata- solutie clorura de fier 10%- suc gastric- eprubete

1

TEHNICA DE LUCRU:

Intr-o eprubeta se pun:- 20 ml apa distilata- 2-5 picaturi solutie clorura de fier 10%

Se imparte continutul in 2 eprubete. Intr-una se adauga suc gastric filtrate. Daca proba contine acid lactic se formeaza lactatul de fier, un lichid galben verzui characteristic.

Daca nu contine acid lactic isi pastreaza culoarea ca si proba din eprubeta a doua.

Reactia Uffelmann:

MATERIALE NECESARE:- reactiv Uffelmann:

20 ml solutie acid fenic 1% + 1 picatura perclorura de fier 10% (culoare violet) sau

20 ml solutie apoasa de fenol 4% + 2 picaturi solutie clorura ferica 30% (culoare albastru-violet)

- suc gastric- eprubete

TEHNICA DE LUCRU:- se folosesc 2 eprubete:

o eprubeta 1 : contine suc gastrico eprubeta 2 : contine suc gastric si acid lactic

Se adauga in ambele eprubete reactiv Uffelmann. Continutul eprubetei 2 capata o culoare galben-verzuie.

2

24. Dozarea aciditatii sucului gastric.

PRINCIPIU: Neutralizarea acidului clorhidric cu solutie NaOH n/10 in prezenta unui indicator: indicatorul Topfer-Linossier.

PREPARARE INDICATOR:- alcool 96o – 100ml- paradimetilamidoazobenzol – 25g- fenoftaleina – 2g

Domeniul de viraj al paradimetilamidoazobenzol-ului este intre 3,1–4,4 iar al fenoftaleinei este intre 8,2-10.

MATERIALE NECESARE:-suc gastric filtrate prin tifon-solutie NaOH n/10-indicator Topfer-Linossier-biureta-pahar Berzelius-pipete gradate

TEHNICA DE LUCRU:-in paharul Berzelius se pun 10 ml suc gastric filtrat-se adauga 3-4 picaturi reactive Topfer-Linossier-daca contine acid clorhidric – culoare rosie-se titreaza cu NaOH n/10 din biureta pana solutia capata o culoare galben-portocaliu-se noteaza volumul de NaOH n/10 consumat (n1)-se continua titrarea pana la culoarea roz; are loc neutralizarea HCl combinat-se noteaza volumul de NaOH n/10 consumat (n2)

n1 = reprezinta numarul de ml de NaOH n/10 utilizati ce corespund aciditatii liberen2 = reprezinta numarul de ml de NaOH n/10 utilizati ce corespund aciditatii combinaten1+n2 = reprezinta numarul total de ml NaOH n/10 utilizati ce corespund aciditatii totale a sucului gastric

Exprimarea aciditatii libere si total se face in unitati clinice Iaworski sau in g%0.1 unitate clinica = numarul de ml de NaOH n/10 ce au neutralizat acidul liber sau total din 100 ml suc gastric (U.Cl.)

CALCUL:

HCl liber = n1 x 10U.Cl.HCl combinat = n2 x 10U.Cl.HCl total = (n1 + n2) x 10U.Cl.

VALORI NOMALE:

HCl liber = 15U.Cl.HCl combinat = 25U.Cl.HCl total = 40U.Cl.

3

25. Actiunea labfermentului.

Laptele este un aliment de baza al sugarului. Contine glucide, proteine, saruri minerale, vitamine (A, B, C, D), anticorpi si enzime.

Are densitate de 1028-1036 si pH – ul in jurul neutralitatii. Fermentul lactic transforma lactoza in acid lactic si da laptelui o reactie acida.

Termolabilitatea presurei

MATERIALE NECESARE:-eprubete-stativ-lapte-solutie labferment-baie de apa la 40oC.

TEHNICA DE LUCRU:Eprubeta 1 Eprubeta 2

Lapte 5ml 5mlSolutie labferment nefiert 2-5 picaturiSolutie labferment fiert 2-5 picaturi

Termostatare cateva minute la 40oC.

