Bazele Teoretice Ale Biotehnologiilor Microbiene 22

7/22/2019 Bazele Teoretice Ale Biotehnologiilor Microbiene 22

1/36

INTRODUCEREImplicaii ale biotehnologiilor moderne:ameliorarea plantelor i animalelorproducerea de subst farmaceuticeproduse chimice i bioenergetice valoroase n domenii ca:

agricultur ind alimentar medicin ind farmaceutic indchimic valorificarea biomasei i producerea de energieneconvenional

Generaii ale biotehnologiilor:1. Primele generaii de biotehnologii la mijlocul sec XX,[debutul ind de fermentaii]2. A doua generaie dup 1927 (descoperirea penicilinei deFleming) i industrializarea ei (1939)3. A treia generaie 1972 1975[1972 - apar tehnicile de inginerie genetic]

[1975 noile met de producer a anticorpilor dau noi obiectivebioindustriilor]

Biotehnologii: (definiii)1.Toate procesele chimice, fizice sau informatice care servesc

la transformarea industrial a vinului2.Tehnicile ce decurg din tiinele vieii ca: genetic,

biochimie, biologia celular sau imunologie!!! 1 i 2 temenul potrivit este inginerie biologic

3.Constau n utilizarea bacteriilor levurilor, celulelor vegetale

i animale, al cror metabolism i a cror capacitate debiosintez sunt orientate ctre fabricarea substanelorspecifice.


2/36

n cadrul bioindustriei Biotehnologiile:pot nlocui tehnologiile folosite n mod curentau un rol promoter esenial ex:

ind alimentar producia de alge, levuri, bacterii n scopul

furnizrii proteinelor, aac., vitaminelor, enzimelor creterea productivitii agricole ind farmaceutic vaccinuri, sinteza hormonilor,

interferonilori i antibioticelor protecia mediului tratarea apelor uzate, transformarea

resturilor menajere compostarea fabricarea compuilor biodegradabili

Biotehnologiile ansamblu procedeelor de transf. a materiilorprime renoibile i de producere cu ajutorul culturilor de

microorganisme i de celule animale i vegetale a unei marivarieti de substane utile omului.Ex: proc de fermentaie n medii lichide/solide

reciclarea resturilor de subst organice i alte deeuri producerea metanului degradarea biomasei lignocelulozice conversia n combustibili biologici

Problema major a biotehnologiilor valorificareabiocatalizatorilor (diverse organisme)Direcii de dezv n biotehnologii

1.Modernizarea proceselor fermentative clasice prinintroducerea tehnologiilor informatice i selectarea unortulpini special cultivate ptr creterea randamentelor


3/36

2.Fermentaii bazate pe imobilizarea unor enzyme pesuporturi polimerice

3.Ingineria genetic tehnica AND-recombinat ptr folosireaenzimelor de restricie (simplu sistem imun, care recunoate

i distruge ADN-ul strin) i a ligazelor

Domenii de aplicare a biotehnologiilor1.Biomedicin i farmacologie se realizeaz vaccinuri ptr: maladii virale ca (hepatita A, B; herpes; poliomielit)

a hormonilor de cretereuman creterea eficienei produciei de vitamine i a unormedicamente proteinelor specifice noilor tipuri de antibiotic enzimelor a interferonului

Directii de cercetare tiinific: clarificarea funciilor i mecanismelor de aciune aregulatorilor imunologici investigatii cu peptide neuroactive trombolitice si fibrinolitice clarificarea mecanismelor imunitii nelegerea fiziologiei i aspectelor genetice ale camcerului2. Agricultur i industria alimentar se urmarete producerea unor soiuri i hibrizi mai productivi: rezisteni la boli fixarea biologic a N manipulrii genetice prod. de enzime, adaosuri furajere, subst. de ndulcire, aac.,antiox. introducerea unor soiuri noi


4/36

prod. de noi pesticide, medic. veter., protein unicelulare,lipide, steroizi, compui aromatici, biopolimeri polizaharidicisolubili n ap ageni de diagnosticare n fitopatologie

3. Producia de energie prod. de biocombustibililor gazoi/lichizi, bicarbonailor dinfotomas, fabricarea H pe cale biologic

creterea capacitii de extracie a zcmintelor de petrolprin metode biotehnologice

4.Producia de materii prime i utilizarea biomasei reziduale conversia biomasei reziduale n materii prime ce pot fi

utilizate n continuare n ind chimic ipetrochimic [proteine,lipide, glucide, ac. organici, aac., glicerol, etc]

5.Extracia materiilor prime minerale i protecia mediului extracia unor metale i metaloizi din minereuri srace descompunerea biologic i combaterea unor poluani monitorizarea calitii aerului, soului i apei


5/36

PARTICULARITTILE BIOTEHNOLOGIEI CATIIN1. Activitatea BTH necesit convergena unui nr mare decunotine disciplinare ex: Microbiologie, Bioghimie

