Teza de Doctorat - Varroa

7/29/2019 Teza de Doctorat - Varroa

1/25

Cercetri privind dezvoltarea i validarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp.prezent n stupinele din zona Transilvaniei

229

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICINVETERINAR CLUJ-NAPOCA

COALA DOCTORALFACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

Ing. chimist ANTONIA CRISTINA MARIA M. ODAGIU

TEZ DE DOCTORAT

CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I VALIDAREAUNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUIVARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA

TRANSILVANIEI(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CONDUCTORTIINIFIC

Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC

CLUJ NAPOCA

2010


2/25


230

Teza de doctorat intitulat CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA I

VALIDAREA UNEI METODE DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUI VARROA

SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA TRANSILVANIEI i propune

dezvoltarea unei metode de identificare a genotipului cruia i aparine parazitul Varroa sp.

prezent n stupinele din Transilvania, precum i caracterizarea parametrilor de performan a

metodei n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a Animalelor al Universitii de

tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj Napoca, n vederea validrii procedurii.

INTODUCERE

Datorit importanei mierii ct i a produselor apicole secundare (polen, lptior de

matc, propolis, cear) tributar factorilor nutritivi pe care i conin precum i aciunii

terapeutice a acestora, prevenirea i combaterea bolilor albinelor constituie una dintre

preocuprile majore ale apicultorilor pe plan mondial (Bura M., 1996; Dezmirean D. i

colab., 2008; Mrghita L. Al., 2002).

Un alt factor ce contribuie la importana pstrrii strii de sntate a albinelor, l

constituie calitatea lor de vector n procesul de polenizare al plantelor, dar i de

perspectivele deschise de progresul biotehnologiilor care le transform n virtuali ageni de

vehiculare al transgenelor provenite de la plantele modificate genetic (Dezmirean D. icolab., 2007; Rakosy-Tican Elena, 2005).

n acest context, o tot mai mare importan se acord factorilor genetici care sunt

implicai n rezistena natural a unor specii sau populaii de albine la ageni patogeni

specifici, sau parazii, dari a paraziilor la aciunea produselor destinate combaterii lor.


3/25


231

CAPITOLUL I

ASPECTE PRIVITOARE LA COMPORTAMENTUL IGIENIC

ALAPIS MELLIFERA L.

Bolile albinelor pot fi de natur necontagioas sau contagioas. Cele de natur

necontagioas au cauze fiziologice, pe cnd cele contagioase sunt provocate de ageni

bacterieni, virali, micotici, sau parazii (Mrghita L. Al., 2002).

Datorit efectelor sale extrem de nocive i rspndirii largi Varroa destructor

(jacobsoni) constituie o problem major pentru apicultorii din ntreaga lume. Varroa sp.este un parazit ce face parte din regnul Animalia, ncrengtura Arthropoda, Clasa

Arachnida, Ordinul Acari, Familia Parasitidae, Genul Varroa, Specia destructor(Drees

B.M. i colab., 1999).

Combaterea eficient a parazitului constituie una dintre cele mai mari provocri ale

apicultorilor din ntreaga lume (Tew J. E., 2000; Moosbeckhofer R. i colab., 2003; Donz

G., 1998; Al-Abbadi A. i colab., 2003). Una dintre cele mai mari probleme ale apicultorilor

de azi const n rezistena parazitului la tratamentul cu Apistan (pesticid piretroid avnd

component activ tau fluvalinatul), una dintre substanele cu cea mai mare utilizare n

combaterea Varroa destructor, dari la cele cu Amitraz i Cumafos (Pettis J. S., 2003).

Rezistena parazitului Varroa sp. la principalii produi de combatere, bazai pe

piretroizi s-ar putea explica prin mecanisme identificate la momentul de fa. Aceasta, ns,

n contextul mai larg al dezvoltrii rezistenei la pesticide att a plantelor ct i al altor

organisme (echinoderme, insecte, arahnide etc.), care se pare c sunt guvernate de procesesimilare (Doyle K. i colab., 1991; Sibbesen O. i colab., 1995; Besten P.J., 1998; Valles

S.M. i colab., 2003; Tan J. i colab., 2005; Eleftherianos I. i colab., 2008, .a.).

Unul dintre ele este reprezentat de prezena anumitor esteraze (monooxigenazele),

care stau la baza unui mecanism metabolic de rezisten specific, mediat de acestea -

detoxifierea. n prezena monooxigenazelor piretroizii sintetici sunt oxidai, ceea ce conduce

la anihilarea activitii lor toxice asupra paraziilor (Sammataro Diana i colab., 2005).

Aceste monooxigenaze fac parte dintr-un grup mai extins (Lewis D. F.V., 2001) localizat n

reticulul endoplansmatic i este desemnat ca Citocrom P 450 (CYP sau P450). Acestea
http://www.jbc.org/search?author1=Ole+Sibbesen&sortspec=date&submit=Submithttp://www.jbc.org/search?author1=Ole+Sibbesen&sortspec=date&submit=Submit


4/25


232

aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine). Denumirea

atribuit acestui grup enzimatic se datoreaz localizrii celulare a acestora (cito), dar i

caracteristicilor spectrofotometrice (crom) cnd fierul din Hem este redus, P450 absoarbe

radiaiile luminoase cu lungimea de und carcteristic de 450 nm.

Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic

monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un substrat organic

RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt atom de oxigen):

RH + O2 + 2H+ + 2e ROH + H2O

La echinoderme a fost evideniat dependena de P450 a metabolismului compuilorpiretroidici (Besten P. J. i colab., 1990; Besten P. J., 1998).

n cazul insectelor, a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul enzimatic

microzomal P450, care utilizeaz sistemul NADPH/NADH pentru a cliva reductor

oxigenul atmosferic, conducnd la o funciune organici o molecul de ap (Schuler Mary

A., 1996; Dong K., 2007; Soderlund D. M., 2008). Descrierea acestor mecanisme a facilitat

explicarea fenomenului de rezisten a parazitului Varroa sp. la piretroizi. Pe baza lor

tulpinile rezistente la produii de combatere i-au dezvoltat capacitatea de a detoxifica

insecticidele prin oxidare.

Cellalt mecanism al rezistenei poate fi explicat prin mutaiile punctiforme produse

la nivelul genei, care controleaz canalele sodiului. Canalele sodiului caracterizate de un

potenial electric sunt constituite integral din proteine transmembranare i sunt responsabile

de faza de cretere rapid a potenialului de aciune al celulei care face parte din categoria

celor cu excitabilitate ridicat. Insecticidele piretroide au efect de reducere a cineticii

activrii i dezactivrii canalului sodiului. Consecina direct este deschiderea prelungit a

canalelor individuale, ceea ce conduce la paralizia i n final moartea insectelor ce vin n

contact cu aceti compui (Wang R. i colab., 2002; Wang R. i colab., 2003; Wang, R. i

colab., 2003). Multe dintre insectele ce prezint rezisten la piretroizi au suferit mutaii

punctiforme la nivelul genei canalului sodiului. Teste efectuate asupra oocitelor deXenopus

ce au exprimate canalele sodiului, au demonstrat c aceste mutaii reduc sensibilitatea

acestor canale la piretroizi, ceea ce confirm faptul c acesta reprezint mecanismul majorde rezisten la piretroizi la diverse specii de insecte (Soderlund D.M. i colab., 2003).


5/25


233

Wang Ri colab. (2003) au reuit s evidenieze gena pentru canalul sodiului de la arahnide

gena VmNai la Varroa destructorO. Izolarea integral a genei VmNa a reprezentat un

moment important pentru caracterizarea complet a modului de funcionare a acestui

mecanism de rezisten la produse pe baz de piretroizi.

Cel mai cunoscut mecanism de rezisten a albinelor la boli i duntori, pe baza

cruia se poate realiza selecia, este datorat comportamentului igienic al acestora, descris

iniial de Park O.W. (1937), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997. Acest

comportament complex const n dou activiti distincte desfurate n dou etape

successive (Lapidge K.L. i colab., 2002). Primul implic descpcirea celulelor n care seafl larvele infestate, iar cel de al doilea const n eliminarea efectiv a corpului larvei din

celulele descpcite. Pornind de la constatrile lui Park (1937), Rothenbuhler (1964a,b)

presupune existena a dou mecanisme diferite care stau la baza controlului acestor

activiti. Conform acestei aseriuni, fiecare dintre aceste dou activiti este controlat de o

gen cu dou alele, iar comportamentul este transmis la descendeni conform mecanismului

mendeleean. Spre exemplu, dac mperecherea se produce ntre un trntor a crui

comportament igienic este controlat de ambele alele recesive i o matc ce posed doar

cte o alel recesiv pentru fiecare tip de comportament, vor rezulta doardoi descendeni

(un trntori o albin) ce posedambele alele recesive (fig. 3).

Fig. 3.Transmiterea comportamentului igienic laApis mellifera L.(http://members.aol.com/queenb95/genetics.html)


6/25


234

CAPITOLUL II

BAZELE TEORETICE ALE METODOLOGIEI DE GENOTIPIOZARE A

PARAZITULUI VARROA SP.

Dup prelevarea i conservarea probelor n condiiile impuse de protocol, procedeul

implic: extracia ADN, amplificarea, restricia, migrarea n gel de agarozi secvenierea.

Izolarea ADN trebuie s fie caracterizat de o eficien ct mai mare, precum i de

obinerea unei cantiti suficiente, de puritate corespunztoare, care mai apoi s poat fi

utilizat n scopul amplificrii, migrrii i eventual secvenierii atunci cd scopul final alanalizei o impune (Vlaic A., 1997; Vlaic A. i colab., 2005). Cea mai utilizat metod de

cuantificare a probelor de ADN se bazeaz pe spectrofotometria de absorbie molecular n

