1

CURS VII

CULTURA DE PROTOPLAŞTI ŞI HIBRIDAREA SOMATICĂ

Cultura de protoplaşti Din sistematica vegetală şi animală se cunoaşte faptul că speciile sunt delimitate prin

bariere de incompatibilitate sexuală, ceea ce reduce posibilităţile de încrucişări interspecifice. Creşterea variabilităţii genetice, atât de necesară în lucrările de ameliorare şi selecţie,

implică găsirea unor metode de rupere a barierelor de incompatibilitate care izolează speciile între ele. Aceasta a devenit realizabilă prin crearea de protoplaşti din celulele somatice izolate şi fuziunea lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice şi mitocondriale.

La ţesuturile vegetale, membrana celulozică şi stratul petic care asigură sudura dintre celule face imposibilă manipularea directă a celulelor în scopul fuzionării lor. De aceea s-a urmărit găsirea unor tehnici de dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungând la forma de protoplaşti.

Definiţie. Protoplaştii sunt celule somatice „nude” lipsite de membrane pectocelulozice rigide (perete celular) care au capacitatea de a fuziona, de a se divide în continuare şi de a da naştere la noi plante.

Primele încercări de rezolvare a protoplaştilor din ţesuturile vegetale au fost făcute de Klercker (1892) care a elaborat metoda mecanică de separare a celulelor prin plasmolizare totală şi microdisecţia membranelor. Această metodă era însă traumatizantă şi puţin eficientă.

Mai târziu, în 1960, Cocking în Anglia, Otsuki şi Takebe (1969) în Japonia au elaborat metoda enzimatică de producere a protoplaştilor, metodă în care se folosesc enzime extrase din microorganisme ce digeră peretele rigid al celulelor vegetale.

Metoda elaborată de Cocking, utilizată până în prezent, permite obţinerea unei cantităţi mari de material biologic modificat, cu menţinerea viabilităţii şi structurii nealterate a celulelor.

Takebe (1971) a obţinut primii protoplaşti viabili, prin digerarea enzimatică a membranelor celulozice de la celulele frunzelor de tutun. Au urmat realizări privind obţinerea de protoplaşti la Daucus carota (morcov) - Grambow (1972) şi la Petunia hybrida (Hess,1973).

Protoplaştii pot fi izolaţi din toate organele şi ţesuturile plantelor, mai ales din mezofilul frunzelor, ţesuturi epidermale, rădăcini şi nodozităţi ale rădăcinilor, muguri, petale, grăuncioare de polen în curs de germinare, fructe, seminţe şi din ţesuturi cultivate „in vitro”.

Materialul cel mai utilizat este reprezentat de frunze de la care se ia epidermă inferioară prin jupuire sau printr-un tratament enzimatic. Dintr-un gram de frunze proaspete se pot obţine circa un milion de protoplaşti şi câteva milioane de plante noi.

Mai recent, au început să fie utilizate fragmente de calus, izolate din culturi de ţesuturi „in vitro” (care au o creştere rapidă dacă sunt asigurate condiţii riguros controlabile).

Protoplaştii se obţin de obicei prin tratarea ţesuturilor vegetale genitoare, secţionate în fragmente înguste, în condiţii aseptice, cu un amestec de enzime, capabile să degradeze peretele celular, în soluţii care conţin stabilizatori osmotici (protectori) necesari pentru a păstra structura celulară şi a menţine viabilitatea acestora. Principalii stabilizatori osmotici folosiţi în doze reduse sunt: manitol, sorbitol, amestec de polivinilpirolidină (2%) cu zaharoză.

Tehnologia culturilor de protoplaşti Tehnologia culturilor de protoplaşti necesită cunoaştera şi stăpânirea completă a

diferitelor etape care pornesc de la explantul donor până la planta regenerată: obţinerea de protoplaşti viabili; regenerarea pereţilor celulari; inţierea diviziunilor celulare; menţinerea diviziunilor până la obţinerea microcalusurilor; regenerarea plantelor din aceste calusuri.

