1. Introducere1.1. MioglobinaMioglobina este localizat in celulele musculare i are ca funcie preluarea oxigenului din snge i stocarea acestuia pan la momentul la care este consumat n aceste celule n vederea producerii de energie.In mioglobin, hemul este nconjurat de un lan polipeptidic, care se mpacheteaz n spaiu pentru nchide n interiorul su fierul, limitnd accesul potenialilor liganzi dinspre exterior. Mai mult, sistemul imidazolic aparinnd catenei laterale a uneia dintre histidinele din lanul polipeptidic se coordineaz la fier, care ajunge astfel s fie pentacoordinat, cu o singur poziie de coordinare liber; aceast poziie liber este meninut special pentru legarea oxigenului molecular.Mioglobina este o hemoproteina, structural i funcional foarte similar cu hemoglobina, o protein care const dintr-un lan polipeptidic relativ mic, de 153 reziduuri aminoacizi care conine un hem cu un atom de fier.Hemuleste pigmentul propriu-zis a hemoglobinei igruparea prostetica acesteia, n timp ce globina, alctuit n special dinaminoaciziilizin ihistidin, constituie partea proteic a macromoleculei. Hemul respirator se formeaz doar n jurul fierului bivalent (ion feros - Fe2+), ionul feric (Fe3+) fiind incapabil de a fixa oxigenul gazos.Mioglobina i hemoglobina au trsturi similare, un examplu: ambele existe n formele: deoxi-, n care fierul este complet redus la forma Fe+2, oxi-, format prin reacia oxigenului (HbO2 , MbO2) i met- n care fierul este oxidat la Fe+3 i nu reacioneaz cu oxigenul. Cnd oxigenul reacioneaz cu forma redusa (deoxi-) este favorizat i oxidarea Fe+2 la Fe+3 (forma met), care se suprapune peste adiia reversibil a oxigenului la forma deoxi.

1.2. Spectrometria UV-VISMetoda se bazeaz pe interaciunea radiaiilor UV-Vis de regul din domeniul spectral 120 900 nm cu proba. Domeniul spectral 120 400 nm este domeniul ultraviolet (sub 190 nm domeniul UV de vid), iar domeniul 400 800 nm domeniul vizibil.Se bazeaza pe trimiterea unui fascicul luminos prin proba de interes, si pe determinarea in ce msur proba absoarbe aceast lumin, responsabili de aceasta absorbie fiind electronii din straturile de valen ale moleculelor din prob, care, absorbind lumina, sunt promovai pe orbitali de energie superioar, anterior liberi.Interaciunea poate avea loc cu atomii, ionii i moleculele din prob sau pot avea loc interaciuni pe baza proprietilor optice ale probelor de a reflecta, dispersa i de roti planul luminii polarizate. Elemente componente ale unui spectrofotometru sunt: Sursa primar de radiaie; Dispozitivul de monocromare a radiaiei i selectare lungime de und (monocromatoare sau policromatoare); Detectorul optic; Sistemul de condiionare a semnalului (amplificatorul); Sistemul de citire i afiare rezultat;Legea lui Lambert Beer descrie relaia de legtur dintre absorban, grasimea stratului absorbant de prob (grosimea cuvei) i concentraia speciilor absorbante.A=b*c*l

2. Materiale i metodeSe prepara solutii tampon pentru valorile de pH 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, concentratiile acestora fiind de 200 mM. Soluiile tampon se prepar n apa de ultrapura. Soluiile se eticheteaz i se depoziteaz n sticle, de preferin nchise la culoare. Soluiile se depoziteaz la rece dar trebuie aduse la temperatura camerei nainte de fiecare experiment. Se va verifica (i ajusta, dac este cazul) pH-ul la nceputul fiecrei edine sptmnale, dac soluia respectiv urmeaz s fie folosit. Calea aleasa pentru prepararea solutiilor de pH dorit a fost pregatirea solutiei uneia dintre componente, la concentratia dorita, si ajustarea ulterioara a pH-ului cu un acid sau o baza dupa caz, monotorizandu-se cu pH-metrul.Pentru a calcula cantitatea necesar de materiale solide, utilizate n prepararea soluiilor tampon se folosete relaiile: , n reprezentant numarul de moli,c = 200 mM ( 0.2 M )V = 250 ml