UV. Acizii dezoxiribonucleici dublu catenari prezint un maximum de absorbie la = 260

nm. Majoritatea probelor, ns, conin contaminani, respectiv proteine i ADN i/sau ARN

unicatenar, cu un maximum de absorbie la = 280 nm. O alt categorie de contaminani

specifici acestui tip de probe este reprezentat de fenoli i tiocianai, cu un maximum de

absorbie la = 230 nm. Reacia n Lan a Polimerazei - PCR se bazeaz pe caracteristicile

replicrii ADN-ului. Este o tehnic rapid, care permite obinerea n cantiti suficiente,

pentru scopuri analitice, a unor fragmente specifice de ADN aflate iniial n cantiti foarte

reduse. n studiul de fa s-a recurs la adoptarea tehnicii perfecionate de amplificare,

respectiv Real Time PCR (RT PCR). Principiul metodei se bazeaz pe faptul c fiecare

prob sufer o amplificare PCR n prezena unui fluorocrom prezent n amestecul de reacie,

care produce fluorescen doar atunci cnd produsul specific este recunoscut sau sintetizat.Pragul de fluorescen rezult din analiza curbei de reacie i este determinat n partea

liniar a acesteia. El corespunde fazei n care se nregistreaz cea mai mare eficien a

amplificrii. Tehnica RFLP se bazeaza pe existena, n genomul organismului studiat

(Varroa sp. n cazul de fa), a unor situs-uri de restricie, asupra crora acioneaz specific

anumite enzime, numite enzime de restricie. n urma aciunii acestora, se produce tierea

macromoleculei de ADN i obinerea unor fragmente de diferite lungimi. Distribuia

situsurilor de restricie corespunztoare unei anumite enzime este specific pentru fiecare

specie (Vlaic A. i colab., 2008).


7/25


235

CAPITOLUL III

CONCEPTUL DE VALIDARE DE METODE

Procedura de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete

demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost

elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de

laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat. Principalii parametri care

fac obiectul validrii sunt: selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de

lucru, liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate,

incertitudine. Aceste criterii sunt prevzute i n normele ISO i ale IUPAC i, prin urmare,

i n nota explicativ a Comisiei de specialitate a Uniunii Europene.

CAPITOLUL IV

SCOPUL OBIECTIVELE I IMPORTANA CERCETRII

Scopul tezei de doctorat a vizat dou problematici n strns conexiune, respectiv

identificarea genotipului speciei care paraziteaz Apis mellifera carpatica L. n

Transilvania, precum i propunerea spre validare a metodei de genotipizare pe baz de

ADNprovenit de la parazitul Varroa sp. n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a

Animalelor Domestice a USAMV Cluj Napoca, lund n considerare prezena i

importana comportamentului igienic al albinei melifere n rezistena la aciunea parazitului

Varroa.

Planul experimental al cercetrii a prevzut luarea n studiu a comportamentului

igienic al albinelor localizate randomizat n stupine din cele 10 judee din Transilvania

(Alba, Bistria - Nsud, Braov, Cluj, Covasna, Harghita, Hunedoara, Mure, Slaj i

Sibiu), precum i dezvoltarea unei metode de genotipizare a parazitului Varroa sp. i

validarea acesteia n condiiile Laboratorului Zonal de Genotipizare a AnimalelorDomestice a USAMV Cluj - Napoca.
http://ro.wikipedia.org/wiki/Albahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Clujhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Covasnahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Harghitahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Hunedoarahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Sibiuhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Sibiuhttp://ro.wikipedia.org/wiki/S%C4%83lajhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Mure%C5%9Fhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Hunedoarahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Harghitahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Covasnahttp://ro.wikipedia.org/wiki/Clujhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bra%C5%9Fovhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Bistri%C5%A3a-N%C4%83s%C4%83udhttp://ro.wikipedia.org/wiki/Alba


8/25


236

Importana cercetriiLa noi n ar, nu au fost efectuate studii moleculare asupra caracteristicilor

parazitului Varroa sp. i de asemenea, nu a fost ntreprins un studiu integrat ce vizeaz

implicarea comportamentul igienic al varietii autohtone de albine n rezistena la boli n

greneral i la Varroa sp. n particular.

Procedeul de validare a unei metode analitice nou elaborate sau existente urmrete

demonstrarea faptului c acea metod corespunde scopului utilizrii pentru care a fost

elaborat sau selectat i c performanele sale caracteristice, stabilite prin studii de

laborator, satisfac cerinele pentru ca metoda s poat fi aplicat (Kennedy S., 1997). n

validarea metodelor analitice principalii parametri care fac obiectul validrii sunt:

selectivitate/specificitate, precizie, exactitate, domeniul de lucru, liniaritate, limit de

detecie, limit de cuantificare, robustee, sensibilitate i incertitudine. Aceste criterii sunt

prevzute i n normele ISO i IUPAC .

Enunate fiind principiile generale care stau la baza procedeelor de validare, trebuie

subliniat faptul c acestea prezint caracteristici specifice pentru fiecare tip de analizi, de

asemenea, sunt specifice i pentru laboratoarele n care sunt aplicate. n consecin,implementarea acestora n laboratoarele de genetic molecular prezint o serie de

particulariti, trebuind s rspund unor exigene specifice (OECD, 2007; Jennings L. i

colab., 2009).

n acest context, prezentul studiu i aduce aportul la caracterizarea metodei analitice

de de izolare, cuantificare i amplificare a ADN din parazitul Varroa destructor O. Din

punct de vedere al performanelor analitice i totodat rezultatele obinute permnit

ncadrarea aacestora n categoria celor care pot parcurge cu succes exigenele procedeelor

de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele de biologie molecular (IUPAC,

ISO: 2005, 17025).