2

Etape ale cultivării protoplaştilor 1. Izolarea protoplaştilor se poate realiza prin 2 metode: - metoda mecanică (presupune tăierea ţesutului vegetal plasmolizat în

prealabil, în fâşii subţiri şi microdisecţia membranelor) - metoda enzimatică Izolarea protoplaştilor prin metoda enzimatică În compoziţia peretelui celular au fost identificate 3 componente de bază: celuloză,

hemiceluloză şi substanţe pectice. De aceea, după o plasmolizare uşoară, pentru izolarea protoplaştilor se folosesc trei categorii de enzime: pectinaze, celuloze şi hemiceluloze care sunt introduse în ţesuturi prin metoda infiltraţiei „in vacuum”. Aceste enzime cu activitate hidrolizantă sunt extrase din microorganisme (Aspergilus niger, Trichoderma viride) şi dispersate în soluţii apoase cu concentraţii cunoscute. În prezent produsul comercial cel mai utilizat în tehnologia protoplaştilor este celuloza Onazuka R-10, iar dintre pectinaze o largă utilizare o au preparatul Macerozyme R-10). Tratamentul cu enzime se realizează timp de 4-18 ore, la temperatura de 25-27 0C, pentru a asigura hidrolizarea pectinelor şi a moleculelor de celuloză din membrane.

Între factorii implicaţi în izolarea cu succes a protoplaştilor vegetali, pe lângă tipul şi concentraţia enzimelor hidrolitice se menţionează: specia vegetală, explantul utilizat (frunze, cotiledoane, rădăcini, calus), alegerea agentului plasmolizant corespunzător, metodele şi condiţiile de incubare (durată, temperatură, lumină), metodele de purificare. Izolarea protoplaştilor din mediul de incubaţie se face prin 2-3 centrifugări la viteze reduse, timp de 7-10 minute (asigurând sedimentarea lor), după care urmează spălarea restului de enzime cu soluţie de zaharoză (15-20 %) şi NaCl. 2. Purificarea. Procesul de izolare a protoplaştilor este urmat de etapa de purificare, care este necesară pentru obţinerea unor suspensii celulare pure, necontaminate cu resturi de celule distruse sau pereţi celulari nedigeraţi. Purificarea se realizează prin centrifugări şi resuspendări succesive în soluţia cu stabilizator osmotic.

După centrifugare, la interfaţa dintre cele două soluţii se formează un inel de culoare verde în care sunt concentraţi protoplaşti viabili, iar resturile nedigerate şi celulele moarte se depun la fundul eprubetei.

3. Incubarea. Timpul de incubare variază în funcţie de natura şi vârsta materialului biologic iniţial utilizat pentru izolare. Protoplaştii în stare purificată sunt trecuţi în alte medii lichide. Mediul de cultură este foarte complet, bogat în săruri minerale, vitamine, substanţe stimulatoare de creştere, asigurând regenerarea unui nou perete celular. La unele specii, protoplaştii regenerează peretele celular în 2-3 zile şi concomitent intră în diviziune. După 20-25 zile se formează o colonie celulară, din care va apare un calus (30-45 zile). Din calus vor genera lăstari vegetativi sau rădăcini, în funcţie de suplimentarea mediului nutritiv cu citochinine sau auxine. Plantulele înrădăcinate (mature) se formează în 4-6 luni, după care sunt transplantate în seră (pe perlit sau sol).

Testarea viabilităţii protoplaştilor. Înainte de a se efectua o cultură de protoplaşti este necesar să se determine viabilitatea acestora. Se realizează prin examinarea suspensiei de protoplaşti la microscopul optic. Protoplaştii viabili prezintă curenţi citoplasmatici, evidenţiaţi prin deplasări ordonate ale mitocondriilor, au formă perfect sferică, iar cloroplastele sunt aranjate

3

ordonat în stratul citoplasmatic periferic. Protoplaştii morţi (distruşi) prezintă forme neregulate, iar cloroplastele formează aglomerări la unul din polii celulei. Testarea viabilităţii protoplaştilor se face şi prin metode colorimetrice. Analizarea suspensiei de protoplaşti la microscopul optic cu fluorescenţă, permite distincţia între protoplaştii viabili care prezintă o fluorescenţă galben-verzuie, datorită prezenţei clorofilei şi cei neviabili care au o fluorescenţă roşie.

