UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDISFACULTATEA DE MEDICINĂ, FARMACIE ŞI MEDICINĂ DENTARĂ

MICROBIOLOGIE

CAIET DE LUCRĂRI PRACTICE

PROF.DR. ASIST.UNIV. SAŞCĂ CONSTANTIN Dr. ŢĂREAN ADRIANA

1

STERILIZAREA

Noţiunea de steril semnifică lipsa totală a oricărei forme de viaţă de pe suprafaţa şi din interiorul obiectelor, a substanţelor lichide şi/ sau solide. Sterilizarea constă deci, în totalitatea mijloacelor ce duc la distrugerea sau îndepărtarea completă a microorgasnismelor (bacterii în rmă vegetativă sau spori, fungi, protozoare, virusuri).

Metodele de sterilizare sunt:- prin agenţi fizici: 1. căldura uscată şi căldura umedă; 2. radiaţiile; 3. filtrarea; 4. ultrasunetele- agenţi chimici: 1. oxid de etilen 2. - propilolactona 3. glutaraldehida 4. formaldehida

AGENŢII FIZICI FOLOSIŢI ÎN STERILIZARE

I. CĂLDURABacteriile în forma lor vegetativă, cât şi sporii bacterieni şi virusurile sunt distruse prin

căldură, prin carbonizarea şi coagularea proteinelor.Durata sterilizării depinde de temperatură, presiune, umiditatea mediului în care are loc sterilizarea, precum şi de performanţa aparatului utilizat.

Sterilizarea prin căldură uscată. 1. Flambarea constă în trecerea obiectelor direct prin flacără; este o metodă de

sterilizare specifică laboratorului de microbiologie, utilizată pentru:- ansa de platină ( bacteriologică), care se încălzeşte până la incandescenţă, când se

atinge temperatura de 3200 C; operaţiunea se efectuează înainte şi după orice manoperă efectuată cu ansa; manevra trebuie efectuată cu grijă, deoarece materialul infecţios încărcat pe ansa bacteriologică, sub influenţa căldurii poate să fiarbă şi să împrăştie particole în mediu, periclitând atât personalul din laborator cât şi mediile de cultură care se pot astfel contamina. Acest risc se poate reduce foarte mult, dacă flambarea se realizează în interiorul unui cilindru metalic încălzit electric.

- gâtul baloanelor şi eprubetelor înainte de deschidere şi după închidere;- suprafaţa externă a capetelor pipetelor Pasteur;- fiolele cu produse liofilizate, după deschidere şi înainte de solvirea conţinutului;

Stropirea cu alcool şi aprinderea unor instrumente de mică chirurgie, ace de seringă, etc. este o metodă incorectă, care nu se recomandă nici în situaţii de urgenţă.

2. Sterilizarea prin căldură uscată în cuptorul Poupinel se realizează la 18o C şi durează o oră.

Prin acest procedeu se sterilizează: sticlăria de laborator, instrumente chirurgicale metalice, seringi de tip Luer, instrumente stomatologice cum sunt: oglinzi stomatologice, sonde, pense, excavatoare, ace (de nerv, Kerr, Hedstrom, Lentullo), matricea şi portmatricea, pietre de şlefuit, freze dentare, linguri metalice pentru amprentare, apăsătoare de limbă, instrumentarul pentru extracţie, depărtătoare,etc.

2

- înainte de a fi introduse în cuptorul Poupinel, întreg instrumentarul se spală cu apă şi detergenţi, se clăteşte bine, se usucă şi se ambalează; sticlăria de laborator va fi împachetată în hârtie albă, individual sau grupată.Eprubetele, baloanele, cilindrii se astupă cu dopuri şi se acoperă cu capişoane de hârtie legată cu sfoară;înainte de ambalare, pipetele se astupă cu dopuri de vată la partea unde se aspiră, pentru a preveni atât aspirarea produsului cât şi contaminarea acestuia cu flora bucală a persoanei care lucrează.Instrumentarul stomatologic se sterilizează în cutii metalice speciale, închise.

- nu se sterilizează la Poupinel: seringi cu armătură metalică, filtre bacteriologice, obiecte din cauciuc, piele, blană şi materiale plastice.

Controlul sterilizării: hârtia de ambalaj iniţial albă, trebuie să fie îngălbenită la sfârşitul sterilizării. Dacă a rămas albă, înseamnă că nu s-a atins temperatura de 180C, iar dacă este carbonizată se va rupe în timpul manipulării obiectelor care au fost ambalate, compromiţând asfel sterilizarea.Un alt test constă în introducerea în cuptor a unor zaharuri cu punct de caramelizare cunoscut, în jur de 180C.

3. Incinerarea este utilizată pentru sterilizarea materialului infecţios din laborator, înainte de aruncare, de exemplu tampoane de vată, bureţi, produse patologice, cuştile animalelor de laborator infectate.

Sterilizarea prin căldură umedă. 1. Fierberea în apă la 100 C, timp de 30 de minute,distruge formele vegetative ale bacteriilor şi virusurile, dar nu şi sporii, care ar necesita un timp mai îndelungat, de 4-5 ore.

- prin fierbere se pot steriliza: lenjeria şi vesela bolnavilor, şi profilactic, în epidemii, se fierb apa, fructele, legumele, laptele. Deoarece prin fierbere sporii nu sunt distruşi, această metodă este improprie şi nu se recomandă pentru sterilizarea instrumentarului chirurgical şi/ sau stomatologic.

2. Autoclavarea utilizează vapori de apă sub presiune, la 120C, timp de 30 de minute, şi este considerată metoda cea mai practică de sterilizare prin căldură umedă.

Autoclavul este un cazan metalic, cilindric, cu pereţi dubli, rezistenţi la presiune ridicată, prevăzut cu un sistem de închidere care asigură etanşeitatea, manometru, robinet de eliminare a aerului şi o supapă de siguranţă care se deschide când presiunea din aparat depăşeşte valorile de siguranţă. În interior, autoclavul prezintă un suport pentru obiectele de sterilizat şi un tub de nivel care indică nivelul apei.

La autoclav se pot steriliza: întregul instrumentar metalic chirurgical şi stomatologic, medii de cultură, seringi de sticlă cu armătură metalică, obiecte din cauciuc (sonde), materialul infecţios provenit de la bolnavi şi produsele patologice ale acestora, recoltate pentru analize de laborator, casolete de vată, pansamente, halatele personalului.

- nu se sterilizează : medii de cultură albuminoase şi zaharoase, obiecte din plastic, piele, blană.

Controlul sterilizării:- teste chimice bazate pe utilizarea unor substanţe chimice cu punct de fuziune cunoscut, care se înfiolează împreună cu un colorant şi se introduc în autoclav odată cu materialul de sterilizat.- teste bacteriologice: se introduc în eprubete închise cu dop, fire de bumbac sau mătase înmuiate într-o cultură sporulată (b. subtilis) şi se sterilizează în autoclav. După sterilizare, se însămânţează în bulion şi se urmăreşte dacă bulionul rămâne steril.

1. Pasteurizarea este o metodă de sterilizare imperfectă, deoarece nu distruge decât formele vegetative ale bacteriilor, are însă avantajul păstrării vitaminelor în produsele alimentare. Este folosită pentru lichide cum sunt laptele, berea, vinul, sucurile de fructe, şi se

3

realizează la diferite temperaturi, sub 100 C, cu durata variabilă. În funcţie de aceşti doi factori (temperatura şi durata), deosebim următoarele tipuri de pasteurizare:

- joasă la 60 - 65 C, o oră;- medie la 70- 75 C, 20 de minute;- înaltă la 85- 90C, cîteva secunde;

Ultrapasteurizarea constă în injectarea de vapori supraîncălziţi direct în lichidul de sterilizat, menţinut sub presiune şi supus unei curgeri turbulente la 150C , câteva secunde.

2. Tyndalizarea constă în încălzirea repetată, timp de 3 zile, câte 1-2 ore, la temperatura de 56- 90C, a unor medii albuminoase sau vaccinuri, care nu suportă alt tratament termic pentru sterilizare.

II. Sterilizarea prin radiaţii.1. Radiaţiile ultraviolete (neionizante) sunt emise de lămpi bactericide cu

lungimea de undă de 3537A.Prin această metodă sunt distruse bacteriile, virusurile, ciupercile în câteva minute şi sporii bacterieni în câteva ore.Aceste radiaţii sterilizează aerul şi suprafeţele netede şi curate;

- sunt utilizate pentru sterilizarea aerului în laboratoare de microbiologie, în institute de cercetare , boxe pentru nou-născuţi, săli chirurgicale.

2. Radiaţiile ionizante gamma şi razele X au avantajul penetrării, fiind astfel utilizabile pentru sterilizarea unor produse preambalate. Radiaţiile gamma sunt emise spontan de Co radioactiv şi sunt mai puţin costisitoare decât razele X; realizează o sterilizare completă, fără a altera materialul de sterilizat. Sunt larg folosite pentru sterilizarea produselor alimentare preambalate şi a unor echipamente medicale.

III. Sterilizarea prin filtrare.Filtrarea constă în trecerea lichidului de sterilizat printr-o substanţă poroasă

care reţine bacteriile, când porii sunt de ordinul micronilor, sau chiar şi virusurile, în cazul membranelor de colodiu, de unică folosinţă, cu pori de ordinul 0,01m. Filtrarea sterilizantă se foloseşte pentru lichide alterabile sub acţiunea căldurii.După natura substanţei poroase, filtrele pot fi:

- filtre Seitz din azbest şi fibre de celuloză cu pori de diferite dimensiuni; filtrarea se poate efectua cu presiune pozitivă sau cu presiune negativă, prin racordare la o pompă de vid, şi sunt cele mai utilizate filtre în laboratorul de microbiologie.

- filtre de sticlă Jena;- filtre de porţelan Chamberland- Pasteur, rar folosite astăzi.

STERILIZAREA CHIMICĂSterilizarea prin agenţi chimici este deosebit de utilă pentru echipamente medicale

sensibile la căldură, cum ar fi seturile pentru transfuzii de sânge, seringi de plastic, instrumentele pentru cateterizări; se foloseşte de asemenea pentru sterilizarea încăperilor aseptice.

Oxidul de etilen lichid la temperaturi sub 10,8C, devine gazos la temperaturi peste această valoare, şi este foarte inflamabil, chiar şi la concentraţii mici;din acest motiv, se utilizează în amestecuri cu CO2 sau Freon, care sunt gaze neinflamabile. În aceste combinaţii puterea bactericidă a oxidului de etilen este păstrată, fiind omorâte atât formele vegetative cât şi endosporii.

Utilizarea efectivă a oxidului de etilen necesită controlul precis al concentraţiei, temperaturii şi umidităţii aerului; în prezent există autoclave moderne care oferă condiţiile optime pentru utilizarea acestui gaz pentru sterilizarea de rutină a echipamentelor medicale şi de laborator; având putere de penetrare foarte bună, se poate aplica la

4

materiale preambalate.Se mai utilizează şi în programele spaţiale, pentru sterilizarea unor componente a navelor spaţiale.

- propiolactona este bactericidă, sporicidă, fungicidă şi viricidă, dar nu are puterea de penetrare a oxidului de etilen, deşi este activă în concentraţii mult mai mici. Are o arie de utilizare restrânsă din cauza proprietăţii cancerigene şi a penetrabilităţii reduse.

Glutaraldehida în soluţie apoasă 2% omoară bacteriile, sporii fungii şi virusurile şi este utilizată pentru sterilizarea echipamentelor urologice, instrumentelor cu lentile, etc.

Formaldehida este la temperatura camerei un gaz puternic iritant şi toxic, care polimerizează şi trece în paraformaldehidă solidă. Prin încălzire aceasta trece din nou în starea gazoasă de formaldehidă. În starea gazoasă, formaldehida este folosită pentru sterilizarea unor încăperi închise, are însă o putere de penetrare limitată.

AGENŢII CHIMICI ANTIMICROBIENI. DEZINFECTANTE ŞI ANTISEPTICE

Dezinfectantele sunt substanţe chimice capabile să omoare formele vegetative ale bacteriilor patogene, dar nu şi sporii; se utilizează uneori termenul germicid, aproape sinonim cu dezinfectantul, cu deosebirea că se referă atât la microorganismele patogene cât şi la cele nepatogene.

Antisepticele sunt substanţe chimice care se aplică de obicei pe tegumente şi împiedică multiplicarea bacteriilor, fie prin omorârea acestora, fie inhibând creşterea şi activitatea metabolică a microorganismelor respective.

Condiţiile pe care ar trebui să le îndeplinească un agent chimic „ideal”:- activitate antimicrobiană cu spectru larg, la concentraţii cât mai joase:- solubilitate în apă şi / sau alcool;- stabilitate în timp;- să nu fie toxic;- omogenitate;- să nu fie inactivate în contact cu substanţele organice de pe tegumente;- să fie active la temperatura camerei;- penetrabilitate;

- să nu fie corozive;- să aibă proprietăţi deodorizante;- preţ de cost scăzut;

Bineînţeles, nici un dezinfectant sau antiseptic cunoscut nu posedă toate aceste calităţi, dar din numărul mare care se găsesc astăzi se va alege cel mai potrivit cu scopul în care urmează a fi folosit.

Principalele grupe de dezinfectante şi antiseptice:Fenolul şi compuşii înrudiţi este unul din primii agenţi chimici folosiţi,

introdus de J. Lister (1827-1912 ) ca antiseptic aplicat preoperator pe tegumente.În prezent sunt utilizaţi mai mult compuşii înrudiţi, mai puţin toxici, cum sunt lizolul ( podele, pereţi, mobilier din spitale, termometre, etc.) şi hexaclorofena, inclusă în săpunuri, şampoane, deodorante. Compuşii de alcool. Acoolul etilic 70-90 este bactericid şi viricid ,dar nu distruge sporii bacterieni; este utilizat în special ca antiseptic tegumentar.

5

Halogenii. Iodul şi compuşii iodaţi, mai ales sub formă de tinctură de iod, sunt antiseptice tegumentare eficiente, cu un spectru antimicrobian foarte larg, la care se adaugă şi acţiunea sporocidă; iodoformul are proprietăţi asemănătoare, în plus nu pătează şi nu irită pielea. Clorul şi compuşii înrudiţi (hipoclorit, cloramina ) sunt utilizaţi curent pentru dezinfecţia apei potabile, a piscinelor Metalele grele şi compuşii înrudiţi (mercur, argint, zinc, cupru) sunt folosite ca antiseptice, în diferite pudre, unguente profilactic şi în tratamentul unor leziuni tegumentare minore. Detergenţii sub forma săpunurilor şi a detergenţilor anionici şi cationici sunt larg utilizate în dezinfecţie. Cei mai folosiţi sunt compuşii de amoniu cuaternar, din grupa detergenţilor cationici, cu acţiune bactericidă asupra germenilor Gram- pozitiv şi Gram- negativ, în concentraţii relativ mici.

Mijloace specifice de sterilizare în stomatologie

Se consideră că în stomatologie există patru mijloace de bază eficiente în sterilizare: - autoclavarea- considerată cea mai eficientă metodă de sterilizare la un preţ de cost scăzut; există astăzi autoclave moderne, tip casetă, care realizează sterilizarea în numai 6 minute.

- căldura uscată , în curent rapid („rapid flow”), la 190C, timp de 6 minute pentru instrumente neambalate, şi 12 minute pentru instrumentarul împachetat.

- Vapori chimici, în aparate tip „chemiclave”, pentru frezele şi instrumente de mână din carbon.

- Oxidul de etilen, pentru încăperi, timp de 8-10 ore.

Mijloace specifice de dezinfecţie în stomatologie

Instrumentele care urmează a fi sterilizate prin dezinfecţie, necesită inroducerea într-o baie de ultrasunete înainte de a fi frecate cu periuţa, manual.Curăţirea cu ultrasunete pare a fi de 16 ori mai eficientă decât curăţirea manuală.Există în prezent 6 grupe majore de dezinfectanţi recunoscuţi de ADA( American Dental Association).- hipocloritul de sodiu, în diferite diluţii , de la 1/5 –1/ 100, cu durată de aplicare între

10 şi 30 de minute.(conurile de gutapercă se ţin în soluţia nediluată timp de 1 minut ).- Iodoforii, cu durată de aplicare 10 minute, au şi acţiune reziduală; principiul activ este

iodul 1%.- Sprayuri cu fenol- alcool;- Compuşi sintetici pe bază de fenoli, în diluţie de 1:32, cu durata de aplicare 10 minute.- Sprayuri apoase fenolate, 10 minute.- Glutaraldehida sau glutaraldehidă în combinaţie cu alţi compuşi, durata de aplicare

între 10-30 minute.

6

Recoltarea şi transportul produselor patologice

Produsele patologice ( probă de laborator sau prelevat biologic) sunt secreţiile, excreţiile, umorile organismului, fragmente de organe sau ţesuturi obţinute prin biopsie, apa , alimentele, în care se pot găsi microorganismele ce determină îmbolnăviri.

Diagnosticul bacteriologic constă în izolarea şi identificarea bacteriilor din produsele patologice, iar corectitudinea lui depinde esenţial de respectarea riguroasă a unor reguli privind modul de recoltare al produselor patologice, metodele de conservare şi procedura de transport, de la punctul de recoltare la laborator.În acest sens, trebuie cunoscute şi îndeplinite următoarele condiţii:- care este produsul patologic ce urmează a fi recoltat, în care ar putea fi găsite microorganismele patogene în faza respectivă a bolii; de exemplu, în febra tifoidă, în primele zile se recoltează sânge, iar după 2-3 săptămâni de evoluţie, materii fecale, pentru că acolo vom găsi bacilii tifici în această etapă.- care este metoda de recoltare cea mai corectă, prin care se poate evita contaminarea din exterior a produsului patologic respectiv; instrumentarul de recoltare (ace pentru puncţie, seringi, sonde, tampoane faringiene, etc.), precum şi recipientele în care se păstrează şi se transportă produsele patologice vor fi sterile, iar cel care efectuează manopera de recoltare va respecta regulile de asepsie şi antisepsie specifice fiecărei proceduri;- care este momentul optim din timpul zilei, corespunzător momentului în care germenii se află în cantitate maximă în produsul respectiv; de exemplu, urina se recoltează dimineaţa, pentru că în timpul nopţii s-a produs o acumulare mai mare de bacterii, sau într-o septicemie, sângele pentru hemocultură se recoltează în momentul frisonului, dacă se poate, sau măcar în plin puseu febril;- care este cantitatea necesară din fiecare produs;- cum trebuie ambalat produsul respectiv pentru a feri de contaminare personalul care îl manipulează;- timpul optim în care trebuie să ajungă la laborator pentru a fi prelucrat; acesta variază de la produs la produs, precum şi în funcţie de bacteria ce urmează a fi izolată;astfel, urina poate fi în general păstrată la frigider, la + 4C, pentru 24 de ore, în timp ce lichidul cefalo-rahidian LCR recoltat într-o meningită, trebuie prelucrat imediat, deoarece meningococii se autolizează în mediul extern foarte rapid, ducând la un rezultat fals negativ;- când produsele patologice nu pot fi transportate imediat la laborator, trebuie cunoscute procedeele de conservare ale acestora.- indiferent de felul produsului patologic, toate instrumentele utilizate pentru recoltare, precum şi recipientele în care se recoltează, vor fi sterile.