Genotipizarea are un potenial ridicat n depistarea tulpinilor aparinnd

Varroa sp. care au dezvoltat rezisten la tratamentul chimic i a cror existen a fost

demonstrat nc din anii 90 (ben Hamida T., 1997). n urma aplicrii genotipizrii i

confruntrii cu datele din literatur se pot evita cheltuieli inutile cu achiziionarea i


9/25


237

aplicarea tratamentelor cu Amitraz, Apistan, Cumafos .a. care se dovedesc ineficiente

i aplicarea direct a unor soluii diferite de combatere.

CAPITOLUL V

EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LAAPIS MELLIFERA

CARPATICA L. DIN ZONA TRANSILVANIEI

Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de

albine analizate nu au manifestat comportament igienic, procentul mediu de descpcire a

nregistrat valoarea maxim n judeul Cluj, maximumul nregistrat fiind de 78,72%, situat

mult sub limita de 91% de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten

natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic.

Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul

Harghita, 67,54%.

CAPITOLUL VI

REZULTATE PRIVIND DEZVOLTAREA METODEI DE GENOTIPIZARE APARAZITULUI VARROA SP. PREZENT N STUPINELE DIN ZONA

TRANSILVANIEI

Acest demers constituie un proces laborios care implic o succesiune de etape (fig. 30).


10/25


238

Prelevarea probelor

Izolarea ADN

Purificarea ADN

Amplificarea ADN

Restricia produsului de amplificare

cu enzimeleSacI iXhoI

Migrarea n gel de agaroz 2%

i vizualizarea gelului

Secvenierea

Identificarea genotipului

Fig. 30. Etapele procesului de genotipizare a parazitului Varroa sp.

n urma migrrii produsului de amplificare supus restriciei cu enzimele Xho I i

Sac Ia rezultat profilul electroforetic al celor 10 migrri, fiecare corespunztoare unei zone

de colectare a paraziilor (fig. 36).


11/25


239

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

700 pb

400 pb

200 pb

150 pb

XX

S

X

Sn n

SS SS

n n

X X

S S

n

X

S

X

SS

nn n n n

XX X

1- Alba, 2 Bistria Nsud, 3 Braov, 4 - Cluj, 5 - Covasna, 6 - Harghita,

7 - Hunedoara, 8 - Mure, 9 - Slaj, 10 Sibiu, X Xho I, S Sac I, n fragment nedigerat

Fig. 36. Profilul electroforetic al probelor de ADN provenit de la parazitul Varroa sp.

obinut n urma restriciei cu enzimeleSac IiXho I(original)

Secvenierea a fost realizat de ctre compania Mycrosinth n Elveia. Rezultatele

secvenierii au evideniat structura de interes prezent n subunitatea I a genei mitocondriale

citocromoxidazei (CO I) a paraziilor aparinnd genotipului Varroa sp. recoltai din

stupine localizate n Transilvania. A rezultat urmtoarea secven (n format FASTA):

ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTATTATTTCTCAGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGATAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATATTTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTGCGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTAAATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTATTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATGTAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT

Compararea structurii secvenei izolate de noi din ADN provenit de la indivizi

Varroa sp. prezeni n stupinele din Transilvania, cu genotipurile existente n baza de date

NCBI, a crei rezultat a constat n suprapunerea de 100% cu secvenele cu numerele de

acces AF106900.1, AJ84872.1.i AY372063.1 (fig. 40), a condus la constatatrea c

genotipul Varroa existent n Transilvania coincide cu genotipul China 2, ce paraziteazApis

cerana n Asia.


12/25


240

Query 1 atttattttgattttttggacacccagaagtttatattttaattttgcctggttttggta 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1 ATTTATTTTGATTTTTTGGACACCCAGAAGTTTATATTTTAATTTTGCCTGGTTTTGGTA 60

Query 61 ttatttCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 61 TTATTTCTCATGTAATTTGTATACAGAGAGGGAAGAAGCAGCCTTTTGGAAATTTAGGGA 120

Query 121 TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 121 TAATTTACGCTATAATAACTATTGGTATTTTAGGTTTTATTGTATGAGCTCATCATATAT 180

Query 181 TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 181 TTACAGTAGGAATAGATATTGATACTCGAGCATATTTTACTGCAGCTACAATAATTATTG 240

Query 241 CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA 300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 241 CGGTTCCTACTGGTATTAAAATTTTTTCTTGATTAGCAACAATTCATGGTTCTATAGTTA 300

Query 301 AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTAtttttttATTTACTTTAGGGGGTA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 301 AATTAGATGTCCCAATAATTTGATCTTTAGGTTTTATTTTTTTATTTACTTTAGGGGGTA 360

Query 361 TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 361 TTACTGGTGTAATTTTAGCTAATTCTTCTATTGATATTGTTTTACATGATACTTATTATG 420

Query 421 TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT 458

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 421 TAGTAGCACATTTTCACTATGTATTAAGAATAGGGGCT 458

Fig. 40.Secvenele genotipurilor originale China 2 (Anderson i Trueman, 2000;Ting Y. i

colab., 2004; Solignac M. i colab., 2005) obinute pentru Varroa destructori a celor

obinute n stupinele din Transilvania

CAPITOLUL VII

VALIDAREA METODEI DE GENOTIPIZARE A PARAZITULUIVARROA DESTRUCTOR O.

