Inginerie Genetica.doc

5/26/2018 Inginerie Genetica.doc

1/10

INGINERIA GENIC

Ingineria genic poate fi definit drept ansamblu de metode i tehnici prin care esteposibil manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular pentru a obine peci netradiionale produi utili omului i genotipuri noi, avnd la baz tehnologia

moleculelor recombinate (hibride) de AD!

Ingineria genic se profileaz ca direcie tiinific i tehnologic "n anii #$%! Apariia ei afost determinat, "n primul rnd, de aprofundarea cunotinelor de genetic la nivelcelular i molecular, de dezvoltarea cunotinelor privind materialul genetic alorganismelor vii, i anume&

descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informaiei ereditare&transformaia (A.Avery, C.MacLeod, M.MacCarty, ') * prin intermediulfragmentelor de AD+ seducia (J.Lederberg, E.Tatum, '-) * princon.ugarea bacteriilor i transducia (J.Lederberg, '/0) * cu a.utorul fagilor+

descoperirea structurii moleculei de AD (J.Watson, .Cr!c", '/1)+ descoperirea i izolarea enzimelor de restricie i legare a fragmentelor de AD(#.$m!t%, '$%)+

descoperirea fenomenului transcripiei inverse a informaiei genetice de la A2 laAD (#.Tem!n, $.M!&utan!, '.(a)t!mor, '$%)+

descoperirea sintezei chimice a genelor (A.*ornberg, '-$+ #.*%orana, '$%,'$-)!

+. (AELE TE#NIC-MATERIALEALE INGINERIEI GENICE

Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea structurii deprofunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei AD3uluirecombinat i la transferul de gene peste barierele de specie!

4ehnica recombinrii genetice n vitroinclude trei etape principale&

'! etragerea sau sinteza chimic a AD3ului din diferite specii+0! construirea unei molecule hibride (recombinate) de AD+1! reintroducerea moleculei recombinate de AD "ntr3o celul vie pentru

reproducerea i epresia ei (fig! ')!


2/10

Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice.

5tragerea AD3ului se produce utilizndu3se o serie de enzime specifice, "n primulrnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de AD "n anumite locuri! 5nzima derestricie etras dinEscherichia coli5co 2I recunoate urmtoarea secven denucleotide&

6 AA447

744AA 6!

2estrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitateaunic de a tia molecula de AD "n anumite sectoare (loci)! 8rima restrictaz a fostobinut din bacteriileHaemophillusinfluenzaeserotipul i se folosea pentrufragmentarea AD3ului virusului 9:3% i cartarea lui (*e))y, $m!t%, '$%)!

u toate restrictazele se utilizeaz "n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoareleproprieti&

pot tia molecula de AD "n fragmente discrete+ posed o specificitate de aciune "nalt (taie molecula de AD "ntr3o anumit

succesivitate 3 ;site


3/10

multiplicarea rapid "n celula3gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare "ncelulele altor organisme+

prezena unui numr restrns de situri de recogniie+ prezena genelor mar>er pentru selectarea de clone dup moleculele recombinate

de AD+

izolarea relativ uoar, clonarea i epresia "n celulele (organismele) strine!

?n calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit!

8lasmidele reprezint nite molecule inelare de AD specifice bacteriilor! 5le pot eistaautonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi& capacitatea de con.ugare,rezistena la antibiotice, agresivitatea!

8lasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns deregiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie! ?n acest caz, se poate realiza rupereai apoi inseria de AD eogen "n plasmid!

8rimul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat p97'%', realizat de $.Co%en('$1)!


4/10

Fig.2. Obinerea moleculelor recombinate de A!"

A# $ metoda ligazic%& '# $ metoda terminal%.

7a vector plasmidic, la plante se folosete plasmidul 4i (4umour inducing) de la bacteriaAgrobacterium tumefaciens, care condiioneaz formarea tumorilor pe tulpinile anumeroase specii de plante dicotiledonate!

A doua tehnic de introducere a unei gene "ntr3o bacterie folosete ca vector unbacteriofag (fagul leambda 3 ), al crui genom ('%3/% gene) integreaz gena strin! 5ase va sintetiza "ntocmai ca i celelalte gene ale virusului, dac acesta din urm se vareplica "n celula bacterian!

