FOLOSIREA FLUOROCROMILOR PENTRU ENUMERAREA DIRECTA A BACTERIILOR TOTALE IN

PROBELE DE MEDIU: TRECUT SI PREZENT

Numararea numarului de bacterii si a biomasei este importanta pentru

intelegerea noastra datorita rolului ecologic al bacteriei in fiecare mediu.

Identificarea factorilor primari responsabili de aranjarea numarului de bacterii

reprezinta un scop important datorita ecologiei microorganismelor, prin urmare

este necesar o apreciere a metodelor. Bacterile au fost enumerate in mai multe

modurii din acele tehnici aplicate in sistemele dioverse. Tot mai mult

determinarea numarului de bacteri prin epifluorescenta a devenit metoda

preferata decat enumerarea lor pe placa. Epifluorescenta este cea mai frecventa

metoda care estimeaza numarul total de celule (incluzand celulele care nu sunt

viavile si moarte ) intr-o vasta varietate de situatii. In mod curent, cresterea

numarului de bacterii observate depind de tehnica de colorare si de

caracteristicile fizico-chimice ale probelor dar si de problemele cauzate de

investigatorul insusi.

In aceasta revizuire am sumarizat rezultatele obtinute pe parcursul unei

examinarii de 220 de lucrarii descriind studiile in care fluorocromii au fost colorati

prin epifluorescenta microscopica pentru a estima abundenta bacteriilor totale.

ACRIDIN ORANGE SI DAPI

UTILIZARE COLORANTILOR ACRIDIN ORANGE SI DAPI

Enumerarea directa a epifluorescentei este cea mai buna metoda valabila

pentru numararea bacteriilor totale in probele de mediu. Cei 2 fluorocromi cel mai

des intalniti in numararea directa a metodelor sunt: acridin orange si dapi. Cu

ambi coloranti, bacteriile sunt identificate nu numai pe baza de culoare dar si pe

baza de marime si forma. Acridin orange se leaga de ambii acizi nucleici AND si

ARN cu o stimulare de aproximativ 470 nm.

Atunci cand acridin orange se leaga de acidul nucleic monocatenar

(ARNm ), cand are loc sinteza ARNm, ARN-ul devine monocatenar. Atunci cand

AO se leaga de acizi nucleici monocatenari au epifluorescenta verde. AO se

absoarbe si pe particulele neanimate. Inca de la introducere, fluorocromul Dapi a

inlocuit rapid AO ca cel mai frecvent colorant bacterian pentru o gama larga de

tipuri de probe.

TIPURI DE PROBE

Microbiologi sunt adesea interesati in determinarea si intelegerea

organismelor abundente in habitatele speciale sau tipuri de probe. Folosirea mai

devreme a epifluorescentei microscopice a intampinat implicarea muncii lui

Struger si enumerarea bacteriilor in solurile suspendate. El a folosit AO prin ani

1940 si a fost creditat cu publicarea a uneia dintre primele avantaje ale AO peste

coloranti folositi anterior, adica abilitatea de a distinge celulele bacteriene din

amestecarea particulelor de sol din bazele culorii. Enumerarea microscopiei

directe a aratat ca numarul bacteriilor capabile sa formeze colonii pe mediile

neselectate sunt de obicei de numarul ordinelor mai putin decat cele prezente

metabolic active in diferite medii: apa dulce, apa marina si sol. Astfel, metodele

imbunatatite au dat o semnificatie bacteriilor heterotrofice in ambele medii,

terestre si acvatice.

Alte studii, in 1970 au comparat eficientele AO cu al altor coloranti si in

acest timp AO a fost acceptat. Procedurile de numararea directa a

epifluorescentei implicand AO sau Dapi au fost utilizate pe o diversa colectie de

probe variind de la solul din Antarctica la tesuturile de stridii omogenate. Cea mai

multa munca s-a facut pe teren, probele revenind in laborator pentru numararea

bacteriilor. Tehnica standard a AO folosita a fost dezvoltata initial pentru probele

apei de mare. Dapi a fost folosit in principal cu probe de apa sarata sau apa

dulce. Ambii coloranti AO si Dapi au fost folositi pe larg cu sedimente acvatice, si

o recenta revizuire a factorilor, controland numarul bacteriilor si productia in

sedimentele marine si de apa dulce citeaza abundenta de date a bacteriilor in 26

de studii, 25 din care au folosit ambii colorantii AO si Dapi pentru a obtine

rezultate. Lucrarile examinate in cadrul prezentarii, relativ putine, au descris

studiile in care metodele privind colorantul Dapi a fost folosit cu probe naturale,

desi acestea pot reflecta un investigator in tipul de literatura revizuita.

