XMAP
-
Upload
papy-oprisanescu -
Category
Documents
-
view
44 -
download
3
description
Transcript of XMAP
![Page 1: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/1.jpg)
ANALIZA MULTIPLEX PRIN TEHNOLOGIA XMAP
ARRAY
1. PRINCIPIUL METODEI
Multiplexarea prin tehnologia xMAP este o tehnică proteomică ce
permite identificarea şi cuantificarea simultană a seturilor de proteine
din probe biologice complexe, utilizând ca suport solid pentru
imunodetecţie populaţii de microsfere marcate cu concentraţii
precise de 2 fluorocromi; această marcare creează microsferelor
spectre unice de absorb�ie.
În funcţie de procentul de încorporare specifică a celor 2 fluorocromi
de marcare, care au spectre de citire în rosu şi infraroşu, au putut fi
create 100 de popula�ii distincte de microsfere. Fiecare dintre
aceste 100 de tipuri de microsfere poate fi acoperită cu anticorpi de
captură specifici. Astfel, 100 de analiţi diferiţi pot fi identificaţi şi
cuantificaţi simultan din acelaşi volum de probă. Populaţiile de
microsfere pot fi combinate între ele, fiecare populaţie păstrându-şi
însă adresa spectrală unică.
După legarea specifică a analitului din proba de cercetat la anticorpul
care îmbracă microsfera, se adaugă un anticorp biotinilat care se va
lega la un alt epitop al analitului. Pentru eviden�ierea reac�iei
antigen-anticorp, amestecul este apoi incubat cu streptavidină-
![Page 2: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/2.jpg)
ficoeritrină (SAPE), care va emite un semnal fluorescent direct
proporţional cu cantitatea de analit din proba biologică de cercetat.
Tehnologia xMAP array stă la baza funcţionării mai multor
platforme dezvoltate de către Luminex Corporation – Luminex
100/200, FLEXMAP 3D, MAGPIX.
2. PLATFORMA LUMINEX200 - include analizorul
Luminex 200, citometrul Luminex XY, sistemul Luminex SD
de livrare a fluidului Sheath, software-ul şi PC-ul (Figura 1).
Figura 1 - Platforma Luminex200
Tehnologia folosită de platforma Luminex 200 are la bază:
- interacţiunea specifica antigen-anticorp de tip ELISA (enzyme-
linked immunosorbent assay), care este încă considerată metoda
standard de analiză cantitativă a proteinelor. ELISA clasică permite
testarea unui număr mare de probe biologice, dar nu permite analiza
decât a unui singur analit pe o plăcuţă cu 8/96/384 de godeuri în
func�ie de format;
![Page 3: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/3.jpg)
- tehnica citometriei în flux. În citometria în flux „clasică”, o
suspensie de celule este condusă din tubul ce conţine proba spre
analizor. Fiecare celulă marcată fluorescent este analizată individual
şi separată în grupuri specifice pe baza granularită�ii, mărimii
celulare �i pozitivită�ii fa�ă de anticorpii cu care a fost marcată
suspensia celulară. Zeci �i sute de mii de celule pot fi astfel studiate
individual în doar câteva secunde. Citometria în flux poate să
analizeze pe baza caracteristicilor fizice/biochimice �i alte particule
subcelulare în suspensie ca nuclei, organite celulare etc.
Platforma Luminex 200 foloseşte aceste două metodologii,
îmbinate cu idei inovatoare şi analizează astfel microsfere (beads-
uri) în locul celulelor, microsferele jucând şi rol de suport de legare
pentru moleculele de interes.
Figura 2 – Dirijarea microsferelor spre camera de detecţie
Etapele generale ale acestei tehnologii prezentate schematic în
Figura 2. Proba este aspirată la o rată de 1 µl/sec şi antrenată de
către fluidul specific (Sheath fluid) în cuva de măsurare din
interiorul analizorului Luminex 200 cu o viteză de 90 µl/sec astfel
![Page 4: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/4.jpg)
încât să se creeze un flux laminar, iar prin acest proces de
focusare hidrodinamică, microsferele sunt direcţionate una câte
una către camera de detecţie, unde laserele bombardează
microsferele, iar semnalele fluorescente emise sunt analizate de
către procesoare de semnal digital de mare viteză (1000 de
evenimente /semnale de fluorescenţă pentru fiecare microsferă în
parte).
