DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

16
DIAGNOSTICUL DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC VIRUSOLOGIC

description

diagnostic virusologic

Transcript of DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

DIAGNOSTICUL DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGICVIRUSOLOGIC

Diagnosticul virusologic consta in:Diagnosticul virusologic consta in:

1.1. Recoltarea si prelucrarea produselor Recoltarea si prelucrarea produselor patologice ;patologice ;

2.2. Examinarea directa a virionilor la Examinarea directa a virionilor la microscopul electronic ;microscopul electronic ;

3.3. Izolarea virala ;Izolarea virala ;

4.4. Identificarea antigenelor virale specifice ;Identificarea antigenelor virale specifice ;

5.5. Identificarea secventelor genomice Identificarea secventelor genomice specifice ;specifice ;

6.6. Confirmarea serologica .Confirmarea serologica .

1.Recoltarea si prelucrarea 1.Recoltarea si prelucrarea produselor patologiceproduselor patologice

Produsele patologice variaza in functie de patogenia Produsele patologice variaza in functie de patogenia infectiei virale:infectiei virale:in cazul afectiunilor cailor respiratorii superioare:secretii in cazul afectiunilor cailor respiratorii superioare:secretii nazale,tampon faringian,spalatura nazo-faringiana nazale,tampon faringian,spalatura nazo-faringiana (v.gripale,paragripale,adenovirusuri,enterovirusuri);(v.gripale,paragripale,adenovirusuri,enterovirusuri);afectiuni ale cailor respiratorii inferioare:sputa,aspirat afectiuni ale cailor respiratorii inferioare:sputa,aspirat bronsic ;bronsic ;afectiuni eruptive:lichid vezicular,tampon afectiuni eruptive:lichid vezicular,tampon faringian,fecale,sange faringian,fecale,sange (v.variolic,herpetic,enterovirusuri,rujeolic,rubeolic);(v.variolic,herpetic,enterovirusuri,rujeolic,rubeolic);afectiuni ale sistemului nervos afectiuni ale sistemului nervos central:LCR,sange ,fecale,tampon faringian,saliva central:LCR,sange ,fecale,tampon faringian,saliva (enterovirusuri,v.herpetic,v. rabic) ;(enterovirusuri,v.herpetic,v. rabic) ;hepatite :sange,materii fecale.hepatite :sange,materii fecale.

Transportul produselor la laborator se face Transportul produselor la laborator se face la temperatura joasa,in recipiente cu la temperatura joasa,in recipiente cu gheata sau cu zapada carbonica.gheata sau cu zapada carbonica.

In laborator,produsele se amesteca cu In laborator,produsele se amesteca cu mediile de conservare ce contin ioni mediile de conservare ce contin ioni minerali,vitamine,aminoacizi,indicatori de minerali,vitamine,aminoacizi,indicatori de ph.ph.

In final,produsele se centrifugheaza timp de In final,produsele se centrifugheaza timp de 30 de minute la 5000 rot./min.,pastrandu-30 de minute la 5000 rot./min.,pastrandu-se supernatantul=“produs prelucrat”se supernatantul=“produs prelucrat”

2.Examinarea directa a virionilor2.Examinarea directa a virionilor

cu ajutorul microscopului optic nu se pot cu ajutorul microscopului optic nu se pot vizualiza decat virionii din familia vizualiza decat virionii din familia Poxviridae ;Poxviridae ;

imunoelectronomicroscopia aduce insa imunoelectronomicroscopia aduce insa informatii importante-se folosesc anticorpi informatii importante-se folosesc anticorpi marcati cu substante electronoopace care marcati cu substante electronoopace care recunosc specific celulele infectate ;recunosc specific celulele infectate ;

3.Izolarea virala3.Izolarea virala

Izolarea se face pe sisteme celulare vii(culturi Izolarea se face pe sisteme celulare vii(culturi celulare,ou embrionat de gaina,animale de celulare,ou embrionat de gaina,animale de laborator),urmarindu-se efectele virus-specificelaborator),urmarindu-se efectele virus-specifice

1.CULTURILE CELULARE-reprezinta substrate de 1.CULTURILE CELULARE-reprezinta substrate de celule eucariote intretinute in vitro in conditii celule eucariote intretinute in vitro in conditii adecvate de nutritie,temperatura,ph.adecvate de nutritie,temperatura,ph.

Culturile celulareCulturile celulare

-in functie de tesutul sursa,culturile celulare se -in functie de tesutul sursa,culturile celulare se impart in:impart in:

culturi primare provenite din tesuturi de animale culturi primare provenite din tesuturi de animale adulte normale ;adulte normale ;culturi diploide ,tesutul de origine fiind embrionul culturi diploide ,tesutul de origine fiind embrionul sau fatul uman ;sau fatul uman ; linii celulare continue sau tumorale,tesutul de linii celulare continue sau tumorale,tesutul de origine fiind o tumora.origine fiind o tumora.

Efectele virus –specifice sunt :Efectele virus –specifice sunt :

efectul citopatic-reprezentat de efectul citopatic-reprezentat de modificarile morfologice celulare modificarile morfologice celulare consecutive multiplicarii virusurilor consecutive multiplicarii virusurilor citopatogene ;citopatogene ;

efectul hemaglutinant-particulele de virus efectul hemaglutinant-particulele de virus eliberate in mediul culturii celulare ,se eliberate in mediul culturii celulare ,se absorb pe suprafata absorb pe suprafata eritrocitelor ,determinand aglutinarea lor ;eritrocitelor ,determinand aglutinarea lor ;

efectul hemadsorbant-consta in atasarea efectul hemadsorbant-consta in atasarea hematiilor pe suprafata virusurilor care nu-hematiilor pe suprafata virusurilor care nu-si manifesta efectul citopatogen ;si manifesta efectul citopatogen ;

efectul transformant-apar fenomene de efectul transformant-apar fenomene de cancerizare in vitro ;cancerizare in vitro ;

incluziile virale-evidentiate prin coloratii incluziile virale-evidentiate prin coloratii speciale sau prin metode speciale sau prin metode moderne(imunofluorescenta) .moderne(imunofluorescenta) .