8entru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusultumoral 9:3% i virusul papiloma bovin (@8:)! 9e crede c vectorii virali vor putea fiutilizai i la plante!


5/10

n tip particular de vectori reprezint liposomii, picturi foarte mici de lipide produseartificial, "n care pot fi incluse gene, precum i diferite medicamente, enzime etc!

6enomul mitocondriilor i cloroplastelor este similar celui bacterian i, ca urmare, secrede c el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote!

7elulelor utilizate "n eperimentele ingineriei genice le sunt "naintate o serie de cerinecare au menirea de a asigura securitatea investigaiilor tiinifice! 7onform B2egulilordespre molecule recombinate de ADB celulele3gazd trebuie s satisfac urmtoarelecerine&

capacitatea sporit de implicare "n investigaiile tiinifice+ incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare "n afara laboratorului+ capacitatea lizrii AD3ului su "n afara laboratorului+ imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme+ imposibilitaea polurii mediului "ncon.urtor "n rezultatul transformrii iCsau

transfeciei!

?n prezent, de rnd cuE. coli, "n calitate de obiecte de studiu (celule gazd), se utilizeazbacilul fnului ('acillus subtilis), celulele de dro.dii, culturile de celule i esuturivegetale i animale, culturile de protoplati!

Dup obinerea moleculelor recombinate de AD, ele trebuie transferate "n celulele(organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea itransmiterea informaiei ereditare)!

De menionat c, "n cazul operrii cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor

superioare, de regul, nu se manifest "n celulele procariote, iar genele eucariotelorinferioare se manifest doar parial! Iat de ce, "n aceste eperimente se acord odeosebit atenie direciei transferului de informaie ereditar a moleculelor recombinate,adic& de la celula procariot "n celulele pro3 sau eucariote i invers, de la celula eucariot"n eu3 sau procariote!

oleculele recombinate ale procariotelor funcioneaz uor "n celulele procariote ("ncalitate de repliconi)!

9unt descrise i cazuri de funcionare a genelor procariotelor "n celulele eucariotelor!

*.Merr!)i colab!('$'), In.#orsi colab!('$/) au demonstrat posibilitateatransferului genei 3galactozidazei dinE. coli"n fibroblastele umane ale unui bolnav degalactozimie cu a.utorul fagului (galactozimia este o boal autozomial recesiv ceprovoac dereglarea metabolismului ca rezultat al lipsei enzimei '3D3galactozo3'3fosfaturidiltransferazei)!

5presia genelor eucariotelor "n celulele procariote, de asemenea, este posibil! 'ev!s('$-) a transferat gena histidinei dro.diilor "nE. colicu a.utorul fagilor! Astzi se obin


6/10

pe scar larg produse ale organismelor eucariote "n baza bacteriilor (hormoni, interferonietc!)!

Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde "n celula(organismul) gazd, este prote.at pe diferite ci&

metilarea AD3ului (virusurile)+ transferul moleculei liniare de AD "n form circular (fagul )+ blocarea sistemului de restricii al celulei3gazd (fagul 41)+ aciunea restrictazelor!

?n acelai timp, celula3gazd "i prote.eaz informaia ereditar prin diferite mecanisme&

aciunea restrictazelor specifice+ metilarea AD+ aciunea vecintii epigenetice+

aciunea nespecific a nucleazelor celulare+ protecia mecanic prin membranele celulare+ aciunea proteinelor histonice i nehistonice+ aciunea interferonului!

/. REALIRILE INGINERIEI GENICE.

Datorit cercetrilor "n tehnologia AD3ului recombinat, au fost elaborate metode detransfer de gene "n celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile! Astfel, adevenit posibil producerea i chiar comercializarea pe scar larg a unor hormoni(insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare

etc!

a0 -b1!nerea !nsu)!ne! umane 2! a a)tor %ormon!.

Din -% de milioane de diabetici, circa milioane necesit un tratament cu insulin!