EVOLUTIA / DEZVOLTAREA ISTORICA

Evolutia in numararea epifluorescentei bacteriene directe mai ales intre

anii 1940 - 1970 include imbunatatirea procedurilor de colorare a celulelor. In

acel moment, fluorocromul AO a dat cele mai bune estimarii ale numarului de

celule. Munca lui Strugger in 1940 (cu soluri bacteriene) si a lui Jannasch in 1950

-1960 (bacteriile procariote) au aratat AO ca fiind un colorant bacterian eficace.

Pentru bacteriile din sol cativa cercetatorii au gasit isotiocianatul de

fluoresceina pentru a oferi o numarare mai superioara decat cea a AO, in timp ce

altii au observat alte lucrarii opuse. Alte studii in 1970 au comparat eficientele AO

cu al altor coloranti si in acest timp AO a fost acceptat ca fiind cel mai bun

colorant bacterian. Un progres major in enumararea epifluorescentei a fost prima

utilizare a filtrului de membarana Nucleopore.

Ideea numararii bacteriei directe urmarind concentratia pe filtrul de

membrana, dateaza de mult mai devreme. Oarecum celulele bacteriene devin

integrate si imposibil de numarat pe suparfetele aspre ale filtrului celulozic

traditional folosit, si Hobbie et al. obtine numararea de 2 ori mai mare folosind

filtrul nucleopor neted.

Desi filtrul Nucleopore a fost folosit devreme, pastrarea filtrului

transparent de a reduce fondul, fundalul fluorescentei a facut aceasta metoda ca

fiind consumatoare de timp (a durat prea mult).

Au fost publicate 144 de lucrarii inca de la 1977 unde au fost descrise

studii cum AO a fost folosit. Ramsay a imbunatatit tehnica lui Zimmerman si

Meyer-Reil, in care bacteriile sunt colorate dupa ce sunt filtrate in solutie (filtrare -

colorare metoda opusa metodei de colorare-filtrare). A gasit faptul ca densitatile

de bacterii au fost mult mai putin variabile decat activitatea curenta heterotrofica,

exprimand pentru fiecare baza de celula, in ambele probe de apa dulce si

marina. In prealabil, probele acvatice au fost enumerate de metoda de filtrare –

colorare.

Gradul succesului a fost realizat in aplicarea precedenta a tehnicii de

colorarre a AO de a extinde o varietate de tipuri de probe, cum ar fi bacteriile

epifite. 64 de lucrarii descriind studiile in care Dapi a fost folosit in colorarea

bacteriilor au fost revizuite.

S-a estimat faptul ca intre anii 1940 - 1980, circa 90% din enumerarea

bacteriilor directe a fost efectuata urmarind colorarea cu AO. Jones a raportat

faptul ca AO si isotiocianatul de fluoresceina au fost cei mai comuni fluorocromi

folositi. In ultima decada, Dapi a luat in mare masura locul altor fluorocromi non-

acridini (inclusiv isotiocianatul de fluoresceina).

Studiile care au implicat numai AO sau Dapi, 50% au folosit Dapi inca

din 1980 avand in vedere faptul ca peste 70% au folosit Dapi din 1998. Acestea

indica faptul ca Dapi rapid inlocuieste AO ca colorant bacterian.

METODELE PENTRU ENUMERARAREA DIRECTA

CONSERVAREA

Probele pentru enumerarea bacteriana ar trebui sa conserve urmatoarele

colectari pentru evitarea schimbarii in numar, marime, si forma a bacteriei care

se intampla rapid cu pastrarea. 150 de publicatii, aleator revizuite pentru

informatii privind conservarea de probe pentru numarul de bacterii directe prin

microscopia epifluorescenta fie cu Dapi sau AO, relatate fiind 45 de publicatii

care nu contin absolut deloc nici o informatie de conservare a probei sau de

fixare. Marea majoritate a raportat conservarea cu solutia aldehida. Cel mai des,

frecvent conservant folosit este formalaldehida (FMA) care actioneaza pentru a

intarii celulele bacteriene astfel prevenind daune in timpul omogenizarii sau

sonificarii.

Aldehidele functioneaza prin conectarea proteinelor in membranele

celulelor astfel imbunatatind rigiditatea celulelor bacteriene. FMA este un gaz la

o temperatura de -21°C, in timp ce formalinul este un lichid comercial disponibil,

forma a FMA.

