DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

Diagnosticul virusologic consta in:Recoltarea si prelucrarea produselor patologice ;Examinarea directa a virionilor la microscopul electronic ;Izolarea virala ;Identificarea antigenelor virale specifice ;Identificarea secventelor genomice specifice ;Confirmarea serologica .

1.Recoltarea si prelucrarea produselor patologiceProdusele patologice variaza in functie de patogenia infectiei virale:in cazul afectiunilor cailor respiratorii superioare:secretii nazale,tampon faringian,spalatura nazo-faringiana (v.gripale,paragripale,adenovirusuri,enterovirusuri);afectiuni ale cailor respiratorii inferioare:sputa,aspirat bronsic ;afectiuni eruptive:lichid vezicular,tampon faringian,fecale,sange (v.variolic,herpetic,enterovirusuri,rujeolic,rubeolic);afectiuni ale sistemului nervos central:LCR,sange ,fecale,tampon faringian,saliva (enterovirusuri,v.herpetic,v. rabic) ;hepatite :sange,materii fecale.

Transportul produselor la laborator se face la temperatura joasa,in recipiente cu gheata sau cu zapada carbonica.In laborator,produsele se amesteca cu mediile de conservare ce contin ioni minerali,vitamine,aminoacizi,indicatori de ph.In final,produsele se centrifugheaza timp de 30 de minute la 5000 rot./min.,pastrandu-se supernatantul=produs prelucrat

2.Examinarea directa a virionilorcu ajutorul microscopului optic nu se pot vizualiza decat virionii din familia Poxviridae ;

imunoelectronomicroscopia aduce insa informatii importante-se folosesc anticorpi marcati cu substante electronoopace care recunosc specific celulele infectate ;

3.Izolarea viralaIzolarea se face pe sisteme celulare vii(culturi celulare,ou embrionat de gaina,animale de laborator),urmarindu-se efectele virus-specifice1.CULTURILE CELULARE-reprezinta substrate de celule eucariote intretinute in vitro in conditii adecvate de nutritie,temperatura,ph.

Culturile celulare-in functie de tesutul sursa,culturile celulare se impart in:

culturi primare provenite din tesuturi de animale adulte normale ;culturi diploide ,tesutul de origine fiind embrionul sau fatul uman ; linii celulare continue sau tumorale,tesutul de origine fiind o tumora.

Efectele virus specifice sunt :efectul citopatic-reprezentat de modificarile morfologice celulare consecutive multiplicarii virusurilor citopatogene ;efectul hemaglutinant-particulele de virus eliberate in mediul culturii celulare ,se absorb pe suprafata eritrocitelor ,determinand aglutinarea lor ;

efectul hemadsorbant-consta in atasarea hematiilor pe suprafata virusurilor care nu-si manifesta efectul citopatogen ;efectul transformant-apar fenomene de cancerizare in vitro ;incluziile virale-evidentiate prin coloratii speciale sau prin metode moderne(imunofluorescenta) .

Inocularea2.Oua embrionate-inocularea se face intraamniotic si intraalantoidian .

3.Animale de laborator-inocularea se face subcutanat(soarecii nou-nascuti),intracerebral(soarecii adulti),intranazal(dihori sau soareci),intraperitoneal .

4.Identificarea antigenelor specificeReactia de imunofluorescenta-se bazeaza pe proprietatea fluorocromilor de a se lega de imunoglobuline,fara a le modifica proprietatile imunologice,iar legarea lor de un antigen corespunzator confera complexului Ag-Ac fluorescenta ;Reactia de inhibare a hemaglutinarii-in prezenta serului imun specific de tip,efectul hemaglutinant al virusului nu se mai produce ;

ELISA-se bazeaza pe reactia imuna Ag-Ac in care elementul cunoscut(Ac specifici) este fixat pe un suport solid de polistiren iar unul dintre elementele reactiei numit conjugat este cuplat cu o enzima (peroxidaza) ;Radioimunanaliza-consta intr-o reactie de competitie intre doua antigene pentru acelasi anticorp .

5.Identificarea secventelor genomice specificeTehnica Southern-blot compara fragmentele ADN rezultate dint-o secventa lunga,clivata cu enzime de restrictie (endonucleaze care scindeaza dublul helix) ;Tehnica Spot hybridization poate determina si prezenta unei secvente genomice virale specifice in situ,in probe recoltate direct din organismul infectat ;

PCR sau tehnica de amplificare genica-a revolutionat detectia patogenilor bacterieni,virali,fungici ; in reactii in lant,catalizate de polimeraza ADN,se amplifica exponential o secventa tinta din acidul nucleic care urmeaza a fi detectat .

6.CONFIRMAREA SEROLOGICAIn cadrul diagnosticului serologic se pun in evidenta Ac din serul de testat in prezenta Ag viral standard ;Reactiile Ag-Ac utilizate sunt :a) reactia de seroneutralizare-consta in incubarea amestecurilor dintre dilutii binare din serul de testat si antigenul viral standard si apoi inocularea la gazda sensibila ; reactia pozitiva consta in absenta efectului virus specifica asupra gazdei ;

b) reactia de fixare a complementului - indica prezenta sau absenta Ac fixatori de complement (calitativa) sau stabileste titrul Ac in serul de cercetat si cresterea lor in dinamica (cantitativa);

c)reactia de hemaglutinare pasiva-prezenta Ac (specifici Ag) in serul de cercetat este urmata de formarea unor retele,cu prinderea hematiilor si aparitia aspectului de hemaglutinare.