Orice produs patologic va fi obligatoriu însoţit de un buletin de analiză, care va cuprinde următoarele date:- numele şi prenumele pacientului, vârsta, domiciliul sau numărul foii de observaţie şi al salonului de spital, diagnosticul prezumptiv, indicaţii asupra unui eventual tratament cu antibiotice administrat înainte de recoltare, felul şi provenienţa produsului, data îmbolnăvirii, data şi ora recoltării.

Vom reda în continuare metodele de recoltare pentru principalele produse patologice:

7

Recoltarea sângelui pentru examenul bacteriologic.Hemocultura reprezintă izolarea în medii de cultură şi identificarea germenilor ce se

găsesc în torentul sanguin în timpul bacteriemiilor şi septicemiilor.Trebuie subliniat aici, că în condiţii normale, sângele este steril.

Principalele indicaţii pentru efectuarea unei hemoculturi, sunt:1. bacteriemia2. septicemia3. şoc postoperator fără cauză aparentă4. şoc postoperator după manopere pe tractul genito-urinar5. stări febrile de cauză necunoscută, cu durata prelungită mai multe zile6. febră şi frisoane la pacienţi cu: arsuri infectate, infecţie urinară, infecţii tisulare

rapid progresive, plăgi postoperatorii septice, pacienţi cateterizaţi;7. persoane tarate, aflate sub tratament cu: antibiotice, corticosteroizi,

imunodepresive, antimetabolice, sau alimentaţi parenteral.Pentru corectitudinea acestui examen bacteriologic, trebuie respectate următoarele

reguli, în ceea ce priveşte tehnica de recoltare:- momentul recoltării trebuie să fie în plin puseu febril, sau în timpul frisonului, deoarece acesta corespunde multiplicării maxime a bacteriilor;- aseptizarea tegumentului unde urmează a se efectua puncţia venoasă se face după spălarea cu apă şi săpun, cu un antiseptic de tipul tincturii de iod sau Betadina (povidone-iodine);- zona puncţiei venoase se izolează cu câmpuri sterile;- seringa şi acul pentru puncţia venoasă vor fi sterilizate prin autoclavare sau vor fi de unică folosinţă, desfăcute din ambalajul steril la patul bolnavului, în momentul puncţiei; uzual, se folosesc seringi de 20ml;după recoltare, însămânţarea se va face imediat la patul bolnavului, în trei balonaşe cu mediu de cultură.Gâtul balonaşelor se curăţă în prealabil cu tinctură de iod, se usucă şi apoi se mai şterg o dată cu alcool 70%; raportul optim sânge/ mediu de cultură este de aproximativ 1/50 – 1/100, de obicei recoltându-se în jur de 5-8 ml sânge.Înainte de a fi introdus în mediul de cultură, acul se flambează, şi nu va atinge pereţii interiori ai recipientelor.- unul din balonaşe conţine mediu pentru aerobi, unul pentru anaerobi şi unul pentru aerobii care se incubează în atmosferă de CO2; balonaşul cu mediu pentru anaerobi nu se va agita, pentru ca stratul de izolare de la suprafaţa mediului să rămână intact.- dacă se ştie că pacientul a urmat tratament antibiotic înainte de recoltare, se pot introduce în mediile de cultură unele substanţe cu efect inhibitor asupra antibioticelor respective.- toate recipientele se etichetează, menţionându-se numele şi prenumele bolnavului, vârsta, data, ora, numărul probei ( care corespunde cu cel înscris în registrul de analize medicale), şi orice alte informaţii pe care le solicită laboratorul.

Ca măsură generală de protecţie, toate probele se consideră ca fiind potenţial infecţioase, de aceea manipularea lor se face cu maximum de atenţie, şi este indicată folosirea mănuşilor de cauciuc sterile.

În laborator, mediile de cultură însămânţate se introduc la termostat , la 370, şi se fac citiri zilnice.În cazul în care după 3 zile, toate culturile, subculturile şi frotiurile colorate Gram sunt negative, se poate da un rezultat provizoriu negativ, continuându-se incubarea şi citirile pentru încă 7-14 zile, după care, în absenţa creşterii microbiene, se poate da un rezultat final negativ.

În cazul unor culturi pozitive, se anunţă medicul clinician imediat, pentru a se putea începe tratamentul specific cât mai precoce.Citirile se pot face şi automatizat, prin aparate

8

de tip Bactec, care sunt foarte sensibile şi decelează creşterea microbiană mult mai repede, putând scurta durata tehnicii foarte mult.

Rezultate fals pozitive se pot obţine în special datorită contaminării cu germenii tegumentari.

Recoltarea sângelui pentru examene serologice.În unele afecţiuni sau în unele stadii evolutive ale unor boli, diagnosticul direct bacteriologic este dificil, şi este mai convenabil să se cerceteze anticorpii specifici din serul bolnavilor, ceea ce numim în mod curent diagnostic serologic sau indirect.

Pentru aceasta se recoltează sânge integral cu o seringă sterilă care înainte de recoltare se clăteşte cu ser fiziologic steril, pentru că urmele de apă de pe pereţii seringii ar putea produce hemoliză .Sângele se lasă pe masa de lucru la temperatura camerei, 1-2 ore, după care se decantează serul.

Recoltarea urinii pentru urocultură.Indicaţiile cele mai frecvente sunt în cazul infecţiilor aparatului urinar ( rinichi,

uretere, vezică urinară, uretră), urina fiind un mediu de cultură excelent pentru majoritatea bacteriilor care populează şi infectează tractul urinar.- infecţiile urinare sunt una dintre cele mai comune infecţii bacteriene, cu o frecvenţă ceva mai mare la femei, afectând, toate vârstele, cu manifestări variate, de la forme asimptomatice, până la forme grave, sistemice.- infecţia se produce de obicei pe cale ascendentă, de la uretră.- frecvenţa mai mare la femei a infecţiilor acute se explică prin lungimea mai mică a uretrei, o condiţie favorizantă în plus, pentru transmiterea ascendentă a infecţiei.- Tehnica recoltării. Se recoltează prima urină de dimineaţă, deoarece în aceasta se concentrează un număr mai mare de germeni.Organele genitale externe se spală cu apă şi săpun şi se clătesc cu ser fiziologic, după care primul jet de urină se aruncă şi se recoltează jetul mijlociu, într-un recipient steril.Urina se poate obţine şi prin sondaj vezical sau prin aspiraţie suprapubiană (direct din vezică),dar aceste metode sunt rezervate situaţiilor când micţiunile spontane nu sunt posibile.Trebuie subliniat că orice manevră de sondaj vezical creşte riscul contaminării căilor urinare pe cale ascendentă. Prelucrarea probelor se face imediat sau urina se poate păstra la frigider, la + 4oC, 24 de ore.Pe buletinul de analiză care însoţeşte proba se va specifica dacă pacientul a primit tratament antibiotic sau soluţii diuretice înainte de recoltare ( ar putea da rezultate fals negative prin diluarea mare a urinii). - Interpretarea rezultatelor.Urocultura se exprimă cantitativ, prin număr de germeni pe ml de urină.Se consideră că un număr sub 10 000 germeni / ml nu au semnificaţie patologică, bacteriile provenind din contaminare externă în timpul recoltării; între 10 000-100 000 germeni/ ml, rezultatul este dubios şi se repetă proba; peste 100 000 germeni/ ml indică infecţie urinară.Asocierea la bacteriurie a piuriei ( prezenţa puroiului în urină) pledează puternic pentru o infecţie urinară.

Recoltarea produselor patologice din tractul respirator. Pentru diagnosticul infecţiilor respiratorii sunt utile: sputa, exudatul faringian, secreţiile nazale şi exudatul rino-faringian.

Recoltarea exudatului faringian este indicată în următoarele situaţii:- angine, faringite , posibil de etiologie bacteriană(cel mai frecvent implicat Streptococcus pyogenes ), sau micotică ( Candida albicans ), amigdalite .- stabilirea originii focarului de infecţie în scarlatină, reumatism articular acut, glomerulonefrită acută (complicaţii poststreptococice);- detectarea purtătorilor de Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphteriae, Staphilococcus aureus.

9

Tehnică Recoltarea se face dimineaţa, fără toaleta prealabilă a cavităţii bucale, pacientul nu va mânca, bea sau fuma înainte de recoltare.Se utilizează tampoane faringiene sterile, introduse în recipiente speciale ( eprubete sterile) care conţin ser fiziologic sau un mediu special de transport; se pot folosi şi recoltoare speciale asemănătoare unor eprubete cu capac care le închide ermetic şi care conţin mediul de transport în care se descarcă tamponul faringian cu care s-a efectuat recoltarea.Pacientul va deschide gura larg, cu capul uşor înclinat spre spate, şi cu ajutorul tamponului faringian se şterg pereţii posteriori ai faringelui, amigdalele, şi toate zonele inflamate, sau care prezintă aspecte patologice (secreţii, ulceraţii, false membrane, etc), evitând atingerea luetei (declanşează reflexul de vomă),a obrajilor, limbii şi buzelor, precum şi contaminarea tamponului cu salivă.Dacă proba nu va fi prelucrată în ora următoare, aceasta se poate păstra la frigider.

Recoltarea secreţiilor nazale este indicată în leucemii acute, pacienţi propuşi pentru transplante, dializaţi, precum şi în cadrul anchetelor epidemiologice, pentru stabilirea originii unor epidemii.

Tehnica utilizează aceleaşi tampoane ca pentru exudatul faringian, dar de dimensiuni mai mici, şi constă în ştergerea secreţiilor din fosele nazale, urmat de descărcarea pe mediile de transport.

Recoltarea secreţiilor nazo-faringiene se face corect utilizând sonde nazale flexibile care prezintă o extremitate înfăşurată într-un tampon de vată, şi care se introduc printr-o narină în nazofaringe.

Indicaţiile metodei sunt:- izolarea de pneumococi, meningococi sau Haemophilus influenzae;- în tuse convulsivă pentru izolarea agentului etiologic Bordetella pertussis- detectarea purtătorilor de Neisseria meningitidis, implicată în etiologia unor meningite.

Este indicată prelucrarea imediată a probei.Recoltarea sputei. Este important de înţeles şi explicat pacienţilor că sputa reprezintă

produsul provenit prin expectoraţie, din profunzimea arborelui bronşic, şi nu trebuie confundată cu saliva sau cu secreţiile rinofaringiene.

Indicaţii :- pneumonii bacteriene, cu Mycoplasma, de etiologie virală, sau micotică- tuberculoză pulmonară- bronşită cronică- bronşiectazie( dilatarea patologică a bronhiilor)

Tehnică. Pacientul va tuşi şi va expectora într-un recipient steril, cantitatea necesară fiind în general de 1-3 ml, cu excepţia suspiciunii de tuberculoză, când este necesară o cantitate mai mare.Se trimite la laborator şi se prelucrează imediat; sputa nu se poate păstra la frigider.La bolnavii cu tuse uscată, iritativă, neproductivă, se poate stimula secreţia arborelui bronşic prin aerosoli cu soluţii hipertonice încălzite.

Recoltarea materiilor fecale pentru coprocultură.În mod normal, în scaunul persoanelor aparent sănătoase se pot găsi următoarele microorganisme: Candida albicans, Clostridia, Enterococcus, Escherichia coli, unele specii de Proteus, Pseudomonas aeruginosa, specii de Salmonella, Staphilococcus. Prezenţa Candidei albicans, în cantitate mare, după tratamente cu antibiotice, este considerată patologică; modificarea florei intestinale normale sub acţiunea antibioticelor determină frecvent transformarea unor microorganisme saprofite în patogene.

Materiile fecale reprezintă produsul patologic cu cea mai mare încărcătură de bacterii, fungi, virusuri, atât sub aspectul numărului cât şi a varietăţii lor.De rutină, coprocultura se efectuează pentru depistarea următorilor agenţi patogeni: Salmonella, Shigella,

10

Campylobacter, Escherichia coli enteropatogen ( la nou-născuţi) şi stafilococi în cultură pură.De regulă, o coprocultură negativă nu infirmă diagnosticul de infecţie bacteriană, de aceea în prezenţa semnelor clinice de infecţie bacteriană se recoltează trei coproculturi, dacă primele două au fost negative.În cazul coproculturilor pozitive, în scop profilactic, de prevenire a răspândirii infecţiei, atât contacţii direcţi cât şi bolnavul convalescent vor trebui să aibă trei coproculturi negative.

Tehnică. Se recoltează scaunul emis spontan, în recipiente sterile, fără urme de urină.Din aceste recipiente se trece o cantitate mică, în coprorecoltoare speciale (recipiente de formă cilindrică, prevăzute cu un capac cu linguriţă), incluzând toate fragmentele cu aspect patologic: urme de sânge, mucus, puroi, etc.Este bine ca examinarea lor să se efectueze în câteva ore de la recoltare;dacă nu este posibil, se pot conserva în soluţii saline glicerolate.

Recoltarea secreţiilor şi a puroiului din plăgi infectate. În plăgi se pot găsi specii ale următoarelor microorganisme, patogenitatea lor fiind dependentă de numărul lor: Actinomyces, Bacteroides, Clostridium perfringens sau alte specii, Escherichia coli şi alte enterobacteriaceae, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Staphylococcus (mai ales S. epidermidis), Streptococcus, maifrecvent speciile faecalis şi pyogenes. Trebuie acordată o atenţie deosebită speciilor anaerobe, a căror prezenţă este constantă în căile respiratorii superioare, tubul digestiv, căile urinare, de unde pot invada cu uşurinţă întreg organismul, determinând infecţii grave, septicemii, adeseori cu sfârşit letal.Următoarele produse patologice conţin cel mai frecvent agenţi patogeni cu semnificaţie clinică deosebită:- puroiul provenind din plăgi profunde sau abcese, în special când sunt însoţite de un

miros fetid;- ţesuturile necrozate din gangrena gazoasă;- secreţii provenite din plăgi din vecinătatea unor membrane mucoase;- lichidul drenat din plăgi postoperatorii;- lichidul ascitic;

Tehnică. Recoltarea în cazul unor colecţii deschise se face prin ştergere cu ajutorul unor tampoane sterile care se introduc apoi în recipiente care se închid ermetic; în cazul colecţiilor închise, recoltarea se face prin puncţionare şi aspirare cu un ac gros, după dezinfecţia prealabilă a tegumentelor cu tinctură de iod ; pe cât posibil, se procedează în aşa fel încât contactul cu oxigenul să fie cât mai redus (pentru a favoriza dezvoltarea anaerobilor).Incubarea se face obligatoriu în condiţii de aerobioză şi anaerobioză.Dacă plaga este uscată, tampoanele se umezesc în soluţie salină sterilă.

Examenul macroscopic al puroiului sau exudatelor recoltate, poate furniza uneori informaţii importante:- puroiul de etiologie streptococică are un aspect seros, este subţire;- puroiul stafilococic este gelatinos;- prezenţa bacilului pioceanic (Pseudomonas aeruginosa) dă o culoare verzui-

albăstruie;- în actinomicoză, puroiul are aspect granulos, sulfuros;

Recoltarea secreţiilor uretrale. Indicaţia cea mai frecventă este în diagnosticul uretritelor specifice (uretrita gonococică, produsă de Neisseria gonorrhoeae), şi a celor nespecifice ( chlamidiazică, bacteriene, virale, micotice, trichomoniazice).

Tehnică. La bărbat se face toaleta organelor genitale externe cu ser fiziologic steril, apoi cu ansa se prelevă secreţia de la nivelul meatului uretral.Recoltarea se face dimineaţa, înainte de urinare.

11

MEDIILE DE CULTURĂ

Majoritatea bacteriilor şi ciupercilor pot fi cultivate în laborator pe medii inerte, acelulare, iar restul microorganismelor, cum sunt bacteriile cu habitat obligatoriu intracelular (rickettsi, chlamydii) şi virusurile, pe culturi de cellule, ouă embrionate precum şi pe animale de experienţă.

Mediile de cultură asigură condiţiile necesare dezvoltării şi multiplicării bacteriilor, în vederea izolării şi identificării lor.

Aceste condiţii sunt:- să asigure substanţe nutritive necesare creşterii şi reproducerii celulei

bacteriene (apă, azot, sursă de carbon, factori de creştere, vitamine, minerale).

- să aibă un Ph corespunzător dezvoltării bacteriilor în general 7,2 – 7,4 cu excepţia brucelelor 6,8 şi a vibrionului holeric ph=9

- să asigure condiţii de aerobioză sau anaerobioză- să fie sterile şi menţinute în recipiente sterile, care să împiedice

contaminarea înainte şi după însămậnţare- să fie clare, pentru a putea permite observarea oricărei modificări apărute,

pentru a asigura studiul caracterelor culturale.

Clasificarea mediilor de cultură

Mediile de cultură se pot clasifica după mai multe criterii :1. După provenienţă :

a. naturale (cartoful, laptele)b. artificiale- simple – bulionul - agarul

- complexe – bulion+ser+ascită sau sậnge - geloză+ser+ascită sau sậnge

c. sintetice – mediu Sauton, etc.

2. După scop şi compoziţie :a. medii uzuale : bulionul şi gelozab. medii speciale sau complexe

- medii albuminoase : - mediul Loffler (ser coagulat) - mediul Dorset (cu ou) - bulionul cu adaos de ser, sậnge sau ascită ; - geloză cu adaos de ser, sậnge sau ascită ;

12

- medii de diagnostic : sunt bazate pe fermentarea unor hidraţi de carbon, care vor vira culoarea unui indicator de ph.Nu este singu-

ra metodă utilizată, de exemplu mediul Wilson Blair pentru Sal- monele conţine ca factor selectiv verdele briliant, factorul de diagnostic fiind producerea de H2S. Reacţia indicatoare este for- marea sulfitului de bismut negru cu luciu metalic.

- medii de imbogăţire - ce favorizează în mod selectiv dezvolta- rea anumitor specii bacteriene din produsul patologic cu floră aso- ciată (mediul Muller – Kauffmman).