FMA este de asemenea disponibila ca un polimer solid,

paraformalaldehida, dar acest lucru a fost rareori folosit pentru probele de

conservare. Glutaraldehida folosita (GTA) a fost raportata in 20 din 105 lucrarii si

numai 3 lucrarii au raportat folosirea si conservarea nonaldehidei.

Conservantii sunt de multe ori fosfati, acetati, borati sau NaCl tamponat si

tamponari alcaline ale conservarii sunt recomandate pentru evitarea degradarilor

acizilor nucleici si rezultatele lizei celulelor din descompunerea aldehidei

corespunzatoare a acestor acizi in prezenta oxigenului molecular. Folosirea

conservarii aldehidei tamponate a fost descrisa in 20 de lucrarii din 150. In

anumite cazuri, folosirea FMA ca o conservare este contraindicat.

Pigmentul clorofila autofluorescent ar putea scadea in termen de 24 de h

urmand conservarea in 1% FMA. Prin urmare conservarea in 1% GTA este

recomandata daca diferenta dintre microorganismele fototrofice si heterotrofe

sunt dorite. GTA este frecvent folosita la o concentratie de 1% cu toate ca Clarke

si Joint nu au gasit nici o schimbare in numarul celulelor.

Conservarile alternative sunt recomandate pentru microorganismele

nonbacteriene; acestea incluzand fixatorii Van Der Wals, mixtura de tiosulfat

lugol-formalin, 4 % gheata rece GTA, fixator tetroxid GTA osmium si combinatii

GTA paraformalaldehida.

Toti acesti conservanti ar trebui sterilizati prin filtre inainte de utilizare

pentru a evita contaminarea probei. Desi probele de sol sau sediment sunt

cateodata inghetate, toate tipurile de probe sunt din puct de vedere chimic

normal conservate. Aceste probe conservate sunt bine pastrate la frigider (4/5°C)

in intuneric. Fray raporteaza conservarea cu succes a apei marii si sediment

marin in 0,2% Fma pentu 10 zile cu nici o schimbare semnificativa in numarul

bacteriilor sau biovolum.

Probele de apa inmagazinate la 5°C in 2% FMA ofera consistenta in

numararea AO pentru una sau doua saptamani. Oricum, numarul descresterii

AO a fost observat in termen de 40 de zile de la pastrarea in GTA, si

descresterea numarului Dapi al probei de formalin fixata au fost observate

inauntrul refrigerarii.

Odata diapozitivele pregatite, longevitatea probelor pot depinde de fiecare

fluorocrom care a fost folosit. Diapozitivele preparate din probele de apa de mare

pot fi depozitate ingetate (-20°C) pana la 70 de zile fara nici o pierdere

apreciabila in numarul celulelor.

DISPERSAREA (imprastierea)

Munca recenta a fost solutionata cu examinarea probelor ce detin

sedimente sau alte particule moarte care ar putea interveni cu vizualizarea

microorganismelor. Inainte de aparitia particulelor de dispersare si tehnicii de

filtrare, frotiurile sol-agar au fost pregatite pe lame la microscop, colorate clatite si

observate direct. De obicei mai multe tehnici sunt folosite sa disperseze

particulele atasate bacteriilor in sol sau in sedimentele rezidurilor.

Bacteriile atasate pe suparfete pot fi indepartate ca o suspensie de

numarare directa dupa filtrare. Dispersarea si dezagregarea sunt importante

pentru ca numararea se face corect si pot fi obtinute daca celulele sunt distribuite

in filtre. In acest caz colorarea bacteriana devine a doua parte a unui proces de

doua etape, primul care implica separarea microorganismelor din particulele

minerale si detritus.

Amestecarea, ultrasunetele cu cavitatii sau alte tratamente omogenizate

de proba sunt adeseori combinate cu dispersanti chimici ca tensioactivi Tween

80, Na4PPi sau Triton X-100. Au fost testate si comparate diverse mecanisme

care implica agitarea fizica a probelor, dupa cum recomanda Scheraga, folosind

0.00001% cetil trimetil amoniu brom. Mecanismele diverse au implicat agitarea

probelor pentru a ajuta dispersarea, iar diferitele metode au fost recomandate

pentru diversele tipuri de probe.

Omogenizarea mecanica poate fi cea mai buna modalitate de a extrage

bacteriile din sedimente, particule de nisip, particule de sol si de pe suprafata

planteleor. In ceea ce priveste sedimentele marine, Kuzhinovskii a concluzionat

ca tratamentul preliminar cu ajutorul sonificarii a fost esential inainte de colorarea

AO.