?n ''-, E.$%ar3y$c%a4era descoperit c insulina este secretat de celule carealctuiesc insulele =angherhans din pancreas, ceea ce l3a determinat s numeaschormonul insulin! ?n '0', .(ant!ngi #.(est, la 4oronto, au izolat din pancreasul decine hormonul insulin, demonstrnd aciunea lui antidiabetic! ?n '01, firmafarmaceutic american ;5li =illE< pune de.a "n vnzare prima insulin animal ("n

prezent, pentru a obine circa '%% grame de insulin, este nevoie de F%% >g de pancreasde bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 0%%30/% grame))!

Insulina uman este alctuit din dou catene polipeptidice A i @, compuse respectiv din0' i 1% de aminoacizi, a cror secven a fost stabilit "n '// de .$anger!


7/10

?n perioada '-13'-/, trei grupe de cercettori (americani, germani i chinezi) au reuitsinteza artificial a insulinei prin intermediul a '$% de reacii chimice, lucru ce fceaimposibil producerea insulinei pe cale industrial!

oile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost posibile odat cu

etragerea genei insulinei (W.G!))berti colaboratorii si, 'F%) i crearea moleculelorrecombinate de AD "n baza plasmidelor (fig!1)!

Fig. (. )chema obinerii insulinei umane.

oleculele recombinate de AD sunt transferate "n colibacili (Escherichia coli), undeare loc realizarea informaiei genetice codificate "n molecula de AD! 8aralel cuproteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i insulina! 8entru a prote.a insulina uman(ea nu este proprie colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), "n molecula

recombinat de AD se "ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o gen reglatoare carecodific o protein specific colibacililor (de eemplu galactozidaza)! 7a rezultat almanifestrii informaiei genetice a moleculei recombinate de AD, se obine o catenpolipeptidic hibrid, din care mai apoi se separ insulina!

Datorit utilizrii tehnologiei AD3ului recombinat, se obin aproimativ 0%% grame deinsulin de pe ' m1de mediu de cultur, adic tot atta ct se poate etrage din aproape'-%% >g de pancreas de bou sau porc!


8/10

8robele clinice efectuate cu insulina uman, produs prin tehnici de inginerie genic, audemonstrat c ea nu are efecte secundare i c poate fi comercializat, adic folosit latratarea bolnavilor de diabet (din 'F0 "n 9A, din 'F1 "n area @ritanie)!

n hormon de mare importan biologic este hormonul de cretere sau somatotropina

(G6G * Guman 6roHth Gormone), secretat de lobul anterior al hipofizei! oleculahormonului cuprinde '' de aminoacizi! Absena lui provoac nanismul hipofizar, ce areo frecven de $3'%% per milion de persoane! 4ratamentul cu acest hormon se realizeaz"ncepnd cu vrsta de 3/ ani i pn la puberitate, "n doze de minimum - mg pesptmn per persoan! 9omatrotopina este un hormon cu o specificaie "nalt i nupoate fi utilizat de la animale! Din hipofiza unui cadavru se etrag doar 3- mg dehormon, heterogen i impurificat! Iat de ce, producerea acestui hormon prin tehnici deinginerie genic prezint un interes deosebit!

9inteza acestui hormon pe cale artificial s3a "nceput cu producerea de ADc (AD3ulcopie) cu a.utorul revers3transcriptazei, avnd ca matrice A2m din hipofize

(transcripie invers)! Acesta a fost clonat, apoi tiat cu enzime de restricie pentruobinerea secvenei nucleotidice corespunztoare somatotropinei, cu ecepiafragmentului ce determin primii 01 de aminoacizi! ragmentul "n cauz era clonatseparat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele dou segmente unite, la ele seadug segmente reglatoare i pe baza plasmidelor se obine plasmidiul recombinat cugena G6G (a somatotropinei)! 7olibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizausomatotropina (la ' litru de mediu de cultur se obine 0,%30,/ mg somatotropin)!

?n prezent, cu a.utorul bacteriilor recombinate sunt obinui i ali hormoni, de eemplu,thimopoietina ce conine de aminoacizi i este secretat de timus!

?n ce privete hormonii cu molecule mai mici (sub 0% de aminoacizi), este preferabilsinteza lor pe cale chimic!

b0 -b1!nerea !nter4eron!)or!