Microsferele MicroPlex-caracteristici
- microsfere de polistiren
-diametru mic (5.6 microni)
- u�or de resuspendat în mediu
lichid
- raport optim suprafaţă/ volum
- cinetică rapidă
- marcate fluorescent
Φ=5.6µm
Figura 3. Microsferele MicroPlex-caracteristici
Microsferele MicroPlex prezintă pe suprafaţă grupări carboxil
pentru realizarea de legături covalente stabile între suprafaţa
microsferelor şi setul de anticorpi specifici (Figura 3).
![Page 5: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/5.jpg)
Activarea microsferelor pentru includerea în kitul de detec�ie se
realizează de către producător prin incubare timp de 2 ore cu soluţie
de anticorp. Pentru îndepărtarea reactivilor necuplaţi se realizează
etapele de spălare, prevenind astfel şi activarea grupărilor carboxil de
pe moleculele de proteine care ar determina formarea legăturilor
proteină - proteină, în detrimentul legăturilor specifice proteină –
microsferă (Figura 4).
Figura 4 – Cuplarea microsferelor cu anticorpii specifici de captură
Iniţial microsferele sunt produse în loturi foarte mari pentru a se
asigura o suprafaţă identică din punct de vedere chimic pentru
fiecare populaţie de microsfere, apoi loturile sunt împărţite în sub-
loturi în vederea marcării microsferelor prin imersarea acestora
într-o soluţie organică ce conţine un amestec de 2 fluorocromi.
Tehnologia xMAP foloseşte această tehnică de marcare a
microsferelor cu ajutorul unei combinaţii precise de 2 fluorofori
(cu lungime de unda de excitatie la 635 nm si benzi de emisie la
658, respective 712 nm), astfel putând fi creată o hartă cu 100 de
populaţii distincte de microsfere. În funcţie de raporturile de
![Page 6: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/6.jpg)
concentratie ale fluoroforilor, fiecare microsferă interogată emite
o fluorescenţă cu o adresă spectrală unică ce aparţine unei
anumite populaţii de microsfere (Figura 5).
Figura 5 – Harta popula�iilor de microsfere 100-plex.
Alte tipuri de Microsfere
MagPlex sunt microsfere având în compozi�ia chimică polistiren
cu proprietăţi magnetice; pot fi create 500 de populaţii distincte cu
adrese spectrale unice.
MagPlex-TAG sunt microsfere din polistiren cu proprietăţi
magnetice �i care au fost cuplate cu oligonucleotide; pot fi create
până la 150 de populaţii distincte, fiecare populaţie având o
secvenţă unică de 24 de perechi de baze ADN.
LumAvidin sunt microsfere din polistiren �i care sunt direct
cuplate cu avidină, putând fi create 100 de populaţii distincte de
![Page 7: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/7.jpg)
microsfere. Sunt adecvate pentru testări proteice şi
imunogenetice.
SeroMAP sunt microsfere de polistiren, optimizate pentru
reducerea legăturilor nespecifice dintre molecule, fiind astfel
ideale pentru testări serologice. Reprezintă varianta îmbunătăţită a
microsferelor MicroPlex.
Tehnologia xMAP array în 5 etape (diagrama din Figura 6)
1. Resuspendarea microsferelor
2. Legarea anticorpului de captură specific (cuplarea)
3. Adăugarea analitului de cercetat (antigenul)
4. Legarea anticorpului de detecţie biotinilat la un alt epitop al
antigenului
5. Legarea complexului streptavidină-ficoeritrină (SAPE)
– molecula raportor
![Page 8: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/8.jpg)
Figura 6. Microsfera cuplată cu anticorpul de captură care s-a legat de
antigenul din proba de analizat. Reac�ia antigen-anticorp a fost eviden�iată
prin anticorpul de detec�ie biotinilat care a cuplat molecula-raportor
Microsferele antrenate într-un singur şir către camera de detecţie
trec consecutiv prin faţa a două fascicule laser:
LASERUL ROŞU – realizează identificarea microsferei pe baza
adresei spectrale unice → identifică analitul de cercetat.
LASERUL VERDE – excită ficoeritrina şi determină
fluorescenţa acesteia → cuantifică analitul de cercetat.