Dale a observat ca omogenizarea sedimentelor interstitiale ( 5 minute la

23,000rpm), oarecum, in mod constant a dat un numar mai mare de celule decat

a facut ultrasonificarea, slefuirea sau agitarea de mana. A fost descrisa astfel o

metoda complicata ce necesita mult timp pentru sol si sedimente implicand

omogenizarea si gradientul de densitate al centrifugarii.

Epifitele sau alte bacterii de suprafata asociate pot fi desprinse si

dispersate prin utilizare unui omogenizator. Probele sunt puse in pungi sterile cu

apa diluata; pungile sunt apoi puse in omogenizator, unde sunt puternic indesate

de paletele masinii. Pentru diferitele tipuri de probe, Velji si Albright au descoperit

ca sonificarea dupa 15-30 de minute de pre-tratare in NaPPi (0.1 sau 0.01M

depinzand de tipul de proba) a fost superioara fata de vortex-ul de amestecare

cu sau fara NaPPi.

Bacteriile au mai fost extrase si din particule de sediment folosind un

procedeu cu ultrasonificare, reusind astfel pentru o durata de 2,5 minute sa se

obtina un randament optim. In concluzie sunt recomandate, in majoritatea

cazurilor, desprinderea, dezagregarea si dispersarea uniforma a bacteriilor prin

combinatia de tratamente chimice si fizice.

FILTRE DE MEMBRANA

Filtrele din membrana policarbonata Nucleopore au fost in mod obisnuit

folosite pentru numararea directa spre deosebire de cele din filtrele de

membrana de oxid de aluminiu Anopore, care desi permit folosirea la presiuni

mai mici in vid nu sunt la fel de frecvent folosite datorita costului ridicat.

Filtrele de policarbonat s-au dovedit superioare filtrelor de acetat de

celuloza, desi mai devreme s-a facut un studiu de comparatie intre filtre,

recomandand ambele filtre: filtru de celuloza-ester si filtrul de membrana

policarbonat. Bowden a descoperit ca numararea bacteriilor estuare pe filtrul de

memrana Nucleopore 0.2-µm au fost semnificativ mai mari decat numararea pe

0.2-µm pe filtrul de celuloza Sartorius, in timp ce Pomeroy et al. nu a gasit nici o

diferenta semnificativa intre numararea celor doua tipuri de filtre.

Numararea pe filtrul Nucleopor nu a fost in mod semnificativ diferit din

cele obtinute prin scanarea microscopiei electronice in studiile lui Bowden.

Filtrele ar trebui sa fie predominant negre pentru a reduce fluorescenta din fundal

si a oferii un contrast mai ridicat pentru numararea bacteriilor. Predominanta

filtrelor ar trebui sa fie dobandite, desi filtrele necolorate pot fi usor colorate

inainte de utilizare. IB (acidul negru 107,2 litri -1 in 2% acid acetic), frecvent folosit

pentru colorarea acestora. Am folosit cu succes colorarea filtrului Nucleopr cu IB

pe placi petri de la 2-24 h.

Colorarea filtrelor in acest fel ar trebui clatita in filtre sterilizate cu apa

inainte de utilizare, si predominanta filtrelor negre ar trebui de asemenea udate

inainte de aditia probelor. Puterea de presiune la vid aplicata ar trebui sa fie

redusa la minimum pentru a evita ruptura celulelor fragile, liza si penetrarea in

membrana, de aceea multi cercetatorii recomanda ca filtrarea in vid sa fie facuta

la mai putin de 80 mm Hg.

S-au folosit filtre cu dimensiunea de pori de 0.2µm desi multe celule

bacteriene treceau prin aceste filtre. In prezent sunt disponibile filtrele din

membrana policarbonata cu o dimensiune a porilor de 0.1µm dar folosirea lor

pentru numararea bacteriilor din probele de mediu nu a fost intalnita in literatura

de specialitate. Folosind microscopia electronica, Bae et al. observa faptul ca

mici cocobacili (<0.3µm in diametru ) formeaza 72% din populatiile bacteriene din

solul natural si faptul ca multe celule au avut mai putin - 0.08µm diametru, prea

mici pentru a fi vazute de lumina standard sau prin tehnica epifluorescenta

microscopica.

