ANALIZA MULTIPLEX PRIN TEHNOLOGIA XMAP

ARRAY

1. PRINCIPIUL METODEI

Multiplexarea prin tehnologia xMAP este o tehnică proteomică ce

permite identificarea şi cuantificarea simultană a seturilor de proteine

din probe biologice complexe, utilizând ca suport solid pentru

imunodetecţie populaţii de microsfere marcate cu concentraţii

precise de 2 fluorocromi; această marcare creează microsferelor

spectre unice de absorb�ie.

În funcţie de procentul de încorporare specifică a celor 2 fluorocromi

de marcare, care au spectre de citire în rosu şi infraroşu, au putut fi

create 100 de popula�ii distincte de microsfere. Fiecare dintre

aceste 100 de tipuri de microsfere poate fi acoperită cu anticorpi de

captură specifici. Astfel, 100 de analiţi diferiţi pot fi identificaţi şi

cuantificaţi simultan din acelaşi volum de probă. Populaţiile de

microsfere pot fi combinate între ele, fiecare populaţie păstrându-şi

însă adresa spectrală unică.

După legarea specifică a analitului din proba de cercetat la anticorpul

care îmbracă microsfera, se adaugă un anticorp biotinilat care se va

lega la un alt epitop al analitului. Pentru eviden�ierea reac�iei

antigen-anticorp, amestecul este apoi incubat cu streptavidină-

ficoeritrină (SAPE), care va emite un semnal fluorescent direct

proporţional cu cantitatea de analit din proba biologică de cercetat.

Tehnologia xMAP array stă la baza funcţionării mai multor

platforme dezvoltate de către Luminex Corporation – Luminex

100/200, FLEXMAP 3D, MAGPIX.

2. PLATFORMA LUMINEX200 - include analizorul

Luminex 200, citometrul Luminex XY, sistemul Luminex SD

de livrare a fluidului Sheath, software-ul şi PC-ul (Figura 1).

Figura 1 - Platforma Luminex200

Tehnologia folosită de platforma Luminex 200 are la bază:

- interacţiunea specifica antigen-anticorp de tip ELISA (enzyme-

linked immunosorbent assay), care este încă considerată metoda

standard de analiză cantitativă a proteinelor. ELISA clasică permite

testarea unui număr mare de probe biologice, dar nu permite analiza

decât a unui singur analit pe o plăcuţă cu 8/96/384 de godeuri în

func�ie de format;

- tehnica citometriei în flux. În citometria în flux „clasică”, o

suspensie de celule este condusă din tubul ce conţine proba spre

analizor. Fiecare celulă marcată fluorescent este analizată individual

şi separată în grupuri specifice pe baza granularită�ii, mărimii

celulare �i pozitivită�ii fa�ă de anticorpii cu care a fost marcată

suspensia celulară. Zeci �i sute de mii de celule pot fi astfel studiate

individual în doar câteva secunde. Citometria în flux poate să

analizeze pe baza caracteristicilor fizice/biochimice �i alte particule

subcelulare în suspensie ca nuclei, organite celulare etc.

Platforma Luminex 200 foloseşte aceste două metodologii,

îmbinate cu idei inovatoare şi analizează astfel microsfere (beads-

uri) în locul celulelor, microsferele jucând şi rol de suport de legare

pentru moleculele de interes.

Figura 2 – Dirijarea microsferelor spre camera de detecţie

Etapele generale ale acestei tehnologii prezentate schematic în

Figura 2. Proba este aspirată la o rată de 1 µl/sec şi antrenată de

către fluidul specific (Sheath fluid) în cuva de măsurare din

interiorul analizorului Luminex 200 cu o viteză de 90 µl/sec astfel

încât să se creeze un flux laminar, iar prin acest proces de

focusare hidrodinamică, microsferele sunt direcţionate una câte

una către camera de detecţie, unde laserele bombardează

microsferele, iar semnalele fluorescente emise sunt analizate de

către procesoare de semnal digital de mare viteză (1000 de

evenimente /semnale de fluorescenţă pentru fiecare microsferă în

parte).