![Page 9: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/9.jpg)
Figura 7 – Excitarea microsferelor de către cele două tipuri de lasere
Laserul roşu (laser pentru clasificare, lungime de undă λ = 635
nm) excită cei 2 fluorocromi încorporaţi în microsferă, care vor
emite semnale fluorescente ce vor putea fi măsurate de către o
serie de fotodiode (3 APD = Avalanche Photodiode). În acelaşi
timp, fiecare microsferă sau microsfere legate nespecific între ele
(dublete), bule de aer etc. emit fluorecenţă în funcţie de
dimensiunea fiecăreia, semnalul fiind preluat de altă serie de
fotodiode care permite determinarea mărimii fiecărei particule
interogate.
Laserul verde (laser Yttrium-Argon-Germanium, la lungimea de
undă λ = 532 nm) excita microsferele iar fotomultiplicatorul
(PMT, photomultiplier) detectează semnalele raportor emise de
către ficoeritrina legată de suprafaţa microsferelor. Intensitatea
fluorescenţei este direct corelată cu cantitatea de analit legat de
microsferă.
![Page 10: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/10.jpg)
Sistemul optic analog unui citometru clasic este reprezentat în
Figura 8.
Figura 8 – Sistemul optic al Platformei Luminex 200 – Laser de 532
nm (laser raportor) i 635 nm (laser clasificator) fotomultiplicator (PMT pentru
ficoeritrina, 565-585 nm), APD pentru detectie clasificator 1 si 2; APD opus
PMT = discriminator de dublet
Analiza şi prelucrarea datelor
Sistemul de analiză Luminex 200 este capabil să proceseze şi să
înregistreze până la 20.000 de evenimente/secundă (Diagrama
Figurii 9).!
În urma acţiunii sistemului optic sunt înregistraţi
4 parametri pentru fiecare microsferă:
- emisia moleculei raportor la λ=565-585nm (RPT)
- emisia fluorescentă a microsferei la λ= 635nm (DD)
- emisia fluorocromului cu spectru roşu cu care este marcată
microsfera (CL1)
- emisia fluorocromului cu spectru infraroşu cu care este
marcată microsfera (CL2)
![Page 11: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/11.jpg)
Luminex200 – Procesarea semnalului
APD ( CL1, CL2, DD),
PMT (RPT)
↓
SEMNALE
FLUORESCENTE
↓
PROCESOR DE
SEMNALE
↓
SEMNALE DIGITALE:
(HISTOGRAME)
↓
MEDIAN
FLUORESCENCE
INTENSITY (MFI)
↓
CURBA DE ETALONARE
FIVE PARAMETER LOGISTICS
↓
pg/mL
Figura 9. Schema de procesare a fluorescen�ei captate pe fotomultiplicator
până la furnizarea rezultatelor exprimate ca �i concentra�ie /mL.
![Page 12: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/12.jpg)
3. TIPURILE DE PROBE BIOLOGICE ce pot fi analizate prin
tehnologia xMAP array şi pregatirea/prelucrarea lor:
3.1.SER
- sângele recoltat în vacutainer cu capac roşu (fără anticoagulant)
este lăsat să coaguleze cel puţin 30 de minute
- se centrifughează 10 min la 1000g
- serul se separă şi se analizează imediat sau este alicotat în tuburi
de polipropilenă şi stocat la < -20°C
3.2.PLASMA
- sângele se recoltează pe anticoagulant (EDTA) şi se
centrifughează timp de 10 min la 1000g în maxim 30 min de la
recoltare
- plasma se separă şi se analizează imediat sau este alicotată în
tuburi de polipropilenă şi stocată la <-20°C
3.3.SUPERNATANŢII DE CULTURI CELULARE
-după recoltare se centrifughează pentru a îndepărta resturile
celulare
-se analizează imediat sau sunt stocaţi în aceleaşi condiţii descrise
mai sus
În cazul în care sunt analizate probe congelate, acestea se
decongelează complet, se vortexează şi apoi se centrifughează. Se
recomandă evitarea repetării ciclurilor îngheţ/dezgheţ.
![Page 13: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/13.jpg)
Serurile şi plasma se diluează înainte de analiză conform
recomandărilor producătorului sau conform diluţiei optime
determinate în prealabil.
Alte probe biologice ce pot fi analizate prin tehnologia xMAP
array: lichid cefalorahidian (LCR), urină, saliva, lichid sinovial,
pleural etc.
În cazul supernatanţilor de culturi celulare sau a extractelor
tisulare, se recomandă determinarea concentraţiei de proteine
înainte de efectuarea analizei.