De asemenea, sistemele marine oligotrofice sunt dominate de

“ultramicrobacterii” planctonice mici, mai putin de 0.3µm in diametru. Aceste

bacterii cresc incet dar nu se dezvolta in marime chiar si atunci cand cresc in

substante nutritive bogate. In rezervoarele de apa, celulele bacteriene cu latimi

mai putin de 0.18µm contribuie cu circa 20% din biomasa totala de bacterii, in

timp ce majoritatea celulelor au fost intre 0.09 si 0.25µm lungime.

CONCENTRATIA CULORII SI TIMPUL EXPUNERII

Jones si Simon a concluzionat faptul ca pentru o durata de 5 minute

adaugand 10µg de AO ml-1 a fost cea mai buna metoda pentru colorarea

bacteriilor acvatice, cu toate acestea majoritatea cercetatorilor au decis sa isi

expuna probele la o concentratie mult mai mare, lucru recomandat pentru

probele ce contin sedimente. Colorarea probelor este in general mai scurta la AO

fata de Dapi. In plus pentru efectul de conservare si pastrare a biovolumelor

bacteriene, tipul de fluorocromi folositi influenteaza dimensiunea celulelor

precum si numarul de bacterii observate. Acest lucru trebuie luat in considerare

atunci cand este dorita o estimare a biomasei bacteriene.

Volumul total al probelor de lichid filtrate sunt de asemenea importante atat timp

cat afecteaza egalitatea distribuirii bacteriilor pe suprafata filtrului. Este

recomandat un volum de minim 2 ml pentru filtrele cu membrana ce au un

diametru de 25mm, dar si volume de la 5-10ml sunt preferate de asemenea.

Probele sunt diluate usor cu particule de apa (0.2µm por – marime filtrata)

inainte de colorare si filtrare; oricum, aplicarea volumului de AO sau Dapi trebuie

sa fie ajustate in consecinta pentru a mentine o concentratie de colorare

adecvata.

Variabilitatea ridicata atat in concentatia culorii cat si in timpul expunerii indica o

necesitate a unei metode standard chiar si pentru cele mai uzuale tipuri de

probe. Concentratia culorii variaza pana la 3 ordine de marime chiar si pentru

acelasi tip de proba. De aceea unii cercetatorii coloreaza intr-o lumina

ambientala in timp ce altii recomanda ca lucrul acesta sa fie facut in intuneric.

Variatia in tehnicile de colorare, tipuri de filtre, tipuri de colorare,

concentratia si timpul expunerii , metodele de numarare post–preparate pot

influenta rezultatele.

Oricum, aici, este o impresie predominanta ca microscopia fluorescenta a

condus la un acord intre descoperiri si faptul ca exista o “omogenitate

metodologica” standard. Momentan numeroase metode sunt la fel de acceptate.

METODE DE NUMARARE

In dorinta de a standardiza procedura de numarare, recent au fost

descrise mijloace diferite pentru mascarea particulelor sediment. Amplificarea la

care celulele au fost enumerate a fost raportata in 35% din lucrarile revizuite.

Amplificarea mediana si modala folosita pentru numararea directa a bacteriilor pe

filtrul de membrana a fost ×1,250(categorie, ×540 la ×1,875, n=53).

Tipic, bacteriile sunt numarate in interiorul patratelor a unor graticule

oculare, exceptand marginile extreme ale filtrului. In mod traditional, cercetatorii

au numarat un numar de celule pe suprafetele superioare ale particulelor opace

si pur si simplu au dublat acest numar, asumandu-si faptul ca numarul egal de

bacterii au fost in ambele locuri la orice particula minerala sau detrituala.

Probele tulburi ar trebui diluate astfel incat proportia de pe campul

acoperit de particule nu ar trebui sa depaseasca 40-70%. Recent, diversele

mijloace de numarare pentru efectul de mascare ale particulelor de sediment sau

detrituale au fost descrise in tentativa de a standardiza procedurile de numarare.

Literatura a fost impartita in mod egal intre studii, in care au fost gasite un

numar minim de celule (52%) sau un numar minim de domenii de grile (51%).

Grilele oculare sunt frecvent folosite pentru a delimita un domeniu al

campului in care celulele vor fi numarate. Precizia numararii depinde de numarul

de bacterii numarat. Cei mai multii cercetatorii numara cel putin 400 de celule

/filtru, desi unii investigatorii au descoperit ca putine celule trebuiesc numarate.

Frecvent, minim 200 celule/filtru trebuiesc numarate.