Microsferele MicroPlex-caracteristici

- microsfere de polistiren

-diametru mic (5.6 microni)

- u�or de resuspendat în mediu

lichid

- raport optim suprafaţă/ volum

- cinetică rapidă

- marcate fluorescent

Φ=5.6µm

Figura 3. Microsferele MicroPlex-caracteristici

Microsferele MicroPlex prezintă pe suprafaţă grupări carboxil

pentru realizarea de legături covalente stabile între suprafaţa

microsferelor şi setul de anticorpi specifici (Figura 3).

Activarea microsferelor pentru includerea în kitul de detec�ie se

realizează de către producător prin incubare timp de 2 ore cu soluţie

de anticorp. Pentru îndepărtarea reactivilor necuplaţi se realizează

etapele de spălare, prevenind astfel şi activarea grupărilor carboxil de

pe moleculele de proteine care ar determina formarea legăturilor

proteină - proteină, în detrimentul legăturilor specifice proteină –

microsferă (Figura 4).

Figura 4 – Cuplarea microsferelor cu anticorpii specifici de captură

Iniţial microsferele sunt produse în loturi foarte mari pentru a se

asigura o suprafaţă identică din punct de vedere chimic pentru

fiecare populaţie de microsfere, apoi loturile sunt împărţite în sub-

loturi în vederea marcării microsferelor prin imersarea acestora

într-o soluţie organică ce conţine un amestec de 2 fluorocromi.

Tehnologia xMAP foloseşte această tehnică de marcare a

microsferelor cu ajutorul unei combinaţii precise de 2 fluorofori

(cu lungime de unda de excitatie la 635 nm si benzi de emisie la

658, respective 712 nm), astfel putând fi creată o hartă cu 100 de

populaţii distincte de microsfere. În funcţie de raporturile de

concentratie ale fluoroforilor, fiecare microsferă interogată emite

o fluorescenţă cu o adresă spectrală unică ce aparţine unei

anumite populaţii de microsfere (Figura 5).

Figura 5 – Harta popula�iilor de microsfere 100-plex.

Alte tipuri de Microsfere

MagPlex sunt microsfere având în compozi�ia chimică polistiren

cu proprietăţi magnetice; pot fi create 500 de populaţii distincte cu

adrese spectrale unice.

MagPlex-TAG sunt microsfere din polistiren cu proprietăţi

magnetice �i care au fost cuplate cu oligonucleotide; pot fi create

până la 150 de populaţii distincte, fiecare populaţie având o

secvenţă unică de 24 de perechi de baze ADN.

LumAvidin sunt microsfere din polistiren �i care sunt direct

cuplate cu avidină, putând fi create 100 de populaţii distincte de

microsfere. Sunt adecvate pentru testări proteice şi

imunogenetice.

SeroMAP sunt microsfere de polistiren, optimizate pentru

reducerea legăturilor nespecifice dintre molecule, fiind astfel

ideale pentru testări serologice. Reprezintă varianta îmbunătăţită a

microsferelor MicroPlex.

Tehnologia xMAP array în 5 etape (diagrama din Figura 6)

1. Resuspendarea microsferelor

2. Legarea anticorpului de captură specific (cuplarea)

3. Adăugarea analitului de cercetat (antigenul)

4. Legarea anticorpului de detecţie biotinilat la un alt epitop al

antigenului

5. Legarea complexului streptavidină-ficoeritrină (SAPE)

– molecula raportor

Figura 6. Microsfera cuplată cu anticorpul de captură care s-a legat de

antigenul din proba de analizat. Reac�ia antigen-anticorp a fost eviden�iată

prin anticorpul de detec�ie biotinilat care a cuplat molecula-raportor

Microsferele antrenate într-un singur şir către camera de detecţie

trec consecutiv prin faţa a două fascicule laser:

LASERUL ROŞU – realizează identificarea microsferei pe baza

adresei spectrale unice → identifică analitul de cercetat.

LASERUL VERDE – excită ficoeritrina şi determină

fluorescenţa acesteia → cuantifică analitul de cercetat.

Figura 7 – Excitarea microsferelor de către cele două tipuri de lasere

Laserul roşu (laser pentru clasificare, lungime de undă λ = 635

nm) excită cei 2 fluorocromi încorporaţi în microsferă, care vor

emite semnale fluorescente ce vor putea fi măsurate de către o

serie de fotodiode (3 APD = Avalanche Photodiode). În acelaşi

timp, fiecare microsferă sau microsfere legate nespecific între ele

(dublete), bule de aer etc. emit fluorecenţă în funcţie de

dimensiunea fiecăreia, semnalul fiind preluat de altă serie de

fotodiode care permite determinarea mărimii fiecărei particule

interogate.