Trasabilitatea probelor este asigurată prin alocarea unui cod unic de
identificare pentru fiecare probă, cod ce însoţeşte probele pe timpul
analizelor/stocare şi se regăseşte atât în sistemul informatic al
laboratorului, cât şi în registru. E�antioanele extrase din probă trebuie
de asemenea să fie trasabile la proba primară.
4. METODOLOGIA DE MULTIPLEXARE
Kitul furnizat de către MERCK-MILLIPORE (Figura 9) este
livrat cu următoarele
componente: microsfere x-plex,
standard liofilizat, controale
QC1 şi QC2, soluţie SAPE,
matrix (pentru ser/plasmă),
anticorpi de detecţie, plăcuţa cu
96 godeuri filtrante, tampon de
diluare a microsferelor, tampon de spălare, protocolul kitului. Figura 10 - Kit furnizat de către MERCK-MILLIPORE
![Page 14: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/14.jpg)
Următorii reactivi �i echipamente trebuie să fie asigurate de
utilizator:
Luminex Sheath Fluid
Pipete ajustabile pentru volume cuprinse între 25 �i 1000 µL
Pipete multicanal
Flacoane de preparare pentru reactivi
Tuburi de propilenă pentru microcentrifugare
Folie de aluminiu
Benzi de cauciuc
Tampoane absorbante
Vortex Mixer
Sonicator
Shaker pentru plăcu�ele de lucru
Pompă de vid pentru filtrare
Suport pentru placa
Pregătirea kitului
Toate componentele kitului trebuie lăsate să ajungă la temperatura
camerei înainte de a fi folosite.
Pregătirea suspensiei de microsfere tapetate cu anticorpi de
captură:
-Fiecare flacon conţinând microsferele dintr-o anumită populaţie
se sonichează 30 secunde şi se vortexează 1 minut
![Page 15: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/15.jpg)
-Se realizează un cocktail prin adăugarea a câte 60 µL din fiecare
flacon ce conţine suspensia de microsfere şi tampon de diluare a
microsferelor până la un volum total de 3 mL conform
recomandărilor kitului.
Pregătirea suspensiei ce conţine anticorpii de detectie
biotinilaţi:
-Se vortexează soluţia stock ce conţine anticorpii de detecţie
biotinilaţi şi se reconstituie cu tampon de reacţie conform
recomandărilor din protocol
Pregătirea suspensiei ce conţine SAPE:
-Se vortexează soluţia stock ce conţine SAPE şi se aduce la
concentraţia de lucru cu tampon de reacţie conform
recomandărilor din protocol
Pregătirea controalelor QC:
-Controalele QC1 şi QC2 se resuspendă folosind apă ultrapură
conform recomandărilor din protocol
-Se agită flacoanele şi apoi se vortexează
-Se lasă 5-10 minute apoi se transferă în tuburi de polipropilenă,
care pot fi păstrate timp de maxim 1 lună la ≤ -20°C.
Pregătirea tamponului de spălare:
-Tamponul de spălare (10x) se aduce la concentraţia de lucru
folosind apă ultrapură.
Pregătirea matricei:
-Pentru probele din ser şi plasmă se va utiliza matricea de ser
furnizata în kit. Aceasta se reconstituie adăugând tampon de
![Page 16: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/16.jpg)
reacţie conform recomandărilor din protocol şi se va lăsa 10
minute înainte de a fi utilizat.
Pregătirea standardelor:
-Standardul furnizat în kit se reconstituie folosind apă ultrapură şi
se amestecă până la dizolvare.
-Se agită şi se vortexează, apoi se lasă 5-10 minute înainte de a fi
utilizat. Acesta reprezintă standardul cu concentraţia cea mai
mare.
-Pornind de la standardul cu concentraţie maximă, se realizează
diluţii seriale cu ajutorul tamponului de reacţie. Ultimul tub
conţine numai tampon de reacţie care se utilizează ca standard cu
concentraţia 0 (vezi Figura 11).
Figura 11 -Diluţii seriale pentru realizarea curbei de etalonare
![Page 17: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/17.jpg)
5.PROTOCOL DE LUCRU
Poate fi parcurs în 2 zile dacă se aplică
incubarea peste noapte.
Imunodetecţie – ziua I
-Se umezesc filtrele în prealabil cu tampon de spălare/de reacţie.
-Se îndepărtează tamponul prin aspirare cu pompa de vid, apoi se
îndepărtează excesul de tampon prin tapotare pe prosoape de
hârtie.
-Se adaugă standardele, controalele şi tamponul de reacţie în
godeurile destinate probelor.
