Cuprins I. Structura imunoglobulinelor1. Imunoglobulina A

2. Imunoglobulina E

3. Imunoglobulina G

4. Imunoglobulina M

5. Imunoglobulina D

II. Patologia imunoglobulinelor

III. Gamapatiile monoclonale

IV. Tipuri de gamapatii monoclonale

V. Metode imunochimice de detectare a gamapatiilor monoclonale

1. Electroforeza proteinelor serice

2. Imunofizarea proteinelor serice

3. Metoda nefelometrica determinarea cantitativa a lanturilor usoare si VI. Studiu asupra incidentei gamapatiilor monoclonale in populatia Romaniei

Sistemul imunitar este un sistem de aprare extrem de versatil, care a evoluat pentru a proteja organismul de invadarea microorganismelor patogene i cancer. El este capabil de a genera o varietate enorma de celule i molecule capabile s recunoasc n mod specific i elimine celule invadatoare. Aceste molecule acioneaz mpreun ntr-o reea dinamic a crei complexitate rivalizeaz cu sistemului nervos. Funcional, un rspuns imun poate fi mprit n dou activiti: recunoatere i rspunsul. Sistemul imunitar este capabil s recunoasc diferene chimice subtile. Mai mult, sistemul este capabil sa diferentieze moleculele strine i celulele proprii organismului .Odata ce un organism strin a fost recunoscut, sistemul imunitar recruteaza o varietate de celule si molecule pentru a dezvolta uni raspuns adecvat, numit un rspuns efector, ce are rolul de elimina sau neutraliza organismul strain. In acest fel sistemul este capabil s transforme evenimentul de recunoaterea iniial ntr-o varietate de rspunsuri efectoare, fiecare fiind unic, potrivit pentru eliminarea unei varetati de agenti patogeni.Intalnirea organismului cu acelai organism strin induce un rspuns de memorie, caracterizat printr-o reactie imuna mai rapid. Structura imunoglobulinelor Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu functie de anticorpi. Efectori ai imunitatii mediate umoral, imunoglobulinele neutralizeaza antigenul actionand fie singure asupra acestora, fie in asociere cu alte molecule sau celule, cum este cazul citotoxicitatii mediate de catre complement sau a celei mediate celular-anticorp-dependente ( ADCC ). In camp electric migreaza spre zona catod, in regiunea gama ( ), de unde si denumirea lor initiala de gamaglobuline.

O molecula de imunoglobulina este alcatuita din doua lanturi lungi de glicoproteina, denumite si lanturi H ( heavy=greu ), si doua lanturi scurte sau L ( light=usor ), legate intre ele prin legaturi disulfidice -S-S-. Legaturile disulfidice leaga atat lanturi diferite cat si segmente diferite ale aceluiasi lant, pe care le apropie intre ele. Pozitia reziduurilor de aminoaciziin lant este foarte variabila la extremitatealor NH2 terminala, anume, incepand cu reziduul numarul 1dar tot mai constanta catre cealalta etremitate, adica spre extremitatea COOH terminala. Ca rezultat a acestui fapt, un lant are domenii variabile V si constante C, denumirte in cazul lantului usor VL si CL, iar al celui greu VH si CH . Domeniile variabile VL si VH formeaza portiunea de molecula prin care aceasta recunoaste antigenul, cunoscuta sub denumirea e situs combinative ( SC ). Acesta are o structura complementara epitopului, fapt care confera anticorpuilui stricta lui specificitate de recunoastere. Pozitia aminoacizilor in lant este cu atat mai variabila cu cat locul lor este mai aproape de inceputul lantului, deci de primul reziduu de aminoacid si cu atat mai constanta cu cat sunt mai aproape de sfarsitul lui, adica de ultimul reziduu de aminoacid. In primul caz , domeniul variabil Vare regiuni de determinare a complementaritatii ( CDR ), iar in cel de-al doilea caz , domenii constante. Un lant L sau H are trei CDR si un domeniu constant in cazul lanturilor usoare sau trei patru in cel al lanturilor grele. In organism imunoglobulinele se pot gasi sub forma de molecule libere, molecule care fac parte integrate din membrane limfocitelor B si au rol de receptori pentru antigen, molecule care au fixat specific antigenul solubil si se gasesc in circulatie sub forma de complexe antigen-anticorp, molecule fixate specific la determinatii antigenici de pe suprafata celulelor, molecule fixate citofil la receptorii Fc. Imunoglobulinele sunt sensibile la actiunea unor enzyme care pot rupe molecula in diferite fragmente dintre care doua contin lanturile L intregi si o parte din lanturile H, la nivelul carora se gaseste situsul combinative, de unde si denumirea lor de Fab (fragment antigen binding). Un alt fragment este alcatuit din domeniile constante ale lanturilor H care cristalizeaza in vitro,motiv pentru care este denumit fragment cristalizabil sau Fc.