Laserul verde (laser Yttrium-Argon-Germanium, la lungimea de

undă λ = 532 nm) excita microsferele iar fotomultiplicatorul

(PMT, photomultiplier) detectează semnalele raportor emise de

către ficoeritrina legată de suprafaţa microsferelor. Intensitatea

fluorescenţei este direct corelată cu cantitatea de analit legat de

microsferă.

Sistemul optic analog unui citometru clasic este reprezentat în

Figura 8.

Figura 8 – Sistemul optic al Platformei Luminex 200 – Laser de 532

nm (laser raportor) i 635 nm (laser clasificator) fotomultiplicator (PMT pentru

ficoeritrina, 565-585 nm), APD pentru detectie clasificator 1 si 2; APD opus

PMT = discriminator de dublet

Analiza şi prelucrarea datelor

Sistemul de analiză Luminex 200 este capabil să proceseze şi să

înregistreze până la 20.000 de evenimente/secundă (Diagrama

Figurii 9).!

În urma acţiunii sistemului optic sunt înregistraţi

4 parametri pentru fiecare microsferă:

- emisia moleculei raportor la λ=565-585nm (RPT)

- emisia fluorescentă a microsferei la λ= 635nm (DD)

- emisia fluorocromului cu spectru roşu cu care este marcată

microsfera (CL1)

- emisia fluorocromului cu spectru infraroşu cu care este

marcată microsfera (CL2)

Luminex200 – Procesarea semnalului

APD ( CL1, CL2, DD),

PMT (RPT)

↓

SEMNALE

FLUORESCENTE

↓

PROCESOR DE

SEMNALE

↓

SEMNALE DIGITALE:

(HISTOGRAME)

↓

MEDIAN

FLUORESCENCE

INTENSITY (MFI)

↓

CURBA DE ETALONARE

FIVE PARAMETER LOGISTICS

↓

pg/mL

Figura 9. Schema de procesare a fluorescen�ei captate pe fotomultiplicator

până la furnizarea rezultatelor exprimate ca �i concentra�ie /mL.

3. TIPURILE DE PROBE BIOLOGICE ce pot fi analizate prin

tehnologia xMAP array şi pregatirea/prelucrarea lor:

3.1.SER

- sângele recoltat în vacutainer cu capac roşu (fără anticoagulant)

este lăsat să coaguleze cel puţin 30 de minute

- se centrifughează 10 min la 1000g

- serul se separă şi se analizează imediat sau este alicotat în tuburi

de polipropilenă şi stocat la < -20°C

3.2.PLASMA

- sângele se recoltează pe anticoagulant (EDTA) şi se

centrifughează timp de 10 min la 1000g în maxim 30 min de la

recoltare

- plasma se separă şi se analizează imediat sau este alicotată în

tuburi de polipropilenă şi stocată la <-20°C

3.3.SUPERNATANŢII DE CULTURI CELULARE

-după recoltare se centrifughează pentru a îndepărta resturile

celulare

-se analizează imediat sau sunt stocaţi în aceleaşi condiţii descrise

mai sus

În cazul în care sunt analizate probe congelate, acestea se

decongelează complet, se vortexează şi apoi se centrifughează. Se

recomandă evitarea repetării ciclurilor îngheţ/dezgheţ.

Serurile şi plasma se diluează înainte de analiză conform

recomandărilor producătorului sau conform diluţiei optime

determinate în prealabil.

Alte probe biologice ce pot fi analizate prin tehnologia xMAP

array: lichid cefalorahidian (LCR), urină, saliva, lichid sinovial,

pleural etc.

În cazul supernatanţilor de culturi celulare sau a extractelor

tisulare, se recomandă determinarea concentraţiei de proteine

înainte de efectuarea analizei.

Trasabilitatea probelor este asigurată prin alocarea unui cod unic de

identificare pentru fiecare probă, cod ce însoţeşte probele pe timpul

analizelor/stocare şi se regăseşte atât în sistemul informatic al

laboratorului, cât şi în registru. E�antioanele extrase din probă trebuie

de asemenea să fie trasabile la proba primară.