Genetica M i ingineria genetic,Bioinginerie industrial2. Posibiliti extinse de aplicare a realizrilor proprii nproducia de mas a bioindustriei nu exist o ramurindustrial, ci intreprinderi care utilizeaz biotehnologiile n

diferite sectoare3. Cercetarea biotehnologic este de lung durat i necesit osuccesiune de competeneex: cercetarea fundamental experiena ind. i opiuni econ.de valorificare

4. Existena unei nencrederi fa de aceast evoluie apracticienilor vechilor tehnologii

Factori ce determin succesul i supremaia n biotehnologii1.Cercetarea fundamental avansat2.Complementaritatea ntre ntreprinderile clasice i cele noi3.Investiii adecvate4.Spirit ntreprinztor5.Existena unor cadre specializate, cu o formaie solid de

baz i activitate interdisciplinar


6/36

BIOTEHNOOGIILE I MEDIUL- Biotehnologiile prin nelegerea unor legi i mecanisme subtile

ajut la intensificarea unor ritmuri natural expluateaz M n lupta mpotriva unor patogeni ptr

om/mediu- Microbii artizani ai ciclurilor C, N, O, S etc- Modificarea acestor cicluri modific metab. naturaldezechilibre ce dau efectul de ser n cazul CEx: Bact degradeaz MO gaz carbonic [fixat de org

superioare la lumina solarproteine (hran ptr om/anim)]Ex: Bact fixeaz N bact folosesc compuii (amoniac, nitrat)i i transf n compui asimilabili ptr plante.- Dpdv ecologic M din sol sunt ntr-o lupt dinamicpermanent ptr a pstra un relaiv echilibru n sol (fiecare sp.

este imp. n lupta mpotriv paraziilor/insectelor periculoase).Sarcina biologiei n natur stpnirea ciclului N (far N nuar exista protein, ac. nucleici, clorofil, pigmenti etc)Biotehnologia are contribuii nfixarea direct mai rapid a N datorit NITROGENAZEI(convertete N n amoniac devine asimilabil ptr .pl.)fixarea P cu ajutorul micorizelorobinerea de biopesticide prin procese de sintezdomeniul farmacologiei celulare veccinuriEx: Vaccin ptr hepatita B obinut cu anvelope viraleneinfecioase prezente n serul purttorilor sntoi!!! In trecut inactivarea viruilor se fcea prin metoda preparriiantigenilor, ns acetia produceau apariia anticorpilorprotectori.


7/36

ind alimentar amilaze, protease, pectinaze, celulazeEx: Hidroliza enzimatic a amidonului cu bacterii deBacillus licheniformis (acioneaz i lat>100C)

cu enzime de amilaz [asa se produc cateva mil. de t de zahrdin porumb pe plan mondial]

BIOTEHNOLOGIILE PREZENT I PERSPECTIVEBiotehnologiile urmresc utilizarea M ptr producerea unei

game variate de subst. utile, economice.Preocuprile rilor n curs de dezv mrirea produciei dealimente prin descoperirea unor surse energetic rentabile.Avtj utilizrii biotehnologiilor combaterea polurii, reciclarea ieftinirea alimentelor

creearea de proteine reducerea costurilor la aacclonarea plantelor i selecia celor valoroasecontrolul fixrii biologice a azotuluiatm fotosintezaartificial


8/36


9/36

SUBSTANE UTILE PRODUSE PRIN BIOTEHNOLOGIIBiotehnologii (BTH) n ind. alimentar i furajerex: din levuri proteine monocel neconvenionale (pesubstraturi de parafine, grsimi reziduale, zer din ind.

laptelui, melase din ind. zahrului, metanol etc)ex: fol. bacteriilor ptr sinteza aac. eseniali lizina acglutamicProteine microbiene neconvenionale (single cell proteins) fol celulele de levuri

Substraturi fol ca surs de C:parafine pe aceste substraturi s-au realizat primelecercetriEx: n bioreactor se introduce ammoniac surs de N, menine pH mediului

levurile sp. Candida lipolytica oxideaz hidrocarburile nac. grai [cu ajutorul hidroxilazelor]!!! ac. grai degradai de acetil Co-A proteine celulare

LevuriCandida

lipolytic

a

hidroxilaze

ac. grai

degradai d

Acetil Co-

A

Proteinecelulare

(50% din

SU)Zer din ind. laptelui/ Grsimi reziduale din abatoare /Ape reziduale i deeuri din ind. Lemnului/hrtieiCandida utilis!!! Levurile preferate ptr ob. proteinelor monocelulare ptr

c: au productivitate f mare ciclu de via scurtMetanolul[ob prin oxidarea gazului metan derivat dincrbune] substrat mai ieftin


10/36

METODE I SISTEME DE CULTIVARE A MCultivarea unui microorg operaii i lucrri ce urmrescasig. cond. de cretere, multiplicare i producere de subst. ntr-un sist. tehnologic dat.