Un studiu ce examineaza diferitele niveluri de replicare a numararii

sedimentelor bacteriene a constatat ca s-au obtinut rezultate mai bune prin

numararea a cinci domenii cu aproximativ 30 de celule pe domeniul pe patru filtre

replicate decat prin numararea tuturor bacteriilor in 20 de domenii pe un singur

filtru.

Lebedeva si Shumakova au observat distributia empirica ce a afisat

diferente statistic semnificative din distributia teoretica a lui Poisson. Acestia doi

au pregatit o nomograma, facand posibila determinarea numarului de campuri ce

trebuiesc numarate la o concentratie data pentru a pbtine un grad de acuratete.

Majoritatea lucrarilor publicate descriu experimente in care bacteriile au

fost numarate in minim 10 sau 20 de campuri sau grile. Pentru numararea bazata

pe cateva campuri si grile este bine sa se amestece probele la un punct pentru a

obtine mai putin de 50 de celule/camp sau grila. Pentru o considerare completa a

impactului de numarare si a strategiilor pentru prelevarea probelor nu poate fi

ignorat studiul lui Kirchman care examinand variatia numarului la diferitele

niveluri de replicare a descoperit ca, variatia de a lungul campurilor microscopice

a crescut de la 62-80%.

PROBLEME CAUZATE DE INVESTIGATORUL INSUSI

O problema importanta si rar dezbatuta este investigatorul insusi introdus

de observarile diferite la microscop. Diferentele de estimari depind de

interpretarile individuale a ceea ce constituie numararea celulelor bacteriene.

Pentru a aborda partial problema de subiectivitate implicata in

identificarea obiectelor de fluorescenta ca celulele bacteriene, noi am evaluat

date de numarare obtinute de la trei observatori diferiti lucrand in laborator.

Fiecare individ a examinat acelasi 10 lame pregatite urmarind aplicatia

colorantului Dapi.

Probele de apa au fost obtinute din Sayers Lake, Centre County, Pa., pe

durata lui septembrie si octombrie 1989. Densitatea bacteriilor obtinuta de cei trei

observatori nu este semnificativ diversa. Tendintele generale in estimarea

densitatii bacteriene au fost in concordanta intre observatori. De exemplu,

probele 2 la 5 si 10 au avut cel mai mic numar bacterian pentru cei trei

investigatorii in laboratorul nostru.

Din moment ce variatia numarului poate fi partial atribuita celulelor

distribuite neuniform pe suprafata de filtrare, putem spune ca problemele cauzate

de investigatorul insusi este astfel sustinuta. Nu toate campurile contin acelasi

numar de celule si domenii.

PROBLEMA METODELOR

Diferentele de numarare bazate pe alegerea culorii sunt intalnite in diverse

lucrarii in care au fost comparate culorile bacteriene incluzand Dapi sau AO. Intre

timp alte potentiale diferente semnificative raman trecute cu vederea. Urmarind

acest scop Schallenberg adreseaza probleme asociate cu colorantul Dapi si

efectele particulelor de mascare intalnita, cand se lucreaza cu particule de

sedimente.

Similar, Suzuki et al. a aratat faptul ca, colorantul Dapi numara in medie

70% decat numara AO in probele de apa de mare. Precedentul lucru a indicat

deja ca AO poate da randament mai mare in numarare decat Dapi in probele de

apa de mare. Aparent, anumite celule strict colorate cu AO nu sunt vizibile

ulterior daca se va proceda la folosirea asuptra lor a colorantului Dapi. Cu toate

acestea mecanismele responsabile si rezultatul numararii din anumite tipuri de

probe de mediu raman necunoscute.

O metoda de numarare directa cu ajutorul epifluorescentei pentru

enumerarea tuturor bacteriilor folosind AO a fost aprobata de “Standards Metod

Committee of the American Public Health Association – Comitetul Metodelor

Standard Al Asociatiei Americane de Sanatate Publica “, iar un protocol similar a

fost aprobat ca “Ameriucan Society for Testing and Material Standard Test

Metode”.

Daca tendintele actuale continua, cercetatorii ar putea sa inceapa sa vada

urmatoarele: “Bacteriile au fost enumerate de numararea microscopica directa “,

ca un succint inca suficient “detaliat”, descriere a metodei utilizata.