4. METODOLOGIA DE MULTIPLEXARE

Kitul furnizat de către MERCK-MILLIPORE (Figura 9) este

livrat cu următoarele

componente: microsfere x-plex,

standard liofilizat, controale

QC1 şi QC2, soluţie SAPE,

matrix (pentru ser/plasmă),

anticorpi de detecţie, plăcuţa cu

96 godeuri filtrante, tampon de

diluare a microsferelor, tampon de spălare, protocolul kitului. Figura 10 - Kit furnizat de către MERCK-MILLIPORE

Următorii reactivi �i echipamente trebuie să fie asigurate de

utilizator:

Luminex Sheath Fluid

Pipete ajustabile pentru volume cuprinse între 25 �i 1000 µL

Pipete multicanal

Flacoane de preparare pentru reactivi

Tuburi de propilenă pentru microcentrifugare

Folie de aluminiu

Benzi de cauciuc

Tampoane absorbante

Vortex Mixer

Sonicator

Shaker pentru plăcu�ele de lucru

Pompă de vid pentru filtrare

Suport pentru placa

Pregătirea kitului

Toate componentele kitului trebuie lăsate să ajungă la temperatura

camerei înainte de a fi folosite.

Pregătirea suspensiei de microsfere tapetate cu anticorpi de

captură:

-Fiecare flacon conţinând microsferele dintr-o anumită populaţie

se sonichează 30 secunde şi se vortexează 1 minut

-Se realizează un cocktail prin adăugarea a câte 60 µL din fiecare

flacon ce conţine suspensia de microsfere şi tampon de diluare a

microsferelor până la un volum total de 3 mL conform

recomandărilor kitului.

Pregătirea suspensiei ce conţine anticorpii de detectie

biotinilaţi:

-Se vortexează soluţia stock ce conţine anticorpii de detecţie

biotinilaţi şi se reconstituie cu tampon de reacţie conform

recomandărilor din protocol

Pregătirea suspensiei ce conţine SAPE:

-Se vortexează soluţia stock ce conţine SAPE şi se aduce la

concentraţia de lucru cu tampon de reacţie conform

recomandărilor din protocol

Pregătirea controalelor QC:

-Controalele QC1 şi QC2 se resuspendă folosind apă ultrapură

conform recomandărilor din protocol

-Se agită flacoanele şi apoi se vortexează

-Se lasă 5-10 minute apoi se transferă în tuburi de polipropilenă,

care pot fi păstrate timp de maxim 1 lună la ≤ -20°C.

Pregătirea tamponului de spălare:

-Tamponul de spălare (10x) se aduce la concentraţia de lucru

folosind apă ultrapură.

Pregătirea matricei:

-Pentru probele din ser şi plasmă se va utiliza matricea de ser

furnizata în kit. Aceasta se reconstituie adăugând tampon de

reacţie conform recomandărilor din protocol şi se va lăsa 10

minute înainte de a fi utilizat.

Pregătirea standardelor:

-Standardul furnizat în kit se reconstituie folosind apă ultrapură şi

se amestecă până la dizolvare.

-Se agită şi se vortexează, apoi se lasă 5-10 minute înainte de a fi

utilizat. Acesta reprezintă standardul cu concentraţia cea mai

mare.

-Pornind de la standardul cu concentraţie maximă, se realizează

diluţii seriale cu ajutorul tamponului de reacţie. Ultimul tub

conţine numai tampon de reacţie care se utilizează ca standard cu

concentraţia 0 (vezi Figura 11).

Figura 11 -Diluţii seriale pentru realizarea curbei de etalonare

5.PROTOCOL DE LUCRU

Poate fi parcurs în 2 zile dacă se aplică

incubarea peste noapte.

Imunodetecţie – ziua I

-Se umezesc filtrele în prealabil cu tampon de spălare/de reacţie.

-Se îndepărtează tamponul prin aspirare cu pompa de vid, apoi se

îndepărtează excesul de tampon prin tapotare pe prosoape de

hârtie.

-Se adaugă standardele, controalele şi tamponul de reacţie în

godeurile destinate probelor.