- medii selective: sunt medii complexe ce conţin elemente care împiedică dezvoltarea unor germeni permiţând selectarea altora, uşor de recunoscut pe baza unor caractere metabolice (mediul Wilson-Blair, Istrati-Meitert, Tinsdal).

- medii speciale- sunt acele medii pe care se cultivă numai anumite bacterii ca de ex: Lövenstein Jensen pentru bacilul Koch, mediul Tinsdale pentru bacilul difteric, mediul Bordet- Gengu pentru bacilul tusei convulsive.

3 După starea fizică:a. medii lichide (bulionul, apa peptonată)b. medii solide (geloza, etc)c. semisolide (geloza 0,5%)

4. După conţinutul în oxigen molecular: a. medii aerobe

b. medii anaerobe (mediul Tarozzi şi geloza Veillon).

Prepararea mediilor uzualeMediile uzuale sau simple sunt medii artificiale pe care se dezvoltă cea mai

mare parte a germenilor patogeni. Prin medii uzuale înţelegem bulionul şi geloza.Bulionul este un decoct de carne la care se adaugă peptonă şi clorură de

sodiu.Decoctul de carne se prepară din carne slabă de vită sau de cal care se

curăţă de oase, tendoane, aponevroze grăsime, se toacă la maşină, iar la 1 kg se adaugă 2000 ml apă de la robinet. Se lasă la macerat la rece 24h. În acest interval se realizează autoliza ţesuturilor şi solubilizarea produselor de autoliză în apă. Se fierbe apoi 30' , pentru a accentua dizolvarea substanţelor solubile şi a coagula albuminele nehidrolizate, apoi se filtrează prin tifon dublu sau hârtie de filtru. Decoctul de carne astfel obţinut se repartizează în baloane închise cu dopuri de vată şi se sterilizează la autoclav.

13

Preparaea bulionului propriu-zis : la 1000 ml zeamă de carne se adaugă 5 g NaCl şi 10 g peptonă. Se fierbe în continuare până la solubilizarea completă apoi se face corecţia ph-ului. Se sterlizează din nou la autoclav.

Peptonele menţionate sunt amestecuri de substanţe care se obţin prin hidroliza enzimatică sau acidă a proteinelor de origine animală. Prin conţinutul de peptide şi aminoacizi constituie o sursă de azot pentru bacteriile cultivabile. Prepararea peptonelor tehnic vorbind constituie patente de firmă.

Geloza simplă se prepară din bulion la care se adaugă agar-agar.Agar-agarul este un gel extras dintr-o algă marină roşie. Din puct de vedere

chimic este un polimer al unui ester sulfuric al galactozei. După purificare este inodor, incolor, fără gust, şi netoxic pentru microorganisme. Este insolubil în apă rece, dar solubil în apă la temperatura de fierbere. După răcire produce gelifierea mediului în concentraţie de 0,5- 1%. Agarul nu are valoare nutritivă.

Cultivarea bacteriilor pe medii solide a constituit un pas hotărâtor în dezvoltarea microbiologiei în general şi a diagnosticului bacteriologic în special. Marele avantaj constă în faptul ca microbii nu se dezvoltă în amestec ci în colonii izolate, putând rezulta în final culturi ,, pure “bacteriene.

Mediile îmbogaţite sunt medii care au un aport nutritiv îmbogăţit prin adăugarea de sânge, ascită, ser, zaharuri.

Cel mai utilizat mediu de cultură îmbogăţit este geloza sânge 10% care se prepară prin adăugarea a 10 ml sânge la agarul topit şi răcit la 45°C. La noi în ţară se foloseşte sângele de oaie. Pe acest mediu se observă dacă bacteriile au sau nu activitate hemolitică.

În prezent mediile de cultură de bază, precum şi reactivii suplimentari care se adaugă, sunt produse de firme specializate, existând o adevărată industrie producătoare de medii. La noi în ţară mediile sunt preparate de institutul Dr. I. Cantacuzino, iar pe plan internaţional, amintim : DIFCO (SUA), Merk (Germania), Unipath (Anglia), Biomerieux , Sanofi în Franţa, etc.

14

IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA BACTERIILORDIN PRODUSELE PATOLOGICE

Microbiologia clinică are rolul de a preciza:- etiologia unei infecţii- stabilirea chimioterapicului cel mai performant- depistarea purtătorilor sănătoşi de germeni patogeni.

Metodele de laborator pentru diagnosticul infecţiilor sunt directe şi indirecte.Metodele directe constituie de fapt diagnosticul bacteriologic sau

virusologic şi constau în :- evidenţierea directă prin microscopie- evidenţierea antigenelor microbiene prin reacţii imunoenzimatice,

imunofluorescenţă, reacţii de precipitare ;- tehnici de izolare şi identificare a microbului infectat.

Metode indirecte urmăresc răspunsul immmmun umoral şi celular la antigenele microbului (dg serologic şi imunologic).

ETAPELE IDENTIFICĂRII BACTERIILOR :1. Recoltarea şi transportul. Recoltarea este unul din punctele de

întâlnire dintre laboratorul de microbiologie şi clinică. Dacă recoltarea nu este corectă nici o tehnică de laborator nu va putea îndepărta această eroare. De aceea trebuie să se cunoască : - care este produsul patologic în care se pot găsi bacteriile ; - momentul optim de recoltare ; - dacă proba este sterilă sau conţine floră normală ; - procedeul cel mai corect de recoltare ; - cantitatea necesară pentru fiecare probă ; - cum trebuie ambalat acel produs pentru a-l feri de contaminare - procedeele de conservare

(se studiază recoltarea produselor patologice : secreţia nazală, farin- giană, sputa, sângele, puroiul, materiile fecale, urina, secreţia uretrală, secreţia vaginală, secreţia cervicală, LCR).

2. Examenul direct: - macroscopic

- microscopic - nativ - frotiu (din cultură sau din produs patologic)

15

3. Însămânţarea pe medii de cultură4. Identificarea culturilor5. Antibiograma.Examenul macroscopic este foarte important atât pentru diagnosticul în

sine cât şi pentru alegerea mediului de cultură cel mai corespunzător izolării bacteriilor.

În produse patologice ca :Sputa se va urmări aspectul acesteia – o spută ruginie îndreptând atenţia

spre o infecţie pneumococică ; una verzuie spre b.piocianic; aspectul cremos spre stafilococ, o spută numulară spre TBC. Mirosul fetid îndreaptă atenţia spre cercetarea germenilor anaerobi.

Puroiul – puroiul cremos – stafilococ - seros - streptococ - verde - piocianic - gronjos - actinomicoză - cazeos - TBCUrina – prezenţa de filamente atrage atenţia spre o infecţie gonococică.Lichidul cefalo- rahidian purulent atrage atenţia spre etilogie

meningococică sau cu alţi germeni piogeni, pe când un lichid clar spre TBC sau etiologie virotică.

Materiile fecale cu mucus şi sânge, îndreaptă investigaţiile spre dizenteria bacteriană, fecale lichide cu grunji riziformi spre holeră.

Examenul microscopic direct sau prin frotiuri colorate A efectua un frotiu înseamnă a etala pe o lamă de sticlă o porţiune mică

în strat subţire din produsul patologic sau dintr-o cultură bacteriană.Timpii efectuării unui frotiu :- etalarea pe lamă- uscarea- fixarea- colorareaStudiul frotiului nu furnizează date în legătură cu :- morfologia bacteriilor (coci, bacili, spirili)- dispoziţia lor (în ciorchine, în lanţ, în diplo)- relaţia lor cu celelalte celule existente pe frotiu (intra- sau

extracelular)- dacă există o singură specie sau mai multe- dacă produsul este paucibacilar sau bogat în bacterii.Tehnica efectuării unui frotiu :Materiale necesare : PP sau cultură bacteriană, lame de sticlă curate

şi degresate, pipete Pasteur sau anse bacteriologice, flacără, coloranţi, microscop, oleu de cedru.

16

În cazul PP lichide se trece de câteva ori prin flacără vârful unei pipete Pasteur se deschide flaconul cu PP se flambează gura acetuia, se va absorbi o cantitate mică în pipetă. Se închide recipientul flambând din nou gura acestuia. Se depune o picătură din PP pe mijlocul unei lame de sticlă şi se întinde cu vârful pipetei. Pipeta se depune într-un recipient cu dezinfectant, iar frotiul se lasă la uscat.

Din culturile de mediu solid se fac frotiurile depunându-se în prealabil pe lamă o picătură de ser fiziologic steril în care se va emulsiona o cantitate mică de cultură luată cu ansa.

Fixarea este necesară pentru a face ca produsul să adere de lamă, să omoare bacteriile, şi să înlesnească absorbţia colorantului, pe suprafaţa acestora. În acest scop se trece lama de 3-4 ori prin flacără încalzind-o pe faţa opusă frotiului.

O fixare prea insistentă degradează germenii, iar fixarea insuficientă are ca urmare spălarea produsului de pe lamă în timpul colorării.

Fixarea se poate face şi cu substanţe chimice (sol May Grunwald, alcool metilic).

Colorarea frotiurilor:Coloraţiile pot fi simple când se utilizează un singur colorant, şi

combinate când acţionează doi sau mai mulţi coloranţi.Colorarea se realizează datorită unor procese fizice şi chimice care

depind atât de compoziţia chimică a celulei bacteriene cât şi de structura colorantului. Nucleo- proteinele din citoplasma celulară măresc afinitatea pentru coloranţi bazici. De aceea se folosesc coloranţi bazici din grupa anilinei.

Coloraţia simplă cu albastru de metilen. Se acoperă frotiul fixat cu colorantul, şi se ţine 1-2 minute. Se spală cu apă , se usucă şi se examinează la microscop.

La examenul microscopic fondul preparatului apare colorat în albastru deschis, iar bacteriile în albastru închis.

Coloraţia combinatăMetoda Gram – se acoperă frotiul fixat cu sol violet de genţiană sau

cristal violet – 1 min.- se spală cu lugol şi se acoperă cu lugol 2 minute- se îndepărtează lugolul şi se decolorează câteva secunde cu alcool-

acetonă- se spală cu apă- se acoperă lama cu sol de fuxină fenicată diluată 1 /10- se spală cu apă- se usucă şi se examinează la microscop

17

Metoda Gram permite clasificarea bacteriilor în două mari categorii : Gram pozitive şi Gram negative. Bacteriile Gram positive apar colorate în violet închis, cele Gram negative în roşu.

Explicaţia diferenţierii bacteriilor în Gram positive şi negative este legată de cantităţiile de lipoizi din membrana celulară. Bacteriile Gram negative având o cantitate mai mare de lipoizi se dizolvă după tratarea cu alcool-acetonă pierzând colorantul.

Coloraţia Gram se utilizează pentru studiul majorităţii bacteriilor.

18

IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA BACTERIILOR DIN PRODUSELE PATOLOGICE

PARTEA A-II.A

După examinarea frotiurilor din produsele patologice, etapa următoare în diagnosticul bacteriologic este izolarea bacteriilor în culture pure. În acest scop produsele patologice se însămânţează pe medii de cultură apreciate ca favorabile pentru speciile pe care le suspectăm a fi agenţi patogeni.

Sunt obligatorii condiţiile de asepsie – boxe, camere sterilizate cu ultra violete pentru a evita contaminarea cu microflora aerului ambiant.

Însămânţarea se poate efectua direct pe medii favorabile sau pe medii îmbogăţite (medii care prin substratul ce îl conţin inhibă dezvoltarea selectivă a unor germeni, dar permite înmulţirea bacteriilor pe care urmărim să le izolăm). De obicei mediile de îmbogăţire sunt lichide.

În mod curent din produsul patologic se ia un mic fracment cu ansa sterilizată, se depune pe peretele eprubetei în apropierea nivelului de lichid, se spală peretele cu mediu de cultură prin înclinarea eprubetei. Se flambează gura eprubetei atât la închidere cât şi la deschidere. Tuburile se notează şi se introduc la termostat la 37°C timp de 12- 18h. Când produsul patologic este recoltat cu tampon, acesta se cufundă în mediul lichid.

Prin aceste metode se urmăreşte să se obţină izolarea bacteriilor în colonii individualizate şi aprecierea existenţei unei singure specii bacteriene în produsul patologic sau a mai multora. În acest din urmă caz vor fi analizate numai cele aparţinând speciilor patogene.

Tehnici de obţinere a coloniilor izolate:

Tehnica diseminării produsului patologic pe medii solideSe flambează ansa, se încarcă cu produsul patologic, se descarcă în

striuri dense, continuându-se ,,epuizarea“ pe suprafaţa unui alt mediu sau sector.Epuizarea se poate efectua pe geloză înclinată, descărcând ansa succesiv

pe suprafaţa a 5-8 tuburi sau pe suprafaţa mediului turnat în 2 plăci Petri. În cazul produsului patologic recoltat cu tampon faringian se descarcă

pe o arie triunghiulară a mediului turnat şi cu o baghetă de sticlă în formă de L se face diseminarea, printr-o mişcare de rotaţie pe suprafaţa mediului.

După incubaţie de 20- 24h la 37ºC se va observa o creştere confluentă în zona în care s-a început însămânţarea şi cu cât este distanţa mai mare de această zonă voe fi colonii izolate, bine individualizate.

19

Tehnica diluţiilor succesive în medii lichide Se pregătesc pe un stativ 6-10 eprubete cu mediu de cultură lichid. În

primul tub se însămânţează produsul patologic cu ansa sau pipeta Pasteur. Se trece o picătură în tubul 2, se omogenizează prin barbotare, apoi se trece o picăturăîn tubul 3 şi se continuă astfel până la ultimul tub.

Se introduc la termostat la 37ºC pentru 20h. În ultimele tuburi se va găsi câte o simgură specie bacteriană, cea care a fost cantitativ mai bogată.

Tehnica combinată a diluţiilor în mediu lichid şi diseminarea pe mediu solid

Tehnica este similară cu cea a diluţiilor succesive doar că din ultimul tub se pune o picătură pe suptafaţa unui mediu turnat în cutie Petri şi se diseminează cu ansa.

Izolarea prin mijloace biologice

Bacteriile pot fi izolate şi chiar identificate prin inlocularea produselor patologice la animale de laborator. Animalele fac o boală cu manifestări tipice pentru o bacterie dată şi din umorile sau ţesuturile acestora se poate izola agetul patogen.

20

ANTIBIOGRAMA

Antibiograma constă în determinarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice.

Majoritatea moleculelor de antibiotice au fost grupate pe baza structurii lor chimice

în familii de antibiotice; pe lângă acestea, mai există grupe mai mici, sau chiar molecule

izolate. Principalele mecanisme de acţiune prin care antibioticele reuşesc să omoare

bacteriile - efect bactericid -, sau cel puţin să împiedice multiplicarea lor, - efect

bacteriostatic -, sunt:

- inhibarea sintezei peretelui celular;

- împiedicarea sintezei proteice pe ribosomi;

- acţiune asupra acizilor nucleici;

- inhibarea sintezei acidului folic;

- distrugerea membranei citoplasmatice;

Clasificarea antibioticelor după modul de acţiune asupra bacteriilor:

A. Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular:

I. BETA- LACTAMICE:

1. Penicilinele ( cu administrare orală, injectabilă, cu acţiune retard, cu

spectru îngust sau larg de acţiune, sau rezistente la penicilinazele

stafilococice), cum sunt Penicilinele V, G, Meticilina, Oxacilina,

Ampicilina, Amoxicilina, etc.

2. Cefalosporinele ( de mai multe generaţii).

3. Monobactami : Aztreonam.

4. Carbapenemi : Imipenem.

5. Inhibitori de beta–lactamaze: acidul clavulanic, sulbactam şi

tazobactam, în diferite combinaţii, de exemplu: Augmentin

(Ampicilină + Acid clavulanic), Amoxiclav (Amoxicilina + Acid

clavulanic).

II. GLICOPEPTIDE : Vancomicina;

III. FOSFOMICINA, antibiotic neîncadrat în familie,utilizat în asociere

IV. CICLOSERINA

V. BACITRACINA

21

B. Antibiotice care împiedică sinteza proteinelor pe ribozomi:

1. Aminociclitoli / Aminoglicozide: Streptomicina, Gentamicina,

Kanamicina, Neomicina;

2. Tetracicline : Tetraciclina, Doxiciclina ;

3. Fenicoli: Cloramfenicol;

4. Macrolide: Eritromicina, Lincomicina, etc;

5. Acidul fusidic;

C. Antibiotice cu acţiune pe acizii nucleici:

- asupra sintezei ADN :

1. Quinolone: Acidul nalidixic (Negram), Fluoroqinolone: Ciprofloxacin,

Ofloxacin, etc.

2. Nitrofurani : Nitrofuran ( Furazolidon);

3. Nitroimidazoli : Metronidazol, Tinidazol;

- asupra sintezei ARN:

4. Rifamicine : Rifampicina ( Sinerdol) ;

D. Antibiotice care inhibă sinteza acidului folic:

1. Sulfonamidele ( Sulfametoxazol, Sulfatiazol, Sulfatiazina, etc.);

2. Diaminopirimidine:Trimetoprim, Sulfametoxazol + Trimetoprim

( Biseptol );

3. Sulfone : antibiotic de excepţie, antilepromatos ( Dapsona);

4. Acid paraaminosalicilic PAS;

E. Antibiotice cu acţiune pe membrana citoplasmatică:

1. Peptidele ciclice : Polimixinele ( Polimixina B, Colimicina, etc.);

2. Gramicidina;

Sensibilitatea germenilor la antibiotice se determină prin concentraţia minimă

inhibitorie (CMI) de antibiotic care în condiţii standard inhibă ( împiedică) creşterea

germenilor respectivi, şi prin concentraţia minimă bactericidă (CMB) de antibiotic care în

condiţii standard are efect bactericid.Ambele valori se exprimă în mcg /ml şi se raportează la

nivelul minim, respectiv maxim pe care îl poate realiza antibioticul respectiv în ser ( umori).

Dacă atât raportul dintre nivelul seric minim (Nsm) şi CMI sau CMB cât şi raportul

dintre nivelul seric maxim (NsMx) este supraunitar, tulpina bacteriană testată este sensibilă la

antibioticul respectiv.

22

Dacă raportul Nsm / CMI sau CMB este subunitar, iar raportul MsMx / CMI sau CMB

este supraunitar, tulpina bacteriană testată este moderat sensibilă.

Dacă ambele rapoarte sunt subunitare, tulpina testată este rezistentă.

Determinarea CMI se realizează pe culturi pure, prin mai multe metode, dintre care

mai frecvent se utilizează tehnica diluţiilor pe medii lichide şi tehnica difuzimetrică în gel.

