Bacteriologie LP 1

19
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR MICROBIENE

description

Master Biologie Medicala UNIBUC

Transcript of Bacteriologie LP 1

Page 1: Bacteriologie LP 1

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR MICROBIENE

Page 2: Bacteriologie LP 1

ETAPELE INVESTIGARII DE LABORATOR A UNUI PACIENT INFECTAT

Page 3: Bacteriologie LP 1

Mediul de cultivare reprezintă un substrat nutritiv, de complexitate diferită, care favorizează creşterea şi dezvoltarea microorganismelor în condiţii artificiale, de laborator.

Cerinţe minime, obligatorii:

1. Să asigure cantităţi optime de apă şi substanţe nutritive necesare creşterii şi multiplicării microorganismelor;

2. Să asigure sursa de carbon şi energie;

3.Să asigure sursa de azot necesară biosintezei acizilor nucleici şi proteinelor;

4. Să conţină săruri minerale, cu rol în menţinerea echilibrului ionic al celulei (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn, Fe2+, Co2+);

5. Să asigure factori de creştere necesari pentru dezvoltarea unor microorganisme cu exigenţe de creştere;

6. Să ofere un pH optim pentru dezvoltarea microorganismelor;

7. Să ofere condiţii de aerare corespunzătoare tipului de metabolism respirator al microorganismului care urmează a fi cultivat;

8. Să fie steril şi repartizat în recipiente sterile.

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Page 4: Bacteriologie LP 1

- prepararea mediilor: din ingrediente de baza/pulberi deshidratate

- insotite de certificat de calitate (atesta cresterea si supravietuirea microorganismului tinta si inhibarea/supresarea cresterii altora)

- aspecte care influenteaza prepararea unui mediu: calitatea materialelor utilizate, calitatea apei, calitatea placilor Petri, calitatea aditivilor, sterilitatea sangelui

- stocarea mediilor: loc ferit de lumina si calduramediile cu sange, alte lichide biologice, antibiotice – la frigider

Controlul calitatii mediilor- testare pH – sa nu depaseasca 0.2 unitati.- sterilitate- testarea performantelor de crestere microbiana

Page 5: Bacteriologie LP 1

CGP Enterobacterii Bacterii Gram negative fastidioase

Enterococcus faecalis (ATCC 29212)

Citrobacter freundii Moraxella catarrhalis

S. aureus (ATCC 25923) Enterobacter cloacae N. gonorhoeae

S. epidermidis K. pneumoniae N. meningitidis

Str. agalactiae Proteus mirabilis

Str. mitis E. coli (ATCC 25922)

S. typhimurium Sh. flexneri

Str. pneumoniae Yersinia enterocolitica

Str. pyogenes

Fungi Alti BGN Anaerobi

C. albicans Acinetobacter lwoffi Bacteroides fragilis

Ps. aeruginosa (ATCC 27853)

Cl. perfringens

Tulpini de referinta recomandate pentru controlul mediilor (WHO, 2003)

* Nota: Tulpina de referinta - orice microorganism caracterizat la nivel de gen si specie clasificat si descris conform caracteristicilor si originii obtinut dintr-o colectie recunoscuta la nivel national sau international

Page 6: Bacteriologie LP 1

Teste de performanta realizate pe mediile uzuale (WHO, 2003)

Mediu Tulpina testata Prezenta cresterii/aspectul coloniilor sau mediului

Agar bila esculina 24h Enterococcus faecalisStreptococ alfa-hemolitic

Da/innegrirea mediuluiNu

Geloza sange, 24h, CO2 Streptococcus pyogenesStreptococcus pneumoniae

Da/ beta-hemolizaDa/alfa-hemoliza

Gelatinaza 24h E. coliSerratia marcescens

-+

Uree 24h E. coliP. mirabilis

-+ (roz)

Page 7: Bacteriologie LP 1

Neconformitate Sursa

Agar nesolidificat corespunzator Depasirea temperaturii de sterilizare, pH scazut care poate determina hidroliza acida a agarului, eroare de cantarire a ingredientului, omogenizare insuficienta, calitate necorespunzatoare a agarului

pH necorespunzator Sticlarie contaminata chimic, apa impura, supraincalzirea mediului la sterilizare, pH masurat incorect, deteriorarea mediilor deshidratate

Culoare modificata Sticlarie murdara, apa impura, supraincalzirea mediului la sterilizare, pH necorespunzator, deteriorarea mediilor deshidratate