-Se adaugă matrixul peste standarde şi controale. În cazul
analizării de supernatanţi din culturi celulare/ lizate tisulare, se
foloseşte drept control mediul de cultură adecvat.
-Se adaugă probele biologice diluate în prealabil conform
recomandărilor din protocol.
-Se adaugă cocktail-ul de microsfere pregătit după ce a fost
vortexat în prealabil.
-Plăcuţa cu 96 de godeuri se sigilează cu o folie şi se incubează la
întuneric la temperatura camerei (20-25 ˚C) timp de o oră sau
peste noapte la 4˚C cu agitare continuă.
![Page 18: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/18.jpg)
Imunodetecţie – ziua II
-Plăcuţa cu 96 de godeuri se filtrează cu ajutorul pompei de vid.
-Se realizează spălări cu tampon de spălare pentru îndepărtarea
substanţelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfârşit se
tapotează plăcuţa pe prosoape de hârtie.
-Se adaugă soluţia ce conţine anticorpii de detecţie biotinilaţi
-Se sigilează plăcuţa cu o folie şi se incubează o oră la
temperatura camerei (20-25 ˚C) daca s-a urmat protocolul cu
incubare peste noapte sau 30 minute dacă s-a urmat protocolul cu
incubare la temperatura camerei.
Atenţie! Nu se aspiră cu pompa de vid după incubare.
-Se adaugă suspensia ce conţine SAPE.
-Se sigilează plăcuţa cu o folie şi se incubează 30 minute la
temperatura camerei (20-25 ˚C) cu agitare continuă.
-Se filtrează plăcuţa cu ajutorul pompei de vid.
-Se realizează spălări cu tampon de spălare pentru îndepărtarea
substanţelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfârşit se
tapotează plăcuţa pe prosoape de hârtie.
-Se adaugă fluidul de antrenare a microsferelor (Sheath Fluid).
-Se resuspendă microsferele prin agitare 5 minute pe shaker.
-Se citesc probele utilizând platforma Luminex 200, după
editarea protocolului de măsurare şi realizarea mentenanţei
sistemului.
![Page 19: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/19.jpg)
6.EDITAREA PROTOCOLULUI DE MĂSURARE
Definirea kitului şi a plăcuţei este o etapă necesară înainte de
citirea probelor �i se poate efectua şi înainte de realizarea
încălzirii sistemului (vezi mai jos sec�iunea MENTENANŢA
DE PORNIRE A PLATFORMEI)
În cadrul acestei etape se editează denumirea kitului, a analiţilor
(x-plex), numărul de concentraţii pentru curba standard şi
numărul de controale (Figura 12).
Fig. 12 Ecranul în care se editează denumirea kitului, a anali�ilor,
numărul de standarde şi de controale.
-se selectează populaţiile de microsfere analizate (x-plex), se
introduc unităţile de măsură (pg/mL), se selectează modul de
reprezentare a rezultatelor şi de calculare a curbei standard (five
![Page 20: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/20.jpg)
parameter logistics sau conform recomandărilor kitului) – Figura
13.
Fig. 13 Ecranul în care se editează proprietă�ile fiecărui test -se introduc datele legate de furnizor, date de expirare, loturi
(Figura 14);
-se introduc concentraţiile pentru calcularea curbei standard (se
pot introduce doar cele mai mari concentraţii şi factorul de diluţie
iar restul de concentraţii vor fi generate automat) – (Figura 15)
![Page 21: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/21.jpg)
Fig. 14 Ecranul în care se introduc informa�ii legate de furnizorul de reactivi,
data de expirare, numărul lotului
Fig. 15 Ecranul în care se introduc concentra�iile standardelor pentru fiecare test -se introduc valorile pentru controale, se verifică kitul.
-se definesc poziţiile (standard, control, probe) pentru achiziţia
datelor (Figura 16).
![Page 22: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/22.jpg)
Fig. 16 Ecranul în care se definesc pozi�iile pentru standarde, controale �i
probe
în vederea achizi�iei datelor
Achiziţia datelor
Pentru achiziţia datelor, se deschide worklist-ul setat anterior,
plăcuţa se introduce în sistem şi se selectează numărul de
evenimente ce va fi analizat pentru fiecare populaţie în parte,
timpul pentru achiziţie, numărul maxim de evenimente după care
se poate opri achiziţia datelor şi volumul din care se va realiza
analiza (Figura 17).