Dupa cele cateva minute de termostatare s-a constatat ca in eprubeta 1 s-a produs coagularea si in a 2a nu, deoarece presura a fost distrusa prin fierbere.

Labfermentul produce coagularea laptelui in prezenta ionilor de calciu si in absenta acidului clorhidric. Coagularea presupune transformarea cazeinogenului solubil in cazeinogen (paracaseina) care prin combinare cu ionii de calciu se transforma in cazeina solubila.

Rolul cuplului labferment – ioni de calciu in coagulare laptelui:

MATERIALE NECESARE:-eprubete-stativ-solutie labferment

-solutie oxalate de potasiu 1%0-solutie clorura de calciu 2%-baie de apa la 40oC

TEHNICA DE LUCRU:Eprubeta 1 Eprubeta 2 Eprubeta 3

Lapte 5ml 5ml 5mlOxalate de potasiu 2-3 pic 2-3 pic 2-3 picSolutie labferment 2-3 pic 2-3 pic -Solutie clorura de calciu 1ml - 1ml

Termostatare cateva minuteCoagulare Coagulare Coagulare

absenta absenta

4

26. Dozarea amilazei pancreatice.

METODA WOLGEMUTH:

MATERIALE NECESARE:-stativ-eprubete-apa distilata-urina-ser fizilogic 7%0-solutie amiloza 1%0-solutie iod N/50-termostat la 37oC

TEHNICA DE LUCRU:-avand la dispozitie 10 eprubete, urina si ser fiziologic 7%0, prin metoda dilutiilor succesive obtinem valorile indicate in tabelul de mai jos-dupa adaugarea amilozei, se pun eprubetele la termostat 30min.-se scot-se racesc la curent de apa si se adauga cate 2 picaturi solutie Iod N/50-prima eprubeta in care se produce colorarea in albastru indica dilutia de urina care nu a fost capabila sa hidrolizeze amidon adaugat-rezultatul se exprima in unitati diastazice sau unitati wolgemuth

1 UW=cantitatea de diastaza continuta intr-un mililitru de urina capabila sa hidrolizeze 1 ml solutie amidon 1%0

!!!!!DOZAREA SE FACE IN URINA-in afectiuni pancreatice se determina amilazuria si amilazemia.

Nr. eprubeta

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Urina,ml 1 1

Sol.NaCl 7%0,ml

- 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Dilutia - 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

amiloza 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Nr UW=numitorul dilutiei in care a aparut colorarea

NORMAL:16-64 UW VALORI CRESCUTE: 1000-15000 UW – pancreatita acuta

1000-3000 UW – pancreatita hemoragica

5

27.Separarea produsilor de proteoliza gastrica.

MATERIALE NECESARE:-stativ-eprubete-palnii mici-pipete-hartie de filtru-suc gastric cu produsi de digestie-solutie NaOH 4%-sulfat de amoniu saturat si cristale-solutie concentrate NaOH 30%-solutie sulfat de cupru 1% TEHNICA DE LUCRU:

Eprubeta 110ml suc gastric + sol. NaOH 4% (adaugata cu picatura)

se agitaapare o usoara tulbureala care prin repaus devine mai intense

=precipitat fin de acilalbuminese filtreaza

Eprubeta 2 Pp.de pe hartia de filtrufiltrat + vol.egal solutie saturata de sulfat de amoniu se solva cu NaOH + apa distilataapare un precipitat care se filtreaza se face reactia biuretului

(exces de NaOH + o picatura CuSO4)Culoare albastru – violet = acidalbumine

Eprubeta 3 Pp. de pe hartia de filtru se solva cu apa distilatafiltrat+sulfat amoniu cristale la saturare se face reactia biuretului. apare un precipitat care se filtreaza Culoare albastru-violet=albomoze primare

Eprubeta 4 Pp. de pe hartia de filtru se solva cu apa distilatase face proba biuretului se face proba biuretuluiCuloare roz=peptone Culoare violet-rosietic=albumoze secundare

6

28.Separarea produsilor de proteoliza intestinala.