Aplicaţii la plantele floricole Protoplaştii sunt celule vegetale folosite pentru manipularea materialului genetic. Pot fi

utilizaţi pentru fuzionare şi hibridare somatică, pentru transformare cu ADN exogen, pentru transferul de cromozomi, nuclee şi diverse organite celulare, pentru studiul virozelor vegetale, pentru elucidarea modului de acţiune al agenţilor patogeni bacterieni şi fungici.

Această tehnică permite: cercetări aprofundate asupra funcţionării celulei; aplicarea de tratamente mutagene la celule izolate; obţinerea unor plante rezistente la bacterii, ciuperci şi chiar dăunători; permite manipulări genetice ca introducerea sau substituirea de gene. În momentul de faţă lista speciilor de plante floricole de interes economic la care s-a realizat

regenerarea de plante de la protoplaşti este destul de cuprinzătoare. Ex.: Digitalis lanata, D. purpurea, Helianthus annuus, Ipomoea batatas, Lolium multiflorum, L. corniculatus, Nicotiana sp., etc.

Tehnologia culturilor de protoplaşti necesită cunoaştera şi stăpânirea completă a diferitelor etape care pornesc de la explantul donor până la planta regenerată: obţinerea de protoplaşti viabili, regenerarea pereţilor celulari şi inţierea diviziunilor celulare, menţinerea diviziunilor până la obţinerea microcalusurilor şi regenerarea plantelor din aceste calusuri.

2. Hibridarea somatică Constă în fuzionarea (contopirea) a doi sau mai mulţi protoplaşti şi refacerea unei noi celule care conţine material genetic (nuclee, cromozomi, organite citoplasmatice) provenit din celule care aparţin aceleiaşi specii sau la specii diferite (fără a recurge la hibridarea sexuată). Cu alte cuvinte, hibridarea somatică prin fuziunea protoplaştilor este o metodă de obţinere a hibrizilor între plante aparţinând aceleiaşi specii sau unor specii diferite, imposibil de realizat prin metode clasice. S-a constatat că protoplaştii izolaţi enzimatic sunt capabili să fuzioneze spontan, dar cu o frecvenţă relativ mică (8% la Datura innoxia şi 11 % la Lilium longiflorum), deoarece sunt încărcaţi cu sarcină electrică negativă. Keller şi Melchers (1973) au elaborat prima metodă eficientă de inducere a fuzionării protoplaştilor prin neutralizarea sarcinilor electrice, folosind ioni de Ca++ şi K+ cu sarcină electrică pozitivă (CaCl2, KH2PO4), la temperatura de 370 C şi pH alcalin (9,5-10,5). Ulterior, s-a elaborat metoda de fuzionare prin tatament cu polietilenglicol (care este indicatorul cel mai eficient), aplicat în concentraţie de 25-40 %. Totuşi, acesta prezintă o oarecare toxicitate care poate atinge 50% din protoplaşti, ducând în unele cazuri la formarea de celule multinucleate, prin fuziuni ale mai multor protoplaşti. Zimmermann (1981) a elaborat o metodă mai modernă în care fuziunea protoplaştilor este indusă într-un câmp electric alternativ discontinuu, aceasta realizându-se într-un procent de 80 -100%, cu o eficienţă mult mai mare decât prin tratamentul cu polietilenglicon, deoarece nu afectează viabilitatea protoplaştilor. Prin fuzionarea protoplaştilor de la diferite specii este posibilă manipularea informaţiei genetice şi hibridarea celulară interspecifică, cu rol deosebit în lucrările de ameliorare, oferind

