LP IMUNOLOGIE 1

REACȚIILE ANTIGEN - ANTICORP

Reacția Ag – Ac = asociere între cele 2 molecule prin legături necovalente; această reacție nu determină modificări chimice ireversibile în nici una dintre cele 2 molecule.

Ac = anticorpAg = antigen

Ac = receptor specific și solubil pentru un anume Ag.

Legăturile necovalente între cele Ag și Ac:- legături de hidrogen- legături ionice- legături hidrofobe- reacții van der Waals

Legăturile se realizează între epitopul antigenului (determinantul antigenic) și CDR ale regiunilor variabile ale lanțurilor H și L ale Ig (VH și VL)

CDR = complementarity-determining regions = regiuni de determinare a complementarității.

Aceste legături necovalente sunt relative slabe (comparativ cu cele covalente) și se realizează dacă moleculele se află la distanțe mici una față de cealaltă; astfel că o legătura puternică între Ag și Ac depinde de o ‘potrivire’ între domeniile Ac și Ag = o complementaritate care să asigure aceasta distanță mică și care să asigure realizarea unui număr mare de astfel de legături.Aceasta complementaritate între Ac și Ag determină specificitatea legăturii.

Legăturile între Ag și Ac nu sunt ireversibile. Reacția dintre Ac și Ag este cu dublu sens, asociere și disociere: Ag+Ac⇄ AgAc

Reacția Ag-Ac poate fi influențata de mai mulți factori: Afinitatea, aviditatea Ac fata de Ag Titrul Ac Concentrația Ag Starea Ag: Ag solubile/corpusculate Condiții de mediu: pH, temperatura

Caracteristici ale legăturii între Ac și Ag:1. SPECIFICITATE = Ac recunoaște în mod ideal un singur tip de antigen față de care are

complementaritate.2. AFINITATEA = puterea combinată a legăturilor necovalente între un singur situs combinativ (Fab) al

Ac și un singur determinant antigenic/epitop al Ag.3. AVIDITATEA = suma afinităților între situsurile de legare ale Ac și toți determinanții Ag pe care îi

leagă. Este o măsură mai buna de evaluare a capacității de legare a Ac in vivo.Aviditatea crescută poate compensa pentru o afinitate scăzută în cazul antigenelor polivelente: ex. IgM au afinitate mai scăzută decât IgG dar având mai multe situsuri de legare (în forma lor pentamerică) pot lega eficient Ag.

Notă: Ag polivalent sau multivalent = care are repetat de mai multe ori același determinant antigenicCROSS-REACTIVITATE = în practică, uneori, un Ac[1] poate recunoaște un alt Ag[2] decât cel specific(Ag[1]), dacă acest Ag[2] are un epitop identic sau asemănător cu Ag[1]. *De obicei aviditatea Ac[1] pentru Ag[2] este mai mică decât pentru Ag[1].

IMUNOSEROLOGIA

1

LP IMUNOLOGIE 1

=domeniul imunologiei care studiază reacțiile Ag-Ac in vitroAplicații diagnostice: serotipie (=caracterizarea unei celule normale/tumorale//bacterii etc. prin evidențierea unor Ag specifice de suprafață); dg imunologic al unor afecțiuni (infecțioase, imune/autoimune).

Componente esențiale ale reacțiilor serologice: Ag, Ac

AgSe utilizează pentru:- imunizarea animalelor de laborator în scopul obținerii serurilor imune- reacții imune de serodiagnostic.

Metode de preparare a Ag: Purificarea Ag prin electroforeza - SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis) cu transfer ulterior pe nitroceluloză; pentru extragerea proteinelor de pe nitroceluloză e necesară folosirea unor reactivi de disociație puternici și care pot contamina Ag; dacă acest Ag este ulterior utilizat pentru imunizarea animalului de experiență pot apare reacții adverse importante la acesta din cauza reactivilor de disociere.