-Se adaugă matrixul peste standarde şi controale. În cazul

analizării de supernatanţi din culturi celulare/ lizate tisulare, se

foloseşte drept control mediul de cultură adecvat.

-Se adaugă probele biologice diluate în prealabil conform

recomandărilor din protocol.

-Se adaugă cocktail-ul de microsfere pregătit după ce a fost

vortexat în prealabil.

-Plăcuţa cu 96 de godeuri se sigilează cu o folie şi se incubează la

întuneric la temperatura camerei (20-25 ˚C) timp de o oră sau

peste noapte la 4˚C cu agitare continuă.

Imunodetecţie – ziua II

-Plăcuţa cu 96 de godeuri se filtrează cu ajutorul pompei de vid.

-Se realizează spălări cu tampon de spălare pentru îndepărtarea

substanţelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfârşit se

tapotează plăcuţa pe prosoape de hârtie.

-Se adaugă soluţia ce conţine anticorpii de detecţie biotinilaţi

-Se sigilează plăcuţa cu o folie şi se incubează o oră la

temperatura camerei (20-25 ˚C) daca s-a urmat protocolul cu

incubare peste noapte sau 30 minute dacă s-a urmat protocolul cu

incubare la temperatura camerei.

Atenţie! Nu se aspiră cu pompa de vid după incubare.

-Se adaugă suspensia ce conţine SAPE.

-Se sigilează plăcuţa cu o folie şi se incubează 30 minute la

temperatura camerei (20-25 ˚C) cu agitare continuă.

-Se filtrează plăcuţa cu ajutorul pompei de vid.

-Se realizează spălări cu tampon de spălare pentru îndepărtarea

substanţelor nelegate folosind pompa de vid, iar la sfârşit se

tapotează plăcuţa pe prosoape de hârtie.

-Se adaugă fluidul de antrenare a microsferelor (Sheath Fluid).

-Se resuspendă microsferele prin agitare 5 minute pe shaker.

-Se citesc probele utilizând platforma Luminex 200, după

editarea protocolului de măsurare şi realizarea mentenanţei

sistemului.

6.EDITAREA PROTOCOLULUI DE MĂSURARE

Definirea kitului şi a plăcuţei este o etapă necesară înainte de

citirea probelor �i se poate efectua şi înainte de realizarea

încălzirii sistemului (vezi mai jos sec�iunea MENTENANŢA

DE PORNIRE A PLATFORMEI)

În cadrul acestei etape se editează denumirea kitului, a analiţilor

(x-plex), numărul de concentraţii pentru curba standard şi

numărul de controale (Figura 12).

Fig. 12 Ecranul în care se editează denumirea kitului, a anali�ilor,

numărul de standarde şi de controale.

-se selectează populaţiile de microsfere analizate (x-plex), se

introduc unităţile de măsură (pg/mL), se selectează modul de

reprezentare a rezultatelor şi de calculare a curbei standard (five

parameter logistics sau conform recomandărilor kitului) – Figura

13.

Fig. 13 Ecranul în care se editează proprietă�ile fiecărui test -se introduc datele legate de furnizor, date de expirare, loturi

(Figura 14);

-se introduc concentraţiile pentru calcularea curbei standard (se

pot introduce doar cele mai mari concentraţii şi factorul de diluţie

iar restul de concentraţii vor fi generate automat) – (Figura 15)

Fig. 14 Ecranul în care se introduc informa�ii legate de furnizorul de reactivi,

data de expirare, numărul lotului

Fig. 15 Ecranul în care se introduc concentra�iile standardelor pentru fiecare test -se introduc valorile pentru controale, se verifică kitul.

-se definesc poziţiile (standard, control, probe) pentru achiziţia

datelor (Figura 16).

Fig. 16 Ecranul în care se definesc pozi�iile pentru standarde, controale �i

probe

în vederea achizi�iei datelor

Achiziţia datelor

Pentru achiziţia datelor, se deschide worklist-ul setat anterior,

plăcuţa se introduce în sistem şi se selectează numărul de

evenimente ce va fi analizat pentru fiecare populaţie în parte,

timpul pentru achiziţie, numărul maxim de evenimente după care

se poate opri achiziţia datelor şi volumul din care se va realiza

analiza (Figura 17).