Vom detalia în continuare, determinarea CMI prin tehnica difuzimetrică în gel:

Principiu: pe medii de cultură gelozate ( în general, mediul Mueller-Hinton) se aplică

microcomprimate de antibiotice care difuzează prin mediu, realizând concentraţii din ce în ce

mai mici. Mediul de cultură se însămânţează în striuri dense cu o cultură pură a bacteriei de

testat, se aplică antibioticele pe suprafaţa însămânţată şi se termostatează 24 de ore la 37 o C.

Bacteriile vor creşte pe suprafaţa mediului până în zona unde în momentul multiplicării lor,

antibioticele difuzate se vor afla la o concentraţie egală cu CMI. Astfel, în jurul antibioticelor

la care bacteria este sensibilă, vor apărea zone de inhibiţie de dimensiuni mai mari sau mai

mici, în funcţie de gradul de sensibilitate faţă da fiecare antibiotic.

Citirea se face cu ochiul liber, măsurând diametrul zonei de inhibiţie în mm, care se

compară cu valorile înscrise într-un tabel standardizat pentru fiecare laborator, în funcţie de

condiţiile specifice de lucru, exprimând rezultatele prin sensibil, intermediar sensibil şi

rezistent.

Metoda permite şi identificarea antibioticelor cu acţiune sinergică ( a căror asociere

este recomandată) , respectiv a celor cu acţiune antagonistă ( care nu se asociază). Dacă două

antibiotice sinergice sunt plasate pe mediul de cultură una în vecinătatea celeilalte, se constată

că zona de inhibiţie care apare între ele este mai mare, pentru că acolo au acţionat ambele

antibiotice; dimpotrivă, în cazul a două antibiotice care îşi antagonizează efectele, zona de

inhibiţie dintre ele va fi de diametru mai mic.

În prezent, unele laboratoare utilizează metoda modernă de determinare a sensibilităţii

bacteriilor la antibiotice, care este computerizată, prin sistemele Bactec, avantajele fiind

reducerea timpului de lucru şi creşterea fiabilităţii rezultatelor.

Buletinul de antibiogramă va cuprinde obligatoriu, pe lângă datele generale înscrise

în orice buletin de analiză, toate antibioticele testate ,inclusiv pe cele la care tulpina rezistentă

prezintă rezistenţă.

23

NOŢIUNI GENERALE DESPRE IMUNITATE

Imunitatea organismului uman este asigurată prin:1. Rezistenţa (imunitatea) nespecifică (naturală, constitutivă), realizată larândul ei prin:

- linia I de apărare, reprezentată de piele şi mucoase, factori de apărare la poarta de intrare;

- linia a-II-a, reprezentată prin factorii tisulari: - celulari - polimorfonuclearle şi sistemul fagocitar mononuclear SFM;

- umorali - de natură proteică;2. Rezistenţa specifică (dobândită ):

- spontan - pasiv, transplacentar şi - activ, prin boală

- artificial – pasiv, prin administrarea de seruri imune ( care conţin anticorpi specifici); - activ, prin vaccinări

Reacţiile serologice sunt utilizate în diagnosticul de laborator indirect, serologic sau imunologic al unor boli infecţioase şi constau în detectarea anticorpilor specifici din serul pacienţilor, produşi ca răspuns la pătrunderea unui antigen ( bacterii, virusuri,etc.) în organism. Aceste determinări pot fi calitative, sau cantitative, exprimate prin titruri de anticorpi.În prezent, ne stau la dispoziţie mai multe tipuri de teste, folosite în funcţie de specificul necesităţilor de diagnostic, precum şi de dotarea laboratorului respectiv:

1. Precipitare.2. Aglutinare.3. Reacţia de fixare a complementului RFC.4. Fluorescenţă.5. Marcarea cu radio- izotopi ( RIA Radioimmunoassays)6. Măsurarea activităţii enzimatice ( ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-

Assays)

Noţiuni generale despre anticorpi .

Anticorpii sunt imunoglobuline care mediază imunitatea umorală; ei pot fi detectaţi prin electroforeză ELFO , unde migrează cu fracţiunea , , şi cea mai mare parte cu - globulinele serice.

Structura anticorpilor este asemănătoare literei Y, fiind constituiţi din 2 lanţuri grele H ( heavy) şi 2 lanţuri uşoare L ( light), unite între ele prin punţi disulfidice S - S; în microscopia electronică se vede că fiecare moleculă de anticorp este formată din 2 fragmente Fab ( antigen- binding = care leagă antigenele ), de unde rezultă bivalenţa anticorpilor, care sunt capabili să fixeze câte 2 molecule de antigene.Experimental, prin digestia enzimatică cu papaină a unei molecule de Ig G , de exemplu, se obţin 2 fragmente Fab şi 1 fragment Fc

( cristalizabil).Fab determină specificitatea anticorpilor, prin cei 107 aminoacizi terminali situaţi

pe lanţurile H cât şi pe cele L; acest segment este denumit regiune variabilă (variabilitatea aminoacizilor din această regiune determină specificitatea anticorpilor); restul din Fab şi Fc

este regiunea constantă ( CH şiCL).Clasele de imunoglobuline IgM, IgA, IgG, IgD, şi IgD sunt determinate de tipul

lanţului greu din imunoglobulina respectivă.

24

ANTIGENELE

Orice substanţă capabilă să producă în organismul gazdă un răspuns imun şi să reacţioneze specific cu celulele mediatoare sau moleculele rezultate, este un antigen.

Anticorpii Ac produşi de limfocitele B ( LB) sensibilizate, reacţionează numai cu porţiuni foarte mici din antigen Ag, numite epitopi, iar restul moleculei se numeşte carrier. Epitopii determină specificitatea Ag. Molecula carrier, numită şi antigen parţial, determină antigenicitatea, dar nu poate reacţiona specific cu anticorpii; ea stimulează limfocitele T ( LT) sensibilizate de macrofage.Haptena sau Ag incomplet, constă din epitopi separaţi de molecula carrier, poate reacţiona specific cu Ac, dar nu induc un răspuns imun.

AGLUTINAREA

Aglutinarea constă în aglomerarea în grămezi a celulelor bacteriene dintr-o suspensie iniţial omogenă, sub influenţa anticorpilor specifici.

După aspect, aglutinarea poate fi:- de tip H, sau flagelară, determinată de antigene situate pe flagelii celulei bacteriene;

este o aglutinare în grămezi mari, asemănători „fulgilor de zăpadă”, laxă, şi care se desface uşor prin agitare.

- De tip S, sau somatică, cu antigene situate pe peretele bacterian, este fină, granulară, omogenă şi nu se desface prin agitarea tubului.

Reacţia de aglutinare prezintă 2 caracteristici:- sensibilitate, adică reacţia se produce şi dacă serul care conţine anticorpii este diluat

foarte mult; diluţia cea mai mare de ser la care reacţia încă se mai produce, se numeşte titrul serului aglutinant.

- specificitate, adică Ag reacţionează întotdeauna cu Ac specifici.Aplicaţiile reacţiei de aglutinare:- reacţii de sero-diagnostic, în care se evidenţiază şi titrează Ac din serul bolnavilor

folosind ca Ag diferite bacterii (agenţii etiologici ai b0lii pe care dorim s-o diagnosticăm).- identificarea unor bacterii, folosind seruri aglutinante, care conţin Ac specifici.

Reacţiile de aglutinare pot fi efectuate pe lamă (calitativ), sau în tuburi( cantitativ).Un exemplu de aplicaţie a acestor reacţii sunt unele boli febrile, cu debut şi evoluţie

până la un moment dat asemănătoare, în care diferenţierea se face tocmai pe baza unor reacţii de aglutinare; este cazul febrelor tifoide şi paratifoide (Salmonella typhi şi paratyphi A,B, C), tifosul exantematic (Ricketssioză), bruceloză (Brucella), tularemie (Francisella).În toate aceste infecţii, titrul anticorpilor este variabil, în funcţie de faza evolutivă a bolii, sau dacă persoana a fost vaccinată în antecedente sau nu. În general se efectuează două determinări, la interval de 7-10 zile, o creştere de 4 ori a titrului anticorpilor la a doua determinare, fiind considerată semnificativă pentru diagnosticul de boală.

În febra tifoidă şi febrele paratifoide se practică reacţia Widal, cantitativă, în tuburi, în care se pun în contact diluţii succesive ale serului de bolnav (Ac) cu o cultură vie de bacili tifici şi paratifici A şi B, forme flagelate (Ag).În cazul în care serul bolnavilor conţine anticorpi aglutinanţi antitifici, suspensia bacteriană va fi aglutinată.

25

În bruceloză, se pot efectua reacţiile de aglutinare în tuburi, după procedeul Wright, sau pe lamă, Huddleson. În reacţia Wright se pune în contact serul bolnavilor cu o cultură formolizată de brucele (antigen Wright).Se realizează diluţii succesive ale serului în tuburi, şi reacţia este considerată pozitivă, dacă după 24 de ore la 37oC şi o oră la temperatura camerei, după agitarea tuburilor, depozitul rezultat se desface în grunji fini.Reacţia este negativă dacă lichidul din tuburi rămâne tulbure.În reacţia Huddleson, se foloseşte o suspensie fenolată de brucele ca antigen, care se pun în contact cu serul de cercetat, pe lamă, iar interpretarea rezultatelor este calitativă.

În tifosul exantematic, produs de Rickettsia Prowazecki se practică reacţia Weil-Felix, în care se pun în contact diluţii succesive ale serului de bolnav cu antigenele standardizate, nericketsiene, reprezentate de o suspensie de bacil Proteus OX 19.Reacţia Kudicke-Steuer este un procedeu rapid, de diagnostic orientativ, efectuat în marile epidemii, cînd este necesară examinarea unui număr foarte mare de probe;se efectuează pe lamă, folosind o picătură de sânge periferic cu o picătură de antigen Proteus.Reacţia este pozitivă când pe lamă apare aglutinarea.

Datele de mai sus sunt prezentate sintetic in tabelul de mai jos: Numele reacţiei serologice

Tipul reacţiei

Boala Agentul etiologic Antigenul folosit

Widal Aglutinare cantitativă

Febrele tifoide şi paratifoide

Salmonella typhi şi paratyphi A, B, C

Bacili tifici şi paratifici, forme flagelate

Wright Aglutinare cantitativă

bruceloză Brucella Cultură formolizată de Brucella( atg. Wright)

Huddleson Aglutinare calitativă

bruceloză Brucella Suspensie fenolată de Brucella

Weil - Felix Aglutinare cantitativă

Tifos exantematic

Rickettsia prowazecki

Antigene nerickettsiene: cultură de proteus OX19

Kudicke- Steuer

Aglutinare calitativă

Tifos exantematic

Rickettsia prowazecki

Proteus OX 19

26

REACŢIA DE PRECIPITARE

În testele de precipitare are loc o reacţie între antigene solubile şi anticorpii specifici acestora; la locul de întâlnire al celor două soluţii, rezultă un precipitat vizibil cu ochiul liber, format din complexele antigen - anticorp.Reacţia poate fi inhibată în situaţia în care unul din cele două componente se află în exces, de aceea sunt folosite teste în care difuziunea antigenelor şi a anticorpilor să se facă cât mai lent, până se atinge concentraţia optimă pentru reacţie.Zona în care se atinge această concentraţia optimă se numeşte zonă de echivalenţă, în care nu mai există antigene sau anticorpi liberi şi are loc precipitarea completă a acestora.Anticorpii care participă la reacţia de precipitare se numesc precipitine, iar antigenele, precipitinogene.Anticorpii cu eficienţă mai mare în reacţiile de precipitare aparţin claselor IgG, IgM şi IgA, în timp ce IgE şi IgD nu mediază reacţii de precipitare.

Ca mecanism de producere, precipitarea are loc datorită divalenţei anticorpilor ( structura Ig, fragmentul Fab), deci fiecare monomer are cel puţin două situsuri de legare pentru antigene; antigenele la rândul lor, au în majoritatea cazurilor mai mulţi epitopi, deci pot lega mai mulţi anticorpi.Se formează numeroase complexe antigen-anticorp, dispuse într- o reţea care precipită în soluţie. Formarea acestei reţele depinde de concentraţiile relative ale celor două componente; dacă anticorpii sunt în exces, fiecare antigen poate fi legat de mai mulţi anticorpi, astfel încât formarea reţelei este compromisă; dacă antigenele sunt în exces, anticorpii nu sunt suficienţi pentru a forma „punţi” cu antigenele.

Testele de precipitare pot fi calitative ( în mediu lichid şi gelificat), şi cantitative.Reacţia de precipitare în inel este un test în mediu lichid, în care antigenul şi

anticorpii aflaţi în soluţie, sunt puşi în contact în tuburi înguste de precipitare; în zona de echivalenţă, la interfaţa celor două lichide se formează un inel de precipitare de culoare alburie; reacţia era utilizată pentru determinarea grupelor de streptococi, după tehnica Lancefield, şi în medicina legală, pentru precizarea originii umane sau animale a unor pete de sânge ( reacţia Uhlenhuth).

Difuzia simplă în gel constă în încorporarea anticorpilor în geloză, peste care se aplică soluţia cu antigene, care vor difuza prin mediul gelificat (metoda Oudin, nu se mai utilizează în prezent)

Dubla difuzie în gel constă în introducerea ambelor componente în geloză; în metoda Oakley - Fulthorpe anticorpii sunt separaţi de antigene printr-un strat subţire de geloză; aceasta va avea ca rezultat difuziunea celor două soluţii prin geloză şi formarea unui inel de precipitare la locul de întâlnire în concentraţie optimă.Metoda Ouchterlony, folosită pentru detectarea de antigene sau anticorpi, este deosebit de utilă pentru detectarea mai multor antigene sau a mai multor anticorpi pe aceiaşi placă.Pentru aceasta se utilizează plăcuţe speciale în care în stratul de geloză se decupează mai multe godeuri, în care sunt introduse antigenele şi anticorpii; acestea vor difuza prin gel, şi la locul de întâlnire dintre antigen-anticorp specific, în concentraţie optimă se formează linii de precipitare. Reacţia are avantajul că permite identificarea unui complex antigen-anticorp dintr-un amestec de antigene şi anticorpi. Se utilizează, de exemplu pentru determinarea unor enterotoxine în cazul toxiinfecţiilor alimentare, sau pentru decelarea prezenţei anticorpilor specifici în ser, în cazul unor infecţii bacteriene( diagnostic indirect).

Teste de precipitare cantitative.Imunodifuzia radială este folosită pentru determinarea cantitativă a proteinelor serice,

a complementului, a numeroşi anticorpi, etc. În metoda Mancini anticorpii sunt încorporaţi în gel, iar antigenul introdus într-un godeu, este lăsat să difuzeze prin gel.Alte godeuri conţin diferite concentraţii ale unui antigen standard cunoscut.În jurul fiecărui godeu se va forma un

27

inel de precipitare, cu un diametru direct proporţional cu concentraţia antigenului din godeul respectiv.Metoda permite determinarea unor antigene în concentraţii de până la aproximativ 1g/ ml. Diametrele antigenelor standard sunt reprezentate grafic sub forma unei funcţii liniare, pe baza căreia se determină valorile concentraţiei antigenului necunoscut. Testul Mancini este folosit pentru determinarea concentraţiei imunoglobulinelor serice.

Imunoelectroforeza combină tehnica imunodifuziei cu electroforeza; migrarea moleculelor încărcate electric se produce în geloză sau într-o matrice lichidă de tipul acetatului de celuloză.Particolele încărcate pozitiv vor migra spre catod, iar cele negative spre anod. Rata migrării diferă de la o substanţă la alta în funcţie de încărcătura electrică.

Imunoelectroforeza se efectuează în două faze: întâi într-un godeu decupat în geloză se introduce lichidul conţinând un antigen proteic, şi seaplică în câmp electric; antigenul se va separa în componente distincte care vor migra de-a lungul unei linii paralele cu direcţia curentului aplicat. După oprirea curentului electric, va începe difuzia radială a fiecărui component; paralel cu direcţia de migrare electroforetică, se decupează un şanţ în geloză, în care se introduce antiserul ( anticorpii) specific antigenului cercetat.Anticorpii vor migra prin gel, spre antigene, astfel încât la locul de întâlnire al celor două componente, aflate în concentraţia optimă, se vor forma benzi de precipitare. Avantajul major al acestei metode este că oferă posibilitatea separării unor componente antigenice aflate în amestecuri, ceea ce electroforeza simplă nu poate realiza, în cazul unor proteine cu mobilitate electroforetică identică; se pot astfel distinge până la 39 de antigene separate dintr-un amestec.Tehnica are o largă aplicabilitate practică pentru determinarea componentelor proteice din ser, precum şi pentru detectarea unor anomalii legate de imunoglobuline.

Tehnica imunoelectrică combină imunoelectroforeza cu imunodifuzia radială (Mancini), utilizând viteza datorată electroforezei şi cuantificarea antigenului prin tehnica Mancini.Sensibilitatea metodei este foarte mare, permiţând determinarea unor concentraţii antigenice de numai 0,5 g/ ml şi este utilizată pentru detectarea a diferiţi antigeni plasmatici, chiar şi virali.

Contraimunoelectroforeza este o tehnică care permite identificarea de antigene şi/ sau anticorpi necunoscuţi care sunt „forţaţi” să migreze în câmp electric unul spre celălalt. Plasaţi la polii opuşi ai cîmpului electric, antigenele şi anticorpii au încărcătură electrică diferită, aşa încît sub acţiunea curentului electric ei vor migra spre polul electric opus, adică unul spre celălalt.La locul de întâlnire dintre antigene şi anticorpii specifici, aflaţi în echivalenţă, va apărea o linie de precipitare. Tehnica este folosită în laboratoare de cercetare pentru aprecierea răspunsului imun în diferite îmbolnăviri, ca şi pentru detectarea de diferite antigene bacteriene sau tisulare, anticorpi ( într-o oră), sau pentru identificarea unor bacterii din mediile de cultură, după o incubaţie scurtă. Este utilizată curent în diagnosticul hepatitelor virale de tip B.

28

REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

Reacţia de fixare a complementului ( RFC ) se bazează pe capacitatea unor anticorpi serici din clasele Ig M şi IgG de a fixa (lega) complementul seric, în prezenţa antigenelor specifice.Complementul seric, notat C' , reprezintă un complex de proteine serice, care pot fi fixate de anticorpii amintiţi în cursul reacţiilor imune.Antigenele care determină formarea anticorpilor fixatori de complement pot fi de natură tisulară, hormonală, enzimatică, bacteriană sau virală. R.F.C. poate detecta concentraţii foarte mici de antigen, de până la aproximativ 1 g /ml, care nu produc o reacţie vizibilă prin alte mijloace, de exemplu teste de aglutinare sau de precipitare.