Macetat = 136 gMfosfat = 138.011 gMborat = 202 gMCAPS = 221 gMglicina = 75.07 g

Tabel 1pHMaterialpKaCantitatea [g]Ap [ml]

2Fosfat2.156.9250

3Glicina2.353.753250

4Acetat4.766.8250

54.76250

6Fosfat7.206.9250

77.20250

87.20250

9Borat9.2310.1250

109.23250

11CAPS10.4011.05250

12Fosfat12.336.9250

1312.33250

Se prepar soluiie tampon dupa cantitiile prevzute n Tabelul 1.pH-ul se ajusteaz cu ajutorul unui pH metru, al crui electrod se ine n CCl4, i nainte de folosire se spal bine cu ap ultrapur, dup care se calibreaz cu o soluie tampon (de calibrare), care are un pH constant la o temperatur dat.

Soluia tampon cu pH=2;pHinitial = 5.76 + HCl => pH=2; Soluia tampon cu pH=3;pHinitial = 6 + HCl => pH=3; Soluia tampon cu pH=4;pHinitial = 8.26 + HCl => pH=4; Soluia tampon cu pH=5;pHinitial = 8.56 + HCl => pH=5; Soluia tampon cu pH=6;pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=6; Soluia tampon cu pH=7;pHinitial = 5.55 + NaOH => pH=7; Soluia tampon cu pH=8;pHinitial = 5.33 + NaOH => pH=8; Soluia tampon cu pH=9;pHinitial = 9.29 + HCl => pH=9; Soluia tampon cu pH=10;pHinitial = 9.28 + NaOH => pH=10; Soluia tampon cu pH=11;pHinitial = 4.6 + NaOH => pH=11; Soluia tampon cu pH=12;pHinitial = 5.27 + NaOH => pH=12; Soluia tampon cu pH=13;pHinitial = 5.20 + NaOH => pH=13;Soluiile tampon se pstreaz nchise, ferite de lumin i de cldur.Solutia de mioglobina se pastreaza, preferabil, in concentratii de 1-5 mM. Peste mioglobina ferica adaugam apa pura, pe urma se agita cu grija si asteptam sa se aseze solutia. Extragerea probelor din solutiile stoc se va face tot timpul cu varfuri noi, utilizandu-se pipete Eppendorf. In acest caz, solutia de mioglobina are concentratia de 1 mM si se pastreaza obligatoriu in frigider. Pentru prepararea solutiei de mioglobina s-a realizat un amestec echimolar (1:1) de mioglobina din inima de cal si apa ultrapura. Inainte de fiecare utilizare se verifica concentratia solutiei pentru a avea reproductibilitate in metoda utilizata. Pentru aceasta se verifica absorbana la pH=7, deoarece acest pH este cel mai apropiat de pH-ul fiziologic. In cuva se pune 700 l de soluie tampon, cu care se face Baseline-ul. Dup ce a fost stabilita linia de zero, se scoate cuva din spectrometru, se adaug peste 5 l mioglobina i traseaza spectrul. Se stabileste astfel, lungimea de unda la care absorbanta solutiei este maxima.