MATERIAL NECESAR:-stativ-eprubete-pipete-solutie HCl 1%0-solutie saturate sulfat de amoniu si cristale-solutie sulfat de cupru 1%-solutie NaOH 10%

TEHNICA DE LUCRU:Eprubeta nr. 1

suc pancreatic 5-6 ml +solutie HCl 1%0 (adaugata cu picatura)

apare un precipitat prin neutralizarese filtreaza

Eprubeta nr. 2 precipitatul de pe hartia de filtru+vol egal solutie saturate se solva cu sol. NaOH 10%sulfat de amoniu si 1-2 ml apa distilata=> sol.semisat; precipitat se face proba biuretuluise filtreaza => coloratia albastru-violet =

alcalalbumine

Eprubeta nr. 3 precipitatul de pe hartia de filtru+cristale sulfat de amoniu se solva cu apa distilata=>sol. sat. ; se filtreaza se face proba biuretului

=>coloratie albastru-violetalbumonze primare

se solva precipitatul cu apa distilatase face proba biuretului => pozitivaalbumoze secundare

7

29. Evidentierea actiunii emulsionate a bilei.

Principiu : sarurile biliare scad tensiunea supeficiala de contact dintre apa si globulele de grasime formand o emulsie (rol important in digestia si absorbtia grasimilor).

Tehnica de lucru:

-eprubeta + 2ml bila + 1ml ulei-se agita-se lasa in repaus 5 min-cele 2 straturi initial miscibile, se prezinta sub forma de emulsie.

8

30. Evidentierea pigmetilor biliari.

Pigmenti biliari: bilirubina si biliverdina.

Emulsionarea lipidelor:

Principiu: sarurile biliare scad tensiunea superficiala de contact dintre apa si globulele de grasime formand o emulsie.

Epribeta + 2ml bila + 1ml uleiSe agitaSe lasa in repaus 5minute.Cele doua straturi initial miscibile, se prezinta sub forma de emulsie.

Pigmentii biliari:

1.Reactia Gmelin

Principiu: se bazeaza pe rapiditatea cu care pigmentii biliari se oxideaza si modificarile de culoare ce au loc cu aceasta ocazie.

Eprubeta + 3ml acid azotic azotos + bila prin prelingere.La nivelul de separare se observa inele suprapuse colorate in verde, rosu, galben si albastru datorita

trecerii bilirubinei in biliverdina.La oxidare completa apare un singur inel: verde.

2.Reactia Trousseau

Eprubeta + 3ml bila + tincture de iod prin prelingere.Apare un inel verde caracteristici biliverdinei.

3.Reactia cu albastru de metilen

Eprubeta + 3ml bila + 3 picatura albastru de metilen.Apare o culoare verde caracteristica biliverdinei.Daca nu avem pigmentii biliar culoarea solutiei finale va fi albastra.

9

31. Rolul hipofizei in melanogeneza.

MSH – HORMON MELANOTROP:

-rol de formare si dispersie a pigmentului melanic in melanocitele din piele si mucoase.

HIPOFIZECTOMIA LA BROASCA:

-extirparea hipofizei la batraciene, pesti si unele reptile determina retractia celulelor cromatofore (melanofore, eritrofore sau xantofore) si decolorarea pielii.-faptul se datoreste indepartarii lobului intermediar, bine dezvoltat la aceste animale, a carui produs de secretie – hormonal melanocitostimulant (MSH) / intermedina, stimuleaza secretia de melanina si dispersiunea celulelor pigmentare, insotita de intensificarea coloratiei tegumentelor.-in absenta sa, cromatoforele isi retracta treminatiile devenind punctiforme, iar animalul se decoloreaza.-s-a constatat ca nu numai MSH ci si hormonii retrohipofizari, ACTH, adrenalina, urina femeii gravide etc. produc la batraciene expandarea de diverse grade a melanoforelor; astfel s-a hotarat folosirea inei broaste hipofizectomizate ca mijloc de evidentiere si dozare a acestor substante, inclusive in diagnosticul de sarcina (Rives, 1947).