Reacţia îşi găseşte o largă aplicabilitate practică în diagnosticul uno viroze, infecţii cu fungi sau bacteriene, un exemplu în acest sens fiind RFC Wassermann utilizată larg în diagnosticul serologic al sifilisului. Reacţia poate fi calitativă sau cantitativă şi se poate desfăşura în tuburi, în plăci mici de plastic pentru titrări de anticorpi, sau chiar în sisteme automatizate.

În principiu, RFC se desfăşoară în 2 etape:- în prima etapă se pun în contact antigenele cunoscute cu serul de cercetat şi

complementul, şi se lasă la termostat la 37 C , 30 de minute sau mai mult.Serul de cercetat este în prealabil incălzit la 56C, 30 de minute, pentru inactivarea complementului propriu. În aceast etapă reacţia nu este vizibilă, deoarece toate componentele sunt solubile.

- În etapa a 2-a se adaugă în reacţie hematii de oaie sensibilizate (tratate cu anticorpi anti-hematii de oaie), care în prezenţa anticorpilor din serul de cercetat şi a complementului sunt rapid lizate, ceea ce determină o reacţie vizibilă cu ochiul liber.Dacă însă în prima etapă complementul a fost consumat în reacţia dintre antigene şi anticorpii din serul de cercetat, în a doua etapă nu va mai exista complement liber, şi deci nu se mai produce hemoliza ( liza hematiilor de oaie).

Ca urmare, interpretarea rezultatelor RFC, este următoarea:- prezenţa hemolizei la sfârşitul reacţiei semnifică un rezultat negativ, deci absenţa

anticorpilor specifici în serul de cercetat- Absenţa hemolizei semnifică un rezultat pozitiv, adică existenţa anticorpilor specifici

în serul de cercetat

TESTUL E.L.I.S.A.( enzyme-linked immunosorbent assays)

Tehnica ELISA se bazează pe următoarele 2 principii:1. Proprietatea anticorpilor şi a unor antigene de a fi adsorbiţi pe suprafaţa

godeurilor plăcilor de polistiren şi în acelaşi timp de a-şi păstra întreaga capacitate imunologică.

2. Atât antigenele cât şi anticorpii pot fi legaţi de enzime şi complexul format îşi păstrează atât proprietăţile imunologice cât şi pe cele enzimatice.

29

FAMILIA MICROCOCCACEAEGENUL STAPHYLOCOCCUS

Familia Micrococcaceae cuprinde mai multe genuri, dintre care interes medical prezintă genul Staphylococcus, cu speciile principale:

- S. aureus, responsabil de majoritatea infecţiilor stafilococice la om;- S. epidermidis, mai frecvent saprofit, dar poate da infecţii cutanate, în condiţii de

scăderea rezistenţei organismului;- S. saprophyticus, rar incriminat în patologie, poate fi cauza unor cistite;

Speciile genului Staphylococcus sunt foarte răspândite, ele sunt saprofite ale tegumentelor şi mucoaselor, se găsesc în cavităţile naturale ale omului ( buco-faringe, fose nazale, tub digestiv), dar şi în mediul extern (aer, praful din încăperi, etc).

Caractere morfologice şi tinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu dimensiunile între 0,7-1,2 µm, dispuşi în grămezi de forma ciorchinilor de strugure, în perechi sau izolaţi, imobili şi necapsulaţi, aerobi şi facultativ anaerobi.

Caractere culturale: cresc pe medii uzuale cu adaos de NaCl, cum ar fi mediul Chapmann hiperclorurat; tulbură uniform mediile lichide,iar pe mediile solide dau colonii rotunde, bombate, opace, cremoase, lucioase, de 1-3 mm, cu suprafaţa netedă ( colonii tip S).

- coloniile de S. aureus produc un pigment de culoare auriu-gălbuie, care era considerat un criteriu de patogenitate.În prezent acest lucru nu mai este valabil, deoarece s-a constatat existenţa a numeroase colonii albe sau citrine patogene; pe geloza sânge, produce de obicei hemoliză.

- S. epidermidis creşte sub formă de colonii albe, rar hemolitice;- S. saprophyticus dă colonii alb- murdare, nehemolitice;

Structura antigenică este foarte complexă, principalele antigene fiind:- antigene specifice de specie , de natură polizaharidică;- antigene celulare:

o Capsula responsabilă de virulenţa S.aureus;o Proteina A , determină producerea de anticorpi specifici, are rol antifagocitar şi

în mecanismele de agresivitate ale stafilococilor;o Factorul de aglutinare;

- antigene extracelulare:o Coagulaza determină coagularea plasmei prin formarea unei substanţe

asemănătoare trombinei;deşi rămâne unul din testele de patogenitate cele mai importante pentru stafiloci, în prezent s-au identificat numeroase tulpini patogene coagulazo-negative;

o Hemolizinele, de mai multe tipuri, sunt responsabile de zona de hemoliză produsă pe gelozas sânge (clară, de tip α , respectiv tulbure, de tip β).

o Leucocidina cu acţiune citotoxică asupra neutrofilelor şi macrofagelor.o Enterotoxinele , de 5 tipuri, notate cu majuscule de la A la E, determină

toxiinfecţiile alimentare stafilococice şi enterocolite post-antibiotic.o Toxina 1 produce sindromul toxic stafilococic.o Toxina epidermolitică şi exfoliantă cu tropism cutanat, responsabilă de

sindromul „pielii opărite”.

30

o Enzime extracelulare : hialuronidaza, care favorizează penetrarea în ţesuturi, stafilokinaza, fosfolipaza, dezoxiribonucleaza, fibrinolizina, lipaze.

Puterea patogenă a stafilococilor.După mecanismul de producere, afecţiunile produse de stafilococi se clasifică în:

1. Afecţiuni invazive , caracterizate prin abcese, cu localizări la nivelul:- tegumentelor şi ţesut celular subcutanat: abcese, foliculite, furuncule, carbuncule,

hidrosadenita ( infecţia glandelor sudoripare din axilă), mastite (infecţia glandelor mamare); în toate aceste situaţii, produsul patologic este puroiul, care se recoltează prin puncţionarea zonei celei mai confluente, cu un ac gros, steril.

- sistemului osteo-articular şi fanere: osteomielite, artrite, panariţii;- seroaselor: pleurezii, artrite, sinusite. Produsul patologic este lichidul pleural, articular,

sau tot puroiul, care se recoltează prin puncţionarea cavităţilor respective;- sistemului nervos central: meningite (se recoltează lichid cefalo-rahidian LCR prin

puncţie rahidiană), abcese cerebrale;- aparatului uro-genital: cistite, septicemii post-partuum, septicemii post-abortum, alte

infecţii (metrite, salpingite, etc.).- sferei O.R.L. şi al aparatului respirator: angine, faringite (rar), otite, sinusite,

mastoidite, pneumonii şi bronhopneumonii, abcese;- aparatului cardio- vascular: endo- şi pericardite, flebite, septicemii .

2. Afecţiuni toxigenice, produse de substanţele extracelulare eliberate de stafilococii aurei:

- toxiinfecţia alimentară, determinată de enterotoxina stafilococică din alimente, care poate persista chiar dacă bacteria a fost omorâtă; produsele patologice sunt reprezentate de vomismente, materiile fecale, mostre din alimentele incriminate.Decelarea enterotoxinei se poate face prin teste de precipitare.

- toxina epidermolitică şi exfoliantă este responsabilă de sindromul exfoliativ, boala Lyell, stafilococia malignă.

- Sindromul toxico-septic stafilococic, determinat de toxina 1 a stafilococului, foarte grav, adesea cu sfârşit letal.

IMUNITATEA ANTIINFECŢIOASĂ.Apărarea celulară se realizează prin fagocităză la poarta de intrare; apărarea umorală prin anticorpi specifici în infecţiile stafilococice este de mică importanţă.DIAGNOSTICUL DE LABORATOR.- se efectuează la bolnavi şi purtătorii aparent sănătoşi şi se bazează pe izolarea şi

identificarea stafilococilor în produsele patologice recoltate, urmat obligatoriu de demonstrarea patogenităţii şi testarea sensibilităţii la antibiotice.Schematic, se parcurg următoarele etape:

- recoltarea şi transportul produselor patologice la laborator;- examenul macroscopic poate oferi unele indicaţii orientative: puroiul stafilococic este

galben-cremos, închegat;- examenul microscopic prin frotiu colorat Gram, direct din produsul patologic;- izolarea pe mediile de cultură: dacă produsul provine dintr-o colecţie închisă,

însămânţarea se poate face direct pe mediile uzuale ( bulion, geloza), pe care vor creşte coloniile caracteristice descrise anterior.Dacă puroiul provine dintr-o colecţie deschisă, deci a fost contaminat, se însămânţează de mediul Chapmann hiperclorurat, care este un mediu lichid, de îmbogăţire, de pe care se fac după 24-48 de ore, treceri pe mediile uzuale.În cazul septicemiilor, se recoltează sânge, pentru hemocultură.

- Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice ( frotiu colorat Gram efectuat din coloniile caracteristice) şi culturale şi este urmată obligatoriu de efectuarea testelor

31

de patogenitate: coagulaza, hemolizinele, fibrinolizina, catalaza, fermentarea manitei, demonstrarea toxigenezei (când este cazul).

- Antibiograma este absolut necesară, în condiţiile în care tratamentul infecţiilor stafilococice este tot mai dificil, din cauza instalării rapide a multichimiorezistenţei.Este bine cunoscută rezistenţa la penicilină, datorită secreţiei de penicilinază, caracter care se transmite prin bacteriofagi translocatori, prin transfer de ADN.

- fără a fi o regulă, în general stafilococii sunt sensibili la Oxacilină, Dicloxacilin, Vancomicină, Meticilină, cefalosporine.

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE

Streptococii sunt germeni cu o largă răspândire la om şi la animale, având un număr mare de genuri, dintre care unele patogene pentru om, altele făcând parte din flora normală a oro-faringelui sau tractului gastro-intestinal.Cele mai importante specii patogene pentru om sunt: S. pyogenes, S. pneumoniae, S.faecalis, S. agalactiae, S. viridans.

Caractere morfologice: coci Gram – pozitiv, dispuşi în lanţuri, sau în perechi, cu dimensiuni între 0,5 şi 1μm.

Caractere culturale: streptococii cresc pe medii îmbogăţite cu sânge sau ser, cu adaos de glucoză;

- pe mediile lichide, lasă mediul clar, cu depunere de grunji pe peretele eprubetei;pe geloza sânge, dau colonii mici, pulverulente, mate, de culoare cenuşiu-gri, şi înconjurate de o zonă de hemoliză foarte caracteristică anumitor tipuri:

o alfa- hemoliza este incompletă, cu o tentă verzuie, care apare mai ales la S.viridans şi la pneumococi;

o beta-hemoliza este foarte clară, fiind o hemoliză totală, caracteristică S. pyogenes;

o gamma-hemoliza nu este vizibilă cu ochiul liber.Streptococii sunt aerobi şi facultativ anaerobi, catalazo-negativi.

S. pyogenes ( β- hemolitic de grup A)

Structura antigenică este foarte complexă:- polizaharidul C, determină specificitatea de grup (R. Lancefield, 1830), grupurile

sunt notate cu majuscule, de la A la R;- antigenele proteice M, prezente numai la grupul serologic A, responsabile de

virulenţa acestora, au acţiune antifagocitară, inhibă migrarea leucocitară, este puternic imunogenă.Pe baza acestui antigen, streptococii de grup A sunt împărţiţi în tipuri ( în jur de 80 de tipuri).

- Antigenele proteice T, fără rol în virulenţă, cu importanţă epidemiologică;- Antigene R cu rol biologic incomplet elucidat;

- Antigene extracelulare:o Streptolizina „O” (SLO), sintetizată de streptococii de grup A,C, şi G,

deosebit de importantă, cu efect cardiotoxic, leucotoxic şi letal.Determină producerea în organism a anticorpilor specifici anti-streptolizină „O”, numiţi ASLO , al căror titru ridicat chiar de la începutul complicaţiilor reumatismale şi renale sunt considerate ca având un rol important în patogenia lor; complexele SLO-ASLO pot precipita în ţesuturi, dând fenomenul Arthus, sau

32

se depun în membrana glomerulară şi/ sau sinovială şi împreună cu complementul sunt responsabile de leziunile ce apar la acest nivel.

o Streptolizina „S” determină β-hemoliza pe mediile de cultură, nu este antigenică;

o Toxina eritrogenă Dick responsabilă de erupţia (rush) din scarlatină, este piretogenă;

o Streptokinaza cu acţiune fibrinolitică;o Proteinaza determină leziuni ale miocardului şi ale musculaturii scheletice;o Hialuronidaza favorizează penetrarea ţesuturilor.

Puterea patogenă.1. infecţii streptococice primare: - scarlatina , este o febră eruptivă, dată de toxina eritrogenă, poarta de intrare pentru

streptococ fiind faringele;- faringite, angine- sunt cele mai frecvente infecţii streptococice;- infecţii cutanate, de tip impetigo, intertrigo, erizipel, plăgi infectate;- infecţii genitale: febra puerperală, endometrite, etc.- infecţii urinare;

2. complicaţii poststreptococice precoce, supurative: limfadenită cervicală, otită medie, sinusită, mastoidită, abcese peritonsilare, meningite, pneumonii, bronhopneumonii, endocardite severe.

3. complicaţii poststreptococice tardive, nesupurativea. glomerulonefrita acută GNA- prin depunerea complexelor antigen- anticorp la nivelul

membranei bazale glomerulare;b. reumatismul articular acut RAA- prin mecanism de reacţie încrucişată între anticorpii

antistreptococici şi fibrele striate ale miocardului (datorită „asemănării” la nivel molecular a structurii antigenice).

c. cardita reumatismală;d. coreea;e. eritemul nodos;f. purpura reumatoidă;

Imunitatea antiinfecţioasă este în special umorală, prin anticorpii antiproteină M şi ASLO, care apar după 7-8 zile de la debutul infecţiei acute şi ating un titru maxim la 3-4 săptămâni.Deşi valorile variază în funcţie de metoda folosită pentru titrare, în principiu, titruri de sub 200 unităţi ASLO/ml semnifică vindecare, în timp ce valori crescute care se menţin în timp, însoţesc instalarea complicaţiilor poststreptococice. - apărarea celulară este puţin importantă. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR se poate face direct prin izolarea şi identificarea streptococilor în produsele patologice sau indirect, prin determinarea titrului de anticorpi ASLO, în dinamică. Diagnosticul direct (bacteriologic) parcurge schematic următoarele etape:

- prelevarea produsului patologic şi efectuarea unui frotiu colorat Gram;- izolarea pe medii de cultură cu adaos de glucoză; ( mediul special Pike pentru

streptococi ), în cazul septicemiilor se face hemocultura;- identificarea se realizează pe baza mai multor caractere: morfologice şi culturale,

sensibilitatea la bacitracină, reacţii de coaglutinare cu teste „streptic”. Diagnosticul indirect ( serologic) se bazează pe determinarea titrului de anticorpi ASLO în serul bolnavilor.Reacţia este de tip cantitativ, folosind diluţii succesive de ser peste care

33

se introduc cantităţi fixe de streptolizină O. Titrul serului este dat de tubul cu diluţia cea mai mare în care reacţia de neutralizare dintre SLO şi ASLO încă se mai produce.

Antibiograma de regulă nu este necesară, streptococii fiind în prezent încă sensibili la Penicilină.

Streptococcus pneumoniae

Este un germen condiţionat patogen, cu habitat normal în căile respiratorii superioare ale omului, determinînd îmbolnăviri în condiţii de scăderea rezistenţei organismului (favorizată de infecţii respiratorii virale, alcoolism, diabet, subnutriţie, obezitate, infecţii cronice, boli consumptive, SIDA).

Caractere morfologice: coci Gram pozitivi, dispuşi câte doi, cap la cap, în „flacără de lumânare”, încapsulaţi (pe frotiul Gram, capsula apare sub forma unei zone clare în jurul bacteriei).

Caractere culturale: pneumococii cresc pe medii cu adaos de ser sau sânge şi glucoză; (mediu special Truche).

- tulbură uniform mediile lichide;- pe geloza sânge, apar colonii în „picătură de rouă”, translucide, cu o zonă de hemoliză

verzuie în jur. Îmbolnăvirile mai frecvente sunt infecţii ale aparatului respirator (pneumonia francă lobară acută, bronhopneumonii), infecţii ORL, ale seroaselor (pleurezii, peritonite primare), şi cutanate, de tipul abceselor.

Structura antigenică şi factorii de patogenitate sunt reprezentaţi de:- antigene somatice comune genului;- antigene capsulare, de natură plizaharidică, specifice tipului, şi care sunt responsabile

de virulenţa pneumococilor;- alţi factori de patogenitate: hemolizina, hialuronidaza;

Diagnosticul de laborator este direct, şi constă în izolarea şi identificarea pneumococilor din produsele patologice;

- examenul macroscopic al sputei poate fi foarte sugestiv, când este de culoare ruginie şi are un aspect „aerat”;

- pentru identificare, în afara caracterelor morfologice şi culturale, se folosesc teste specifice: sensibilitatea la optochină, biloliza, fermentarea inulinei;

- identificarea de tip se face pe baza antigenului capsular, printr-o reacţie de aglutinare pe lamă, cu seruri specifice de tip, reacţie cunoscută şi sub numele de „umflare a capsulei”. Antibiograma confirmă în general sensibilitatea la peniciline.

34

FAMILIA NEISSERIACEAE GENUL NEISSERIA

Genul Neisseria cuprinde coci Gram negativi, strict aerobi, dispuşi in diplo, reniformi, ca boabele de cafea aşezate faţă în faţă, de obicei intracelulari, în citoplasma polimorfonuclearelor; pot prezenta capsulă, sunt imobili şi nesporulaţi.În cadrul familiei sunt descrise numeroase specii comensale, care fac parte din flora oportunistă a organismului uman, şi două specii patogene specific umane: Neisseria meningitidis (meningococul) şi Neisseria gonorrhoeae (gonococul).

N. meningitidis Meningococul are habitatul în căile respiratorii superioare ale omului, aşa încât el

poate fi izolat din rino-faringele purtătorilor „sănătoşi”, sau al bolnavilor de rino-faringită manifestă.În condiţii de scădere a rezistenţei organismului, specii virulente traversează mucoasa faringiană şi pe cale sanguină ajung la nivelul meningelor, determinând în principal următoarele două manifestări clinice:- meningita cerebro-spinală acută epidemică;- septicemia meningococică ce evoluează adesea cu şoc endotoxinic, sau se complică cu o formă de meningită deosebit de gravă, cu evoluţie fulminantă şi de obicei sfârşit letal, numită meningita Waterhouse-Friedrichsen.