4

numeroase posibilităţi de combinări genomice pentru a crea forme cu totul noi. Se obţin celule hibride, interspecifice sau intergenerice, cu o nouă zestre ereditară şi cu caracteristici noi. În urma fuzionării protoplştilor se formează produşi de fuziune homocariotici (în cadrul celulelor ce aparţin aceleiaşi specii) şi heterocariotici (în cazul fuzionării celulelor ce aparţin la două specii diferite). Hibridarea somatică între două specii diferite constă din următoarele faze:

- preluarea materialului iniţial folosind ţesuturi de meristem foliar; - izolarea celulelor prin tratamente enzimatice; - obţinerea de protoplaşti şi fuzionarea lor până la realizarea heterocarionului; - începerea diviziunilor mitotice; - formarea calusului; - obţinerea plantelor prin culturi de calus selecţionat; - regenerarea plantelor întregi transplantate la sol.

Uneori din hibridarea celulară nu regenerează plante, ci se obţin numai linii celulare hibride. Binding şi Nehls (1978) au obţinut astfel de linii celulare hibride între speciile Vicia faba * Pethunia hybrida din care a generat un calus, fără a evolua în formarea de plante întregi. Alte hibridări somatice, capabile să rupă barielele interspecifice s-au mai realizat între Pethunia parodii şi Pethunia parviflora, Pethunia hybrida şi Atropa belladona, Datura innoxia şi Atropa belladona, etc. Aplicaţii ale hibridării celulare

Între reproducerea sexuată la plantele superioare şi fuzionarea protoplaştilor există diferenţe esenţiale. În cadrul reproducerii sexuate, informaţiile citoplasmatice sunt transmise în general numai de planta mamă şi nu există surse de variabilitate citoplasmatică. De asemenea, nu apar recombinări între diferite tipuri de formaţiuni cloroplastice sau mitocondriale.

1) Obţinerea de varaţii somaclonale. În cazul hibridării de protoplaşti, prin combinarea genotipurilor de la speciile incompatibile apropiate sau îndepărtate din punct de vedere taxonomic, se obţin varaţii somaclonale din care pot fi selecţionate noi forme valoroase sub aspect genetic, utilizate ca material iniţial în lucrări de ameliorare.

2) Obţinerea de hibrizi celulari (cibrizi) Când fuziunea de hibrizi de protoplaşti este urmată de o recombinare genetică, se poate

realiza o hibridare atât a nucleilor, cât şi a organitelor citoplasmatice (cloroplaste, mitocondrii). Dacă unul dintre nuclei este eliminat în cursul divizunilor succesive, se obţin hibrizi citoplasmatici numiţi cibrizi în care apar, cel mai frecvent, recombinări mitocondriale. Def. Cibrizii sunt hibrizi celulari care îmbină genele nucleare ale unui genitor cu cele extranucleare ale celuilalt. Din heterocarioni rezultă hibrizi somatici, care înglobează cromozomii celor 2 specii, sau cibrizi care înglobează cromozomii şi genele nucleare de la o specie, cu genele extranucleare de la cealaltă. În unele cazuri apar himere formate din ţesuturi şi celule diferite genetic. De aceea, selecţia adevăraţilor produşi de hibridare somatică este o problemă cheie a hibridării parasexuale. La plantele superioare, regenerarea de organisme noi, pornind de la genotipuri îndepărtate genetic şi protoplaşti transformaţi prin recombinare genetică, constituie o metodă eficientă de ameliorare. Astfel se realizează creşterea variabilităţii materialului iniţial de selecţie şi transformarea fondului genetic. Prin fuzionarea de protoplaşti s-au realizat mulţi hibrzi somatici vegetali şi animali, unii dintre aceştia dovedindu-se a fi adevărate himere sau aberaţii biologice. În sectorul vegetal pot fi menţionaţi cibrizii: grâu + orz, tomate + cartofi, Vicia + Petunia, între specii de Nicotiana, etc.