Lanturile grele H confera imunoglobulinelor proprietati antigenice pe baza carora au fost impartite in cinci clase distincte care poarta denumiri corespunzatoare denumirilor lanturilor grele ce intra in coponenta lor si anume clasa IgG cu lantul , IgA cu , IgM cu , IgD cu si IgE cu .

Aceste clase pe langa deosebirile antigenice, au si attribute functionale diferite. Spre exemplu, clasa IgM este sintetzata dupa primul contact al organismului cu un antigen, de unde si denumirea de anticorpi de raspuns primar . Clasa IgG apare dupa doua sau ma multe contacte ale organismului cu acelasi antigen, fiind deci anticorpi de raspuns secundar, IgA apara in special suprafetele mucoaselor intestinale si pulmonare, IgE este responsabila de declansarea unor reactii alergice din care cauza anticorpii sunt denumiti reagine. Trei dintre aceste clase si anume IgG, IgD, IgE sunt monomeri , adica moleculele lor sunt formate din doua lanturi L si doua lanturi H, iar doua pot fi dimere sau trimere, cum este cazul celor din clasa IgM aflate in circulatie ( cele fixate pe suprafata limfocitelor B sunt monomeri si au rolul de receptori pentru antigene ) Imunoglobulina M (IgM)

IgM reprezinta aproximativ 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser, cu o concentratie medie in ser de 1.5 mg/ml. IgM monomerica cu o greutate moleculara de 180,000 se exprima ca un anticorp legat la membrana celulelor B. IgM este secretata de celulele plasmei ca un pentamer in care 5 unitati monomerice sunt legate prin punti disulfidice. Cele 5 subunitati monomerice sunt dispuse cu regiunea Fc inspre centrul pentamerului iar cele 10 situri de legare a antigenului sunt situate inspre periferia moleculei. Fiecare pentamer contine o polipeptida aditionala legata Fc numita lant J (Joining Chain). Lantul J este necesar pentru polimerizarea monomerilor in vederea formarii IgM pentamerica. IgM este prima imunoglobulina produsa ca raspuns prima la antigen si este prima imunoglobulina sintetizata de nou-nascuti. Datorita structurii sale pentamerice IgM are o valenta mai mare decat celelalte izotipuri. O molecula de IgM poate lega 10 haptene, insa, datorita obstuctiei serice, doar 5 molecule de antigen mai mare pot fi legate simultan.

Datorita valentei mari, IgM este mult mai eficienta decat alte izotipuri in legarea antigenilor cu numar crescut de repetari epitopice precum particulele virale sau celulele rosii ale sangelui. Spre exemplu, atunci cand celulele rosii ale sangelui sunt incubate cu un anticorp specific, ele se strang in agregate mari in timpul procesului de aglutinare. Sunt necesare de 100 pana la 1000 de molecule IgG decat de IgM pentru a obtine acelasi nivel de aglutinare. Un fenomen similar are loc si in cazul neutralizarii infectiei virale.

IgM este de asemenea mai eficienta decat IgG in activarea complementului, intrucat activarea acestuia necesita doua regiuni Fc in imediata apropiere, iar molecula pentamerica de IgM indeplineste aceasta conditie. Datorita dimensiunii mari, IgM nu difuzeaza bine, fiind gasita in concentratii mici in fluidele tesutului intercelular. Prezenta lantului J permite IgM sa se lege de receptorii celulelor secretoare, care le transporta prin tesutul epitelial astfel incat sa ajunga in secretiile externe care imbraca suprafetele mucoase. Desi IgA este izotipul predominant din secretiile externe, IgM joaca un rol accesoriu important ca imunoglobulina secretoarie.

Imunoglobulina A (IgA)

Desi IgA constituie 10-15% din totalul imunoglobulinelor serice, ea este imunoglobulina predominanta din secretiile externe precum laptele, saliva, lacrimile si mucusul. In ser IgA exista in principal sunt forma monomerica, insa pot fi descoperite si forme monomerice (dimeri, trimri si uneori tetrameri) care contin un lant J polipeptidic. IgA din secretiile externe, numita IgA secretorie, este formata dintr-un dimer sau tetramer, un lant J polipeptidic si un lant polipeptidic numit component secretoriu. Componentul secretoriu este derivat din receptorul care transporta IgA polimerica prin membrane. Lantul J polipeptidic din IgA este identic cu cel din IgM pentamerica si are o functie similara in facilitarea polimerizarii atat a IgA serica cat si a IgA secretorie. Componentul secretoriu al IgA este reprezentat de un polipeptid cu greutate moleculara de 70,000, produs de celulele epiteliale ale membranelor mucoase. Este alcatuit din 5 domenii imunoblobulin-like care leaga dimerii IgA de regiune Fc. Interactiunea este stabilizata de o legatura disulfidica intre componentul secretoriu si unul dintre lanturile dimerului IgA.