Metodologia elaborrii unui sist de cultivare nu exist ometodologie universal valabilFactori imp. n elaborarea metodologiei: Forma sub care trebuie cultivat microorg submers lasuprafa

Tipul d emicroorg utilizat aerob anaerob Cond de sterilitate severe mai puinsevere Cond de multilicare culture continuidiscontinuiEtape de cultivare a unui M n cadrul unei metodologii decultivare

1. Ob. inoculului vegetativ trecerea M de multiplicare dinstarea de laten n starea de multiplicare activ- pp creearea unor cond specific de mediu, agitare + t2. Ob. inoculului vegetative de instalaie multiplicareamasei microbiene la un raport 1-10 din capacitatea vaselor deproces.3. Cultivarea pe instalaie, n vederea ob. produsuui finit trecerea M pe sist biotehnologic d eproducie.- se va asig cond. de cretere i dezv. +

cond de producere a produsului de biosintez


11/36

Clasificarea tipurilor de sisteme de cultivareDup modul de derulare a procesului discontinue M i parcurge ciclul de funcionare apoi proc.trebuie reluat

!!! Apar fact. care limiteaz prod. de metabolii epuizareas.n. din mediu de cultur + acumularea subst. toxice rezultatedin metabolism stagnarea culturii + diminuarea prod demetabolii moartea productorului continui alimentarea continu a sist. cu s.n.

desfurarea proc biosintetice la valori superioare!!! faza exponenial poatefi prelungit (zile-sptmni)Ex: Sist chemostat deschis, dar care trebuie s asig. condiiica:

cultura s fie nchis n spaiu steril (evitm cntaminarea)

s aib dispositive de reglare a ratei diluiei mediului s poat fi meninut constant volumul mediului cultura s fie agitat fuxul de mediu introdus s fie

rapid omogenizat O2 solvit s poat fi pstrat la nivele sup., fr a limita

creterea/prod. Metaboliilor s fie reglabile pH, O2 silvit, CO2

sincroneDup necesitile de aer a M productor Sist. aerobe (agitare) Sist. anaerobe (staionare)Dup modul n care trebuie cultivat M submerse la suprafa


12/36


13/36

BIOTEHNLOGIILE N INDUSTRIA FARMACEUTIC- Datorit BTH se fabric n present: antibiotice hormmoni

vitamina vaccinuri interferonul anticorpiimonoclonali ag. tuberculostatici medicam.

Antifungice!!! Prgresele in BTH sintezei de medicamente dupelaborarea metodelor de sintez i transfer de gene prin tehnicide inginerie geneticSinteza hormonilor prin tehnici de inginerie genetic

somatostatina [primul hormone uman sintetizat cu ajutorulbact recombinate genic, 1977] insulina [hormone hipoglicemiat, n absena lui apare diabetulzaharat]

- insulina era extras din pancreasul bovinelor i a porcilor

- 1979 cercettori de la univ din California au extras cele 2gene implicate in sinteza insulinei- Genele au fost incluse ntr-o plasmid i transferate la bact

Escherichia coli

somatotropina [hormon de cretere] absena lui dinorganism produce nanismul hipofizar

- ee obinea din hipofia cadavrelor n cantiti infime- s-a reuit transferul genei ce det sinteza acestui hormone la

bactEscherichia coli, care sintetizeaz o cant. mare dehormon

Hormonii steroizi sinteza acestora ilustreaz importanaBTHInterferonul clas de protein cu proprieti antivirale iantitumorale


14/36

- 1980 Gilbert Weissmann a transferat genele interferonuluilaEscherichia coli

Auextras

ARNmesager

Enzima

revestranscriptaza

Secvene

ADN

Incluse n

plasmide

Transferatecel

bacteriene- 1981 gene de interferon transferate n celulele levurii

Sacharomyces cerevisae [fiecare cel sintetiza 106 moleculeinterferon]

!!! producia ind a interferonului pe microorg e de 200 ori mai

ieftin dect prin culturi de celule umane/animaleProducerea de vaccinuri prin tehnci de inginerie geneticBacteriile sintetizeaz numai proteinele (antigenele), fa decare organismul produce anticorpi (reacie imunologic)!!! Flosirea ag. infecioi atenuai pp. un anumit risc

dar s-a binut un vaccinuri contra: Febra aftoas afecteaz > 30 sp mamifere, (bovine,ovine, porcine)Virusul molec de ARN-monocatenar nconjurat de o capsiddin 4 tipuri x 60 molecule de protein