În afara acestor forme clinice grave, meningococul mai poate fi incriminat în infecţii rino-faringiene acute, infecţii bronho-pulmonare, otite, sinusite, conjunctivite, mai rar pericardite.

Structura antigenică este reprezentată de :- antigene poliozidice care dau specificitatea de grup;- proteina majoră parietală, responsabilă de specificitatea de tip;- lipopolizaharidul LPS, care este o endotoxină cu acţiune letală dacă este injectată intravenos, şi dermonecrotică, în injecţii intradermice.

Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea meningococilor din produsele patologice;- se recoltează LCR sau sânge, din care se întind frotiuri colorate Gram, prin care se

evidenţiază caracterele morfologice specifice genului.Aspectul macroscopic al LCR poate fi sugestiv pentru o meningită bacteriană ( tulbure, hipertensiv, spre deosebire de meningitele virale şi de etiologie tuberculoasă, în care LCR este clar, limpede).

- însămânţarea se face pe medii speciale în atmosferă de CO2 şi pe geloză- sânge,( colonii de tip S ).

- identificarea se continuă până la identificarea de tip, prin reacţii biochimice ( oxidază, fermentarea unor zaharuri, etc), şi / sau reacţii serologice.

Foarte important: LCR trebuie trimis şi prelucrat la laborator în primele patru ore de la recoltare, deoarece meningococii sunt foarte sensibili şi în mediul extern se autolizează.Transportul se realizează în termostat, la 37o C.

Antibiograma se efectuează cât mai repede posibil, dată fiind gravitatea în general ridicată a infecţiilor meningococice.

Neisseria gonorrhoeae (gonococul)Gonococul este agentul patogen al gonoreii, boală cu transmitere sexuală, cu

importanţă deosebită în patologia umană.Evoluează sub o formă acută, care netratată, sau tratată incorect se cronicizează, dând complicaţii locale şi la distanţă.

35

La bărabaţi, se manifestă sub formă de uretrită gonococică, al cărei principal semn clinic este secreţia uretrală, mai pronunţată dimineaţa.Evoluează în timp spre epididimită, prostatită sau orhită.

La femei, semnele clinice sunt uneori mai discrete, dar niciodată nu lipsesc complet.Evoluează sub formă de vaginită, metrită salpingite, anexite.Complicaţiile posibile sunt sterilitatea secundară şi sarcinile ectopice. Infecţia gonococică a mamei se transmite fătului, care se va naşte cu oftalmie gonococică, ce poate determina orbirea nou-născutului.În mod profilactic, în maternităţi, se instilează tuturor nou- născuţilor o picătură de nitrat de argint 1/ 00 în sacul conjunctival.

Forme clinice maI rare de infecţie gonococică, apar cînd gonococii traversează bariera epitelială şi prin curentul sanguin ajung în membranele sinoviale ale articulaţiilor determinând artrite, sau ajung în diferite organe, determinând abcese.

Structura antigenică este reprezentată de :- un antigen capsular, cu efect antifagocitar- antigene proteice, care determină specificitatea de tip;- lipopolizaharidul;- lactamaza, care determină rezistenţa la peniciline.

Diagnosticul de laborator.a. în uretrita gonococică acută , în general este suficientă examinarea frotiurilor

efectuate direct din secreţia uretrală.Recoltarea secreţiilor trebuie făcută de un personal calificat, şi este bine ca prelucrarea să se facă cât mai repede.Este indicat ca recoltarea să aibă loc chiar în laborator (gonococii sunt foarte sensibili în mediul extern); la bărbaţi se recoltează „ picătura matinală”, iar la femei secreţia vaginală şi din jurul colului uterin.Dacă secreţia este redusă, se poate stimula prin injectarea în colul uterin a unei soluţii hipertone de NaCl.

- examenul macroscopic pune în evidenţă aspectul purulent, cremos, de culoare gălbuie al secreţiilor.

- Frotiurile se întind imediat şi se colorează cu albastru de metilen, Gram sau cu una din coloraţiile speciale (Pick-Jacobson, imunofluorescenţă).Aspectul frotiului în această fază acută este caracteristic, şi de obicei suficient pentru diagnostic: diplococi Gram negativi, de forma boabelor de cafea care se privesc prin concavităţile lor, dispuşi predominent intracelular , şi cu absenţa altei flore bacteriene pe frotiu

b. în uretrita gonococică cronică, diagnosticul este uneori dificil.Secreţia uretrală este frecvent mult redusă, ceea ce îngreunează recoltarea ( este necesară stimularea secreţiei prin diverse tehnici).Pe frotiu, apar gonococi dispuşi predominent extracelular, dar şi intracelular, uneori cu morfologia modificată, necaracteristică.

- se fac însămânţări pe medii speciale ( Peizzer-Steffen, Mueller- Hinton, geloză-chocolat, geloză cu adaos de sânge sau ascită), şi se incubează în atmosferă de CO2. După 24-48 de ore apar colonii de tip S, de 1- 1,5 mm.

- Identificarea se face în continuare pe baza unor caractere biochimice, de metabolism şi prin reacţii serologice.

Antibiograma pune deseori în evidenţă rezistenţa crescută la antibioticele uzuale.O gonoree cronică se consideră vindecată după 3 culturi negative, efectuate

la interval de 3 săptămâni.

BACILI AEROBI SPORULAŢI

36

Genul Bacillus cuprinde mai multe specii larg răspândite în natură, prezente deseori pe sol, dintre care cu importanţă deosebită în patologie este Bacillus anthracis (bacilul cărbunos), agentul etiologic al cărbunelui ( antraxului).Alte specii ale genului ( B. cereus) sunt incriminate în toxiinfecţii alimentare, fiind producătoare a unei exotoxine cu tropism intestinal, asemănătoare celei produse de tulpinile enterotoxigene de B coli.

Bacillus anthracis ( bacilul cărbunos)

A fost observat în 1850 sub forma unor filamente în sângele animalelor care mureau de antrax, dar a fost confirmat drept agent etiologic abia în 1863, iar în 1877, Pasteur a reuşit să prepare un vaccin anticărbunos.

Caractere morfologice şi culturale. Este unul dintre cei mai mari bacili, având dimensiunile cuprinse între 1,5 / 4-8μ , cu formă de bastonaşe cu capetele tăiate drept, Gram pozitiv, dispus izolat, sau în lanţuri scurte, formator de spori, aerob, sau anaerob facultativ, imobil.Creşte pe mediile uzuale, unde formează sporul, situat central, care nu deformează bacteria şi este foarte virulent.

- pe mediile lichide (bulion) formează un depozit floconos în mediul care rămâne clar;- pe geloza-sânge dă colonii mari, mate, rugoase, de culoare gălbuie („în cap de

meduză”).Structura antigenică este caracterizată prin:

- antigen capsular de natură polipeptidică- antigen somatic polizaharidic- toxina proteică cu trei componente: antigenul protector, factorul letal şi factorul de

edem.Puterea patogenă. Antraxul este o antropozoonoză ce evoluează la ierbivore ( sub forma unei

septicemii mortale), care se infectează prin sporii de pe sol, şi care se poate transmite omului, frecvent ca boală profesională ( măcelari, tăbăcari, etc.)

- contaminarea pe cale cutanată determină pustula malignă, care apare ca o veziculă ce se infectează şi se transformă în pustulă, înconjurată de o coroană de alte pustule, acoperite de o crustă neagră.( de unde şi denumirea bolii, de cărbune), sau se poate produce edemul malign, care conţine un exudat sanguinolent.

- contaminarea respiratorie, prin inhalarea sporilor, determină cărbunele pulmonar, manifestat sub forma unei pneumonii cu evoluţie severă.

- pătrunderea bacilului pe cale digestivă determină o enterită gravă, cu diseminare pe cale sanguină (posibilă în toate formele de cărbune) şi septicemie sau meningită.

Patogenitatea este conferită de prezenţa capsulei, cu efect antifagocitar, care permite iniţierea infecţiei şi difuzarea bacilului, iar semnele clinice sunt datorate prezenţei toxinei , a cărei concentraţie în organism creşte pe parcursul evoluţiei, atingând titrul maxim în momentul decesului.

Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea germenului în produsele patologice( pe baza caracterelor morfologice, culturale, biochimice) şi pe o reacţie serologică de precipitare cu ser anticărbunos, numită reacţia Ascoli.

Tratamentul se face cu Penicilină, în doze mari şi ser anticărbunos administrat cât mai precoce, pentru neutralizarea toxinei cărbunoase circulante.

Profilaxia urmăreşte depistarea animalelor bolnave şi izolarea lor, nu se recomandă autopsierea cadavrelor de animale, care vor fi îngropate şi acoperite cu var nestins.Persoanelor cu risc profesional li se poate administra vaccinul anticărbunos( conţine anatoxină)

37

Familia Actinomycetaceae Genul Corynebacterium Specia Corynebacterium diphteriae

Genul Corynebacterium cuprinde mai multe specii comensale omului, prezente în faringe şi pe tegumente (C.xerosis, C. hoffmanni, C.cutis communae), numiţi şi bacili pseudodifterici, sau difteromorfi, datorită asemănării morfologice cu bacilul difteric; aceştia nu produc îmbolnăviri, dar pot determina confuzii de diagnostic, atunci când se izolează din produsele patologice.Ei trebuie diferenţiaţi de specia patogenă, C. diphteriae, care este responsabilă de toxiinfecţia difterică, caracterizată prin:

- cantonarea bacilului difteric la poarta de intrare- faringe-, unde se înmulţeşte şi produce toxina;

- producerea de exotoxină, care difuzează în organism pe cale sanguină şi este responsabilă de fenomenele toxice la distanţă.

Clinic, difteria, se manifestă prin:- angina pseudomembranoasă, caracterizată de prezenţa de false membrane fibrinoase,

foarte aderente la faringe, pilierii amigdalieni, vălul palatin, evoluează spre laringe,putând poduce asfixia mecanică prin obstruarea căilor respiratorii;

- toxemia difterică, cu leziuni la nivelul glandelor suprarenale, rinichi, miocard, şi ale sistemului nervos periferic, cu paralizii.

- Localizări mai puţin frecvente sunt la nivelul mucoaselor nazale, conjunctivei, sau a plăgilor chirurgicale şi arsurilor.

Complicaţiile sunt foarte grave, reprezentate de miocardită,polinevrite, sindroame hemoragice, toate determinate de efectele toxinei difterice.

Toxina difterică este puternic antigenică şi determină în organism producerea de anticorpi antitoxină.Prin tratarea cu formol, învechire şi căldură, toxina îşi pierde toxicitatea, dar rămâne antigenică, şi se transformă în anatoxină, care reprezintă substratul pentru vaccinul antidifteric.

Producerea de toxină de către bacilul difteric este condiţionată de prezenţa unui bacteriofag temperat lizogen, care se încorporează în cromozomul bacterian şi codează proteina specifică toxinei.Sub acţiunea unor factori inductori (radiaţii U.V.), fagul endogen trece din starea de profag în fag matur, virulent; bacteria „se vindecă” de lizogenie, îşi pierde caracterul toxigen, iar eliberarea fagului din celulă se face prin liza bacteriei.

Diagnosticul de laborator se poate face labolnavii de difterie căt şi la purtători.La bolnavi se recoltează exudatul faringian şi nazal, din care se fac frotiuri şi însămânţări pe

medii de cultură speciale.Frotiurile se colorează Gram, cu albastru de metilen sau cu coloraţia specifică Del-

Vecchio.Bacilii difterici sunt Gram pozitivi la limită,dimensiuni de 4-6μ, „măciucaţi”, cu aspect specific de „halteră”, datorită unor granulaţii metacromatice care se dispun bipolar, şi se dispun în frotiu formând unghiuri ascuţite, în forma majusculelor V, Y, W,M, ca „beţele de chibrit”aruncate pe masă, sau uneori imitând literele chinezeşti.

Cutivarea bacilului difteric se face pe medii selective, cum sunt mediul Tinsdale, Gundel-Tietz, dar şi pe geloza sânge.Mediul de elecţie este mediul Loffler.( conţine ser coagulat de bou).În cazul unor produse patologice sărace, sau la purtători, însămânţarea se face pe mediul de îmbogăţire O.C.S.T. (ou, cisteină, ser, telurit de potasiu);sunt bacili aerobi, microaerofili, cu creşterea favorizată de adaosul în mediu a cisteinei şi proteinelor serice.Aspectul caracteristic este pe mediul Tinsdale, unde coloniile sunt mici, cenuşii-negre şi înconjurate de un halou cafeniu ,

38

care permite diferenţierea lor de difteromorfi.Aspectul coloniilor pe bulion şi pe mediul Gundel-Tietz, permite diferenţierea tipurilor în cadrul speciei Corynebacterium diphteriae.

Identificarea continuă prin efectuarea testelor biochimice.Evidenţierea toxigenezei este obligatorie pentru demonstrarea patogenităţii, şi se realizează in

vitro, prin teste de precipitare în gel, cu ser antidifteric.(reacţia Elek-Ouchterlony).Tratamentul se bazează pe administrarea cât mai precoce a serului antidifteric, care

acţionează însă numai asupra toxinei circulante, nu şi asupra celei acumulate în ţesuturi.- antibioterapia se adresează bacilului cantonat la poarta de intrare, fiind indicate

Eritromicina, Tetraciclina, Penicilina, Cloramfenicol.Profilaxia este asigurată prin vaccinarea populaţiei receptive cu unul din vaccinurile: DTP

( anti-difteric, tetanic, pertussis), DT (difteric, tetanic), sau ADPA (anatoxină difterică purifiată şi adsorbită).

Receptivitatea la infecţie este generală, iar calea de transmitere este predominent respiratorie, sau uneori, mai rar, prin alimente.

39

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Enterobacteriaceele cuprind un număr foarte mare de genuri de bacili Gram negativi, aerobi şi anaerobi facultativ,cu un metabolism de tip respirator şi fermentativ, care descompun glucoza în acid şi gaz, şi sunt nesporulaţi.Unele specii prezintă cili peritrichi, şi sunt deci mobile (E. Coli, Proteus, Salmonella).

Principalele genuri cu interes medical, sunt:Escherichia ( cu specia E. Coli), Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Yersinia.

Caractere morfologice şi culturale: bacili Gram negativi, cu dimensiunile de 0,4-0,6 μ, nesporulaţi, necapsulaţi, cu excepţia E.coli şi Klebsiella, care prezintă capsulă; cresc pe mediile uzuale, tulbund uniform bulionul, iar pe geloza simplă dau colonii de tip S, rotunde, de 1-3 mm diametru, semitransparente.Unele specii,cum este Klebsiella, creşte sub forma unor colonii mari, de tip mucos, iar Proteusul prezintă fenomenul de „invazie”, cu o creştere „în valuri”, caracteristică, datorată mobilităţii mari a acestei specii.Pentru diagnosticul infecţiilor produse de Entrobacteriacee, se folosesc curent o serie de medii de îmbogăţire ( Müller- Kauffmann, mediul cu selenit acid de sodiu, care inhibă flora de asociaţie), şi medii selective, care în principiu, sunt medii lactozate la care se adaogă un indicator de pH, care modifică culoarea mediului în funcţie de pH-ul acestuia, dintre care amintim:

- geloza Mc. Conkey (conţine geloză, lactoză, roşu neutru- ca indicator de pH), culoarea mediului este roz, transparent.Bacteriile care fermentează lactoza, acidifică mediul, şi cresc sub formă de colonii roşii, uneori cu halou opalescent ( E. Coli, Klebsiella).Bacteriile nefermentative dau colonii transparente, de culoarea mediului.

- Mediul Leifson sau ADCL ( agar, dzoxicolat, citrat, lactoză), tot de culoare roz, enterobacteriaceele fermentative dau colonii roşii, cele lactozo-negative, cresc sub formă de colonii transparente, uneori cu centrul negru, datorită producerii de H2S.

- Mediul pentru Salmonella- Shigella- Mediul Istrati- Meitert, conţine indicatorul de pH albastru de brom-tymol, care dă

mediului o culoare verde.Coloniile lactozo-pozitive sunt galbene şi virează culoarea mediului de sub ele în galben, în timp ce cele lactozo-negative rămân transparente.Bacilii producători de H2S au centrul negru.

- Geloza Wilson Blair, este selectivă pentru Salmonella, conţine verde brilliant şi citrat de bismut, care sub acţiunea Salmonellelor se transformă în sulfură de bismut, conferind coloniilor culoarea neagră, cu halou metalic.

- Mediul AABTL ( agar, albastru de brom tymol, lactoză), de culoare verde-transparent, pe care coloniile lactozo-pozitive sunt galbene, iar cele lactozo- negative rămân transparente.

Dintre speciile cu interes mdical amintite, Salmonella, Shigella şi Proteus sunt lactozo-negative, în timp ce E.coli şi Klebsiella fermentează lactoza.

Caractere biochimice. Un număr foarte mare de teste biochimice ne stau astăzi la dispoziţie pentru identificarea precisă a diferitelor specii de enterobacteriacee.Testarea acestor caractere se poate realiza fie pe medii politrope (multitest), sau prin procedee automatizate, care economisesc mult timp şi oferă posibilitatea citirii unui număr foarte mare de teste, crescând astfel mult fiabilitatea unui diagnostic precis.Dintre mediile politrope utilizate de rutină în laboratoarele noastre amintim:- mediul TSI ( triple sugar , iron), pentru fermentarea lactozei,glucozei, zaharozei şi producerea de H2S;

- mediul MIU, pentru mobilitate, producere de indol şi urează.

40

- Mediul MILF, pentru mobilitate, indol, producere de lactic-dehidrogenază, fenil-alanin-dehidrogenază.

Caracterea antigenice. Enterobacteriaceele prezintă o structură antigenică complexă, pe baza căreia au fost elaborate scheme de diagnostic pentru identificarea grupelor şi tipurilor în cadrul speciei.

1. Antigenul somatic O , conţinut în peretele bacterian, posedă 2 componente:- lipidul B ;- componenta lipo-polizaharidică LPS cu 3 subcomponente:

a. lipidul Ab. miezul (core)c. lanţurile polizaharidice specifice;

Primele două subcomponente alcătuiesc endotoxina, responsabilă de şocul endotoxinic, iar polizaharidele conferă specificitatea de grup. Antigenul O se poate uni cu anticorpii corespunzători anti-O, dând in vitro reacţii de aglutinare de tip polar, cu grunji fini, care se desfac greu prin agitare.

3. Antigene de înveliş K, ataşate peretelui, nu sunt prezente la toate enterobacteriaceele; pot „masca” antigenul somatic, şi tulpinile respctive nu aglutinează cu serurile anti-O.