Pe baza testrii parametrilor de reacie implicai n procedeul de izolare a ADN din

parazitul Varroa destructorO., a fost elaborat un flux de operaii care au avut drept rezultat

dezvoltarea unei metode de izolare i cuantificare a ADN.

n urma caracterizrii parametrilor de performan ai metodei (selectivitate/

specificitate, precizie, exactitate, parametrii analizei de regresie liniar, liniaritate, domeniul


13/25


241

de lucru, test de liniaritate, limit de detecie, limit de cuantificare robustee, i

incertitudinea de msurare) a rezultat c procedeul are o capabilitate (proficiency)

corespunztoare i este n conformitate cu scopul pentru care a fost selectat (tabelul 25).

Tabelul 25

Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda spectrofotometric de

absorbie molecular UV-VIS dezvoltat n vederea cuantificrii ADN izolat din parazitul

Varroa destructorO.

Parametrul Rezultat impus Rezultat realizat

1 2 3

Selectivitatea Obinerea spectrului de

absorbie molecular UV-VIS la

= 230 nm, = 260 nm i

respectiv = 280 nm, pentru

diferite cantiti de ADN (ng/l)

izolate de la parazitul Varroa

destructorO.

Tehnic specific

Precizia RSD% < 3,50 Repetabilitate RSD% = 1,98%

Precizia intermediar RSD% = 1,64%

Exactitatea 85% R 105% R = 99,60%

Parametrii analizei de

regresie liniar

Curba de etalonare are o

reprezentare liniar de forma

y = a + bx

y = 0,0675 + 0,0009x

Absorbana(Absorbance)

Cantitatea de ADN extras din parazitul Varroa destructorO., ng/l

Quantity of DNA extracted from Varroa destructorO. mite, ng/l


14/25


242

Tabelul 25 continuare

1 2 3

Liniaritate Dispersie redus a valorilor

individuale n jurul dreptei de

regresie

400

450

500

550

600

650

700

750

-0,58 -0,08 0,42 0,92 1,42

Domeniu de lucru Testul de omogenitate a

dispersiilor

Valoarea de ncercare PG < 5,35

PG = 1,484

Testul de liniaritate Valoarea abaterii standard reziduale

(0,8139) indic o dispersie redus a

valorilor individuale n jurul liniei de

regresie calculate.

Limita de detecie i

limita de cuantificare

Limita de cuantificare trebuie s

fie superioar cu cel puin un

ordin de mrime Limitei de

detecie

xLC = 0,002500 ng/l

xLD = 0,000859 ng/l

Robusteea Influena minim a variaiilor

parametrilor metodei

-Stabilitatea n timp a soluiei de

ADN izolat din parazitul Varroa

destructorO.

Metoda are un caracter robust, din

punct de vedere a stabilitii n timp a

soluiei de ADN (rproaapt, r48hi r96h).

- izolat ADN proaspt -



r = 0,9833


Absorbana (Absorbance)

CantitateadeADNextrasdin

parazitulVarroadestructorO.,ng/l

QuantityofDNAextractedfrom

VarroadestructorO.mite,ng/l


15/25


243


1 2 3

- izolat ADN la 48 ore dup preparare

- izolat ADN la 96 ore dup preparare

-Influena temperaturii Metoda are un caracter robust dac se

lucreaz la temperatura ambiental

normal 15 - 200C i se evit variaiile de

temperatur (tabelul 21).

Incertitudinea de

msurare

Stabilirea bugetului de

incertitudini.

Cea mai mare contribuie le bugetul de

incertitudini este adus de volumul total de

soluie supus cuantificri (soluie tampon

+ ADN izolat).

0,0086592

3,21066

3,2363877

0,407738

0,747674,391795

0,1318

0,025

0 1 2 3 4 5

u_absorban (ADN)

u_volum (Tips)

u_volum (Total)

u_volum (Ap pur)

u_volum (Nonidet)

u_volum (tampon)

u_volum (Eppendorf)

u_puritate (Tris)


r = 0,9827




r = 0,9759




16/25


244

Tabelul 32

Gradul de ndeplinire a criteriilor de validare selectate pentru metoda de amplificare a

fragmentului de ADN mitocondrial localizat la nivelul genei CO-I a parazitului

Varroa destructorO.

Parametrul Rezultat impus Rezultat realizat

1 2 3

Limita de detecie Amplificarea devine vizibil

dup un numr redus de cicluri

de amplificare (< 21)

Ct =16,83

Reproductibilitatea Nu exist diferene ntre

rezultatele obinute de analiti

diferii care realizeaz

amplificarea n acelai

Termocycler

Precizia Valoare ct mai redus a

deviaiei standard pentru

amplificarea aceleiai probe n

20 de repetiii

s = 0,638

Sensibilitatea Cantitate ct mai redus de

ADN ce poate fi amplificat

(< 1 g)

500 ng

700 pb

400 pb

150 pb

500 pb

400 pb

150 pb


17/25


245

Liniaritatea Dispersie redus a valorilor

individuale n jurul dreptei de

regresie

Robusteea Influena minim a variaiilor

parametrilor metodei

-Stabilitatea n timp a soluiei de

ADN izolat din parazitul Varroa

destructorO. (amplificare ADN:

izolat proaspt - a, dup 48h - b

i dup 96h - c)

-Influena temperaturii de

ataare a primerilor

-n condiile prezervrii probelor n

condiii corespunztoare, au fost obinute

geluri identice.

a

b

c

Metoda are un caracter robust dac se

lucreaz la temperatura de ataare a

primerilor de 500C.