O PROCEDURA GENERALIZATA

REACTIVI

(i) Fixatorul:10%(wt/vol) Pi- GTA tamponata

0.40 g de NaH2PO4

1.23g de NaHPO4

80 ml H2O distilata

20 ml din 50%(wt/wt)GTA

(ii) Dispersanti:0.1 M tetrasodiu Ppi

44.61g de Na4 P2 O7.10H2O

1.0 litri H20 distilata

(iii) Culorile fluorocromilor: solutie de stoc

100µg Dapi ml -1

10 mg Dapi

95 ml H2O distilata

5 ml din 50%(wt/wt) GTA

Sau

1,000µg AO ml-1

100mg AO 95 ml H2O distilata

5ml din 50%(wt/wt)GTA

Solutie de stocare in intuneric la 4°C

(iv) IB solutie:

0.2g IB

95 ml din 2% acid acetic

5 ml din 50% (wt/wt)GTA

(v) Ulei de imersie: nu este fluorescent, uleiul de imersie neuscat;

( tipul FF; Laboratorul Cargille Inc. )

(vi) Reactivul de conservare: 50% (wt/wt) GTA

Apa diluata si culoarea trebuiesc pastrate cu glutaraldehida (concentratie

finala, 2.5%). Reactivii, altii decat uleiul de imersie trebuiesc pastrati la rece (4°C)

in intuneric si in filtrul de sterilizat chiar inainte de utilizare. Totii reactivii trebuie

sa fie sterili, particule libere, si la temperatura camerei (21°C ) inaintea utilizarii.

APARATURA

(i) Microscopul epifluorescent: iluminator UV si camp neted 100×ulei

de imersie, obiectiv fluorescent liber cu diafragma inalta numerica. Amplificarea

minima totala din ×1,000 este solicitata, desi ×1,250 este preferata.

(ii) Filtre de lumina: combinarea de excitatie si filtrul de bariera; pentru

AO excitatia albastra; pentru Dapi, excitatia UV.

(iii) Graticul ocular: etapa micrometrica calibrata 10, grila wipple, sau

echivalenta.

(iv) Filtru de membrana: 25 mm diametru, 0.2µm predominand filtrul de

membrana policarbonata neagra.

(v) Filtre de sustinere fizica: 25 mm diametru, 1.0 la 8.0µm acetat de

celuloza sau alte filtre celulozice.

(vi) Filtru de aparatura turn: 25 mm filtru de sustinere, o reglementata

pompa de vid.

(vii) Pipete: 0.1-, 1.0 -, si 5.0 ml pipete si extremitati de pipete sterile;

micropipete si extremitatii sterile pentru distribuirea volumelor de la 10 la 100µl.

(viii) Siringi: 5 ml, siringi de unica folosinta sterile si filtre.

(ix) Mixerul vortex si unul dintre dizpozitivele mecanice dispersante: baie

cu ultrasunete (Bransonic), tocator, blendar sau omogenizator, sonda de tip

sonicator, dismembranator sonic modelul 300 (Fisher Scientific).

Procedura

(i) Colectarea de probe in recipiente sterile si pastarea lor cu GTA

tamponata (concentratie finala, 1%).

(ii) Daca predominarea filtrelor de membrana sunt indisponibile atunci

filtrele normale trebuiesc colorate intre 2-24 h in solutie IB intr-o placa

petri sterila. Se clateste filtrul cu solutie colorata IB de doua ori steril,

particule libere de apa distilata inainte de utilizare.

(iii) Inainte de colorare se permite probelor si altor reactivii sa ajunga la

temperatura camerei.

(iv) Se disperseaza bacteriile si se perturba agregatele bacteriene prin

adaugarea de PPi (concentratie finala, 0.01 M ) si tratarea probei cu

dispozitivul de dispersare ales( baie de sonoficare, tocatorul).

Probele de sediment si sol vor necesita predilutie in particulele libere

sterile de apa. Trebuie sa avem grija sa evitam supraincalzirea

probelor sau afectarea celulelor cu tratamentul excesiv de dur pe

parcursul omogenizarii.

(v) Volumul de probe pentru colorare trebuie ajustat pe baza densitatii

bacteriene, iar aceasta trebuie sa fie determinata printr-un proces de

incercare si eroare. Probele de volum cuprinse intre 0.05 - 5.00 ml

sunt adecvate pentru cea mai naturala suprafata de proba de apa.

Folosirea lui Dapi la finalul concentratiei de colorare 0.1µg ml -1 pentru

probele acvatice relativ curate si 0.5µg ml -1 pentru probe purtatoare

de sediment, suspensii de epifite, sau alte probe care contin proportii

mari de particule materiale nonbacteriale.Concentratia finala de

100µg ml-1 este suficienta pentru toate tipurile de probe cand folosim

AO. Daca fluorescenta bacteriana este prea neclara, concentratia

fluorocromilor poate fi crescuta.