A = b cb = 1 cmA = 1.383663

= 188 Deoarece n cuv am pus 5 l de mioglobina i 700 l de soluie stoc, concentraia iniial se calculeaz dup ecuaia:C1 V1 = C2 V2

Concentraia soluiei tampon va fi 50 mM. Domeniul de realizare a spectrului UV-Vis pentru o protein este de obicei 260-800 nm, insa de multe ori pentru mioglobin i alte hemoproteine se nregistreaz spectrul doar n domeniul 400-750 nm. Pentru o protein se va observa ntotdeauna un maxim n jur de 280 nm, datorat materialului proteic. Alturi de acesta, proteine ca mioglobina prezint cofactori sau grupri prostetice cu absorbana n domeniul vizibil. Un spectru UV-VIS ideal are absorbanele cuprinse n intervalul 0.1-1 uniti.Pentru a determina absorbanele soluiile tampon se dilueaz de 3 ori ( 1 soluie tampon : 3 ap ultrapur), se pune 700 l, cu care se face linia de zero, dup care se adaug 5 l mioglobin, i se nregistreaz spectrul. Absorbanele se citesc la lungimile de unda, la care s-a stabilit ca apare maximul de absorbtie.

Influena pH-ului asupra mioglobineiFig. 2. Spectrul UV-VIS al mioglobinei la pH = 2 13 (Domeniul 280-650 nm)

La pH = 2 4 proteina se denatureaz, rupandu-se legaturile de hidrogen din structura. Cnd are loc creterea pH-ului se obin benzi asemntoare cu spectrul mioglobinei, deoarece pH-ul se apropie de pH-ul fiziologic. Se observ o band intens (banda Soret) la, aproximativ, 410-430 nm, care in mediu acid sunt mai intense, iar n mediu bazic mai putin. La pH bazic Fe este hexacoordinat, i are loc o acumulare de OH-. Dac la Fe se leag OH- acesta devine de spin jos, iar cnd face legtur cu apa, acesta devine de spin nalt.

Fig. 3. Influena pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 13 ( 450-650 nm)

Fig. 4. Influena pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 13 ( 580-650 nm)In intervalul de 450 650 nm se observ suprapunerea benzilor pe la aproximativ 620 nm, ceea ce sugereaza existenta Fe in 2 forme de oxidare, in functie de pH diferind ligandul si tiupl spinului.La pH< 5 scade absorbanta i la fel i concentraia mioglobinei, dar la pH > 8 are loc creterea absorbanei, deci i creterea concentraiei mioglobinei (absorbanta este direct proportionala cu concentratia conform legii lui Lambert-Beer). La lungimi de und mai mari decat 700 nm mioglobina nu mai absoarbe.In domeniul de pH n care proteina nu este denaturat, pH>4, se poate defini o constant pKa (logaritm zecimal din constanta de aciditate), care indic punctul de de echivalen dintre Fe n stare de spin nalt sau jos. Pentru determinarea pKa-ului, se folosete un program de tip excel reprezentndu-se grafic absorbana n funcie de pH, valoarea acesteia fiind determinat din grafic, in acest caz punctul de echivalenta coincide cu acest pKa. Din grafic se poate vedea ca pKa = 9.

Fig. 5. Determinarea pKa (absorbanta in functie de pH)

Influena unui agent reductor (ditionit de sodiu) asupra mioglobineiSe prepar o soluie de mioglobin la pH = 7; 10; 12, cu concentraie de 20 mM. La soluii cu pH = 7 i 10 se adaug ditionit de sodiu, iar cu pH = 12 dioxid de tiouree.Soluiile tampon se dilueaz 1:5, folosindu-se apa ultrapura. Se pun n cuv 700 l din aceast soluie i trage Baseline-ul, dup care se pun 5 l mioglobin i se nregistreaz spectrul. Pentru urmrirea efectului unui agent reductor se adauga si cteva cristale de ditionit de sodiu n cuv i se nregistreaz nc odat spectrul.

Fig. 6. Efectul ditionitului de sodiu i dioxidului de tiouree asupra concetraiei mioglobinei In cazul probei la pH = 7 s-a observat scderea absorbanei i benzile se deplaseaz spre vizibil. In cazul spectrului formei ferice maximul de absorbtie apare la 410 nm, iar n cazul formei feroase apare la 430 nm, iar aceeasta scazand de la 0.9881132 la 0.6654195.