![Page 23: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/23.jpg)
Fig. 17 Ecranul în care se selectează condi�iile de oprire a achizi�iei datelor
7. NOŢIUNI PRIVIND SOFTUL STARSTATION 2.3 ŞI
ÎNTREŢINEREA SISTEMULUI
Utilizare - se selectează din Instrument controls şi se rulează
scripturile predefinite. Folosirea scripturilor permite parcurgerea
facilă a mai multor paşi pentru realizarea mentenanţei sistemului.
![Page 24: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/24.jpg)
Fig. 18 Ecranul în care se derulează protocolul de ini�ializare a sistemului MENTENANŢA DE PORNIRE A PLATFORMEI
Derularea protocolului de iniţializare a sistemului (Default Start-
up) cuprinde următoarele operaţiuni (Figura 18)
-Încălzirea laserelor – durează aproximativ 30 de minute (un timer
din bara de instrumente va indica timpul rămas până la încălzirea
completă).
-Verificarea presiunii sistemului (normal 6-9 psi).
-Îndepărtarea bulelor de aer din sistem (comanda Prime) şi ciclul
de spălare cu alcool etilic 70%, apă şi Sheath fluid.
AJUSTAREA ÎNĂLŢIMII SONDEI (AC DE PIPETARE)
-Se efectuează înainte de citirea plăcuţei şi de realizarea calibrării
sistemului.
-Se realizează cu ajutorul kitului de aliniament furnizat la
achizi�ia platformei (2-3 discuri de metal pentru plăcuţa cu 96
![Page 25: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/25.jpg)
de godeuri cu baza plată sau o sferă metalică pentru godeuri cu
baza rotunjită).
-De asemenea este obligatoriu ca volumul final în fiecare godeu al
plăcuţei să fie cu cel puţin 30 µL mai mult decât volumul setat
pentru a fi preluat de către sondă (care este aprox. de 50 µL).
CALIBRAREA SISTEMULUI
-Se realizează după ce sistemul şi-a încheiat cu succes paşii de
mentenanţă (care pot genera căldură).
-Pentru o performanţă optimă se recomandă calibrarea sistemului
în fiecare zi ca parte a protocolului de mentenanţă şi de fiecare
dată când variaţiile de temperatură afişate pe bara de instrumente
sunt +/- 3°C.
-Statusul calibrării sistemului este afişat pe bara de instrumente,
individual pentru cei 2 calibratori (Figura 19?):
Cal 1- Classification Calibrator
Cal 2- Reporter Calibrator
Figura 19 – Bara de instrumente ce furnizează în orice moment date despre
statusul sistemului
-Calibratorii sunt populaţii de microsfere cu proprietăţi de difuzie
a luminii şi intensităţi fluorescente cunoscute care se încadrează
în lungimile de undă ale canalelor RPT, DD, CL1 şi CL2.
![Page 26: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/26.jpg)
-Rata evenimentelor în timpul calibrării este afişată pe bara de
instrumente şi trebuie să se încadreze între 100-300
evenimente/secundă.
-O rată mică de evenimente sugerează o ajustare incorectă/
înfundare a sondei.
-Calibrarea se realizează efectiv prin adăugarea a câte 5 picături
de Cal 1 şi Cal 2 în godeurile selectate.
CONTROLUL SISTEMULUI
-Înainte de efectuarea controlului sistemului, ne asigurăm că
sistemul a fost încălzit, sonda curăţată şi ajustată corespunzator,
iar calibrarea s-a încheiat cu succes.
-Se derulează după selectarea script-ului Control Verification care
se regăseşte în Instrument Controls.
-Microsferele de control (CON 1 şi CON 2) sunt folosite pentru
verificarea calibrării şi a integrităţii optice a sistemului.
-CON 1 (Classification Control Beads) sunt folosite pentru
verificarea eficienţei clasificării microsferelor. CON 1 este un
cocktail de 5 populaţii diferite de microsfere folosite pentru
verificarea funcţionării la parametri optimi a canalelor de
clasificare. Aceste populaţii de microsfere sunt special selectate
pentru a corespunde unei zone periferice a hărţii populaţiilor de
microsfere, ID-ul lor fiind 6, 21, 73, 81 şi 96 (vezi �i Figura 5).