Fig. 17 Ecranul în care se selectează condi�iile de oprire a achizi�iei datelor

7. NOŢIUNI PRIVIND SOFTUL STARSTATION 2.3 ŞI

ÎNTREŢINEREA SISTEMULUI

Utilizare - se selectează din Instrument controls şi se rulează

scripturile predefinite. Folosirea scripturilor permite parcurgerea

facilă a mai multor paşi pentru realizarea mentenanţei sistemului.

Fig. 18 Ecranul în care se derulează protocolul de ini�ializare a sistemului MENTENANŢA DE PORNIRE A PLATFORMEI

Derularea protocolului de iniţializare a sistemului (Default Start-

up) cuprinde următoarele operaţiuni (Figura 18)

-Încălzirea laserelor – durează aproximativ 30 de minute (un timer

din bara de instrumente va indica timpul rămas până la încălzirea

completă).

-Verificarea presiunii sistemului (normal 6-9 psi).

-Îndepărtarea bulelor de aer din sistem (comanda Prime) şi ciclul

de spălare cu alcool etilic 70%, apă şi Sheath fluid.

AJUSTAREA ÎNĂLŢIMII SONDEI (AC DE PIPETARE)

-Se efectuează înainte de citirea plăcuţei şi de realizarea calibrării

sistemului.

-Se realizează cu ajutorul kitului de aliniament furnizat la

achizi�ia platformei (2-3 discuri de metal pentru plăcuţa cu 96

de godeuri cu baza plată sau o sferă metalică pentru godeuri cu

baza rotunjită).

-De asemenea este obligatoriu ca volumul final în fiecare godeu al

plăcuţei să fie cu cel puţin 30 µL mai mult decât volumul setat

pentru a fi preluat de către sondă (care este aprox. de 50 µL).

CALIBRAREA SISTEMULUI

-Se realizează după ce sistemul şi-a încheiat cu succes paşii de

mentenanţă (care pot genera căldură).

-Pentru o performanţă optimă se recomandă calibrarea sistemului

în fiecare zi ca parte a protocolului de mentenanţă şi de fiecare

dată când variaţiile de temperatură afişate pe bara de instrumente

sunt +/- 3°C.

-Statusul calibrării sistemului este afişat pe bara de instrumente,

individual pentru cei 2 calibratori (Figura 19?):

Cal 1- Classification Calibrator

Cal 2- Reporter Calibrator

Figura 19 – Bara de instrumente ce furnizează în orice moment date despre

statusul sistemului

-Calibratorii sunt populaţii de microsfere cu proprietăţi de difuzie

a luminii şi intensităţi fluorescente cunoscute care se încadrează

în lungimile de undă ale canalelor RPT, DD, CL1 şi CL2.

-Rata evenimentelor în timpul calibrării este afişată pe bara de

instrumente şi trebuie să se încadreze între 100-300

evenimente/secundă.

-O rată mică de evenimente sugerează o ajustare incorectă/

înfundare a sondei.

-Calibrarea se realizează efectiv prin adăugarea a câte 5 picături

de Cal 1 şi Cal 2 în godeurile selectate.

CONTROLUL SISTEMULUI

-Înainte de efectuarea controlului sistemului, ne asigurăm că

sistemul a fost încălzit, sonda curăţată şi ajustată corespunzator,

iar calibrarea s-a încheiat cu succes.

-Se derulează după selectarea script-ului Control Verification care

se regăseşte în Instrument Controls.

-Microsferele de control (CON 1 şi CON 2) sunt folosite pentru

verificarea calibrării şi a integrităţii optice a sistemului.

-CON 1 (Classification Control Beads) sunt folosite pentru

verificarea eficienţei clasificării microsferelor. CON 1 este un

cocktail de 5 populaţii diferite de microsfere folosite pentru

verificarea funcţionării la parametri optimi a canalelor de

clasificare. Aceste populaţii de microsfere sunt special selectate

pentru a corespunde unei zone periferice a hărţii populaţiilor de

microsfere, ID-ul lor fiind 6, 21, 73, 81 şi 96 (vezi �i Figura 5).