Purificarea Ag prin affinity chromatography: principiul metodei: Ac specific antigenului este fixat pe particule sintetice (ex. de Sepharose); aceste particule de sefaroză cu Ac specifici fixați se amestecă cu soluția în care se găsește și Ag de extras; Ag se va fixa pe Ac, respectiv pe particulele de sefaroză; restul soluției se va spăla; ulterior legăturile Ag-Ac se rup prin modificarea pH-ului mediului.

Producere de epitopi prin ADN recombinat în culturi de celule.

Serurile imune = conțin Ac. Se pot obține și utiliza seruri policlonale/monoclonale: Seruri POLICLONALE = prin imunizarea (unui animal de experiență) cu un Ag se obține de obicei un ser

policlonal = care conține mai multe tipuri de Ac, fiecare din ei specific pentru unul din mai mulții determinanții antigenici ai Ag respectiv.

Serurile policlonale pot fi:- monospecifice = conțin mai multe tipuri de Ac care recunosc epitopi diferiți ai unui singur

antigen - polispecifice = conțin anticorpi pentru mai multe tipuri de antigene

Se pot obține:- de la pacienți (bolnavi/convalescenți)- prin imunizarea animalelor (se pot folosi animale mari – pentru utilizarea serurilor pe scară largă,

comercializare; sau animale mici pentru cercetare) Ac/seruri MONOCLONALI/e = un singur tip de Ac împotriva unui singur tip de epitop, secretat de o

singură clonă de LB (limfocit B).Tehnica de obținere a acestora în laborator: celule numite hybridomas = rezultate din fuziunea unei celule normale secretante de Ig (prelevate de la un animal imunizat în prealabil cu Ag specific) și celule tumorale de mielom multiplu; acești hibrizi, spre deosebire de plasmocitele normale cresc și se înmulțesc pe medii de cultura și pot avea o ‘viață’ lungă; prin procese de selecție se obține o clona care produce 1 singur tip de Ac.

Avantaje/dezavantaje seruri poli/monoclonale: Pentru a fi eficient un ser policlonal trebuie să fie cât mai puțin contaminat de Ac nenecesari și să fie de

o specificitate înaltă. Serurile policlonale variază între ele în ceea ce privește specificitatea, afinitatea, aviditatea. Dacă epitopul specific unui Ac monoclonal a fost denaturat în cursul procesului de purificare, el nu va

mai fi recunoscut de serul monoclonal. Folosirea unui ser policlonal, cu Ac care recunosc mai mulți epitopi ai aceluiași Ag e mai puțin probabil să fie afectată de aceasta condiție.

Un ser monoclonal obținut dintr-un anume hybridom are proprietăți standard în ceea ce privește structura, specificitatea, afinitatea.

2

LP IMUNOLOGIE 1

Serurile pot fi folosite pentru: teste diagnostice tehnici de cercetare terapia/profilaxia unor afecțiuni, ex :

- Ac monoclonali (mab) în poliartrita reumatoidă, SM, diverse tipuri de tumori- Seruri polivalente în s. Guillan-Barre, imunodeficiența primară, secundară; profilaxie pre- și

postexpunere la virusul hepatitei A

Evidențierea reacției Ag-Ac poate fi realizată prin: Reacții de neutralizare imună Reacții de fixare a complementului Reacții de precipitare Reacții de aglutinare Reacții cu liganzi marcați

Tipul de reacție folosit depinde de tipul, starea, concentrația antigenului, respectiv ale anticorpului.

REACȚII DE NEUTRALIZARE IMUNĂ

= o reacție Ag-Ac în care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus (= Ag) sunt blocate de către anticorpul specific care recunoaște și leagă antigenul. Ex. hemaglutinoinhibarea virală, reacția de neutralizare a SLO,etc.

ASLO = Ac anti-streptolizina OStreptolizine = exotoxine produse de streptococi; cu funcție de hemolizină → determină liza hematiilor (și a altor celule ex. leucocite - neutrofile). Streptolizina O (SLO) se leagă de colesterolul membranar, polimerizează și formează canale transmembranare.Streptolizina O – produsă de streptococi β-hemolitici grup A (=Streptococcus pyogenes), C, G; numită O pentru ca e inactivată de oxigenul atmosferic; este intens imunogenică.( streptolizina S – stabilă în oxigenul atmosferic, mai slab imunogenică).