5

3) Transferul de material genetic în protoplasti Elaborarea unor metode eficiente de obţinere a unor cantităţi mari de protoplaşti a făcut

posibilă folosirea acestora în vederea unor manipulări genetice la plante. Transferul direct de gene, prin hibridare somatică se poate realiza în faza de protoplast,

protejat la exterior numai de membrana plasmatică (plasmalema). Includerea în protoplaste a unor microorganisme, virusuri, organite, macromolecule

exogene se poate realiza pe 3 căi: - prin endocitoză – prin străbaterea membranelor plasmatice după degradarea peretelui

celular. Pe această cale au fost incluse în protoplaşti: alge, virusuri, bacterii, drojdii, nuclei, cloroplaste, mitocondrii, ADN – exogen, etc. Membrana plasmatică poate fi uşor traversată de molecule de ADN – extern care va migra până la nucleu şi se va integra în cromozomi. - fuzionarea membranelor; - transfer prin intermediul lipozomilor, care sunt vezicule artificiale de fosfolipide ce pot include diverse materiale, inclusiv ADN, pe care îl pot transfera în protoplaşti, prin fuzionarea acestor tipuri de celule.

Tehnologia ADN-ului recombinat, prin fuziunea protoplaştilor a devenit în prezent o ramură de vârf a biologiei (care va reuşi să elaboreze produse cu rol esenţial în dezvoltarea economiei mondiale).

4) Mărirea rezistenţei plantelor la factorii chimici sau fizici (toxine, erbicide) şi la factori abiotici (ger, secetă, salinitatea solului)

Tehnicile de inginerie genetică, moleculară şi celulară pot contribui la crearea unor noi forme adaptate la stresul biotic şi osmotic, prin cercetări care vizează funcţionarea sistemelor enzimatice, reglarea şi transferul informaţiei genetice de la formele rezistente la cele sensibile.

5) Ameliorarea planelor şi crearea de soiuri noi Rezultatele obţinute până în prezent arată că ameliorarea plantelor şi biotehnologiile sunt

domenii complementare care pot asigura progrese remarcabile pentru viitor, prin valorificarea realizărilor ingineriei genetice privind hibridarea somatică interspecifică şi intergenetică. Hibridarea somatică a devenit o sursă importantă de variabilitate, fie la nivel nuclear (recombinări între genomuri), fie la nivel citoplasmatic (modificări de ADN – mitocondrial sau ADN - cloroplastic). Totodată, este posibilă apariţia unui număr cât mai mare de mutaţii, precum şi livrarea de hibrizi somatici şi cibrizi. Hibridarea somatică poate fi un mijloc rapid de introducere a unor gene străine în interiorul unei specii cultivate. Transferul unor caractere de la speciile sălbatice la cele cultivate asigură mărirea rezistenţei plantelor hibride, atât la factori patogeni, cât şi la factori abiotici, inclusiv pesticide. Tehnologia hibridării prin fuziuni de protoplaşti este relativ simplă în comparaţie cu alte tehnici de inginerie genetică, în mod particular cu tehnologia ADN-recombinat. Până în anul 1992 au fost regenerate pornind de la culturi de protoplaşti circa 50 de specii ornamentale, atât monocotiledonate, cât şi dicotiledonate (Ochatt şi Power - 1992). Exemple de genuri şi specii regenerate: - Chrysanthemum – Otsuka şi col.-1985; Gaillardia grandiflora – Binding - 1981; Pelargonium hortorum – Yarrow şi col. – 1987, etc.

Cercetările actuale ce se efectuează prin culturi de protoplaşti vizează numeroase aspecte: introducerea de gene responsabile de fixarea azotului atmosferic, de sinteza de noi pigmenţi, de rezistenţa la frig, secetă, poluare etc.

Protoplaştii sunt izolaţi de obicei din fragmente de limb, acestea sunt introduse într-o soluţie unde au loc două operaţii simultane: plasmoliză şi degradarea peretelui celular. Plasmoliza se realizează cu ajutorul zahărului din soluţie şi este necesară pentru a evita spargerea celulelor după dispariţia peretelui celular şi pentru a detaşa celula de peretele ei scheletic. Degradarea peretelui pectocelulozic se face cu enzime care se determină pentru fiecare specie.