-CON 2 (Reporter Control Microspheres) este un cocktail care
conţine în proporţii relativ egale 4 populaţii de microsfere cu
![Page 27: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/27.jpg)
concentraţii diferite de fluorocrom (ficoeritrină – molecula
raportor). Sunt folosite pentru verificarea funcţionării la parametri
optimi a canalului raportor pentru ficoeritrină. Microsferele CON
2 nu au amestecul de 2 fluorocromi cu care sunt marcate
populaţiile de microsfere MicroPlex, dar au 4 nivele de
concentraţii de ficoeritrină. Aceste microsfere nu pot constitui un
4-plex veritabil, deoarece nu pot fi identificate individual sau de-
multiplexate prin filtre de clasificare (gating).
Controlul efectiv se realizează prin adăugarea a câte 5 picături de
CON 1 şi CON 2 în godeurile selectate.
MENTENANŢA DE ÎNCHIDERE A PLATFORMEI
-Se realizează prin derularea operaţiunilor din script-ul Default
Shutdown: SANITIZE (durează 5 minute şi foloseşte hipoclorit
pentru decontaminarea sistemului şi a sondei) şi SOAK (foloseşte
apa ultrapură pentru reducerea potenţialului de precipitare a
sărurilor conţinute de Sheath fluid).
ANALIZA ŞI PRELUCRAREA REZULTATELOR.
EXPORTUL DATELOR
Platforma Luminex 200 afişează în timp real informaţii legate de
achiziţia datelor; astfel pot fi urmărite histogramele care apar în
cele 3 ferestre (DD, CL1/CL2, RPT) – (Figura 20).
![Page 28: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/28.jpg)
Fig. 20 Histogramele afi�ate în ferestrele DD, CL1/CL2, RPT
Pentru analiza şi prelucrarea rezultatelor se va urmări aspectul
fiecărei curbe corespunzătoare analiţilor luaţi în studiu şi se vor
elimina valorile aberante (valorile eliminate din curba standard
vor fi reprezentate prin elipse goale) – (Figura 21).
![Page 29: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/29.jpg)
Fig. 21 Exemplu de curbă standard pentru IL-4R
Softul permite calcularea a 4 variante de curbă (se va selecta
varianta optimă conform recomandărilor kitului de multiplexare) -
(Figura 22).
Fig. 22 Exemplu de selectare a variantei de curbă
-După optimizarea curbelor standard, rezultatele pot fi salvate
într-un fişier de format .xml. Se poate genera un raport al analizei
sau fişierul poate fi importat în documente de tip Microsoft Excel
(Figura 23).
![Page 30: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/30.jpg)
Figura 23 – Exemplu de raport generat în urma citirii plăcuţei
8.TEHNOLOGIA XMAP ARRAY - UTILITATE ŞI
AVANTAJE Viteză
Flux Crescut
1 set de microsfere = 1 analit/probă biologică.
100 seturi de microsfere = 100 de analiţi/probă
biologică.
De exemplu pentru 100-plex:
30 de probe x 100 de analiţi/probă biologică = 3000
analiţi
Ace�ti 3000 de analiti sunt măsuraţi simultan pe o
plăcuţă cu 96 de godeuri.
Versatilitate
Analiza variată de biomarkeri (acizi nucleici,
proteine, enzime etc.) datorită posibilităţii cuplării
microsferelor cu diverse molecule (anticorpi /
antigene, peptide / oligonucleotide, alte proteine şi
molecule mici).
Reproductibilitate
Numărul mare de microsfere din acelaşi lot permite
standardizarea testului în comparaţie cu testele pe
![Page 31: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/31.jpg)
suport solid (ELISA).
Acurateţe
Analiza în timp real.
Acurateţea procesării datelor.
Flexibilitate
Platforma Luminex 200 permite updatarea soft-ului
pentru folosirea kiturilor de multiplexare cu
microsfere magnetice (exemplu – software-ul
xPONENT 3.1).
![Page 32: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/32.jpg)
III. BIBLIOGRAFIE
1. B. Nolen, A. Lomakin, W. L. Bigbee, J. Siegfried and A. Lokshin.
Serum biomarkers for early detection of lung cancer. Journal of Clinical
Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting
Edition).Vol 28, No 15_suppl (May 20 Supplement), 2010: e21057.
2. Faina Linkov1, Robert L. Ferris, Zoya Yurkovetsky, Adele
Marrangoni, Lyudmila Velikokhatnaya, William Gooding, Brian Nolan,
Matthew Winans, Eric R. Siegel, Anna Lokshin, and Brendan C. Stack
Jr. Multiplex analysis of cytokines as biomarkers that differentiate
benign and malignant thyroid diseases. Proteomics Clin Appl. 2008
October 10; 2(12): 1575–1585.