Determinarea ASLO prin test de neutralizareTestul se bazează pe faptul că, in vitro, Ac anti-SLO blochează activitatea acesteia de hemolizină.E utilizat pentru a evalua prezența ASLO în serul pacientului.

Testul Todd: în eprubete se pune: serul pacientului în diluții seriate, buffer, SLO ; se amestecă ușor; se incubează 15 minute la 37°C; apoi se adăugă suspensie de hematii (de om grup O sau de iepure) în concentrație de 5%, 0,5 ml; se amestecă ușor; se incubează la 37°C timp de 45 minute și apoi se centrifughează la 1.500 rpm timp de 1 minut.Titrul ASLO în unități Todd = inversul diluției serului la care este neutralizată complet activitatea SLO = nu se mai produce hemoliza.

1 unitate Todd = cantitatea de Ac care blochează 2,5 x doza minimă hemolitică de SLODoza minimă hemolitică = cantitatea de toxină care hemolizează complet 0,5 ml de suspensie de hematii de iepure în concentrație de 5%.

Există și alte design-uri de teste de determinare a ASLO bazate fie pe reacția de neutralizare, fie pe alte tipuri de reacție Ag-Ac: aglutinare, nefelometrie.

3

LP IMUNOLOGIE 1

Pentru teste care folosesc un standard OMS pentru SLO sau alte tipuri de reacții titrul se exprimă în unități internaționale (UI). 1 UI = activitatea conținută în 0,0213 mg din Standardul Internațional (un amestec de seruri de la pacienți cu infecție streptococică).

După o infecție acută cu streptococ titrul ASLO începe să crească la 7 – 10 zile; ajung la titru maxim la ~ 6 săptămâni (~3 săptămâni de la instalarea RAA); după aceea titrul ASLO scade progresiv; la 12 luni de la infecție doar~ 20% din cei infectați mai au titru ASLO peste normal.

Titrul ASLO e normal dacă e < 200UI; < 125 U Todd – există însă variații în funcție de vârstă, expuneri anterioare la streptococ grup A, capacitatea de reactivitate imună, regiune geografică, anotimp etc. Un titru ASLO crescut e indicator de infecție streptococica recentă.

Alte proteine streptococice: - Proteina M = proteina a peretelui bacterian; împreună cu acidul lipotecoic mediază adeziunea S.

pyogenes la fibronectina din celula epitelială a gazdei. E o proteină stabila termic, sensibilă la tripsină, formată din 2 lanțuri; capătul N-terminal este hipervariabil – determină specificitatea de tip a streptococilor. Proteina M reprezintă proteina majoritară de suprafață a tulpinilor virulente de S. pyogenes – reprezintă factorul major de virulență: inhibă depunerea de complement și astfel previne fagocitarea bacteriei.

- Exotoxinele A și C ale lui S. pyogenis (SPE A și SPE C - streptococcal pyrogenic exotoxin) – superantigene care induc activarea LT, inhibă sinteza de Ac, potențează șocul toxic, induc apariția febrei, induc elaborare promptă de citokine proinflamatorii.

- Enzime : 2 streptokinaze (imunogenice) care activează plasmina; 1 până la 4 DNA-aze (cea mai comună – DNA-aza B care e și cea mai imunogenică); hialuronidaze, neuraminidaze, fosfataze, etc..

Ac anti-streptococ: Protectivi = Ac anti-proteină M (sunt însă specifici de tip = în funcție de proteina M a tipului; grupul A

de streptococi > 120 tipuri de proteină M); apar mai lent decât alți Ac; persistă ani, posibil chiar toată viața.

Ac anti produse extracelulare: anti-SLO, anti-DNA-aza – sunt doar markeri ai infecției; nu protejează împotriva infecției streptococice.