Vaccinul transferul genelor ce det. sinteza proteinelor viralen celulele bact. deEscherichia coli [produs ind din 1984]Hepatita B tulburri grave a ficatului cancer hepaticVirusul genom alctuit dintr-o macromolecul ADN [3200nucleotide + 1 nucleocapsid ce conine antigenele de

suprafa]!! Antigenele HBs i HBe sintetizate sub controlul a 2 genediferite


15/36

Vaccinul transferul genelor virale ce det. sinteza antigenelorn Escherichia coli sintetizarea de.proteine virale, care fol.n vaccin det. rspunsul imun al organismului[Poliomielita, Turbarea, Sifilisul(produs de Treponema

pallidum)] prin transf. genelor virale ce det. sintezaproteinelor care servesc la vaccin n celule bacterii i levurirecombinate geneticEx: Sacharomyces cerevisae 1981 la univ din California

Producerea de energie cu ajutorul microorganismelor criza energetic atenia spre alternative- Atenia asupra bioenergiei prin fotosintez se produc cant.uriae de materie organic [parial utilizat n alimentaie]

!!! Fotosintez 173 mld. t s.u. [de 20 ori mai mult energiedect din hidrocarburi]!!! Din agricultur

- aprox. 1,7 mld t paie rmn neutilizate- Agic + Zootehn + Silvic + Ind alimentar deeuri

[celulozice amidon melas lignin grsimi] +deeuri menajere cant imp de substane organice

- Fol acestor deeuri reducerea polurii prinacumularea lor producerea de bioenergie

- Sunt ri care cultiv exclusiv ptr bioenergie ex: cartor,cereal, trestia zahr (bogate n glucide [amidon + zaharoz]) hidrolizate n hexoze apoi fermentate alcoholic. alcooletilic fol ca i carburantAmidonul 50% a s.u. a boabelor de cereal, cartofului


16/36

Amidon

Hidrolizenzimatic (sau cu

ac.)

Dextrin +Glucoz

!!! zahrul fol ptr fermentare i transf. n alcool etilic + sirop de

fructoz (fol n ind alimentar)Hemicelulozele degradate de bact Thermobacterioidessaccharolyticum la 40 C alcool etilic + ac. LacticCeluloza degradat de bact. i fungi care conin celulaz

CelulozHemiceluloz

Microrg.

Alc. etilic + Furfurol + Fenoli +

Crezoli(fol n ind chimic, farmaceutic,

alim)!!! Valorificarea acestei cant. de biomas epurareabiologic a mediului + ameliorarea cond. de via a populaiei

Producia de biogas transf. biomasei prin fermentaiemetanic (metanogeneza)Bact metanogene: capacitatea de a crete in prezena H i CO2sensibile la O2 (toxic otr ele) produc gaz metanMetanogeneza fermentaie anaerob, n care intervin 3 gr debact.Gr. 1 Transf substratului organic nac butiric propionic lacticGr. 2 transf ac. organici n ac. acetic H CO2Gr. 3 reduc CO2 n metan i consum H!!! Instalaiile rentabile unde sunt cant mari de gunoi grajd etcJaponia sue de metanogene ce produc fermentarea n 8 zile[tipul clasic 20 zile]


17/36

BIOEXPLUATAREA PETROLULUI I MINEREULUI- Tehnica actual permite expluatarea industrial


18/36

indirect bact oxideaz Fe fieros solubil n Fe ferric(oxidant puternic care reac cu alte metale pe care le transf. nioni oxidai solubili n ac. sulfuric) reapare Fe fieros,reoxidat rapid de bacterii.

Lixivierea favorizat de :aciditatea ridicat T optim ptr microorg (> dect amediului)Ex: bact ce asig lexivierea:Thiobacillus ferrooxidans (acidofil, t 25-35 C)

[n ape termale, zcminte S, cratere vulcanice]Thiobacillus thiooxidans ..GenulSulfolobus t>60C, acidofil [ape termale, ac.,vulcani]Proc. microbiol. de extragere a metalelor din apele reziduale:

transf chimic a metalelor cu ajutorul unor proc. biologice.absorbia metalelor la sup. microorg.fixarea intracelular a metalelorEx:Saccharomyces cerevisae /Rhizopus absorb uraniul dinapele reziduale [au pe membran si PC atomi cu sarcin elecricnegativ absorb ionii cu sarcina pozitiv]Ex:Pseudomonas aeruginosa (bact. ucigase) absorb 56%din s.u a bacteriei n 10 sec (100 mg uranium/l soluie)Ex: Alge (Spirogyra, Oscillatoria, Chara) acumuleaz ionide Mo, Se, uranium, Na apoi putrezesc datoritmicroorganismelor

Ex: Alge albastre-verzi (Synechococcus) fixraz 1,28 atomiCd /molecul protein


19/36

Biotehnologiile i bioindustria urmresc rezolvarea unorprobelme ale umanitii [alimente, furaje, medicamente,subst chimice, substituieni petrolieri, valorificareaminereurilor, combaterea polurii]