(vi) Colorarea probelor in filtrul de aparatura turn pentru a preveni o

sursa suplimentara a probelor contaminate. Combinarea diluatului

H20, probe, si florocromi (Dapi sau AO) pentru a obtine volumul total

de lichid nu mai putin de 2.0 ml. De exemplu, pentru a colora 0.50 ml

apa lacului cu Dapi, se adauga 1.48 ml diluant H2O, 0.50 ml proba

pretratata, si 20 µl din 10 µg.ml-1 Dapi.

(vii) Efectuarea colorarii intr-o camera intunecata. Imediat dupa

adaugarea culorii, agitati prin rotire continutul pentru a amesteca

culoarea cu probele; permiteti AO sa reactioneze ciu probe timp de 3

minute (Dapi timp de 7 minute).

(viii) Dupa timpul alocat de colorare, scurgeti continutul palniei prin filtrul

turn sub vidul scazut (<30mmHg[<4.0kPa]).In cazul in care continutul

dureaza mai mult de 1 sau 2 minute sa treaca de filtru, probele vor

necesita o diluare suplimentare. Chiar inainte ca probele sa treaca de

filtru, clateste in jurul bazei filtrului de palnie cu doua aliquouts

separate (1.0 ml fiecare ) de apa diluata. Continua vidul inainte ca

toate lichidele sa dispara.

(ix) Eliberarea vidului, desamblarea aparaturii al filtrului turn si inlaturarea

membranei filtrului cu o penseta. Filtrul de sustinere poate ramane in

vigoare si refuzat.

(x) Se pune o picatura mica de ulei de imersie pe o lamele din sticla

etichetata in mod corespunzator. Pune o alta picatura de ulei de

imersie in partea de sus a filtrului negru de membrana, si se acopera

cu o bucata de sticla curata. Permiteti uleiului sa se raspandeasca, si

apasati usor ca bulele de aer ce se afla dedesupt sa iasa, daca este

necesar.

NUMARAREA SI CALCULAREA

(i) Este recomandat ca lamele sa fie numarate cat mai curand posibil,

urmand pregatirea, in mod ideal in aceeasi zi.

Lamele trebuie sa fie pastrate la rece (4°C) si minimizarea expunerii lor la

lumina.

(ii) Determinarea domeniului de filtrare eficace a aparatului utilizat. Numai o

proportie din 25 mm diametru din domeniul filtrului este valabil pentru depunerea

de celule in interiorul diametrului filtrului turn este intotdeauna mai mic decat 25

mm.

(iii) Determinarea domeniului din campul grilei, sau graticula ocularului ce va

fi folosita la numarare folosind etapa micrometrica.

(iv) Numarul de celule care se incadreaza in cadrul grilei in mod aleatoriu

sunt localizate in campuri. Pentru a evita problemele cauzate de investigatorul

insusi, probele nu ar trebui observate cand campurile sunt pe cale sa se

schimbe. Este recomandat sa se numere cel putin 400 de celule/filtru care se

incadreaza la un minimum de 20 de campuri. Cand AO este folosit toate celulele

ar trebui numarate indiferent de culoare (portocaliu, rosu sau verde ).

(v) Este necesar un dispozitiv pentru a urmarii numarul bacteriilor si al

grilelor observate. Bacteriile sunt mai usor de numarat intr-o camera intunecata.

(vi) Calcularea densitatii bacteriene in probele originale folosind formula

Bacteria (celule/mm) = (N×At)/(d×Vf×G×Ag)

Unde:

N = numarul de celule numarate

At= suprafata efectiva a filtrului (milimetru patrat sau micrometru patrat)

Vf = volumul de filtru al probei diluate (milimetri); d= factorul de diluare

(Vfinal/Vproba) (motivul pentru care adausul de conservant si dispersant precum

si orice dilutie inainte de utilizarea probei in filtru turn ).

Vf = volumul probelor diluate

Ag = aria grilelor numarate

Recomandam pregatirea si numararea a doua filtre/proba. Densitatea bacteriana

obtinuta din spatiile adecvate ar trebui dedusa din densitatea finala calculata. De

obicei, densitatea celulelor din probele de sediment si sol sunt convertite la

numerele de celule/volumul sedimentului sau numarul/masa solului.

Densitatea de bacteri asociata cu suprafata este de obicei exprimata ca

numar pe unitatea de suprafata (milimetru patrat).