S. pyogenes determină afecțiuni prin 3 mecanisme principale: - Supurație: infecții determinate de S. pyogenes: faringită*, amigdalită*, limfadenită supurată*, sinuzită,

abces peritonsilar, retrofaringeal*, pneumonie, empiem pleural, impetigo*, erizipel, celulită, limfangită, fasceită necrozantă, meningita, septicemie, ș.a.

- Elaborare de toxine: afecțiuni mediate de toxine streptococice: scarlatina*, șoc toxico-septic (STSS – Streptococcal toxic shock syndrome).

- Inflamație mediată imun non-supurativă: afecțiuni post-infecție streptococică = RAA*, glomerulonefrita acută(GNA) poststreptococică*.

*mai frecvent sau exclusiv la copii, adolescenți.

RAA (reumatism [poli]articular acut; ‘febra reumatică’)Susceptibilitate genetică: HLA-DR2, HLA-DR4; marker non-HLA - un marker al LB = D8/17Mecanismul apariției manifestărilor RAA: probabil cross-reactivitatea datorită mimetismului molecular între componente antigenice ale streptococilor β-hemolitici grup A și proteine proprii ale organismului.

Clinică:Manifestarea acută apare de obicei la copii, adolescenți, tineri (rar la copii < 4 ani sau la adulți ), la 2-3 săptămâni după o angină streptococică cu S. β-hemolitic grup A (uneori paucisimptomatică, dificil uneori de identificat în anamneză).

4

LP IMUNOLOGIE 1

Simptomele se instalează tipic brusc: febră, stare de rău, paloare, artralgii și artrite migratorii ale articulațiilor mari (de obicei genunchi, umeri, glezne, coate, RCC). Clasic manifestarea articulară este acută, dureroasă, migratorie (afectând de obicei > 5 articulații). Rar manifestarea e monoarticulară, sau la nivelul articulațiilor mici; excepțional la nivelul coloanei vertebrale. Artrita reumatismală se vindecă.O parte din pacienți prezintă și manifestări de cardită reumatismală: dispnee, palpitații, tahicardie, sufluri, frecături pericardice, dureri precordiale. Afectarea cardiacă reprezintă cea mai serioasă manifestare a RAA; pot fi afectate valvele, miocardul și pericardul (uneori toate în același timp). O parte din pacienții care prezintă cardita la primul episod de RAA pot rămâne cu sechele cardiace (mai ales St.Mi.); o mare parte însă se vindecă, dar, fără profilaxie secundară au risc crescut de recurență și deci de sechele.Manifestări cutanate și subcutanate: eritema marginatum, noduli subcutanați (mai frecvent la nivelul genunchilor, cotului, umărului, occiputului).Coreea acută ( Sydenham) – debutează de obicei mai tardiv decât celelalte manifestări ( la 6-8 săptămâni după infecție); manifestările dispar de obicei după 1-3 luni, dar pot recidiva.

Laborator: teste care confirmă infecția recentă streptococică: - exudat faringian (la majoritatea pacienților, după episodul acut de faringită acută nu mai cresc culturi din

exudatul faringian, mai ales dacă au fost tratați cu antibiotice) - Ac anti-SLO (ASLO), Ac anti-DNA-aza markeri inflamatori prezenți în perioada RAA (reactanți de fază acută; VSH și CRP care pot rămâne

crescute săptămâni, luni) modificări EKG: cel mai frecvent tulburări de conducere, dar și supradenivelare de ST în cazul

pericarditei ecocardiografie (lichid pericardic, FE..)

Criterii Jones:Majore:

- cardită- artrită- coree- eritem marginat- noduli subcutanați

Minore:- artralgii- febră- VSH, CRP, alți reactanți de fază acută ↑- PR prelungit

DG(+): 2 criterii majore sau 1 criteriu major + 2 minore+ evidenta infecției cu Streptococ grup A în antecedente: exudat faringian + cultură / sau markeri imunologici: ASLO cu titru ↑ etc.