- BTH dezv mai ales n rile care dispun de resurse financiare,si RU.- Bact / Levuri enzime fol n industrie- Enzimele purificate au molecule solubile, greu de separate

dezv tehnicii enzimelor imobilizate 1960 (legate la o matricesolid / fixate n gel microporos)imobilizarea enzimelor n celule sau organite celulare(mitocondrii, cloroplaste)Ex: Japonia aspartaza imobilizat nEscherichia coli

fumaraza Brevibacterium ammoniagenes gluco-izomeraza StreptomycesPremize favorabile utiliznd tehnicile de inginerie genetic iBTH

- Creearea de noi pl. fixatoare de N- Proteine monocel. comestibile- Crearea de soiuri de pl. rezistente- Selecia tulp. bact. ptr. ob. unor produi substituieni ai

petrolului- Cunoaterea proc. de mbtrnire uman i a proc.

Imonologice


20/36


21/36

MICROORGANISME UTILIZATE N BTH- Din 100.000 sp. cunoscute n natur cateva sute sintetizeaz produseefectueaz reacii utile ptr om (aparin Pro-Eu-cariote)

- 5 grupe bacterii, actonomicete, levuri muceg, alge- Iniial s-au indus mutaii cu radiaii X, UV, subst chimice selecia unor microorg utile.Ex: Penicillium (tulp. slbatic) 60 mg penicilin/l mediucultur sel.genetic a ajuns s prod. 20 g/l mediu cultur

Genul Eubacterii;Bact. acetice genurileGluconobacter bacilli G- , transfl etanolul n ac. aceticAcetobacter bacilli G-, transf ac acetic produs n CO2 +H2O

Bacillus G+,ce form. EndosporiB. subtilis strict aerobB. thuringiensis triete i anaerob

Bact anaerobe sporulate:Clostridium acetobutylicum ferm. acetobutanolic[zaharuri aceton, etanol, izopropanol, n-butanol]Bact. Lactice nu form. spori, G+, tolereaz O2.

A: BL heterofermentative Leuconostoc transf. zaharurileac. lactic + etanol + CO2

B: BL homofermentative Streptococcus transf zaharuri ac. lacticLactobacillus d mai muli compui nafar ac. lactic (Corynebacterium G+, nu fosrm endospori,

C. glutamicum produce lizina


22/36

Actonomicetele (bact. miceliene) strict aerobe, G+, nu formspori

Streptomyces produc antibioticMicromonospora produc antibiotic

Drojdiile (fungi microsc, unicelulari) eucariote cu > 500 spLevurile ind. nu se reproduc sexuat, nu form. spori, suntpoliploide vigoare i adaptabilitate la schimbrile de mediuAscomycotina, Saccharomices cerevisae S. c. var.

ellipsoideus S. uvarum S. pasteurianus

Kluyveromyces fragilis fermenteaz lactoz producealcool pornind de la zer Saccharomyces lipolytica degradeaz hidrocarburile fabricarea biomasei proteice

Deuteromycotina se reproduc NUMAI prin nmugurire, nu

au R sexuat) Candida utilis crete pe licori sulfitate (ind pastei ihrtiei)

Candida tropicalis C. robusta obinerea de maslevurian

Rhodotorularubra produce provitamina ABasidiomycotina

Mucegaiuri fungi filamentoi, eucariote, precedfermentaile!!! Produc enzime utile n ind.: amilaze, proteaze, ac.organici (citric, lactic), antibiotice, fabric. brnzeturilor.Penicillium roquefortii brnz RoquefortP. camembertii brnz CamembertP. crysogenum P. notatum penicilina


23/36

P. claviforme antibioticul claviforminaAspergillus oryzae shakeA. niger ac. citric!!! [Aspergillus sp. proteaz, pectinaz, celulaz]

A. fumigatus A. clavatus antibiotic (fumigatina iclavacina)Rhizopus oryzae R. japonicas fermentaia alcoolicMucor javanicus fermentaia alcoolic M. rouxianus bogat n amilaz, zaharificarea

amidonului n fabricarea alcoolului etilic prin fermentarea substamidonoaseCI DE CONVERSIE A SURSELOR NUTRITIVE

Cile metabolice secvene de reac. chimice, catalizateenzimatic care permit microorg. s-i obin din sursele

nutritive: compuii necesari propriilor sinteze energianecesar realizrii acestoraTipuri de ci metabolice:1. Cile catabolice succesiune de reac biocimice ptrdegradarea s.n. din mediu + eliberarea de energie necesardesfurrii procesuluiFaze: I. degradarea molec. sursei nutritive uniti mici[proteineaac., glucide hexoze, lipide ac. grai, glicerol]II. degradarea molec. mici 1/3 din energie, CO2, H2O +intermediary metaboliciIII. diferit fc. de microorg. utilizat Microorg. aerob (metabolizeaz sursele. n. pn la CO2 iH2O) ciclul ac. tricarboxilici (Krebs) cuplat cu fosforilareaoxidativ.