Productia zilnica de IgA secretorie este mai mare decat a oricarei alte clase de imunoglobuline. IgA secretoare de plasma sunt concentrate pe suprafata membranelor mucoase. Zilnic un om secreta intre 5 si 15 grame de IgA secretorie in secretiile mucoase. Celulele plasmei care produc IgA migreaza spre tesutul subepitelial, unde IgA secretata se leaga la un receptor pentru molecule polimerice de imunoglobulina. Acest receptor este exprimat pe suprafata basolaterala a majoritatii epiteliilor mucoase (ex. captuseala tractului digestiv, respirator si genital) si la nivelul epiteliilor glandulare (ex. glandele mamare, salivare si lacrimale). Dupa ce IgA polimerica se leaga de receptorul polipeptidic, complexul rezultat este transportat peste bariera epiteliala spre lumen. Transportul complexului IgA-receptor implica endocitoza mediata de receptor si transportul veziculelor peste celulele epiteliale spre membrana luminala, unde veziculele fuzioneaza cu membrana plasmatica. Receptorul poli-Ig este apoi clivat enzimatic de la nivelul membranei si devine component secretoriu care este legat la IgA polimerica si eliberat in secretiile mucoase.

IgM pentamerica este transportata in secretiile mucoase prin acelasi mecanism, desi procentual are mult mai putin anti-corpi in secretiile mucoase decat IgA.

IgA secretorie serveste ca efector la nivelul suprafetelor membranelor mucoase care sunt principalele cai de intrare a majoritatii organismelor patogenice. Intrucat este polimerica, IgA secretorie poate lega anticorpi de dimensiuni mari, cu epitopi multipli. Legarea IgA secretorie de antigenii virali si bacterieni previne atasarea patogenilor de celulele membranelor mucoase, inhiband astfel infectia virala si formarea de colonii bacteriene.

Studiile ar aratat ca IgA secretorie reprezinta o linie importanta de aparare impotriva bacteriilor precum Salmonella, Vibrio cholerae sau Neisseria gonorrhoeae precum si impotriva virusurilor precum polio, influenza si reovirus. Laptele matern contine IgA secretorie si numeroase alte molecule care protejeaza nou-nascutul in prima luna de viata.

Imunoglobulina G ( IgG) Imunoglubulina G este cea mai abundenta imunoglobulina din ser, constituind aproximativ 80% din totalul imunoglobulinelor prezente in ser. Molecula de IgG este formata fie din doua lanturi grele si doua usoare, fie din doua lanturi usoare. La oameni exista 4 subclase ale IgG care se disting prin diferente in ceea ce priveste secventa lantului de aminoacizi si sunt notate in mod descrescator in functie de concentratia lor in ser dupa cum urmeaza: IgG1, IgG2, IgG3 si IgG4. Secventele de aminoacizi care disting cele 4 subclase de IgG sunt codificate de diferite gene CH a caror secventa de ADN este omoloaga in proportie de 90-95%. Caracteristicile structurale care disting cele 4 subclase sunt reprezentate de dimensiunea regiunii balama si de numarul si pozitia legaturilor disulfidice dintre lanturile grele. Diferentele dintre cele 4 subclase influenteaza activitatea moleculelor dupa cum urmeaza:

IgG1, IgG3 si IgG4 traverseaza cu usurinta placenta si au rolul de a proteja dezvoltarea fetusului

IgG3 este cea mai eficienta activatoare a complementului, urmata de IgG1. IgG2 este mai putin eficienta, in timp de IgG4 nu are capacitatea de a activa complementul.

IgG1 si IgG3 se leaga de receptorii Fc ai fagocitelor mediand astfel opsonizarea. IgG4 are o afinitate medie fata de receptorii Fc, in timp ce IgG2 are o afinitate foarte mica pentru receptorii Fc.

Imunoglobulina E ( IgE) Imunoglobulina D ( IgD) V. Metode imunochimice de detectare a gamapatiilor monoclonale

Electroforeza proteinelor serice

Electroforeza este metoda de separare a moleculelor proteice n funcie de sarcina electric i de greutatea molecular. Metoda electroforetic se aplic probelor de ser, urinii i lichidului cerebrospinal.