MediavalorilorCT

TheaveraeofC

Tvalues

700 pb

500 pb

700 pb

500 pb

700 pb

500 pb

150 pb

Log din cantitatea de ADNLog of DNA quantity


18/25


246


1 2 3

Incertitudinea de

msurare

Stabilirea bugetului de

incertitudini.

Cea mai mare contribuie le bugetul de

incertitudini este adus de volumul total de

soluie supus amplificrii (soluie tampon

+ ADN izolat).

0,0086592

1,1859058

0,0250,0375

0,015

0,1001278

0,3184415

0,2700263

0,2000003 2,1606608

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Valo

T

ipulincertitudinii(Typeofincertitude)

Aceste constatri permit ncadrarea metodei de izolare i cuantificare i amplificare a

ADN din parazitul Varroa destructor O. n categoria celor care pot parcurge cu succes

exigenele procedeelor de validare n condiiile asigurrii calitii n laboratoarele debiologie molecular (IUPAC, ISO: 2005, 17025).

CONCLUZII

Datorit faptului c finalitatea tezei de doctorat a vizat o abordare complex a

problematicii dezvoltrii i validrii unei metode de genotipizare a parazitului Varroa

sp. n stupinele din zona Transilvaniei, n conexiune cu particularitile albinei

melifere (Apis mellifera L.) din punctul de vederea al aspectelor etologice i al

mecanismelor de rezisten la boli i parazii, concluziile formulate debuteaz cu

aceste aspecte.

Privitor la studiul comportamentului igienic al Apis mellifera L., n stupinele din

Transilvania, rezultatele studiului concretizate n nregistrarea valorilor medii ale

procentului de descpcire cuprinse n intervalul 67 78% (cu valoarea medieminim de 67,54% nregistrat n judeul Harghita i maxim de 78,72% n judeul


19/25


247

Cluj) au demonstrat c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine

analizate nu au manifestat comportament igienic, limita de la care familiile de albine

se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a

comportamentului igienic fiind de 91%.

Genotipul identificat n urma studiului nostru n stupinele din Transilvania,

corespunde numrului de acces n Banca de Gene AF 106900 este genotipul China 2

(Anderson i colab., 2000), unul dintre cele dou genotipuri Varroa din cadrul

varietii extreme de largi prezente n Asia capabile s paraziteze iApis mellifera L.

Acesta se suprapune 100% cu genotipurile evideniate de Ting Z. si col. (2004) nChina, avnd numarul de acces n baza de date NCBI - AY372063.1 i n Europa, de

Solignac M. i colab. (2005) avnd cu numrul de acces n baza de date NCBI

AJ84872.1

Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de amplificare a ADN din

parazitul Varroa destructor O. enumerai mai sus i analiza rezultatelor obinute,

confirm faptul c aceasta corespunde scopului pentru care a fost selectat i n

consecin poate fi validat.

RECOMANDRI

Pentru combaterea eficient a parazitului Varroa destructorO. este necesar aplicarea

unui management specific rezistenei la duntori, inndu-se cont de faptul c orice

organism, n condiii de constrngere, caut s gseasc soluii de supravieuire. Acesttip de management trebuie s includ tehnici legate de: bune practici n managementul

stupului, meninerea unui grad redus de infestare, dar i aplicarea produselor de

combatere n cantitile omologate i de calitate ecologic.

Identificarea rezistenei parazitului Varroa destructor O. la Apistan i cuantificarea

acesteia, constituie premisa pentru elaborarea unor strategii eficiente pentru combaterea

parazitului. Cunoscndu-se genotipul Varroa sp., precum i faptul c rezistena se

datoreaz apariiei unei mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului, prin


20/25


248

aplicarea secvenierii se poate dezvolta un sistem de diagnoz eficient, bazat pe

diferenele genetice ntre formele rezistene i cele sensibile.

Este necesar implementarea, la nivel naional, a unui sistem de monitorizare a formrii

i dezvoltrii rezistenei parazitului Varroa destructor O. la tratamentul cu ageni de

combatere piretroidici, dari a celor pe baz de compui organofosforici sau antibiotice,

dei, alturi de o metodologie competent pentru diagnoza acesteia, utilizarea lor este

din ce n ce mai rar datorit efectelor de remanen.

Cuantificarea parametrilor de performan ai metodei de genotipizare a parazitului

Varroa destructor O. (prin aplicarea direct la etapele de de izolare, cuantificare iamplificare a ADN) i analiza rezultatelor obinute, n condiiile Laboratorului Zonal de

enotipizare a Animalelor Domestice, confirm faptul c aceasta poate fi propus spre

validare, contribuind de aceast manier la sporirea competenei laboratorului.