Fig. 7. Efectul ditionitului de sodiu i dioxidului de tiouree asupra concetraiei mioglobinei Din spectrul inregistrat se poate observa ca la pH = 10 nu apar schimbri semnificative fa de pH = 7. La pH = 12 se observ dou peakuri la band fr dioxid de tiouree, iar cu agentul reductor se observ doar un singur peak. Are loc o cretere a absorbanei, de la 0.7285849 la 1.08099.

Dozarea activitii peroxidazice printr-o metod spectrofotometricPeroxidaza este o enzim din clasa oxidoreductazelor ce catalizeaz oxidarea unor substraturi organice pe seama reducerii apei oxigenate:peroxidaza + H2O2 + substrat -> peroxidaza + H2O + substrat oxidatPrepararea soluiei de ascorbatMascorbat = 176.12 g/mol200 mM = 0.2 M = 0.2 mol/l m = n M = 0.2 176.12 = 25.224 g25.224 g ............................1000 ml x......................................1 mlx = 0.0252 gSoluia de ascorbat de 200 mM se prepar prin dizolvarea 0.0252 g n 1 ml de soluie tampon pH = 5.Se verific concentraia soluiei de ascorbat prin spectrometrie UV-VIS. Se traseaza Baseline-ul cu solutie tampon de pH=5, apoi se adauga ascorbatul si se inregistreaza spectrul. A ~ 1 la = 290 nmPrepararea soluiei de peroxidSe ia 50 l de peroxid, peste care adauga 1 ml de ap ultrapur.Se verific concentraia, cnd se face Baseline-ul cu ap ultrapur, dup care se adauga 50 l soluie de peroxid i se traseaza spectrul.A = 2.62111b = 1 cm = 41A = b c

Pentru a prepara soluia cu concentraia dorit (50 mM), soluia necesar pentru determinare se calculeaz cu formula:C1 V1 = C2 V210 64 = 50 x => x = 12.8 ml

Fig. 8. Influena ascorbatului asupra mioglobinei, n soluii cu pH = 6 i 8Prin adugarea apei oxigenate Fe(II) oxideaza la Fe(III). La pH = 6 dup adugarea ascorbatului intensitatea benzii scade, ceea ce nseamn, c fierul tinde s revine la starea de oxidare initiala. In cazul probei la pH = 8 banda reprezint dou maxime, dup adugarea ascorbatului, care nseamn c forma feric la pH=8 este mai stabil dect cea feroasa. Se studiaz comportamentul mioglobinei la pH = 6, cnd se adaug peroxidaz n diferite concentraii.Soluia tampun cu pH = 5 [l]Mioglobina [l]Ascorbat [l]Peroxid [l]

982.615.3820

98015.3822

97015.38210

96015.38220

94815.38232

Se prepar soluiile dupa datele intabelate.In cuv se pune soluia tampon, cu care inregistreaza punctul zero, dup care se adauga ascorbatul i peroxidul i se pornete reacia. Dup aproximativ 5 secunde se deschide spectrometrul, se adauga rapid cantitatea de mioglobin, se agit i se msoar n continuare spectrul.Vpanta se citete din panta dreptei, reprezentndu-se mai intai grafic absorbana n funcie de timp, pentru fiecare concentraie. Peroxid [M]vpantavcalcVmax0.05VteoreticDiferentaSuma

Km600

000.00000.00000.00018kcat

1000.00550.01570.0077.25771E-050.004167

5000.00830.02360.0238.24878E-07

10000.01240.03530.0311.64907E-05

16000.01610.04580.0368.99375E-05

Dupa utilizarea opiunii SOLVER, se obtin urmatoerele date:Peroxid [M]vpantavcalcVmax0.05965VteoreticDiferentaSuma

Km600

000.00000.00007.3E-05kcat

1000.00550.01570.0095.09878E-050.004971

5000.00830.02360.0271.20991E-05

10000.01240.03530.0373.88374E-06

16000.01610.04580.0436.07605E-06

Concluzii Mioglobina la pH < = 4 se denatureaz, la pH>5 este stabil La pH = 6 forma oxidat a mioglobinei este mai puin stabil dect la pH = 8