GNA poststreptococicăPoate apare după infecții faringiene (la 10 zile după) sau cutanate (la 3 săptămâni după debutul piodermei) cu streptococ β-hemolitic grup A (de obicei alte tulpini decât cele care se asociază cu RAA); cea mai mare incidență la copii (vârful incidenței copii 2 – 6 ani); apare mai rar la adulți.Patogenie: depunere de CI la nivelul membranei bazale glomerulare (conțin IgG și Ag) – se activează complementul, eliberare de factori chemoatractanți, infiltrat inflamator celular; Ag implicat este încă necunoscut: există fie un Ag self fie un Ag nonself streptococic ajuns la acest nivel; în cazul ipotezei că Ag este self – RIU anti-antigen self poate apare ca urmare a cross-reactivității între unii epitopi a unor tipuri de proteină M streptococică cu o proteină self. Aspect anatomopatologic: de obicei – GNAD (GNA difuză) proliferativă (proliferare de celule endoteliale și mezangiale locale, acumulare de leucocite, mai ales neutrofile). Microscopia cu imunofluorescență: depozite de CI (care conțin de obicei IgG), C3.

Clinic: de obicei sindrom ‘nefritic’ = edeme, hematurie, frecvent HTA, oligurie; mai rar sd. nefrotic.

Paraclinic: Urina:

5

LP IMUNOLOGIE 1

- hematurie micro-/macro-scopică, +/- cilindri (hialini, granulari, hematici), +/- piurie- proteinurie, (tipic < 3, 5 g/24h, dar aproximativ în 20% cazuri e de rang nefrotic) - de obicei funcție tubulară păstrată (FE Na⁺ <1%)

Plasma:- ↓CH50, ↓C3 – tranzitor, prin consum- ↑ uree, creatinina (de obicei moderat)- ↑VSH; Fbg.- în caz de sindrom nefrotic - hipoproteinemie cu hipoalbuminemie - în caz de disfuncție renală severă: acidoză metabolică, hiperpotasemie, hipercloremie,

hiponatremie.De obicei e o afecțiune autolimitantă.Diagnosticul se pune pe elemente clinice și paraclinice de afectare glomerulară acută + evidența de infecție Streptococica recentă : ASLO, Ac anti-DNA-aza B, eventual izolarea germenului din faringe (vezi RAA) /piele (o cultură pozitivă din prelevări tegumentare nu face însă diferența între o infecție acută și purtător cronic de streptococ).

Alte teste de neutralizare: Testul Schick: se injectează intracutan o mică doză de toxină difterică purificată; dacă pacientul nu are

Ac anti-toxină difterică circulanți, la locul injectării, după 5 zile apare o zonă roșie, indurată și dureroasă cu diametrul > 10 mm; dacă pacientul are respectivii Ac atunci aceștia vor neutraliza toxina difterică și nu apare inflamație locală. (exotoxina difterica inhibă sinteza proteică a celulelor organismului gazdă, este citotoxică și produce necroze tisulare).

Testul de hemaglutinoinhibare viralăREACȚII DE AGLUTINARE NON-IMUNĂ = există virusuri, toxine bacteriene, compuși chimici, care induc hemaglutinare non-imună.HEMAGLUTINAREA VIRALĂ = Exista virusuri care pot determina aglutinarea hematiilor în absența unei reacții Ag-Ac: vir. urlian, rujeolei, gripal datorită prezenței unor proteine de suprafața – hemaglutinine.Acest tip de hemaglutinare poate fi inhibată de prezența Ac neutralizanți ai virusului respectiv = HEMAGLUTINOINHIBARE VIRALĂ = e o reacție de neutralizare (= o reacție Ag-Ac în care efectele unui virus sunt blocate). Testul este folosit pentru subtiparea virusurilor gripale, detectarea Ac + evaluarea titrului acestora în serul pacienților.

REACȚIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

Se folosește pentru evidențierea unor anticorpi specifici (notați în acest text Ac [1]) în serul pacientului (sau în alte lichide biologice, ex. în LCR).