21/25


249

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Andersen C.L., J.L. Jensen and T. F. rntoft, 2004, Normalization of Real-TimeQuantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance

Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied toBladder and Colon Cancer Data Sets, Cancer research, No. 64, 5245 5250

2. denBesten P.J. 1998, Cytochrome P450 monooxygenase system in echinoderms,Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and

Endocrinology, Vol. 121, No. 1 - 3, 139 146

3. Brown, T.A., 2002, Genomes, 2nd Edition, BIOS Scientific Publishers Ltd., 101, 121,122

4. Bruneau E., Jacobs F., and Trouiller J., 1997, Rsultats de la campagne dedtectionde la rsistance de Varroa aux pyrthrinodes en Belgique - 1997. Abeilles et

Compagnie, No. 60, 5 6

5. Bura M., Creterea intensiv a albinelor, 1996, Editura Helicon, Timioara6. Bura M., Silvia Ptruic, V.A. Bura, 2005, Tehnologie Apicol, Ed. Solnes,

Timioara

7.Burkardt H. J., Standardization and quality control of PCR analyses, Clin. Chem.Lab. Med, 2000, Vol. 38, No. 2, 87 91

8. Cuia Eliza, 2006 - 2008, Determinarea rezistenei naturale la boli a populaiilorde albine (A. M. Carpatica) din Romania pe baza unor teste specifice i

realizarea unei metodologii optime de ameliorare pentru acest character, Proiect

CEEX, Modulul II, EP

9. Colton T., 1974, Statistics in Medicine, Little Brown Publishers, 372 pag.10. Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic

animal, Editura Todesco, Cluj - Napoca
http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%234926%231998%23998789998%2331471%23FLA%23&_cdi=4926&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b559d837238ba1051e7c30103f75eba7http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%234926%231998%23998789998%2331471%23FLA%23&_cdi=4926&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b559d837238ba1051e7c30103f75eba7http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413http://www.sciencedirect.com/science/journal/07428413


22/25


250

11. Defilando Baker M. D., 1988, Variability and biotypes of Varroa jacobsoniOudemans, American Bee Journal, Vol. 128, No. 8, 567 568

12. Dezmirean S. Daniel, L. Al. Mrghita, Graia I. Dezmirean, G. Dini, O.Bobi, L.Laslo, A. Moise, Antonia Odagiu, A. Fiiu, I. Paca, C. Bojan, Simona Brsan, O.

Maghear, C. Coroian, M. Man; 2007, Reccomandations regarding prophylaxis of

honey contamination during primary processing, Apicultura de la tiin la

agribusiness i apiterapie, 82-84

13. Dezmirean D., L. Al. Mrghita, Oltica Giorgiana Stanciu, Otilia Bobi, Laura Laslo,Adela Moise, O.Maghear, Cristina Bojan, 2008, Mineral composition of honeydewhoney produced in Transylvania determined by Atomic Absorbtion

Spectrometry, Bulletin USAMV-CN, Vol. 65, No.1 - 2, 233-237

14. Gonccalves M.C., M. M. Klerks, M. Verbeek, J. Vega, J. F. van den Heuvel, 2002,The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection

of Sugarcane Yellow Leaf Virus, European Journal of Plant Pathology No. 108,

401407

15. de Graaf D.C., W. Ritter, F. J. Jacobs, Marleen Brunian, H. Inberechts, K. Mintiens,Y. Van der Stede, B. Verheyden, A.K. Fauske, P. Boujon, Gabriela Chioveanu, D.

Dezmirean, G. Formato, F. Mutinelli, H.-J. Roest, D. Titera, S.F. Pernal, Katia

Knapen, 2009, Lessons from the first international proficiency test for the

detection of spores from the honey bee pathogen Paenibacillus larvae,

Accreditation Quality Assurance, No. 14, 273-276

16. Martin S. J., 2004, Acaricide (pyrethroid) resistance in Varroa destructor, BeeWorld, No. 85, 67 - 69

17. Mrghita L. Al., 2003, Albinele i produsele lor, Editura Ceres, Bucureti18. Mrghita L. Al., D. Dezmirean - Coordonatori, 2007, Apicultura de la tiin la

agribusiness i apiterapie, Editura AcademicPres, Cluj - Napoca

19. Milani N., G. Della Vedova, 2002, Decline in the proportion of mites resistant tofluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids,

Apidologie, No. 33, 417 - 422


23/25


251

20. Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, I. Cornoiu, Laura Laslo,2007, Research into the hygienic behaviour of honeybees in Transylvania,

Proceedings of the 42nd Croatian&2nd International Symposium on Agriculture, 13-16

February, 302 306

21. Odagiu Antonia, A. Vlaic, L. Al. Mrghita, D. Dezmirean, 2007, The hygienicbehavior testing honeybee colonies from Transylvanian area, n Apicultura

de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean -

Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 17 - 19

22. Odagiu Antonia., A.Vlaic, L. Al. Mrghita, I. Oroian, D. Dezmirean, Dana Pusta,2008, The Validation of the DNA Extraction Method from Apis mellifera L.,

Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Animal

Science and Biotechnologies, Vol. 65, No.1 - 2, 387 390

23. Odagiu Antonia, I. Oroian, A. Vlaic, Al. Mrghita, P. Mazzone, E. Caprio, D.Dezmirean, 2009, Assessing Linearity of the Parasite Varroa destructor DNA

Amplification, ProEnvironment/ProMediu, Vol. 2, No. 4, 226 229 (319 322)

24. PattiElzen and D. Westervelt, 2004, A scientific note on reversion of fluvalinateresistance to a degree of susceptibility in Varroa destructor, Apidologie, No. 35,

519 520

25. Peirson S. N., J. N. Butler, and R. G. Foster, 2003, Experimental validation ofnovel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis,

NucleicAcid Res., Vol. 31, No. 14, 118 125

26. Peters I. R., C. R. Helps, E. J. Hall, and M. J. Day, 2004, Real-time RT-PCR:considerations for efficient and sensitive assay design, J. Immunol. Methods, Vol.

286, Nos. 1- 2, 203217

27. Ponchel F., C. Toomes, K. Bransfield, F. T. Leong, Susan Douglas, Sarah Field,Sandra Bell, Valerie Combaret, A. Puisieux, A.J. Mighell, P. A. Robinson, C. F.

Inglehearn, J. D. Isaacs and A. F. Markham, 2003, Real-time PCR based on SYBR-

Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative

quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro genedeletions, BMC Biotechnology, Vol. 3, No. 18, 1 13


24/25


252

28. Rakosy - Tican Elena, 2005, Inginerie genetica vegetala: note de curs, Casa Crii detiin, Cluj-Napoca

29. Rakosy Tican Elena, L. Al. Mrghita, 2007, The bees as vehicles for transgenetransfer from genetically moddified plants to other organisms theoretical

issues, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al.,

D. Dezmirean - Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 184 188

30. Rieu I. and S. J. Powers, 2009, Real - Time Quantitative RT-PCR: Design,Calculations, and Statistics, Plant Cell, No. 21, 1031 1033

31. Soderlund D. M., 2008, Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels,Pest Management Science, Vol. 64, No. 6, 610 - 616

32. Solignac M., D. Vautrin, E. Baudry, F. Mouguel, A. Loiseau and J-M Cornuet, 2004,A Microsatelitte-Based Linkage Map of the Honeybee, Apis mellifera L.,

Genetics, No. 167, 253 - 262

33. Spivak M., and G. S. Reuter, 2001, Varroa destructor infestation in untreatedhoney bee (Hymenoptera: Apidae) colonies selected for hygienic behavior, Journal

of Economic Entomology, Vol. 94, No. 2, 326 331

34. Tnase I. Gh., G. L. Radu, Al. Pan, Mihaela Buleandr, 2007, Validarea metodeloranalitice. Principii teoretice i studii de caz, Editura PRINTECH, Bucureti

35. Vlaic A., 1997, Inginerie genetic, realizri, sperane, neliniti, Editura Promedia Plus

36. Vlaic A., T. Oroian, Simona Pacalu, 2001, Genotypization of bulls used forartificial insemination at k-casein and-lactoglobulin locus, Bulletin USAMV-

CN, Vol. 55 56, 112 117

37. Vlaic A., T. Oroian, 2004, Elemente de genetic pentru zootehniti, EdituraAcademicPres, Cluj Napoca

38. Vlaic A., Viorica Coier, Antonia Odagiu, T. Oroian, V. Blteanu, 2005, Analysis ofgenetic diversity in five cattle breeds from Romania, Bulletin USAMV-CN, Seria

ZB, Vol. 61, 332


25/25


39. Vlaic A., V. A. Blteanu, F. D. Pop, Anda Raluca Rusu, 2008, Molecular methodsused for detection of cattle milk in buffalo, ewe and dairy products, Lucrri

tiinifice, seria Zootehnie, Iai, Vol. 51, 1016 - 1021

40. Ting Z., L. Anderson, Z. Y. Huang, S. Huang, J. Yao, T. Ken, Q. Zhang, 2004,Identification ofVarroa mites (Acari: Varroidae) infestingApis cerana andApis

mellifera in China, Apidologie, No. 35, 645 - 654

41. ***, 1993, ISO 3534 - 1/VIM, International Vocabulary of Basic and GeneralTerms in Metrology, International Standards Organization, Geneva, Switzerland,

IInd

Edition42. ***, 1995, SR 13 434, ISO/GUM, Guide to the expression of uncertainty in

measurement, International Standards Organization, Geneva, Switzerland

43. ***, 2001, IUPAC Recommendations, Selectivity in analytical chemistry, PureApplied Chemistry, Vol. 73, No. 8, 1381 - 1386

44. ***, 2003, Validation of analytical procedures: Methodology, InternationalConference on Harmonization Federal Register, Vol. 60, 27463

45. ***, 2003, Ghidul ILAC-G17 privind incertitudinea de msurare, SR ENV13005, International Standards Organization, Geneva, Switzerland

46. ***, 2005, Standardul SR EN ISO/CEI 17025 : 2005, International StandardsOrganization, Geneva, Switzerland

Teza de Doctorat - Varroa

Documents

Transcript of Teza de Doctorat - Varroa