InoculareaInocularea

2.Oua embrionate-inocularea se face 2.Oua embrionate-inocularea se face intraamniotic si intraalantoidian .intraamniotic si intraalantoidian .

3.Animale de laborator-inocularea se face 3.Animale de laborator-inocularea se face subcutanat(soarecii nou-subcutanat(soarecii nou-nascuti),intracerebral(soarecii nascuti),intracerebral(soarecii adulti),intranazal(dihori sau adulti),intranazal(dihori sau soareci),intraperitoneal .soareci),intraperitoneal .

4.Identificarea antigenelor specifice4.Identificarea antigenelor specifice

Reactia de imunofluorescenta-se bazeaza pe Reactia de imunofluorescenta-se bazeaza pe proprietatea fluorocromilor de a se lega de proprietatea fluorocromilor de a se lega de imunoglobuline,fara a le modifica proprietatile imunoglobuline,fara a le modifica proprietatile imunologice,iar legarea lor de un antigen imunologice,iar legarea lor de un antigen corespunzator confera complexului Ag-Ac corespunzator confera complexului Ag-Ac fluorescenta ;fluorescenta ;

Reactia de inhibare a hemaglutinarii-in prezenta Reactia de inhibare a hemaglutinarii-in prezenta serului imun specific de tip,efectul hemaglutinant serului imun specific de tip,efectul hemaglutinant al virusului nu se mai produce ;al virusului nu se mai produce ;

ELISA-se bazeaza pe reactia imuna Ag-Ac ELISA-se bazeaza pe reactia imuna Ag-Ac in care elementul cunoscut(Ac specifici) in care elementul cunoscut(Ac specifici) este fixat pe un suport solid de polistiren este fixat pe un suport solid de polistiren iar unul dintre elementele reactiei numit iar unul dintre elementele reactiei numit conjugat este cuplat cu o enzima conjugat este cuplat cu o enzima (peroxidaza) ;(peroxidaza) ;Radioimunanaliza-consta intr-o reactie de Radioimunanaliza-consta intr-o reactie de competitie intre doua antigene pentru competitie intre doua antigene pentru acelasi anticorp .acelasi anticorp .

5.Identificarea secventelor 5.Identificarea secventelor genomice specificegenomice specifice

Tehnica Southern-blot compara Tehnica Southern-blot compara fragmentele AND rezultate dint-o secventa fragmentele AND rezultate dint-o secventa lunga,clivata cu enzime de restrictie lunga,clivata cu enzime de restrictie (endonucleaze care scindeaza dublul (endonucleaze care scindeaza dublul helix) ;helix) ;Tehnica Spot hybridization poate Tehnica Spot hybridization poate determina si prezenta unei secvente determina si prezenta unei secvente genomice virale specifice in situ,in probe genomice virale specifice in situ,in probe recoltate direct din organismul infectat ;recoltate direct din organismul infectat ;

PCR sau tehnica de amplificare genica-a PCR sau tehnica de amplificare genica-a revolutionat detectia patogenilor revolutionat detectia patogenilor bacterieni,virali,fungici ; in reactii in bacterieni,virali,fungici ; in reactii in lant,catalizate de polimeraza ADN,se lant,catalizate de polimeraza ADN,se amplifica exponential o secventa “tinta” din amplifica exponential o secventa “tinta” din acidul nucleic care urmeaza a fi detectat .acidul nucleic care urmeaza a fi detectat .

6.CONFIRMAREA SEROLOGICA6.CONFIRMAREA SEROLOGICA

In cadrul diagnosticului serologic se pun in In cadrul diagnosticului serologic se pun in evidenta Ac din serul de testat in prezenta Ag evidenta Ac din serul de testat in prezenta Ag viral standard ;viral standard ;Reactiile Ag-Ac utilizate sunt :Reactiile Ag-Ac utilizate sunt :

a) reactia de seroneutralizare-consta in incubarea a) reactia de seroneutralizare-consta in incubarea amestecurilor dintre dilutii binare din serul de amestecurilor dintre dilutii binare din serul de testat si antigenul viral standard si apoi testat si antigenul viral standard si apoi inocularea la gazda sensibila ; reactia pozitiva inocularea la gazda sensibila ; reactia pozitiva consta in absenta efectului virus specifica consta in absenta efectului virus specifica asupra gazdei ;asupra gazdei ;

b) reactia de fixare a complementului - b) reactia de fixare a complementului - indica prezenta sau absenta Ac fixatori de indica prezenta sau absenta Ac fixatori de complement (calitativa) sau stabileste titrul complement (calitativa) sau stabileste titrul Ac in serul de cercetat si cresterea lor in Ac in serul de cercetat si cresterea lor in

dinamica (cantitativa);dinamica (cantitativa);

c)reactia de hemaglutinare pasiva-prezenta c)reactia de hemaglutinare pasiva-prezenta Ac (specifici Ag) in serul de cercetat este Ac (specifici Ag) in serul de cercetat este

urmata de formarea unor retele,cu urmata de formarea unor retele,cu prinderea hematiilor si aparitia aspectului prinderea hematiilor si aparitia aspectului

de hemaglutinare.de hemaglutinare.