O metodă rapidă de detectare a petelor uscate de salivă prelevate de pe pielea umană cu ajutorul spectroscopiei de fluoresceță

1.Introducere Analiza urmelor de muscaturi in cazurile de abuz sexual sau abuz asupra copiilor, este foarte greu de realizat deoarece dentitia umana nu lasa intotdeauna caracteristicile sale imprimate la nivelul pielii.

Analiza ADN-ului extras din urmele de salivă prelevate de pe suprafața pielii în cazuri simulate de muşcături, pare să fie o metodă eficientă de identificare a persoanelor. Din păcate, analiza ADN este costisitoare, durează foarte mult şi nu oferă un feedback imediat. Pe de altă parte, utilizarea radiației UV şi a celei laser sunt tehnici simple utilizate în identificarea urmelor de fluide umane. Identificarea urmelor de fluide umane cu ajutorul acestor tehnici a avut succes doar în 13.21-30% din cazuri.

Această lucrare reprezintă un prim pas în dezvoltarea metodei spectrofluorimetrică în detectarea petelor de salivă de pe suprafața pielii. S-a presupus că probele prelevate prin tamponarea suprafeței suspecte ar putea oferi o serie de caracteristici de fluorescență date de anumite componente ale salivei, care ar putea fi un posibil indiciu de depunere a salivei.

2. Materiale şi metode2.1 Determinarea lungimii de undă optime de excitație

Pentru determinarea lungimii de undă optime de excitație folosită în obținerea spectrelor de emisie a probelor de salivă prelevate de pe piele s-au realizat spectre de exitație (de la 200 la 320 nm) a unor probe de salivă lichida nediluată prelevată de la 5 voluntari. Spectrele de absorbție s-au obținut cu ajutorul unui spectrofluorimetru (Fluoromax 2, Instruments SA, Inc., Edison, NJ) în care probele s-au introdus în cuve de cuarț cu grosimea de 1 cm.

2.2 Spectroscopia de fluorescență a probelor de salivă şi a celor de control prelevate de pe suprafața pielii

S-au folosit 82 de voluntari care au depus monstre de salivă pe suprafața pielii de pe antebraț. S-au depus şi monstre de control cu apa în acelaşi loc dar pe celălalt braț. Monstrele depuse s-au lăsat la uscat la temperatura camerei timp de 30-60 minute. Experimentul având loc într-o zi de vară între orele 14-17 cu temperatură şi umiditate ridicată.

Pentru prelevarea probelor s-au utilizat tampoane de bumbac care a fost înmuiate într-o soluție de KCl 0.1M cu un pH de 7.4, tampoane care apoi a fost scuturate pentru a înlătura surplusul de soluție. Cu aceste tampoane s-au şters usor porțiunile de piele cu salivă. La fel s-a procedat şi în cazul probelor de control.

În cazul a 43 de voluntari s-a realizat o singură probă de control, iar pentru restul s-au realizat 3 probe de control: o probă pe acelaşi braț cu monstra de salivă la 5 cm de aceasta şi alte două în acelaşi loc dar pe celălalt braț. Apoi, fiecare dintre tampoane au fost introduse separat în containere de plastic cu un conținut de 2 ml de soluție de KCl 0.1M, timp de 10 secunde. Conținutul fiecărui container a fost transferat apoi în cuve de cuarț şi introduse în spectrofluorimetru, obținându-se spectre de emisie de fluorescență de la 300 la 540 nm.

2.3 Spectroscopia de fluorescență a componentelor saliveiSpectrele obținute de la probele de salivă au fost comparate cu cele obținute de la

soluțiile obținute din amestecul a 10 unități/ml amilază, 0.5mg/ml triptofan, 1mg/ml lizozimă şi 1mg/ml mucin. Toate probele au fost dizolvate în 5mM soluție de KCl.

1

În cazul a doi voluntari s-au luat probe de salivă de pe piele cu ajutorul unei benzi scotch iar probele au fost prelevate apoi de pe suprafata benzilor, cu scopul de a determina dacă pielea joacă vre-un rol în fiabilitatea detecției salivei cu ajutorul spectrofluorimetrului.