3. Panel Jindra Vrzalova, Marketa Prazakova, Zdenek Novotny, Ondrej
Topolcan, Miroslava Casova, Lubos Holubec Jr. Test of Ovarian
Cancer Multiplex xMAP Technology. ANTICANCER RESEARCH 29:
573-576 (2009).
4. Xu BJ, An QA, Srinivasa Gowda S, Yan W, Pierce LA, Abel TW, Rush SZ, Cooper MK, Ye F, Shyr Y, Weaver KD, Thompson RC. Identification of blood protein biomarkers that aid in the clinical assessment of patients with malignant glioma. Int J Oncol. 2012. Epub 2012 Feb 3.
![Page 33: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/33.jpg)
5. Melinceanu L, Lerescu L, Tucureanu C, Caras I, Pitica
R, Sarafoleanu C, Salageanu A. Serum perioperative profile
of cytokines in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. J
Otolaryngol Head Neck Surg. 2011 Apr;40(2):143-50.
6. Bortolin MT, Tedeschi R, Bidoli E, Zanussi S, Pratesi C, Vaccher
E, Tirelli U, De Paoli P. Multiplex analysis of blood cytokines as a
prognostic tool in HIV related non-Hodgkin lymphoma patients: a
potential role of interleukin-Cytokine 2012 Oct;60(1).
7. Ayalew Tefferi, Rakhee Vaidya, Domenica Caramazza, Christy
Finke, Terra Lasho, and Animesh Pardanani. Circulating Interleukin
(IL)-8, IL-2R, IL-12, and IL-15 Levels Are Independently Prognostic in
Primary Myelofibrosis: A Comprehensive Cytokine Profiling Study.
Journal of Clinical Oncology, vol.29, No.10, 2011.
8. Zia A. Dehqanzada, Catherine E. Storrer, Matthew T. Hueman,
Rebecca J. foley, Katie A. Harris1, Yusuf H. Jama, Craig D. Shriver,
Sathibalan Ponniah, George E. Peoples. Assessing serum cytokine
profiles in breast cancer patients receiving a HER2/neu vaccine using
Luminex® technology. Oncology Reports, 17: 687-694, 2007. 687
9. Clint Allen, Sonia Duffy, Theodoros Teknos, Mozaffarul Islam,
Zhong Chen, Paul S. Albert, Gregory Wolf, Carter Van Waes. Nuclear
Factor Kappa-B-Related Serum Factors as Longitudinal Biomarkers of
Response and Survival in Advanced Oropharyngeal Carcinoma. Clin
Cancer Res 2007;13(11) June 1, 2007.
10. Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R, Wu Q, Bartkova J, Lee M, et
al. Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes glioma
![Page 34: XMAP](https://reader033.fdocumente.com/reader033/viewer/2022042502/55cf92b5550346f57b98ed04/html5/thumbnails/34.jpg)
stem-like cell viability and tumor growth. The Journal of experimental
medicine. 2012;209(3):507-20. Epub 2012/03/07.
11. Wehland M, Bauer J, Magnusson NE, Infanger M, Grimm D.
Biomarkers for anti-angiogenic therapy in cancer. International journal
of molecular sciences. 2013;14(5):9338-64. Epub 2013/05/01.
12. Sharma T, Dhingra R, Singh S, Sharma S, Tomar P, Malhotra M, et
al. Aflibercept: a novel VEGF targeted agent to explore the future
perspectives of anti-angiogenic therapy for the treatment of multiple
tumors. Mini reviews in medicinal chemistry. 2013;13(4):530-40. Epub
2013/01/16.
13. Yun SM, Jung KH, Lee H, Son MK, Seo JH, Yan HH, et al.
Synergistic anticancer activity of HS-173, a novel PI3K inhibitor in
combination with Sorafenib against pancreatic cancer cells. Cancer
letters. 2013;331(2):250-61. Epub 2013/01/24.
14. Tanase CP, Dima S, Mihai M, Raducan E, Nicolescu MI, Albulescu
L, et al. Caveolin-1 overexpression correlates with tumour progression
markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of molecular
histology. 2009;40(1):23-9. Epub 2009/01/23.
15. Tanase CP, Neagu M, Albulescu R, Hinescu ME. Advances in
pancreatic cancer detection. Advances in clinical chemistry.
2010;51:145-80. Epub 2010/09/23.