- sunt de natură polizaharidică4. Antigene flagelare H , prezente numai la germenii mobili, sunt de natură proteică şi conferă specificitate de tip.Aglutinează cu serurile anti-H, în grunji mari,care se desfac uşor prin agitare.

Puterea patogenă

41

Bacilul pioceanic

Aparţine genului Pseudomonas, şi este incriminat în următoarele infecţii:- tegumentare, în special plăgi chirurgicale, arsuri, fiind frecvent incriminat în etiologia

infecţiilor intraspitaliceşti (nosocomiale)- urinare (alături de E.coli şi Proteus)- O.R.L. si oculare- bronho-pulmonare- digestive, mai ales la sugari şi copiii mici- meningită la nou-născuţi- septicemiiDiagnosticul bacteriologic are scopul de a izola şi identifica bacilul în produsele patologice: puroi

şi exudate purulente, urină,secreţii otice, conjunctivale, spută, materii fecale, L.C.R., sânge.- izolarea se face pe mediile uzuale, eventual A.A.B.T.L.- identificarea se face pe baza următoarelor criterii:

o caracterele morfologice pe frotiuri colorate Gram, unde apar coloraţi în roşu, dispuşi izolaţi, în perechi sau lanţuri scurte, nesporulaţi, rar încapsulaţi, mobili.

o caracterele culturale: - tulbură uniform bulionul simplu sau apa peptonată, cu formare de peliculă, şi

caracteristic, apare o culoare albastru- verde, datorată pigmentului pioceanină, elaborată de bacilul pioceanic, şi mirosul de flori de tei;

- pe geloză, dau colonii de tip S sau R, colorate fluorescent, cu reflexe metalice, şi cu mirosuri aromatice;

caractere biochimice;Antibiograma este obligatorie, având în vedere multichimiorezistenţa pe care o dezvoltă adesea

acest bacil.

42

Mycobacterium tuberculosis Caractere morfologice.

- este un bacil imobil, cu dimensiuni de aproximativ 2- 4/ 0,2- 0,3 microni necapsulat şi nesporulat. Pe frotiuri se poate colora cu albastru de metilen sau Gram, dar prezintă o proprietate tinctorială specifică mycobacteriilor, şi anume se colorează la cald cu fuxină şi reţin colorantul chiar după decolorare cu alcool sau sau acizi. Această proprietate se numeşte acido-alcoolo rezistenţă, şi este pusă în evidenţă prin coloraţia Ziehl-Nielsen, în care bacilii apar coloraţi în roşu pe fondul albastru al preparatului. Aspectul pe frotiu este de bastonaşe cu capete rotunjite dispuse izolat sau în grămezi, cu granulaţii citoplasmatice frcvente, iar pe frotiurile efectuate din culturi, apar forme filamentoase, sau ramificate; Aceste aspecte diferite sub care poate apare Micobacterium tuberculosis pe frotiuri, se descrie sub numele de pleiomorfism.

Compoziţia chimică este complexă.a. Lipidele reprezintă 20-45% din greutatea uscată a bacilului, dintre care 60% sunt în peretele bacterian , şi au rolul demonstrat în patogenitate. Principalele lipide sunt:- acizii micolici, care conferă acido-alcoolo rezistenţa;- fosfolipide;- glicolipide;- peptidoglicolipide, numite şi ceara D, prezentă mai ales la formele virulente;

b. Proteinele reprezintă suportul activităţii tuberculinice; pot fi purificate şi se folosesc pentru testarea rezistenţei la infecţia tuberculoasă în preparatul PPD.

c. Glucidele au structură complexă şi se leagă cu lipidele şi proteinele bacilului.

Caractere culturale.- este aerob strict, creşte la 37˚C şi pH de 6,7- 6, 9, necesită adaos de factori de creştere

în mediu : glicerină, ou, amidon, asparagină, săruri minerale.- pentru cultivarea Mycobacterium tuberculosis cel mai frecvent se foloseşte mediul

Lowenstien-Jensen, care conţine elemetele amintite, în plus malachit oxalat verde; mediul este solid, opac, de culoarea verde. Pe acest mediu creşterea bacilului este caracteristică: creşte lent, primele colonii apar după 15-30 de zile, au aspect opac, culoare gălbuie; în zilele umătoare au o creştere eugonică, adică foarte bogată, luxuriantă, capătă un aspect rugos, uscat, conopidiform, descris şi ca ,, pesmet de pâine”;

- acest aspect diferă de cel al Mycobacterium bovis unde primele colonii apar după 30 de zile, sunt mici, netede, disgonice adică cu o creştere săracă, colonii puţine;

- tipul aviar se dezvoltă în 2-3 zile, creşte şi pe medii uzuale;

Rezistenţa la agenţi fizici şi chimici. Bacilul tuberculos este sensibil la lumina solară, raze X şi U.V., dar rezistent la frig. Alcoolul de 90˚ îl distruge în 5 minute. Puterea patogenă la om.În ordinea frcvenţei, principalele localizări ale tuberculozei la om sunt:

- pleuro-pulmonară (90%)- uro-genitală- peritoneală- osteo-articulară- meningeală (meningita tbc)- ganglionară;Constituirea leziunilor iniţiale în infecţia tbc. Inhalarea bK are ca rezultat depunerea în alveole sau eliminarea prin exhalare. Pe suprafaţa alveolară bacilii sunt fagocitaţi de

43

macrofagele alveolare, unde ei reuşesc să se multiplice sau sunt distruşi (în funcţie de virulenţa bacililor şi rezistenţa organismului). De obicei bK se multiplică în macrofage, care în această fază sunt ineficiente, şi se edifică treptat un focar pneumonic; bacilii invadează ganglionii loco-regionali, dând o adenită satelită. Un număr de bacili ajung pe cale venoasă dreaptă (din canalul toracic) în zonele apicale pulmonare, sau pe calea circulaţiei sistemice în diferite organe; în 6-8 săptămâni, organismul reacţionează prin apariţia răspunsului imun (care corespunde pozitivării PPD): creşte foarte mult numărul de limfocite şi macrofage în toate zonele unde există mycobacterii( rolul limfocitelor T activate prin limfokine ), puterea fagocitară este mult crescută, şi mycobacteriile sunt distruse.- focarul pneumonic de tip exudativ ( mulţi bacili şi puţine celule inflamatorii) trece

într-un focar de tip granulomatos, alcătuit din numeroase macrofage, celule epiteloide la mijloc şi celule gigante Langhans multinucleate la interior; la exterior granulomul tbc este înconjurat de o coroană de limfocite. În timp, granulomul se fibrozează, eventualele zone cazeificate se calcifică. Concomitent sunt eradicate şi focarele coexistente din toate organele. Astfel, complexul primar tuberculos se caracterizează prin:

- vindecare spontană;- conferă rezistenţă la reinfecţie;- este inaparent clinic;- determină ,, virajul tuberculinic”, adică pozitivarea intradermoreacţiei la PPD.

Aproximativ 5% din persoanele nou infectate nu reuşesc să oprească multiplicarea bacilului; la aceştia primo-infecţia nu are evoluţia descrisă, ci evoluează în lunile următoare spre boalăDiagnosticul de laborator.

1. Recoltarea produselor patologice în funcţie de localizarea tuberculozei:- tbc pleuro-pulmonară: sputa, lichid pleural, aspirat bronşic, spălătură bronşică;- tbc uro-genitală: urină, fragmente de biopsie de endometru;- tbc ganglionară: puncţie/biopsie ganglionară;- tbc osteo-articulară: lichid articular, fragmente de os;- tbc meningeală: LCR

2. Ex. Direct al frotiurilor efectuate din produsele patologice, colorate Ziehl- Nielsen; bK apare colorat în roşu, pe fondul albastru al preparatului; examinare cu obiectiv cu imersie.

3. Însămânţarea pe mediile speciale, uzual pe mediul Lowenstein Jensen, unde mycobacteriile dau coloniile caracteristice descrise anterior.

4. Antibiograma, este indicată repetarea periodică din cauza multichimiorezistenţei pe care o dezvoltă numeroşi bacili.

Testarea stării de sensibilitate la infecţia cu Mycobacterium tuberculosis se face prin intradermoreacţia la tuberculină (PPD).

- reacţia se citeşte după 72 ore; dacă la locul inoculării nu apare nici o reacţie, înseamnă că individul nu a venit în contact niciodată cu Mycobacterium tuberculosis, deci el este sensibil, ca urmare trebuie vaccinat.

- Dacă la locul inoculării apare un eritem cu diametrul între 10-15 mm, reacţia se consideră pozitivă, acest individ nu trebuie vaccinat, deoarece prezintă rezistenţă la o nouă infecţie.

- Dacă eritemul depăşeşte 15 mm, semnificaţia este a unui proces infecţios evolutiv, individul se îndrumă la ftiziologie.Vaccinarea se face cu o tulpină vie atenuată şi se numeşte vaccinul BCG (bacil Calmette-Guerrin ); prima vaccinare se face la 4 zile după naştere, la toţi nou-născuţii,

44

fără testare prealabilă; după vârsta de 8 luni , se testează sensibilitatea prin IDR la PPD, şi se vaccinează numai cei sensibili la infecţie.

45

BACTERIILE ANAEROBE STRICTE

Cuprind germeni care nu pot utiliza oxigenul şi nici nu se pot dezvolta în prezenţa lui.În funcţie de prezenţa sporului bacterian, au fost clasificate , astfel:

1. Bacterii anaerobe sporulate, aparţin genului Clostridium, cuprinde germeni telurici, exogeni, cu excepţia C. perfringens, care se găseşte în cavitatea bucală.

2. Bacterii anaerobe nesporulate, mai frecvent saprofite, dar în asociere cu alţi germeni, dau supuraţii şi septicemii

GENUL CLOSTRIDIUM- cuprinde bacili Gram pozitivi, cu dimensiuni cuprinse între 3-4, până la 14µ, necapsulaţi şi mobili, cu excepţia C. perfringens, care prezintă capsulă şi este imobil.Toţi reprezentanţii genului prezintă spori, care pot fi situaţi central, sau subterminal.Cu importanţă deosebită în patologia umană, sunt:- agenţii patogeni ai gangrenei gazoase,

o C. perfringenso C. septicumo C. oedematienso C. histolyticum

- agentul patogen al toxiinfecţiei botulinice,o C. botulinum

- bacilul tetanic, sauo C. tetani

Clostridium perfringens se izolează cel mai frecvent, şi poate fi găsit în cavităţile naturale ale omului.Prezintă mai mulţi factori toxici, cu acţiune hemolitică, necrozantă enzimatică şi cardiotoxică, pe baza cărora s-au identificat mai multe varietăţi, tipul A fiind cel mai toxic pentru om.

Puterea patogenă.- gangrena gazoasă , manifestată clinic printr-un flegmon gazos, crepitant, hemoragic, extins şi

însoţit de alterarea gravă a stării generale, icter.Dacă nu se intervine rapid cu tratament antibiotic, seroterapie antiperfringens (pentru neutralizarea toxinei) şi anatoxină, decesul poate surveni în câteva ore de la debut. În cadrul tratamentului chirurgical, se practică antisepsia foarte riguroasă a plăgii, şi incizii largi, pentru a asigura oxigenarea plăgii, care nu mai permite dezvoltarea în continuare a bacilului.

- diferite viscerite, cum ar fi apendicita supraacută, enterita necrozantă ;- septicemii, mai ales post-abortum, cu tendinţă la insuficienţă renală acută datorită hemolizei

intravenoase determinate de toxina bacilului perfringens.

Clostridium botulinum este răspândit în mediu sub forma sa sporulată (pe plante, legume, fructe, sol), dar şi în unele alimente, mai ales conserve de carne şi legume insuficient preparate termic. Consumul acestor conserve care conţin bacilul botulinic şi exotoxina pe care o secretă, determină o toxiinfecţie alimentară foarte gravă, cunoscută sub numele de botulism.

- în organism nu se poate pune în evidenţă bacilul, doar toxina sa. Punerea în evidenţă a bacilului este posibilă doar în alimentul incriminat, unde se dezvoltă în „ cuiburi”, ceea ce explică uneori faptul că dintre mai multe persoane care consumă aceeiaşi conservă, nu toţi fac boala.

- toxina botulinică este cea mai puternică „otravă” biologică, 1mg de toxină de tip A conţinând 32 de milioane de doze limită mortale la şoareci; este de natură proteică, termolabilă, fiind distrusă în 10 minute la 100 0C, dar este acido rezistentă (nu este distrusă de sucurile gastrice).

- Clinic, toxiinfecţia botulinică se manifestă prin:

46

o vomă şi constipaţieo strabism, prin paralizia de acomodare a muşchilor oculomotori, datorită inhibiţiei

producerii de acetil-colină, cu acţiune asupra plăcilor neuro-musculareo paralizii ale muşchilor buco-faringieni şi exitus prin paralizie respiratorie.

Diagnosticul de laborator constă în evidenţierea tipului de toxină (cel mai frecvent este incriminat tipul B), şi identificarea sursei.

Tratamentul urmăreşte administrarea precoce de ser antibotulinic ( până la primirea rezultatului de lalaborator, se administrează ser antibotulinic B), vaccin antibotulinic şi antibiotice.

Clostridium tetani produce tetanosul.Sporii săi sunt răspândiţi în sol.Dacă o plagă cu potenţial tetanigen este contaminată cu pământ care conţine spori, aceştia se transformă în forma vegetativă dacă au condiţii de anaerobioză şi eliberează exotoxina tetanică, responsabilă de fenomenele generale ale bolii.

- prin plagă cu potenţial tetanigen înţelegem acele leziuni care au în general o poartă de intrare de dimensiuni mici, care practic se închide după îndepărtarea agentului cauzal, şi sunt în schimb profunde, creând astfel condiţii de anaerobioză (plăgi înţepate, muşcături de animale, lezări cu unelte agricole,etc.).

- toxina tetanică are acţiune toxică, necrotică, cardiotoxică şi determină sindromul tetanic (prin acţiunea asupra lipidelor din SNC), manifestat în principal prin contractura generalizată a musculaturii scheletice, peste care se suprapun contracţii paroxistice; faciesul este caracteristic, numit „risus sardonicus”, cu gura deschidă într-un „ rânjet” larg, fruntea este încruntată.Bolnavul stă în poziţie de opistotonus, adică în decubit dorsal, sprijinit în ceafă şi călcâie.

Tratamentul este de urgenţă şi constă în administrarea de ser antitetanic, care neutralizează toxina circulantă (dar nu şi pe cea fixată în ţesuturi), vaccinare cu anatoxină tetanică, terapie intensivă cu antibiotice (penicilină) şi tratamentul chirurgical al plăgii.

Profilaxia tetanosului la orice plagă este de o deosebită importanţă şi pune probleme medico-legale, motiv pentru care se înregistrează cu exactitate tratamentul efectuat, iar dacă pacientul refuză tratamentul, acesta va semna în fişa personală (sau bilet de trimitere,etc).În principiu, orice plagă poate avea risc tetanigen, ca urmare se va administra vaccinul antitetanic (de preferinţă ATPA- anatoxină tetanică purifiată şi adsorbită) şi 1500-3000 UAI de ser antitetanic.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de Clostridii- produsele patologice (sânge, secreţii purulente, exudate, materii fecale) recoltate de la bolnavi

se încălzesc la 70 0C timp de 30 minute pentru distrugerea formelor vegetative.- se pot efectua frotiuri direct din produsul patologic, sau preparate între lamă şi lamelă;- însămânţarea se face pe medii anaerobe: bulion VF sau geloza VF, cu adaos de antibiotice, pe

care clostridiile vor dezvolta colonii caracteristice.- tipizarea toxinei este importantă în special în cazul C.botulinum.

Familia Parvobacteriaceae

Cuprinde genurile: Francisella, Yersinia, Brucella, Haemophilus, Bordetella.

Genul Haemophilus

Haemophilus influenzae este un comensal al căilor respiratorii, dă infecţii secundare, fiind responsabil de suprainfecţii în gripă, rujeolă, tuse convulsivă, infecţii pulmonare, precum şi în etiologia altor boli, cum sunt:

47

- meningita acută purulentă la copii, cu prognostic sever;- laringite, pleurezii, pericardite, endocardite;

Din punct de vedere morfologic, sunt bacili mici, Gram negativi, imobili, nesporulaţi, dispuşi izolaţi, în perechi, lanţuri scurte, sau uneori ca elemente paralele, asemănătoare „bancurilor de peşti”.Prezenţa capsulei este considerată factor de virulenţă a bacteriei.Se cultivă pe medii cu adaos de factori de creştere, unde apare sub formă de colonii de tip S.

Alte bacterii aparţinând genului Haemophilus sunt:- H. ducreyi care determină şancrul moale, o boală venerică;- H. parainfluenzae, responsabil de infecţii pulmonare şi endocardite;- H. haemolythicus, nepatogen, poate fi uneori cauză de eroare în diagnosticul streptococilor

pyogenes.Tratamentul se face conform antibiogramei (frecvent sensibil la Streptomicină, Ampicilină,

Tetraciclină).

Genul Bordetella

Cuprinde speciile B.pertussis, care dă tusea convulsivă, B.parapertussis şi B.bronchiseptica, care dau sindroame asemănătoare tusei convulsive.

- sunt germeni care parazitează întotdeauna omul sau animalele, nu se găsesc niciodată în stare liberă în natură.

- sunt bacili mici, Gram negativi, imobili, nesporulaţi, capsulaţi în unele faze de cultură; se colorează bipolar, porţiunea centrală rămânând clară;

- se cultivă greu, pe mediul special Genjou –Bordet, unde după 2-4 zile, apar colonii în „picătură de mercur”, mici, rotunde, bombate, cu reflexe gri- metalice, care după 3-4 zile dau o hemoliză tulbure.

Puterea patogenă:tusea convulsivă apare mai ales la copii, şi se manifestă în mai multe faze:- faza catarală, care este foarte contagioasă- faza de tuse quintoasă, spasmodică, de tuse „măgărească”- convalescenţa este de lungă durată.

Bacilul se dezvoltă la suprafaţa epiteliului respirator, nu trece în sânge; el elaborează o toxină responsabilă de fenomenele generale din tusea convulsivă;modificările epiteliului respirator predispun la suprainfecţii, cu apriţia frecventă a complicaţiilor pulmonare.

Diagnosticul de laborator constă în izolarea în faza catarală şi în perioada quintelor a bacilului din produsele patologice (spută, secreţii nazale, exudat faringian).