-CON 2 (Reporter Control Microspheres) este un cocktail care

conţine în proporţii relativ egale 4 populaţii de microsfere cu

concentraţii diferite de fluorocrom (ficoeritrină – molecula

raportor). Sunt folosite pentru verificarea funcţionării la parametri

optimi a canalului raportor pentru ficoeritrină. Microsferele CON

2 nu au amestecul de 2 fluorocromi cu care sunt marcate

populaţiile de microsfere MicroPlex, dar au 4 nivele de

concentraţii de ficoeritrină. Aceste microsfere nu pot constitui un

4-plex veritabil, deoarece nu pot fi identificate individual sau de-

multiplexate prin filtre de clasificare (gating).

Controlul efectiv se realizează prin adăugarea a câte 5 picături de

CON 1 şi CON 2 în godeurile selectate.

MENTENANŢA DE ÎNCHIDERE A PLATFORMEI

-Se realizează prin derularea operaţiunilor din script-ul Default

Shutdown: SANITIZE (durează 5 minute şi foloseşte hipoclorit

pentru decontaminarea sistemului şi a sondei) şi SOAK (foloseşte

apa ultrapură pentru reducerea potenţialului de precipitare a

sărurilor conţinute de Sheath fluid).

ANALIZA ŞI PRELUCRAREA REZULTATELOR.

EXPORTUL DATELOR

Platforma Luminex 200 afişează în timp real informaţii legate de

achiziţia datelor; astfel pot fi urmărite histogramele care apar în

cele 3 ferestre (DD, CL1/CL2, RPT) – (Figura 20).

Fig. 20 Histogramele afi�ate în ferestrele DD, CL1/CL2, RPT

Pentru analiza şi prelucrarea rezultatelor se va urmări aspectul

fiecărei curbe corespunzătoare analiţilor luaţi în studiu şi se vor

elimina valorile aberante (valorile eliminate din curba standard

vor fi reprezentate prin elipse goale) – (Figura 21).

Fig. 21 Exemplu de curbă standard pentru IL-4R

Softul permite calcularea a 4 variante de curbă (se va selecta

varianta optimă conform recomandărilor kitului de multiplexare) -

(Figura 22).

Fig. 22 Exemplu de selectare a variantei de curbă

-După optimizarea curbelor standard, rezultatele pot fi salvate

într-un fişier de format .xml. Se poate genera un raport al analizei

sau fişierul poate fi importat în documente de tip Microsoft Excel

(Figura 23).

Figura 23 – Exemplu de raport generat în urma citirii plăcuţei

8.TEHNOLOGIA XMAP ARRAY - UTILITATE ŞI

AVANTAJE Viteză

Flux Crescut

1 set de microsfere = 1 analit/probă biologică.

100 seturi de microsfere = 100 de analiţi/probă

biologică.

De exemplu pentru 100-plex:

30 de probe x 100 de analiţi/probă biologică = 3000

analiţi

Ace�ti 3000 de analiti sunt măsuraţi simultan pe o

plăcuţă cu 96 de godeuri.

Versatilitate

Analiza variată de biomarkeri (acizi nucleici,

proteine, enzime etc.) datorită posibilităţii cuplării

microsferelor cu diverse molecule (anticorpi /

antigene, peptide / oligonucleotide, alte proteine şi

molecule mici).

Reproductibilitate

Numărul mare de microsfere din acelaşi lot permite

standardizarea testului în comparaţie cu testele pe

suport solid (ELISA).

Acurateţe

Analiza în timp real.

Acurateţea procesării datelor.

Flexibilitate

Platforma Luminex 200 permite updatarea soft-ului

pentru folosirea kiturilor de multiplexare cu

microsfere magnetice (exemplu – software-ul

xPONENT 3.1).

III. BIBLIOGRAFIE

1. B. Nolen, A. Lomakin, W. L. Bigbee, J. Siegfried and A. Lokshin.

Serum biomarkers for early detection of lung cancer. Journal of Clinical

Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting

Edition).Vol 28, No 15_suppl (May 20 Supplement), 2010: e21057.

2. Faina Linkov1, Robert L. Ferris, Zoya Yurkovetsky, Adele

Marrangoni, Lyudmila Velikokhatnaya, William Gooding, Brian Nolan,

Matthew Winans, Eric R. Siegel, Anna Lokshin, and Brendan C. Stack

Jr. Multiplex analysis of cytokines as biomarkers that differentiate

benign and malignant thyroid diseases. Proteomics Clin Appl. 2008

October 10; 2(12): 1575–1585.