Principiu:- Când IgG sau IgM fixează Ag specific, acești anticorpi devin capabili să “fixeze” complementul. - Dacă reacția are loc pe suprafața hematiilor => liza hematiilor.

Se folosește un sistem-indicator: eritrocite “sensibilizate” = eritrocite preincubate, opsonizate cu Ac specifici anti-hematie (notați în acest

text cu Ac [2] )

6

LP IMUNOLOGIE 1

se folosesc concentrații de Ac [2] care nu produc aglutinarea hematiilor sistemul indicator NU conține complement

Sistemul test:

serul pacientului se încălzește la 56°C pentru inactivarea complementului pacientului (pentru eliminarea unui eventual factor de confuzie – nu cunoaștem calitatea complementului pacientului), apoi este adsorbit cu hematii de oaie ‘spălate’ – pentru a elimina din reacție eventualii Ac anti-hematie din serul pacientului (alt factor posibil de confuzie)

apoi serul se amestecă cu Ag [1] purificat (= antigenul specific Ac[1]) și o soluție standard de complement (din ser proaspăt diluat de porcușor de Guineea). Amestecul se incubează 30 minute la 37°C pentru a se lăsa timp Ac [1] din serul pacientului să reacționeze cu Ag [1] și să fixeze complementul.

se adăugă apoi sistemul-indicator (= eritrocitele “sensibilizate”)

1. Dacă în serul pacientului există Ac [1] specifici atunci aceștia se vor atașa de Ag[1] specific și vor fixa complementul; astfel încât nu mai rămâne complement liber în sistemul test. La adăugarea sistemului indicator hematiile “sensibilizate” nu vor mai fi lizate.

7

SISTEM TEST = Ag[1]+SER PACIENT ( cu Ac[1] prezenti) +COMPLEMENTAg[1]

Ac[1]

COMPLEMENT

SISTEM INDICATOR – HEMATII SENSIBILIZATE

HEMATII Ac[2] - ANTIHEMATIE

LP IMUNOLOGIE 1

Lipsa lizei hematiilor sistemului indicator = în sistemul test există Ac [1] de determinat => test pozitiv.

2. Dacă apare hemoliza eritrocitelor “sensibilizate” = în sistemul-test există complement liber și acesta se va lega de Ac [2] anti-hematie care sunt fixați pe hematiile “sensibilizate”. Se declanșează cascada complementului care determină liza hematiilor din sistemul indicator.

8

SISTEM TEST = Ag[1]+SER PACIENT ( cu Ac[1] prezenti) +COMPLEMENT

SISTEM INDICATOR + SISTEM TEST( cu prezenta de Ac[1] in serul pacientului)

FARA HEMOLIZA

LP IMUNOLOGIE 1

Apariția lizei hematiilor = în sistemul test nu există Ac [1] specifici = în serul pacientului nu există Ac [1] specifici = test negativ.

Aplicații: reacția Wassermann pentru sifilis; detectarea Ac anti-Mycoplasma, Bordetella, Ricketssi, virusuri, fungi (Cryptococcus, Histoplasma).Reacția Wassermann folosește ca Ag fosfolipide (cardiolipină) pentru a detecta apariția unor Ac numiți reagine; reagine = Ac care apar în cursul infecției luetice, din motive necunoscute; nu sunt Ac anti-treponema! Reacții fals pozitive: alte boli infecțioase (malarie, mononucleoza, etc.), infecții cu alte treponeme (ex. boala Lyme – infecția cu Borrelia b.), sindromul APL (anticorpi antifosfolipidici), LES ș.a.

9

SISTEM INDICATOR – HEMATII SENSIBILIZATE

HEMATII Ac[2] - ANTIHEMATIE

SISTEM TEST = Ag[1]+SER PACIENT ( fara Ac[1] ) +COMPLEMENTAg[1]

COMPLEMENT

SISTEM INDICATOR + SISTEM TEST fara Ac[1] HE

MOLIZA