Precipitate Supraincalzirea mediului la sterilizare, apa impura, sticlarie contaminata, deteriorarea mediilor deshidratate

Inhibarea dezvoltarii microorganismelor/crestere redusa/selectivitate redusa

Supraincalzirea mediului la sterilizare, sticlarie sau apa contaminata, deteriorarea mediilor deshidratate, erori de cantarire a ingredientelor si de omogenizare a acestora

Surse de neconformitate privind calitatea mediilor de cultura

Page 8: Bacteriologie LP 1

Clasificarea mediilor de cultura

După complexitate şi scopul utilizării:•Medii uzuale simple (ex. bulion simplu, agar nutritiv);•Medii speciale (sunt medii cu grade diferite de complexitate care permit creşterea preferenţială a anumitor specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme dintr-o probă sau evidenţierea anumitor caractere particulare de metabolism ale microorganismului cultivat):

•medii selective conţin unul sau mai mulţi agenţi inhibitori reprezentaţi de coloranţi, antibiotice, săruri biliare care pot limita sau inhiba multiplicarea anumitor specii de microorganisme dintr-o probă cu încărcătură microbiană mixtă (mediu BSA, mediu MacConkey);•medii de îmbogăţire -oferă condiţii preferenţiale de creştere pentru anumite specii bacteriene, care se vor multiplica mai rapid decât microorganismele asociate (ex. geloză-sânge, geloză chocolat);•medii diferenţiale - evidenţiază anumite particularitaţi metabolice, utile în identificarea unei anumite specii de microorganisme: sistemele multitest;•medii de transport care asigură supravieţuirea tulpinilor microbiene în proba recoltată până în momentul însămânţării (ex. mediu Cary-Blair);•medii de conservare sau de întreţinere care asigură supravieţuirea microorganismelor în laborator pe o anumită perioada de timp (ex. mediu OMS, mediu YPG).

După consistenţă:•medii lichide;•medii solide;•medii semisolide (ex. mediu OMS, mediu cu gelatina);•medii deshidratate.

După provenienţă:•medii naturale (lichide: must de malţ, lapte; solidificate: cartof glicerinat); •medii artificiale sunt medii cu compoziţie chimică semidefinită, care conţin o bază naturală (lichide: bulion, apă peptonată; solidificate: geloză, gelatină).

Page 9: Bacteriologie LP 1

Denumire mediu Caracteristici Recomandare

Mediu Geloza nutritiva Mediu de cultura uzual care contine extract de carne, peptona, NaCl si agar

- mediu de cultură de uz general pentru cultivarea microorganismelor nepretenţioase

Mediu Geloză sange Mediu Geloza nutritiva cu adaos de sange de berbec defibrinat

- mediu de imbogatire, care permite cresterea majoritatii microorganismelor

Geloză Mueller-Hinton II (NCCLS)

Mediu geloza cu concentraţie foarte scăzută de tiamină şi timidină precum şi cu nivel corespunzător de Ca şi Mg

- mediu folosit pentru testarea sensibilităţii microorganismelor la antibiotice

Medii de cultivare a bacteriilor

Geloza chocolat geloză de bază suplimentată cu factori decreştere, după adăugarea sângelui mediul incalzeste la 80 °C timp de 10 min.

Neisseria, Haemophilus

Page 10: Bacteriologie LP 1

Bila Esculina Azida agar

- contine esculina, azida de sodiu (inhibitor pt. specii Gram-negative) si bila de bou (inhibitori de Gram pozitive)-este imbogatit cu hidrolizat enzimatic de cazeina, proteoza-peptona si extract de vita- hidroliza esculinei ajuta la detectarea streptococilor apartinand grupului D.

Izolarea speciilor de Enterococcus faecium si E. faecalis capabile sa hidrolizeze esculina, cu acumularea in mediu a unui precipitat negru rezultat din combinarea esculetolului cu citratul fericHidrolizeaza esculina in prezenta bilei

Baird Parker Agar

-contine extract de drojdie suplimentat cu complex de vitamine B care stimuleaza cresterea bacteriana, glicina si piruvat de sodiu pentru a stimula cresterea sp. de Staphylococcus. -telurit de potasiu si de clorura de litiu inhiba cresterea altor specii bacteriene decat Staphylococcus.