Viteza cu care proteina migreaza intr-un camp electric (mobilitatea electroforetica) este specifica fiecarei proteine in parte si depinde att de proprietile proteinei de separat ct i de proprietile soluiei n care se face separarea: pH, fora ionic a tamponului, temperatura i intensitatea curentului electric.A. n mediu acid:

B. n mediu alcalin:

Materiale si metode

- aparatul semiautomat Hydrasys , SEBIA

- kit Hydragel 12;

- camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS;

- pipete: 10 L si 200 L

- densitometru / scanner capabil s citeasc geluri de 82 x 51 mm sau 82 x 102 mm la o lungime de und de 570 nm sau cu filtru galben ;

Coninutul kit-ului: 10 geluri de agaroz;-

10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (fiecare burete conine tampon tris-barbital pH 8.5 0.3);

1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;

1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;

1 pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);

1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru;

1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.

Fiecare gel conine: agaroz, 0.8 g/dL ; soluie tampon tris-barbital (pH 8.5 0.1).

Bureii cu soluie tampon conin: tampon tris-barbital (pH 8.5 0.3); azida de sodiu.

Prezentarea si interpretarea rezultatelor

Rezultatele sunt prezentate sub 2 forme : scanare densitometrica si valori numerice pentru fiecare

fractiune (% si g/dl). Fractiune Interval de ref.(%) Interval de ref.(conc.) g/dL

Albumina53.5 66.53.60 5.20

1- globuline1.4 -4.00.10 0.30

2- globuline8.0 15.70.50 0.90

1- globuline5.6 12.10.60 0.80

2- globuline1.8 7.20.20 0.40

-globuline7.9 18.91.00 1.60

Proteinele identificate in cele 6 fractiuni majore separate prin electroforeza:

albumina prealbumina

1- globuline

1-glicoproteina acida ( orosomucoidul) 1-antitripsina 1-lipoproteinele (HDL)

1-antichimotripsina protrombina

2-globuline 2-macroglobulina haptoglobina antitrombina III

1- globuline

transferina - lipoproteine (LDL) transcobalamina II hemopexina

2- globuline

proteina C reactiva

Complement C3

2- microglobulina

2- glicoproteina I si III

IgA

- globuline Fibrinogen IgG

IgA

IgM

IgE

IgD

Modificarile ce pot aparea intr-o migrare electroforetica la nivelul fractiunilor majore Hipoalbuminemiaapare in: insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa), diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii,pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva (gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri), precum si hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing). Hiperalbuminemiafara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma perfuziilor cu albumina.

Bisalbuminemia se poate datora unor mutatii ereditare fara sa aiba consecinte patologice sau poate fi dobandita (tranzitorie), datorata unei pancreatite sau tratamentului cu doze mari de -lactam. ( fig. )

Fig.

Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele cresc in: sindrom nefrotic

diabet zaharat

miocardoscleroza

endocardite bacteriene

arsuri

boli infectioase

reumatism

reactii inflamatorii

In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.

Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1poate fi observata in:

hepatita cronica

reactii de faza acuta insotite de hemoliza

terapie cu estrogeni

sarcina

Cresterea predominanta a componentelor alfa-2se intalneste in:

poliartrita reumatoida

boli cu complexe imune circulante

Scaderea alfa-1 globulinelorapare:

in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii de proteine in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsinaBeta globulinele cresc in:

anemia feripriva

dislipidemii

boala Cushing

gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare Kappa sau Lambda)

hepatite toxice

ciroze, inclusiv alcoolice

sindrom nefrotic ( fig.2 )Scaderi ale beta globulinelorpot apare in:

insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu diminuarea valorii transferinei in mobilitatea electroforetica in zona beta-1

scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a fractiunii beta-2 Gama globulinele cresc in: infectii bacteriene

parazitoze

colagenoze

poliartrita reumatoida

obstructie biliara

hepatita acuta sau cronica

ciroza hepatica

leucemii

mielom multiplu

boli inflamatorii

Fig. In ciroza alcoolica supraproductia de IgA si IgM duce la fuzionarea fractiilor si creand un aspect al electroforegramei de bloc . ( fig.)

Fig.

Hipogamaglobulinemia apare in imunodeficienta primara sau in imunodeficienta secundara datorata tratamentului cu corticosteroizi, imunosupresoare, chimio si radioterapiei. Aspectul de hipogamaglobulinemie mai este prezent si in cazul mielomului multiplu micromolecular cand in urina se identifica proteine Bence Jones. ( fig.)