24/36

Micriorg. anaerobe (nu convertesc compet sursa de C) fermentaii (alc., lact., but., propionic, acetobut.)

- produii cilor metabolice servers direct/indirect cadonori/acceptori de H n reac de oxido-reducere

- energia eliberat mai redus dect la microrg. aerobe.2. Cile anabolice ci de biosintez realizate n 3 fazesuccessive invers dect la cile catabolice[Micromolec faza III molec mai mari II asamblate nmacromolec. (protein, lipide, glucide)]

3. Cile amfibolice funcie cumulat eliberare de energiefurnizare de precursori ptr biosintez- descoperite pe o mutant E. coli capabil s-i ob. energiape cale nespecific, glicolitic era incapabil s urmezeciclul Krebs (sinteza ac glutamic + aac derivai din acesta)

4. Ci anaplerotice asig. o serie de ci metabolice auxiliare[ci suplimentare de producere a intermediarilor metabolici]Importana practic a cunoaterii exigenelor nutritive aicroorganismelorInteraciunea celor 4 ci este coordonat datorit: reac complexe care asig reglarea activitii lor posibilitii de adaptare a microorg la mediile n care triescImp cunoaterea cerinelor nutritive ale microorg intuim:calea metabolic posibilitile sale de biosintez a produsului ptr care estecultivat!! Contrar blocarea sintezei unor substane scaderandamentul de producie


25/36

FIZIOLOGIA M. DE INTERES INDUSTRIAL- Microrg necesiti decretere multiplicare producerea unor subst biologicactive

S conin elem chimice necesare sintezei propriilorconstituieni celulari enzime specific + sist. de transp. celular s furnizeze subst. necesare prod. propriei energii + ptr proc.biosintetice de produi biologici.Bioelementele

B majore (indispensabile) [C, H, O, N, S, P], 95% dinG uscat + [K, Mg, Ca, Fe]- inclui prin componenii surselor nutritive n compon

mediilor- C, H, O, N implicate n toate structurile i sintezele

celulare [furnizeaz energia necesar proc metabolice]B minore necesare n cant mici [Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Co,Cu]

- Zn, Mn elem. eseniale ptr toate microorg.Necesarul de oxigen furnizat de nutrieni apa dincompoziia a mediului- O2 este utilizat f repede de bacteriile aeorbe dincauzasolubilitii sczuteDup necesitile de O2:Microrg strict/obligat aerobe nu pot trai anaerob Microorg strict/obligat anaerobe Microorg microaerofile se dezv. bine la C% sczute de O2Microorg facultative anaerobe se dezv n prezena/absenaO2


26/36

Surse nutritive diferite, elem comun fiind mediu generalcare trebuie s conin: surs de energie C N surs defactori de cretere.Sursa energie proc de cretere sunt endogene energia

trebuie obinutprin oxidarea prilor component de la lumina solar!! Energia este nmagazinat n subst mecroergice ATPBacterii i Alge ATP produs prin energia luminoasOrg autotrofe energie produs prin oxidarea compuilor

anorganiciOrg heterotrofe energie produsa prin oxidarea compusilororganici!! In proc ind. sursa de C se confund cu sursa de energie [C de

multe ori este sursa de energie]

!! ntre sursa de C i sursa de energie deosebiri mai ales cndsursa de energie este un compus necarbonatSursa de C microrg pot fi:Autotrofe folosesc CO2 ca unic/principal surs de CcellularHeterotrofe (organotrofe) sursa de C i sursa de energieeste un compus organic [sursa de energie asig. prin oxidarea /catabolizarea subst. organice]!! Necesarul de C a unei cellule suplimentat de sursa deenergie, ns bacteriile autotrofe i cele fotosintetizante fol CO2.!! imp. calea prin care org. heterotrogfe metabolizeaz C tim ct din ntreaga cant. este convertit n mat. celular propriu Microorg facultateive aerobe ncorporeaz 10% din Ctotal al substratului


27/36

Microrg obligate ncorporeaz 50-80% cele mia impptr producerea de proteine microbieneSursa de N necesar ptr c repr 10% din G uscat a celuleimicrobiene

- ncorporat sub form de NH2Sursa amoniac sruri de amoniu!! N organic sursa mult mai bun randament superior deproducie

- scump s-a apelat la: soia, fin de pete, extract de

drojdii, casein/lizate ale mat bogate n proteine!! Randamentul de producie direct proporional cu cant de Ni capacit. Microorg. de metabolizareFactorii de cretere necesari n cant. mici, prezena lor faceposibil blocarea continuarea unor proc. metabolice ptr care

au fost destinai.!! Mediul sintetic nu satisface necesitile levurii seadaug extracte vegetale, glbenu de ou etcGrupe ale factorilor de crestere: aac. fct de cretere n biosinteza proteinelorPurine i pirimidine indispensabili n sintez ac. nucleici ia unor coenzime.Vitaminele necesari n sinteza enzimelor i coenzimelor.