Pentru a aprecia intensitatea actiunii melanocitostimulatoare, se recurge la indicele Hogben, de dispersie in 5 stadii a celulelor melanofore in functie de gradul de expandare a terminatiilor:

1. imagine punctiforma2. terminatii scurte3. expandare a terminatiilor bifurcate4. terminatii trifurcate5. retea continua intercelulara

Expandarea celulelor cromatofore poate fi urmarita atat in vivo cat si in vitro, pe pielea izolata de broasca.

TEHNICA DE LUCRU:

Se fixeaza animalul in pozitie dorsala.Se deschide larg gura prin rasfrangerea mandibulei cu ajutorul unui departator adecvat sub forma de j.Sectiunea ant-post mediana a planseului bucal pune in evidenta osul sphenoid, prin a carui

transparenta se vad deobicei lobii anterior si posterior ai hipoofizei. Lobul intermediar fiind adherent de neurohipofiza de broasca, va fi indepartat odata cu aceasta.

Dupa dezinsertia muschilor oculo-motori de pe planul osos cu ajutorul unui termo- sau electrocauter, se incizeaza ant si lat corpul sfenoidului, creindu-se un capacel care se ridica dinainte indarat odata cu tesutul cartilaginos subiacent. In modul acesta se ajunge la hipofiza pentru a fi extirpate prin aspiratie sau smulgere cu o pensa fina.

Inchiderea plagii se realizeaza prin simpla repunere a capacelului osteo-cartilaginos in pozitie initiala, urmata de apropierea buzelo mucoasei bucale.

Eficacitatea interventiei va fi controlata in orele urmatoare la nivelul pielii, decolorate in cazul extirparii complete.

Pentru stabilirea indicelui Hogben se va recurge la membrane interdigitala.

10

32.Dozarea radioimunologica a hormonilor hipofizari.

METODA RADIOIMUNOLOGICA:

-permite decelarea unor cantitati foarte mici de hormone in plasma, de ordinal pg/ml.

PRINCIPIU METODEI: -consta intr-o inhibitie competitive de cate anticorpul specific a hormonului nemarcat fata de cel marcat.

Radioactivitate hormonului marcat (legat de Ac specific), observata in precipitatul obtinut dupa centrifugare este mai mare daca in serul dozat se afla o cantitate redusa a aceluiasi hormon nemarcat.

Se traseaza o curba standard, pe care se poate calcula cantitatea de hormon din serul de dozat.

RADIOIMUNODOZAREA (RIA)

-aceasta metoda se bazeaza pe competitia dintre hormonul de dozat (nemarcat) si hormonul marcat radioactiv in reactie cu Ac specific;-un hormon marcat(iod 131 radioactiv) se comporta ca un antigen si det aparitia de Ac antihormonali =>vor reactiona cu Ag specific;-ulterior se va doza fractia care nu a reactionat datorita intrarii in reactie de tip competitiv a hormonului endogen nemarcat. Aceasta dozare va permite ulterior stabilirea unui raport final intre hormonul marcat+Ac  si hormon nemarcat liber.

11

33. Actiunea oxitocinei asupra muschiului neted.

Oxitocina are efect asupra uterului si galndei mamare. Stimularea musculaturii uterine apare evident in vivo, cat si in vitro si variaza in functie de specie si

starea functionala a muschiului. Slab in afara gestatiei, raspunsul contractile creste progresiv in timpul sarcinii, devenind maxim la termen, datorita impregnarii cu estrogeni si mai ales cu progesterone. Modificand potentialul de membrane al fibrei uterine, oxitocina mareste sensibilitatea uterului gravid la stimuli intrinseci. Ca urmare a cresterii excitabilitatii, automatismul muschiului uterin si propagarea undei de excitatie apar stimulate.

In timpul sarcinii, oxitocina avand perioada de injumatatire scurta (3 min), este inactivata rapid de o oxitocinaza plasmatica. Odata cu ajungerea sarcinii la termen, activitatea oxitocinazei se prabuseste, permitand oxitocinei sa actioneze maximal asupra muschiului uterin gravid.

12