Hipergamaglobulinemia Aspectul este de crestere difuza a fractiunii gama datorata in principal bolilor hepatice, infectiilor bacteriene si parazitare sau bolilor autoimune. ( fig.)

Proteina M - se prezinta sub forma unei benzi bine delimitate iar aspectul pe electroforegrama este acela al unui pic ascutit cu baza ingusta. Apare in neoplaziile limfoproliferative ( mielom multiplu). (fig.6a, 6b, 6c, 6d)

Fig.

Fig.

Fig.

Fig.

Imunofixarea proteinelor serice

Principiul metodei Imunofixarea proteinelor serice consta in doua etape: A. Separarea electroforetica in mediu alcalin, la un pH de 9.1, a proteinelor serice;

B. Imunoprecipitarea folosind antiseruri monospecifice.

Imunoprecipitarea este rezultatul interactiunii antigenelor cu anticorpii specifici intr-un mediu suport care poate fi un gel de agaroza sau un mediu lichid. Factorul cel mai important in acest proces este natura bivalenta a moleculelor de anticorp care reactioneaza cu epitopii multipli ai antigenului solubil.

Materiale, echipamente i accesorii necesare:

- kit Hydragel 1IF, 2 IF, 4 IF sau 9 IF furnizate de SEBIA;

- sistem semiautomat HYDRASYS 2 SEBIA;

- camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS;

- pipete: 10 L si 200 L;

masc standard SEBIA;

Fiecare kit este nsoit de un set de antiseruri monospecifice: anti lanuri grele ,, i anti lanuri usoare

i care formeaz complexe imunoprecipitante cu proteinele anormale separate electroforetic.

Coninutul kit-ului:

-10 geluri de agaroz;

-10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (pH 9.1 0.3);

-1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;

-1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;

-1 recipient (32 mL) ce conine diluent (soluie alcalin pH 7.5 0.3 i bromfenol albastru) i este utilizat pentru diluia

probelor;

-1pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);

-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru fin;

-1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru pieptn;

-1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.

-1 recipient de 14,4 ml cu soluie de fixare;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu gama;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu miu;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu alfa;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor kappa;

-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor lambda.

-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru groas;Pentru fiecare caz este necesar sa se aplice cate 10 l de proba diluata in sase godeuri dupa cum urmeaza: ELF, IgG, IgA, IgM, si . Inainte de a se incepe separarea electroforetica a proteinelor, proba trebuie diluata, pentru fiecare tip de lant greu si lant usor existand o anumita dilutie standard prezentata in tabelul de mai jos.Tipul de Ig

Cantitatea de ser si diluant

Electroforeza tuturor proteinelor

30 l ser + 60 l diluant

IgG

20 l ser + 100 l diluant

IgA, IgM, ,

30 l ser + 60 l diluant

Dilutii speciale: pentru valori ale IgG > 20 g/l se recomanda dublarea cantitatii de diluant pentru valori ale IgG < 5 g/ l se recomanda reducerea la jumatate a cantitatii de dilaunt.

Mod de lucru: Aplicarea probei: in decurs de 2 minute se pun cate 10 l de ser diluat in cele 6 godeuri, primul godeu corespunde unei migrari electroforetice normale iar celelalte godeuri corespund celor trei tipuri de lant greu (, si ) si celor dou tipuri de lant usor si ;n cele 6 godeuri corespunztoare unei singure probe sunt adugate dup cum urmeaz: soluie de fixare (40 l), i cte 25 l de antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan .Interpretare: Rezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L) al unei proteine monoclonale.

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si prin metoda nefelometricaPrincipiul metodei:

Nefelometria masoara intensitatea luminii dispersate de catre un complex Ac-Ag. Fasciculul de lumina trece prin cuva de reactie in care se afla complexul Ac-Ag iar lumina

dispersata de acest complex este detectata de catre un fotodetector situat la un unghi < 900

fata de unghiul initial al fasciculului de lumina. Cantitatea de lumina dispersata este corelata cu concentratia proteinei de analizat. In timpul reactiei in vitro, lantul usor se leaga de anticorpul policlonal conjugat cu latex cu specificitate pentru epitopii expusi pe lanturile usoare libere.Reactivi necesari:

Kitul FREELITE compatibil cu nefelometrul Dade-Behring BNProSpec care contine:

a) anticorpi policlonali anti k si uman conjugati cu latex;

b) Calibrator ( ser uman ce contine lant policlonal kapa si lambda )- pana in prezent nu exista un calibrator universal care sa permita realizarea unui control de calitate extern;

c)seruri control +/- (nivel scazut si ridicat).

Fiecare serie de reactivi are propriul calibrator si control.

Reactivi suplimentari: tampon de reactie, diluant.