28/36


29/36

SURSE TRADIIONALE DE M. UTILIZATE N BTHIzolarea din medii natural pp. operatia de screening(izolarea + tierea i seleca M)Dezvtj. izolarea unei probe f mici din nr. de sp. existente

randament sczut la izolarea tulpinilor utileEx: Dup 2 ani + 134266 tulpini M + 5000 soluri 1 tulpinactinomicet productoare de oxitetraciclin.Ex: Se dscoper anual 300 antibiotice noi, majoritatea toxicesau inactive din 5000 antibiotice isolate un nr f mic este

utilizatMetode de cultivare a M isolate din medii naturale (sol ap,aer, resturi veget, frct, abatoare, ind latate)1. nsmnarea pe medii agarizate n placi Petri cu ansa prinmet. Epuizrii

Incubarea la t optim Repicarea!!! Din ape suspensii diuii apoi se depun 1-2 picturi dediluie pe sup. agarului.Etalarea2. nsmnarea pe medii mbogite surse C, N, energie fc de M pe care dorim sa-l izolm.!!! Imbogite cu: Vitamine (B) ac aminici baze purine ipirimidinice [din extracte de carne, levuri]!!! Urmeaz selecia M ptr a obine o surs ct mai productiv

- selecia sub infl. fact. mutageni fizici (UV, roentger) chimici (iperita, azotiperita)

!!! Bacteriile i Fungii se preteaz cel mai bine la ob. demutani [greu de conservat nsuirile mutailor nu de obinut]


30/36

Microorganisme (M) reprogramate genetic1970-1980 promisiunea ADN recombinant, iplicit abeneficiilor ce ar urma datorit progresului BTH realitatea acontrazis ateptrile

Dificulti: lipsa stabilitii nor modificri genetice induse caracterul inadecvat al unor protein mirobiene hibride prterapeutic timp ndelungat de ateptare pnla omologarea final aproduselor explicnr redus de M reprogramate genetic

pre ridicat fa de sinteza chimic + posibiliti reduse decomercializareStrategii moderne de selecie din natur a M imp ptr BTH

Strategii screeningEx: Japonia dupa izolarea+descrierea unui M (actinomicet

Kitasatospora griseola-) s-a urmrit n mediul natural i alimembri ai aceluiai taxon sau taxoni nrudiiKitasatospora griseola produce antibiotic setamicina

MICROORGANISMELE HALOFILE au versatilitatenutriional i metabolicInclud organisme de la simplu tolerante la sare (3.5% NCl) halofile extreme potenial de producere a unor game largi de ac. organici rol n biogazeifierea crbunelui pretratat chimic rol n epurarea anoxic a apelor uzate industrial organice, cu omare salinitate


31/36

MICROORG TERMOFILE I HIPERTERMOFILE avtj fa de mezofile:Vitez mare de cretere recuperarea uoar a produilor finali

Stabilitate i posibilitatea de a urmri/controla oproc deproducieT mari de cretere avtj. ptr. meninerea cond de anaerobioz favoizeaz formarea produilor cu imp biotehnologic(alcooli, ac. org.)

produc o gam larg de enzime active la T > i rezistente ladenaturarea chimicEx: Pyrococcus furious (archaeobacterie) proteinazetermostabile, -glucozidaze, -amilazeEx: Sulfolubus sp. solubilizeaz metale (Au, Zn) din

zcminte sraceEx: transfel de gene [glucose-izomeraz] de la termofile laBacillus subtilis i laEscherichia coli cant mare de enzim,uor depurificat!!! Bacteriile pot nlocui levurile cu avtj ca; facilitarea recuperrii alcoolului volatile costul nclzirii mediului este mai mic comparative cu cel dercire necesar M mezofile M termoaerobe au metabolism mai schimbator dect levurile utilizeaz un spectru mai larg de polimeri cu struct.complex.


32/36

MICROORGANISME ACIDOFILE cresc optim la pH 3,- sunt sp. care se dezv. la t mari (96 C) imp n prod. de ac. organic (citri, gluconic, propionic, fumaric,butiric, succinic, lactic)

M din apele miniere i izvoarele acide sunt fol la solubilizareametalelor neferoase din zcmintele srace n minereu ag. active ptr desulfurizarea crbunilor i decontaminareareziduurilor ind asigur un gr mare de stabilitate i randament de conversie +

recuperarea final a produsului final.