- diagnostic indirect prin imunofluorescenţă- tabloul hemo-leucocitarl indică leucocitoză cu limfocitoză, în jur de 60%

Tratamentul se face cu Eritromicină în doze mari.Profilaxia este importantă, realizându-se prin vaccinarea DTP (anti-difteric, tetanic, pertussis), dar

trebuie subliniat aici, că vaccinul nu dă rezistenţă faţă de infecţiile cu bacil parapertussis, care dă un sindrom asemănător tusei convulsive.

SPIROCHETELE

În această familie sunt cuprinse genurile: Treponema, Leptospira, Borrelia

Spirochetele se caracterizează prin:- dispoziţia helicoidală- flexibilitate- mobilitate, datorită unui aparat locomotor intern, reprezentat de una sau mai multe fibrile,

inserate egal la extermităţile celulei; acestea se întind până la extermitatea opusă a celulei, realizând mai multe ture de spiră în jurul corpului bacterian, dând aspectul helicoidal al bacteriei.

48

GENUL TREPONEMA

Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului, boală venerică, specific umană.În afară de aceasta, mai există şi alte specii de interes medical care dau boli neveneriene, constituite în aşa numitul grup al sifilisului tropical, precum şi treponeme saprofite localizate mai ales la nivelul mucoasei bucale şi genitale.

Caractere morfologice.- Tr. Pallidum poate fi evidenţiată în stare vie în serozitatea de la nivelul şancrului, examinarea se

face la microscopul cu fond întunecat; are o formă helicoidală, cu extremităţile efilate, foarte mobil, prezentând mişcări de rotaţie, flexie,înşurubare, translaţie.

- preparatele fixe se colorează prin metoda Fontana-Tribondeau de impregnare argentică, unde treponemele sunt argintii strălucitoare pe fondul închis al preparatului.

Caractere culturale.Până în prezent nu s-a reuşit cultivarea treponemelor patogene pe medii de cultură.

Rezistenţa în mediul extern este foarte scăzută, treponemele pierzându-şi practic virulenţa în afara organismului în aproximativ 2 ore.

Structura antigenică este formată din:- antigenul Wassermann, de natură lipidică, comun tuturor treponemelor (cardiolipidul);- un antigen proteic „de grup”, comun genului Treponema;- antigene proteice şi antigene poliosidice specifice Tr. Pallidum.Puterea patogenă.Sifilisul este o boală cu transmitere sexuală, care se desfăşoară în trei etape

succesive, după o perioadă de incubaţie de aproximativ 3 săptămâni de la contactul infectant.- faza primară, în care leziunea caracteristică este şancrul sifilitic (nedureros, bine circumscris,

cu o bază de induraţie), localizat predominent la nivelul mucoasi genitale, din care prin presiune se elimină o serozitate bogată în treponeme;se însoţeşte de adenopatie satelită.Şancrul primar se vindecă spontan, chiar în lipsa unui tratament, în aproximativ 3 săptămâni, fără cicatrice, dând bolnavului impresia iluzorie că s-a vindecat.

- faza secundară se produce la 4- 6 săptămâni de la apriţia şancrului, prin leziuni maculo-papuloase, numite rozeole sifilitice, răspândite în diferite zone ale corpului, şi care de asemenea se vindecă spontan;

- faza terţiară, se produce numai la aproximativ 50% din bolnavii infectaţi, tradusă prin leziuni grave de necroză şi scleroză distructivă, cunoscute sub numele de gome sifilitice, cu localizări mucoase, cutanate, osoase, vasculare, viscerale;se produc leziuni nervoase cu paralizie generalizată progresivă, afectarea măduvei spinării (tabes), a aortei (anevrisme).În rest, 25% din cazri se vindecă spontan, iar 25% au o evoluţie lentă, care poate dura toată viaţa (bineînţeles, trecerea de la ofază la alta are loc în absenţa unui tratament adecvat).

- Sifilisul congenital rezultă prin contaminarea transpalacentară a fătului, de obicei când infectarea mamei are loc în a 2-a jumătate a sarcinii; totuşi este posibilă şi naşterea unui copil sănătos, cu serologie pozitivă, prin transfer pasiv de IgG.Contaminarea în primele luni de sarcină, sau dacă mama este bolnavă în timpul concepţiei determină avort sau naşterea unui făt mort.

Imunitatea.- imunitatea umorală este dată de anticorpii care apar încă din primele săptămâni ale infecţiei şi

se menţin pe toată durata evoluţui bolii, în absenţa unui tratament corect, sau al unuia instituit tardiv.Principalii anticorpi sunt:

o de tip Wasseramanno antitreponemici: imobilizine (apar la 3-4 săptămâni după anticorpii tip Wassermann,

dar şi dispar ultimele) anticorpi de imunofluorescenţă (sunt primii care apar) antiproteici de grup Reiter (pe locul doi în ordinea apariţiei).Anticorpii elaboraţi în sifilis nu conferă protecţie.

- imunitatea de tip celular asigură o protecţie mai eficientă decăt anticorpii.Diagnosticul de laborator se poate face direct prin punerea în evidenţă a Tr, pallidum în perioada

primară, şi indirect, prin evidenţierea anticorpilor, prin diferite reacţii serologice.- evidenţierea directă în serozitatea din şancrul primar, se poate face prin preparat nativ între

lamă şi lamelă, examinat apoi în cîmp întunecat, sau prin preparate fixate şi colorate (Giemsa, impregnare

49

argentică, etc).Testul de imunofluorescenţă directă pune în evidenţă treponemele direct în produsul patologic, şi este de o mare specificitate.

- diagnosticul serologic se bazează pe două grupe de teste:o teste cu antigene cardiolipidice, obţinute din cord de bou, care pun în evidenţă

anticorpii antilipoidici, prin:- reacţii de floculare de tip VDRL ( Veneral Disease Research

Laboratory), care se pozitivează precoce, sunt sensibile, dar nu sufucient de specifice, putând da rezultate fals pozitive.Se utilizează cu succes ca teste screening, de depistare în masă.

- reacţii de fixare a complementului, la cald (reacţia Bordet-Wassermann RBW) şi la rece, cu specificitate mare, dar puţin sensibile.Se recomandă ca pentru diagnosticul sifilisului să se efectueze concomitent o reacţie de floculare şi o RFC cu antigen cardiolipidic.

o teste cu antigene treponemice specifice: imunofluorescunţă indirectă, teste ELISA , şi altele.

Tratamentul este cu Penicilină, până în prezent nu au fost selectate suşe rezistente.Epidemiologie.Sursa de infecţie este numai omul bolnav de sifilis, contagiozitatea fiind mai

mare în primele două faze ale bolii.Transmiterea este în principal sexuală.

FAMILIA RICKETTSIACEAE

Genurile Rickettsia şi Chlamydia

Rickettsiozele reunesc îmbolnăviri diverse transmise de la animal la om, prin intermediul unui vector, care poate fi păduchele, puricele sau căpuşa.Cele mai frecvente sunt febrele tifo-exantematice, caracterizate prin prezenţa unui sindrom infecţios sever şi exantem (erupţie cutanată).

- rickettsiile se prezintă în microscopia optică sub formă de coci fini Gram-negativi sau bacili cu dispoziţie filamentoasă.Nu se cultivă pe mediile uzuale, dar cresc în sacul vitelin al oului embrionat, sau pe culturi celulare.

Diagnosticul de laborator este în principal serologic, de cercetare a anticorpilor; cele mai cunoscute, sunt reacţia Weil-Felix (de aglutinare, cantitativă) şi reacţia Kudicke-Steuer, de aglutinare pe lamă, calitativă.

Chlamydiile sunt germeni mici, care nu se colorează Gram, dar se colorează bine Giemsa; sunt paraziţi intracelulari obligatorii.Prezintă aceleaşi caractere culturale ca şi rickettsiile.

Puterea patogenă.- ornitoza şi psittacoza umană, transmisă de porumbei, respectivde papagali, produsă de

C. psittaci, se manifestă ca o bronho-pneumopatie acută.- C.trachomatis produce la om boli oculare şi genitale: trahomul, care duce la orbire, diferite

conjunctivite, uretrita negonococică, mai răspândită decât uretritele gonococice, uneori pote urma sau coincide cu uretrita gonococică, îngreunând mult tratamentul, limfogranulomatoza veneriană.

Diagnosticul de laborator se bazează în special pe reacţiile serologic.Tratamentul se face cu antibiotice cu spectru larg, după antibiogramă.

CANDIDA

Candida este o ciupercă levuriformă, responsabilă de producerea candidozelor umane, infecţii a căror incidentă şi spectru de manifestare clinică a crescut semnificativ în prezent, datorită antibioterapiei, a manoperelor medicale şi a condiţiilor de imunodepresie.

50

Morfologie Candida este o ciupercă levuriformă, mică, ovoidă de 4-6 microni, perete subţire. Se multiplică prin îmugurire. Candida albicans prezintă chlamidospori, caracter de identificare pe medii de cultură. Patogenitate Există 150 de specii, dintre care 10 patogene la om. Candida albicans, krusei, quilliermondii, parapsilosis, tropicalis, glabrata, pseudotropicalis, lusitaniae.Candida albicans este o ciupercă comensală a organismului uman la nivelul cavităţii bucale, tractului digestiv şi a vaginului. Alte specii de candida se intâlnesc pe mucoase sau tegumente sănătoase. Candidele devin patogene în prezenţa factorilor favorizanţi. 1.Factori favorizanţi ai infecţiilor endogene:

- Antibioterapia prelungită, contracepţie orală.- Scăderea rezistenţei organismului, la nou- născuţi, în sarcină, diabet.- Imunosupresie: terapie cu corticosteroizi, citostatice, dificit imun congenital, infecţie HIV.

2. Factori favorizanţi ai infevţiilor exogene:- Manopere medicale: intervenţii chirurgicale, aplicarea de cateter, perfuzii, sonde, injecţii,

proteze dentare, valvulare. Candidele aderă la plastic.- Transmiterea infecţiei de la o persoană la alta prin contact sexual, sau de la mamă la copil.

Principalele localizări la om Candidoze Mucoase

- Candidoze digestive: cadidoza bucală, esofagita candidozică, gastrita candidozică, enterita candidoyică, colitele candidozice, anita candidozică.

- Candidoze urogenitale: volvovaghita candidozică, balano-prostatita, uretrita, cistita candidozică.

- Candidoze bronhopulmonare: bronşite, laringite, epiglotite prin extensia candidozei bucale.

Candidoze cutanate, unghiale- Intertrigo: la pliurilr genitocrutale interfesiere, submamare.- Intertrigo: digitopalmar sau digito plantar.- Zabaluta ( la nivelul conisurilor bucale).- Perionix ( periunghial).- Candida mucocutanată cronică.- Leziuni cutanate în candidoza diseminată: leziuni macronodulare, leziuni asemănătoare cu

ectima gangrenoasă, leziuni asemănătoare cu purpura fulminans.

Septicemia candidozică

Exogen- digestiv sau pulmonar Endogen- după o intervenţie cu leziuni vasculare Candidoze viscerale SNC - meningita candidozică Plămân - pneumonie candidozică Rinichi - pielonefrita, microabcese renale Cord - pericardita, miocardita, endocardita Ochi - endoftalmita candidozică Sistem osteomuscular – artrita, osteomelita, miozita Sistem vascular – vasculita candidozică

51

Peritoneu- peritonita candidozică Ap. urinar- candidoza urinară

Candidoze alergice

Produsii de metabolism ai Candidei pot genera reacţii alergice, cauzând manifestările alergice din candidoze. Alergia la metaboliţi ai Candidei este un fenomen indiscutabil, urmează un factor micotic iniţial şi poate conduce la tulburări diverse. Ca şi tratament se folosesc antifungice pe cale generală sau locală. Ex. Nystadin, Miconazol, Clotrimazol, Ketokonazole, Amfotericina B, Fluconazol, 5 flouro-cytozina. Diagnosticarea se face direct din produse patologice, examen microscopic direct, cultivare, identificare şi antifungigrama. Se mai poate folosi şi diagnosticul serologic, detectare a antigenelor circulante sau diagnosticarea biologică.

52

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ECTOPARAZIŢILOR

Artropodele cu importanţă în patologia umană sunt cuprinse în 6 clase, dintre care unele produc îmbolnăviri prin acţiunea directă, altele acţionează ca vectori, transmiţând alte boli.

Principalele artropode şi ectoparaziţi implicaţi direct în patologia umană, prin traumatisme, secreţia de veninuri sau inducerea de hipersensibilitate, sunt grupate în următoarele clase:

1. Annelida2. Insecta: purecii ( Phtirus pubis, Phtirus corporis), păduchii ( Pediculus corporis,

P. capitis) 3. Arachida: păienjeni, scorpioni, Sarcoptes scabiae ( responsabil de scabie- rîie)4. Chilipoda5. Diplopoda6. Pentastomida

Artropodele considerate vectori sunt în principal cuprinse în clasa Insecta (muştele, insectele, purecii, căpuşele), unele specii de Arachnida şi Crustacea.

Păduchii umani (Pediculus humanus) pot parazita pielea păroasă a capului, părul pubian sau corpul, între cele trei specii existând doar diferenţe minore morfologice.Se hrănesc prin ataşarea la tegumente cu ajutorul unei guri prevăzută cu ventuze ( haustellum), după care penetrează pielea şi sug sînge cu ajutorul a 2 stileţi.După fecundare, femela depune oul la rădăcina firului de păr, ceea ce dă un aspect caracteristic de cuib, ciclul complet de la ou la ou fiind de aoroximativ 16 zile.

Transmiterea se face de obicei prin contact fizic apropiat, folosirea în comun a unor articole vestimentare, sau piepteni, perii de păr; frecvent poate avea caracter endemic în comunităţi de copii.Păduchii de corp se dezvoltă în special în condiţii de igienă precară, şi în general nu sunt consideraţi vectori pentru alte boli, spre deosebire de purecii de corp, care sunt singurul vector pentru Rickettsia prowazeki ( agentul patogen al tifosului exantematic), Borrelia recurentis ( febra recurentă).

Tratamentul se face cu preparate pe bază de malathion, iar cuiburile sunt distruse prin căldură la 70°C, 30 minute.

Sarcoptes scabiae, responsabil de scabie(râie) la om face parte din subclasa Acarieni, este răspândit pe tot globul, incidenţa crescând în condiţii de mizerie, igienă precară, dezastre naturale, război; transmiterea se face prin contact direct.Adultul este de mici dimensiuni, cu corpul de formă aplatizată, prevăzut cu 6 picioare.Femelele fecundate pătrund în grosimea tegumentului, preferând plicile ( încheieturile mâinilor, axilă, penis, scrot sau şanţul submamar); depun la acest nivel 25-30 de ouă, din care în 4-5 zile apar larvele, apoi se transformă în nimfe şi în final în adulţi.Ciclul biologic durează aproximativ 2-3 săptămâni.tratamentul se face cu preparate pe bază de benzyl-benzoat sau gamma-benzen hexaclorid.

Căpuşele parazitează mai frecvent animalele, cărora le sug sîngele, omul este infestat doar accidental.Ele rămân ataşate de corpul organismului pe care îl parazitează un timp variabil, între o noapte (căpuşa moale) sau mai multe zile( căpuşele tari,

53

ixodidele).Sunt vectori ai unor afecţiuni cum sunt rickettsiozele, febră recurentă, febră butonoasă, babetsioze, dar şi infecţii virale (flavivirusuri, bunyavirusuri), cu determinări meningo-encefalice.

54

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR VIRALE

IZOLAREA ŞI CULTIVAREA VIRUSURILOR PE CULTURI CELULARE

Prin culturi celulare înţelegem menţinerea în viaţă şi multiplicarea „ in vitro” a unor celule de provenienţă animală sau umană, din ţesuturi normale sau maligne, adulte sau embrionare.Deosebim:

- culturi primare, care provin direct dintr-un ţesut;- culturi secundare, obţinute din culturile primare;- linii celulare care sunt culturi de celule adaptate cultivării şi multiplicării

indefinite”in vitro”;Cultivarea virusurilor pe culturi celulare comportă 2 etape:1. Obţinerea culturii celulare2. Inocularea virusului şi urmărirea dezvoltării acestuiaUrmărirea culturilor inoculate şi a modificărilor produse de virusuri asupra acestora.- culturile se urmăresc zilnic, la microscop, cu obiectiv mic.Totalitatea modificărilor

morfologice care apar la nivelul pânzei celulare şi afectează celulele unei culturi monostrat, se numeşte efectul citopatogen ECP al virusului respectiv, şi este un semn al dezvoltării virale.Foarte rar este patognomonic pentru un anumit virus, dar orientează diagnosticul spre anumite grupe virale şi spre alte investigaţii utile în final diagnosticului.

- apariţia efectului citopatogen poate însemna dezvoltarea unui virus în cultura celulară respectivă, dar poate fi şi efectul toxic al produsului inoculat.Menţinerea efectului şi în pasajul următor indică cu mare probabilitate o infecţie virală.Exemple de modificări cellulare produse prin ECP sunt:

o Rotunjirea şi mărirea celulelor, într-o cultură fibroblastică din plămân uman, determinată de infecţia cu adenovirus.

o Apariţia de incluziuni celulare, poate fi foarte caracteristică, de ex. corpusculii Babeş- Negri, prezenţi în citoplasma unor neuroni infectaţi cu virusul rabiei.Incluziunile pot apărea şi intranuclear ( virusul herpetic).

Izolarea virusurilor pe ouă embrionate

- se utilizează în laboratoarele de virusologie deoarece unele virusuri se dezvoltă preferenţial pe ouă embrionate ( de ex. virusul gripal, rickettsii şi pararickettsii), iar altele produc modificări foarte caracteristice ( de ex. pox-virusurile).

Cele mai importante căi de inoculare sunt: pe membrana corioalantoidă, în cavitatea alantoidiană, în sacul amniotic şi sacul vitelin.Datorită răspândirii largi a tehnicii de cultivare a virusurilor pe culturi celulare, ouăle embrionate se folosesc mai rar, mai ales pentru izolarea unor mixovirusuri ( virusurile gripale) şi poxvirusuri ( v. variolei).

În afară de izolarea şi multiplicarea virusurilor, ouăle embrionate se folosesc şi pentru efectuarea reacţiei de neutralizare pentru virusurile gripale, precum şi pentru prepararea de antigene şi vaccinuri. Diagnosticul se completează cu teste chimice care permit clasificarea virusurilor pe baza acidului nucleic pe care-l conţin ( ADN sau ARN), reacţii de neutralizare, toate reacţiile antigen-anticorp cunoscute ( R.F.C., reacţia de hemaglutino-inhibare, de hemadsorbţie şi inhibare a hemadsorbţiei, ELISA, precipitare în gel, imunofluorescenţă, etc.).

55