Interferonii sunt produi de celule specializate pentru lupta "mpotriva infeciilor virale! 5iau fost descoperii "n '/$ de .Isaacsi I.L!ndenmannla Institutul aional de7ercetri edicale de lng =ondra! Interferonii reprezint nite substane proteice (din'-3'-- de aminoacizi) i sunt produi "n cantiti infime de celula animal sau uman,cnd un virus ptrunde "n organism!

5ist mai multe tipuri de interferoni& interferonul leucocitar (), interferonulfibroblastelor () i interferonul limfocitelor 4 sau interferonul imun ()!

5i pot fi obinui prin tehnici clasice (din celulele sanguine i din fibroblaste) i printehnici de recombinare genic!

8entru a obine interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acesteasunt infectate cu un virus, iar dup 0 de ore prin centrifugare i purificare se izoleaz din


9/10

mediul de cultur! Dintr3un litru de snge se poate etrage pn la ' m>g ('%31 grame) deinterferon!

?n 'F%, savanii americani W.G!)berti C.We!ssmanni .aponezul T.Tan!gu"!auprodus interferonul uman cu a.utorul unor colibacili cu genomul modificat!

7elulele deE. colinu pot transforma predecesorul interferonului "n interferon activ, deaceea, iniial, compleul de AD, format dintr3o regiune nucleotidic reglatoare i oregiune ce determin structura interferonului, este supus aciunii enzimelor de restricie,care taie molecula de AD aproimativ la frontiera acestor dou catene (geneiinterferonului nu3i a.unge un triplet A46)! 7odonul omis (A46) este aneat prin sintezchimic!

6ena interferonului se "ncadreaz "n continuare "ntr3un plasmid, care se transfer "nE.coli! Astfel, colibacilii sintetizeaz interferonul uman! Dintr3un litru de suspensie deE.coli(circa '%''celule) se pot etrage pn la / mg de interferon (adic de /%%% de ori mai

mult dect din ' litru de snge)!

4ehnicile de inginerie genic permit obinerea preparatelor hibride de interferon cu unspectru larg de aciune!

c0 Trans4eru) de gene 5n ce)u)e)e vegeta)e 2! an!ma)e.

4ehnicile de recombinare genetic permit transferul genelor importante "n celulele deplante i animale, iar "n rezultat se obin plante i animale transgenice! 8entru transferulde gene la plante sunt utilizate bacteriileAgrobacterium tumerfaciens(descoperite "n'%$ de E.$m!t%i C.To6nsend), care provoac formarea unor tumori cancerogene

(croHn gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 1 de familii de dicotiledonate)!

8lasmidul 4i (tumor inducing) descoperit laA.tumefacienscauzeaz tumori la plante printransferul unui segment de AD (AD34) din plasmid "n celulele vegetale!

9trategia pentru transferul genelor cu a.utorul plasmidului 4i "n celula vegetal include&

introducerea segmentului de AD34 "ntr3un plasmid deE. coli+ introducerea "n plasmidul format a genei necesare i a genei mar>er (gena pentru

rezisten la canamicin)+ introducerea plasmidului recombinat "nAgrobacterium tumerfaciens+

infecia cuA.tumerfaciensa plantelor respective+ selectarea plantelor transformate (fig!)!

8entru realizarea transferului de gene "n celula vegetal este utilizat metoda culturilor decelule i esuturi "n vitro!

irma american ;onsanto< comercializeaz de.a plante transgenice (transformate) decartof, rezistente la gndacul de 7olorado!


10/10

J realizare remarcabil "n domeniul transferului de gene "n celula animal o constituieoarecii transgenici! 6ena hormonului de cretere de la obolan a fost transferat prinmicroin.ecii "n cele dou nuclee ale ovulului proaspt fecundat de la oarece ("n fiecarenucleu cte circa -%% copii ale genei hormonului de cretere)!

Jvulele fecundate ('$%) au fost implantate "n oviductul unei femele3receptor! ?nconsecin, s3au obinut 0' de oricei! =a - dintre ei s3a constatat o cantitate mrit ahormonului de cretere (de '%% * F%% de ori)! Aceti oricei aveau o cretere mult mairapid i prezentau greuti corporale superioare animalelor3martor!

Fig.*. +ransferul de gene cu a,utorul plasmidului +i n celula vegetal%.

Inginerie Genetica.doc

Documents

Transcript of Inginerie Genetica.doc