MICROORGANISMELE ALCALIFILE gr heterogendpdv sistematicCuprinde: Eubacterii Cianobacterii Archaeobacterii

pH > 8 (9-10) folosite la obinerea detergenilor biologici!!! iniial au fost isolate proteinazele alcaline apoi amilazeleapoi lipazeleEx: proteinazele active la ph 7-11, adugate la detergeni (0.4-0.6%)degradeaz hidrolitic proteinele curireaEx: amilaze alcaline + proteinazele dizolv combinaiiprotein/amidon din produsele alimentare


33/36

CONSERVAREA MICROORGANISMELORConservarea cult. bacteriene cerine pstrarea culturilor la ntuneric lumina producedistrgerea/degenerarea culturii

evitarea apariiei cel mutante prin excluderea cultivrii nmedii lichide + evitarea repicrii repetate condiiile de pstrare s fie puin favorabile multiplicrii lor(cond latent) [4C, fr s.n bugate, fr O)!!! Pstrarea cult virulente (scop medical) tulp virulent va fi

cultivatct mai rar posibil nainte de conservare

Tehnicide conservare aculturilor bacterieneA: Cultivarea M pe medii nutritive obinuite i specialeConservarea pe geloz nclinat Bacterii i Levuri

- mediu agarizat nclinat- pstrat la 4C cteva luni!! Met p treceri repetate a culturii pemedii proaspete pericol de apariie a mutaiilor i a contaminrii!!! Fol. mediilor cu compoziie modificata prentmpinaalterarea prop. culturii originale Conservarea pe geloz moale n coloan dreapt 3 gagar/l n coloan dreapt M inoculate prin nepare n profunzime Pstrare t optim a m (sau 4C + nchiderea ermetic atubuui daca se observ dezv M)Conservarea sub ulei de parafin min 10 cm ulei deparafin + nchiderea ermetic a tuburilor depozitate la frigider


34/36

B: Procese fizice care s asigure meninerea celulelor n vialatentCongelarea se face ntr-un lichid stabilizator, rezistent laocuri osmotice/termice

Ex: lichid stabilizator bulion nutritiv, lapte degresat 10%serul i albumina 1-10% gelatin 1-10% peptona 5.5%Ex: glucide glucoza 5-10%, zaharoza 5-20% glutamatul 1%!! Tcongelare [-30 C rezist 41% M dupa 15 zile] [-7C rezist 2% celule capabile s fie readuse la via]

Principiile congelrii:- Bacteriile introduce aseptic n mediu stabilizator- pn la -35 C se rcete cu 1C/min, apoi necontrolat -196C- decongelarea rapid, n baia de ap 37-40C (evitarea

exploziei datorit presiunii-N trece din faza lichid in ceagazoas-)Avtj conservrii prin congelare:

conservarea ndelungat a M nesporulate fr s aparmodificribiochimice/genetice nu exist posibilitatea de contaminareDzvtj conservrii prin congelare

pre ridicat al instalaiei necesitatea aprovizionrii constant cu N lichid nu se pot distribui altor laboratoare cel bacteriene pierdearea unor microorganisme cand se readuc la viaLiofilizarea (desicarea n vid la t sczut) ptr M care aui pstreaz viabilitatea dup t f sczute- pp suspendarea bacteriilor lichid stabilizator


35/36

Important ptr supravieuirea cel. bacteriene:vrsta culturii optim 18-24 oredensitatea cel. bacteriene 109-1010 celule/mlalegerea lichidului stabilizator ca la congelare

Principiul liofilizrii produs final o pulbere cu afinitate ptrlichide1.- introducerea aseptic a cel bacteriene n ampule de sticl icongelate brusc2.- supunerea la vid nalt ptr desicare

3.- nchiderea steril a ampulelor la flacrConservareaprobelor liofilizate la ntuneric i la rece (4C) viabilitate civa aniAvtj - menine nealterate proteinele i enzimele microbiene conserv capacitatea vital pruductiv a sporilor

Dezvtj se pot pierde unele gene plasmidiale datorit efectuluinociv al uscrii pierdearea unor microorganisme cand se readuc la viaRevitalizarea culturii liofilizate deschiderea ampuleisteriladugm 10-15 picturi bulion nutritiv suspensiecelular

- 3-4 picturi nsun mediu solidificat- Retul suspensiei nsmnm un mediu lichid


36/36

Conservarea culturilor fungice sporii reista natural zecide aniConservarea prin transfer periodic medii nutritiveagarizate

cartof-dextroz-agar mal-agar cartof-morcov-agar!! Ptr nsmnarea mediilor proaspete se vor folosi spori sauconidia sau miceliu cu viabilitate cert!! Inchiderea ermetic a recipientului, cu paragin s nu se

piard apa din mediu [numai dupa sporularea abundent aculturii fungice]!! Depozitarea ncperi cu U% 60-70%, 4C retransferate la2-3 aniConservarea n sol 5g sol sterilizat se inoculeaz cu 1 ml

suspensie dens de spori!! se pastreaz 8-10 zilela t camerei, apoi se conserv lafrigiderCongelarea la t sczute -30-80 C +uscarea n vid(liofilizarea)

Bazele Teoretice Ale Biotehnologiilor Microbiene 22

Documents

Transcript of Bazele Teoretice Ale Biotehnologiilor Microbiene 22