Fig.1 Spectru fluorescenței de excitație cu emisie la 340 nm a unei probe de salivă pure. Excitația maximă are loc la 282 nm.

Fig.2 Spectrul fluorescenței de emisie cu excitație la 282 nm obținut de la probele prelevate de pe pielea cu salivă şi de la probele de control.

3. Constatări3.1 Spectrul de absorbție al monstrelor de salivă

Spectrele de absorbție al probelor lichide şi nediluate de salivă s-au caracterizat prin apariția unui vârf (peak) de excitație la λ= 282 nm (fig.1). Această lungime de undă s-a stabilit a fi lungimea de undă optimă de excitație pentru obținerea spectrului de emisie.

3.2 Spectrul de emisie şi intensitatea fluorescenței probelor de salivă şi a celor de controlSpectrele de emisie al tuturor tampoanelor cu care s-au prelevat probele de salivă

uscată şi de probe de control s-au caracterizat prin apariția unui peak primar la λ = 345-355 nm (fig.2). În 97.6 % dintre cazuri (80 din cei 82 de voluntari), raportul dintre suprafața peak-ului de fluorescență al salivei şi cel al probei de control a fost mai mare de unu. Acest lucru a fost adevărat atunci când peak-ul de fluorescență a fost raportat la o singură probă de control (43 de cazuri) sau la media celor trei probe de control (37 de cazuri). Tabelul 1 arată raportul dintre suprafața peak-ului de fluorescență al probei de salivă la cea de control.

2

Tabelul 1. Raportul dintre suprafața peak-urilor de fluorescență obținute de la saliva uscată şi de la probele de control.Nr. de cazuri <1 1-2 2-4 >443a 0 8 6 2937b 2 13 13 11

a- O probă de salivă/ o probă de controlb- O probă de salivă/3 probe de control

3.3 Spectrul de emisie al componentelor saliveiSpectrele de fluorescență obținute de la saliva prelevată de pe suprafața pielii sunt

asemănătoare (se potrivesc), cu cele obținute de la probele de amilază pură. Amilaza emite peak-uri la λ= 350 nm (fig.3). În plus, spectrul de fluorescență obținut de la probele de triptofan pur şi fluoroforul ce derivă din alfa-amilaza emit peak-uri la λ= 353 nm. Alte două componente ale salivei: mucinul şi lizozima, au fost excitate cu radiația cu λ= 282 nm. Mucinul a prezentat 2 peak-uri de emisie unul la 310 nm şi un altul la 352 nm (fig.3). Peak-ul de emisie dat de lizozimă a fost deasemenea la 336 nm (fig.3).

Tampoanele de control prelevate de pe suprafața benzilor scotch nu au arătat interferențe importante la 345-355 nm. Ordinea intensității fluorescenței obtinuță de la cei 2 voluntari a fost: banda luată de pe piele+salivă> piele normală+salivă> banda luată de pe piele fără salivă>piele normală fără salivă.

Fig.3 Spectrul de fluorescență de emisie obținut de la componentele pure ale salivei umane excitate la 282 nm.

4. DiscuțiiBenzile obținute de la monstrele de salivă uscată atunci când au fost analizate cu

spectroscopia de fluorescență s-au potrivit cu cele obținute de la probele de alfa-amilază pură, care este o glicoproteină şi o enzimă a salivei cu un rol important în digestie. Se pare că, conținutul de amino-acid aromatic triptofan în amilază, este responsabil de emisia la 345-355 nm. Triptofanul este deasemenea un component prezent în proteinele pielii şi prezintă o absorbție mare la 280-320 nm. Spectrele de emisie al altor componente cunoscute din salivă au prezentat, după excitarea la 282 nm, diferite caracteristici. Mucinul, o glicoproteină mucilaginoasă, a prezentat 2 peak-uri de emisie unul la 310 nm şi un altul la 353 nm, iar lizozima a prezentat un peak de emisie la 336 nm.