Izolarea stafilococilor coagulazo-pozitivi care se vor dezvolta sub forma unor colonii de culoare neagra prin reducerea teluritului de potasiu. Sp. de Staphylococcus care prezinta lecitinaza degradeaza mediu si se formeaza un halou in jurul coloniilor. O zona opaca de precipitat poate aparea datorita prezentei lipazei

Manitol Salt Agar (Mediu Chapman)

-Contine peptona, agar, continut mare de clorura de sodiu si indicator de pH rosu fenol

-Continutul mare de sare inhiba dezvoltarea microorganismelor, cu exceptia celor halofile

S. aureus coagulazo-pozitivi produc colonii inconjurate de o zona galbena stralucitoare, SCN produce colonie roz, fara zona de halou.

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 11: Bacteriologie LP 1

Denumire mediu

Caracteristici Recomandare

Mac Conkey

Agar

Contine saruri biliare ca inhibitori de crestere pentru specii bacteriene de coci Gram pozitivi si cristal violet ca

indicator de pH

Mediu de diferentiere a speciilor de enterobacterii lactozo fermentative (virajul culorii mediului la rosu) de

cele non-fermentative (virajul culorii mediului la galben)

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 12: Bacteriologie LP 1

Denumire mediu

Caracteristici Recomandare

Salmonella Shigella agar

contine lactoza, saruri biliare, citrat feric si indicator de pH- rosu neutru. Sarurile selecteaza bacteriile Gram –negative. Celelalte componente diferentiaza intre speciile Gram-negative.

E. coli fermenteaza lactoza din mediu, rezultand colonii roz.  (Nu produce hidrogen sulfurat).Membrii genului Salmonella nu fermenteaza lactoza, dar produc hidrogen sulfurat, rezultand colonii clare, cu centru negru. Membrii genului Shigella, nu fermenteaza lactoza, nu produc hidrogen sulfurat, deci vor determina aparitia unor colonii incolore.

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 13: Bacteriologie LP 1

Medii de cultivare a bacteriilorDenumire

mediuCaracteristici Recomandare

Mediu A.A.B.T.L (Bromothymol-blue Lactose Agar)

mediu fara inhibitori, lactozat si cu indicator de pH- albastru de brom timol.

-pentru diferenţierea coloniilor lactozo-pozitive de cele lactozo-negative

-folosit mai ales pentru Enterobacteriaceae (lactoza degradată în acid determină indicatorul de pH, albastru de bromothymol, să-şi schimbe culoarea în galben. Alcalinizarea produce o colorare albastră).

Mediu cromogen diferential

utilizat pentru evidentierea simultana a tuturor microorganismelor ce cauzeaza infectii de tract urinar.

Page 14: Bacteriologie LP 1

Mediul Löwenstein-Jensen (ou, cartof, verde malachit, asparagină, glicerină)

Medii de cultivare a bacteriilor

mediu pt. cultivarea micobacteriilor

Page 15: Bacteriologie LP 1

Mediile multitest

TSI – Triple Sugar Iron + indicator de pH

Fermentarea zaharurilor

Glucoza

Lactoza

Zaharoza

Detectarea tiosulfat-

reductazei

Fe SO4

Rosu fenol

Alte aspecte

Permit evidentirea simultana a mai multor caractere biochimice

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 16: Bacteriologie LP 1

Mediile multitest

MIU – Mobilitate Indol Ureaza

Opacizarea uniforma a mediului

Metabolizarea triptofanului cu producere de indol volatil

Inrosirea benzii de hartie de filtru

Metabolizarea ureei inrosirea mediului

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 17: Bacteriologie LP 1

Mediile multitest

MILF – Mobilitate Indol Lizin-decarboxilaza Fenil-alanin-dezaminaza

Metabolizarea triptofanului cu

producere de indol volatil

Inrosirea benzii de hartie de filtru

Opacizarea uniforma a mediului

Fermentarea glucozei – acumulare de acizi

Virajul culorii la galben (R -)LDC determina acumularea de cadaverina

Virajul culorii la violet (R+)

Adaugarea 1-2 pic FeCl3

Aparitia unui inel verde

Medii de cultivare a bacteriilor

Page 18: Bacteriologie LP 1

Medii de cultivare a bacteriilor

Mediu Agar Simmons Citrate: unica sursa de C (citrat de Na) +

indicator de pH (albastru de brom fenol)

Citrat +Citrat -

Page 19: Bacteriologie LP 1

Mediu Sabouraud - mediu selectiv utilizat pentru cultivarea drojdiilor, mucegaiurilor si a unor microorganisme acidurice

Medii de cultivare a fungilor