3. Panel Jindra Vrzalova, Marketa Prazakova, Zdenek Novotny, Ondrej

Topolcan, Miroslava Casova, Lubos Holubec Jr. Test of Ovarian

Cancer Multiplex xMAP Technology. ANTICANCER RESEARCH 29:

573-576 (2009).

4. Xu BJ, An QA, Srinivasa Gowda S, Yan W, Pierce LA, Abel TW, Rush SZ, Cooper MK, Ye F, Shyr Y, Weaver KD, Thompson RC. Identification of blood protein biomarkers that aid in the clinical assessment of patients with malignant glioma. Int J Oncol. 2012. Epub 2012 Feb 3.

5. Melinceanu L, Lerescu L, Tucureanu C, Caras I, Pitica

R, Sarafoleanu C, Salageanu A. Serum perioperative profile

of cytokines in patients with squamous cell carcinoma of the larynx. J

Otolaryngol Head Neck Surg. 2011 Apr;40(2):143-50.

6. Bortolin MT, Tedeschi R, Bidoli E, Zanussi S, Pratesi C, Vaccher

E, Tirelli U, De Paoli P. Multiplex analysis of blood cytokines as a

prognostic tool in HIV related non-Hodgkin lymphoma patients: a

potential role of interleukin-Cytokine 2012 Oct;60(1).

7. Ayalew Tefferi, Rakhee Vaidya, Domenica Caramazza, Christy

Finke, Terra Lasho, and Animesh Pardanani. Circulating Interleukin

(IL)-8, IL-2R, IL-12, and IL-15 Levels Are Independently Prognostic in

Primary Myelofibrosis: A Comprehensive Cytokine Profiling Study.

Journal of Clinical Oncology, vol.29, No.10, 2011.

8. Zia A. Dehqanzada, Catherine E. Storrer, Matthew T. Hueman,

Rebecca J. foley, Katie A. Harris1, Yusuf H. Jama, Craig D. Shriver,

Sathibalan Ponniah, George E. Peoples. Assessing serum cytokine

profiles in breast cancer patients receiving a HER2/neu vaccine using

Luminex® technology. Oncology Reports, 17: 687-694, 2007. 687

9. Clint Allen, Sonia Duffy, Theodoros Teknos, Mozaffarul Islam,

Zhong Chen, Paul S. Albert, Gregory Wolf, Carter Van Waes. Nuclear

Factor Kappa-B-Related Serum Factors as Longitudinal Biomarkers of

Response and Survival in Advanced Oropharyngeal Carcinoma. Clin

Cancer Res 2007;13(11) June 1, 2007.

10. Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R, Wu Q, Bartkova J, Lee M, et

al. Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes glioma

stem-like cell viability and tumor growth. The Journal of experimental

medicine. 2012;209(3):507-20. Epub 2012/03/07.

11. Wehland M, Bauer J, Magnusson NE, Infanger M, Grimm D.

Biomarkers for anti-angiogenic therapy in cancer. International journal

of molecular sciences. 2013;14(5):9338-64. Epub 2013/05/01.

12. Sharma T, Dhingra R, Singh S, Sharma S, Tomar P, Malhotra M, et

al. Aflibercept: a novel VEGF targeted agent to explore the future

perspectives of anti-angiogenic therapy for the treatment of multiple

tumors. Mini reviews in medicinal chemistry. 2013;13(4):530-40. Epub

2013/01/16.

13. Yun SM, Jung KH, Lee H, Son MK, Seo JH, Yan HH, et al.

Synergistic anticancer activity of HS-173, a novel PI3K inhibitor in

combination with Sorafenib against pancreatic cancer cells. Cancer

letters. 2013;331(2):250-61. Epub 2013/01/24.

14. Tanase CP, Dima S, Mihai M, Raducan E, Nicolescu MI, Albulescu

L, et al. Caveolin-1 overexpression correlates with tumour progression

markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of molecular

histology. 2009;40(1):23-9. Epub 2009/01/23.

15. Tanase CP, Neagu M, Albulescu R, Hinescu ME. Advances in

pancreatic cancer detection. Advances in clinical chemistry.

2010;51:145-80. Epub 2010/09/23.