Intensitatea peak-urilor de fluorescență obținute din probele de salivă s-a demonstrat că variază în rândul voluntarilor. Această variație putând avea cauză conținutul de proteine diferit al salivei. Unele dintre probele de control au prezentat o intensitate mult mai mare decât altele. Printre alți amino-acizi, triptofanul s-a găsit prezent în probele de transpirație prelevate de pe suprafața pielii voluntarilor. În cazul a 39 de voluntari intensitatea

3

fluorescenței probelor de control a fost calculată ca media intensităților a 3 probe diferite. La 8 din cei 39 de voluntari, una dintre probele de control nu a prezentat fluorescență. Studii anterioare au demonstrat că, cantitatea de triptofan şi de alți amino-acizi este diferită în transpirație.

Deşi, au existat diferențe între intensitățile peak-urilor măsurate de la un subiect la altul, îțn cazul a 80 din cei 82 de voluntari (~97.6%), suprafața de sub peak-ul de fluorescență a avut valori mai mari în cazul peak-urilor obținute de la tampoanele cu salivă. La 59 din cei 82 de subiecți suprafața peak-ului de fluorescență obținut de la probele de salivă a fost dublă.

Analiza spectrofluorimetrică propusă în această lucrare pare să fie mult mai sensibilă decât alte tehnici, care se bazează pe detectarea fluorescenței salivei. Urmele de salivă au fost detectate în doar 30-48% din elementele testate cu ajutorul unui tub cu arc de cuarț de mare intensitate şi cu un laser cu 2 ioni de argon (18 W si 200mW), comparativ cu ~98% în lucrarea de față. Aceste date nu au fost surprinzătoare, deoarece laserul cu ioni de argon emite o lungime de undă continuă de la 454.5 la 514.5 nm iar saliva absoarbe în domeniul UV. Iluminarea cu radiație UV a fost utilizată în detecția salivei şi al altor fluide ale corpului, invizibile cu ochiul liber, în cadrul unor studii preliminare, utilizând un laser Nd:YAG care emite la 266 nm. Studii recente realizate de acelaşi grup de cercetători privind utilizarea lampei cu mercur-xenon şi a camerei CCD în detecția fluorescenței diferitelor fluide ale corpului, printre care şi saliva, nu au prezentat nici un fel de date clare.

Testul Phadebas pentru amilază este folosit ca un test pentru determinarea cantitativă a amilazei din urmele de salivă. Saliva lichidă, ca şi sursă bogată de amilază, produce nivele mari ale acesteia detectabile în urmele de salivă. Deşi, diferite niveluri ale activității amilazei peste o anumită valoare (0.02 unități), obținute prin testul amilazei în absența contaminării, pot fi privite ca un indiciu al prezenței salivei, nu a fost definit un anume nivel, clar, pentru detectarea amilazei. Mai mult, detectarea activității amilazei în probele de salivă sau în urmele de salivă folosind testul Phadebas, necesită aproximativ 30 minute.

În cazul acestei lucrări, spectroscopia de fluorescență necesită 30 secunde şi nu este specifică doar amilazei. Acest test reflectă contribuția tuturor componentelor salivei. Chiar dacă conținutul unuia dintre componente este scăzut, celelalte componente contribuie la formarea profilului fluorescenței caracterstic salivei.

Metoda spectroscopică descrisă are o sensibilitate bună în detectarea salivei pe suprafața pielii. Se pare că profilul de fluorescență al probelor de salivă obținut de la diferiți subiecți nu variază semnificativ, dar rămâne problema specificității. Avantajul este că aceaşi probă supusă determinării fluorescenței poate fi folosită pentru analiza ADN. Spectroscopia de fluorescență poate fi un instrument util pentru criminaliştii care se confruntă cu problemele ridicate de investigarea semnelor de muşcături în cazurile de abuz sexual.

Această lucrare descrie spetroscopia de fluorescență ca o metodă rapidă, sensibilă şi non-distructivă folosită in detectarea urmelor invizibile de salivă uscată pe suprafața pielii. Această metoda, care a fost în principal utilizată pentru determinare, poate avea o contribuție importantă în criminalistică, deoarece urmele de salivă de pe piele sunt invizibile (aceasta face ca colectarea şi extragerea ADN-ului să fie mult mai dificilă decât în cazurile urmelor de pe haine sau hârtie). În plus, contaminarea ADN-ului de pe piele este comună. Din punct de vedere practic, această tehnică poate detecta saliva din probele obținute de pe suprafața pielii care este suspectă că ar conține urme de salivă.

4

5