122307450 Lucrari Practice Microbiologie(1)

STERILIZAREA SI

DEZINFECTIA

• Sterilizarea – distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv a sporilor.

• Dezinfectia – distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu in mod necesar si a sporilor.

STERILIZAREA

• Agenti fizici: - Caldura - Frigul - Uscarea - Radiatiile - Ultrasunetele - Presiunea mecanica - Presiunea osmotica

DEZINFECTIA / ANTISEPSIA

• Agenti chimici: - Substante chimice elementare - Compusi anorganici - Compusi organici

STERILIZAREA PRIN CALDURA

• Punctul termic mortal – cea mai scazuta temperatura care distruge in 10 minute toate bacteriile unei specii in conditii standard (1 – 2 ml. suspensie bacteriana in concentratie de 50.000 UFC/ml., in tampon fosfat, pH = 7


• Timpul termic mortal – cel mai scurt interval de timp necesar pentru ca toate bacteriile unei populatii microbiene sa fie distruse la o temperatura data


• Caldura umeda: - Autoclavarea - Fierberea - Tindalizarea - Pasteurizarea

• Caldura uscata: - Cuptoare speciale cu aer cald (pupinele sau etuve) - Aducerea la incandescenta - Flambarea - Incinerarea

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA AUTOCLAVAREA

• Caldura umeda distruge bacteriile mai repede decat caldura uscata la aceeasi temperatura deoarece este mai penetranta.

• Sterilizarea prin caldura umeda utilizeaza vaporii de apa sub presiune in autoclav.

• 121 °C – 15 min. • 134 °C – 3 min.


• Bacteriile in forma vegetativa sunt distruse la temperaturi cu 10 – 15 °C mai mari decat temperatura lor maxima de dezvoltare.

• Majoritatea bacteriilor in forma vegetativa mor in timp de 10 minute la 50 – 60 °C.


• Majoritatea sporilor bacterieni sunt distrusi in 10 minute la 100 °C.

• Sporii de Clostridium botulinum pot rezista 8 ore la 100°C.

• Cel mai rezistent – sporul de Bacillus stearotermophilus, acesta necesita pentru distrugere 15 – 18 minute la 121°C si 40 minute la 115°C.

• Sporii de B. stearotermophilus – indicator in aprecierea eficientei sterilizarii prin caldura umeda.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA

• Ce se poate steriliza prin autoclavare? - Instrumentar medical - Material moale (pansamente, campuri operatorii,

halate etc.) - Solutii perfuzabile - Materiale de laborator (medii de cultura, tampoane

pentru recoltari prelevate, materiale infecte).

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA FIERBEREA

• Prin fierbere timp de 30 minute se distrug bacteriile in forma vegetativa, virusurile si fungii, dar rezista unii spori bacterieni.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA TINDALIZAREA

• Sterilizare fractionata prin mentinerea substantelor la temperaturi de maximum 100 °C timp de 30 – 60 minute succesiv timp de mai multe zile (3 – 8).

• In intervalele dintre incalziri recipientele se mentin la temperatura camerei, timp in care eventualii spori prezenti in preparat vor trece in forma vegetativa si astfel vor fi distrusi la incalzirea ulterioara.

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA PASTEURIZAREA

• Prin incalziri la 62 - 85°C pe perioade de timp variabile este o metoda de conservare a unor produse alimentare.

• Sunt distruse formele vegetative ale bacteriilor si fungii, dar rezista sporii si enterovirusurile.

• In functie de temperatura se disting 3 tipuri de pasteurizare:

- Inalta: 8 – 15 sec. la 85°C - Mijlocie: 40 – 45 sec. la 71 – 74 °C - Joasa: 30 min. la 62 - 65°C

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA CUPTOARE CU AER CALD (ETUVE)

• Formele vegetative ale bacteriilor sunt distruse prin caldura uscata in 10 minute la 60 – 80 °C.

• Sporii cei mai rezistenti de B. stearotermophilus in 20 minute la 180 °C.

• 1 ora – 180 °C

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA CUPTOARE CU AER CALD (ETUVE)

• Ce se poate steriliza prin caldura uscata? - Sticlarie de laborator - Obiecte de portelan - Unele instrumente medicale - Substante sub forma de pulbere - Solutii neapoase

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA ADUCEREA LA INCANDESCENTA

• Se sterilizeaza ansa bacteriologica si spatula pentru folosire unica.

• Nu se indica utilizarea acestei metode

pentru instrumente medicale (foarfeci, pense, ace), deoarece se pot degrada.

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA FLAMBAREA

• Trecerea prin flacara timp de cateva secunde a obiectului de sterilizat (gura eprubetelor, flacoanelor, partea efilata a pipetelor Pasteur etc.).

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA INCINERAREA

• Se foloseste pentru materialele infectate care nu se recupereaza:

- Siringi de unica folosinta - Pansamente - Animale de experiente - Deseuri biologice rezultate din laboratoarele de

microbiologie - etc.

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA

• Mecanismul distrugerii bacteriilor prin caldura uscata consta in:

- accelerarea fenomenului de oxido – reducere - asfixie - coagulare - carbonizare.

FRIGUL

• Bacteriile suporta, in general, mai bine temperaturile scazute decat pe cele ridicate.

• La temperaturi sub cea minima de crestere metabolismul si inmultirea bacteriilor inceteaza, majoritatea trecand in stare de latenta.

FRIGUL REFRIGERAREA

• La +4 - +10 ° C majoritatea bacteriilor rezista luni si ani de zile cu conditia eviatarii uscarii.

• Unele bacterii care se intalnesc numai la om (meningococii, gonococii) nu sunt rezistente si mor repede la temperaturi sub cea optima.

FRIGUL CONGELAREA

• In general, la 0°C efectul temperaturii este bactericid.

• Moartea bacteriilor se produce prin inghetarea apei de solvire cu formarea de pungi cu solutii hiperconcentrate care au efect toxic si/sau producerea de cristale de gheata.

FRIGUL CONGELAREA

• La temperaturi mult sub 0°C, de -30°C pana la - 70°C nu se constata un efect bactericid deoarece la aceste temperaturi nu se formeaza pungi cu slotii hiperconcentrate sau cristale de gheata.

• Efectul bactericid este mai puternic prin repetarea operatiunilor de inghetare si dezghetare.

USCAREA

• Actiunea uscarii difera in functie de forma de viata a bacteriilor.

• Formele vegetative sunt mai sensibile, fiind distruse prin concentrarea sarurilor si denaturarea fizico – chimica a proteinelor.

USCAREA

• Pentru formele vegetative rezistenta la uscare depinde de continutul in lipide al invelisurilor celulare: cu cat cantitatea de lipide este mai mare, cu atat pierderea de apa se produce mai incet.

• Ex: - micobacteriile care au in compozitia lor 40% lipide rezista timp de 6 – 8 luni in praf,

- bacilii Gram (-) cu 20% lipide rezista doar 1 – 2 saptamani - pneumococul moare in cateva ore in conditii de uscaciune - gonococul se distruge imediat.

USCAREA

• Pentru conservarea bacteriilor in laborator se intrebuinteaza liofilizarea, metoda de uscare in stare de congelare sub vid.

• Prin liofilizare bacteriile pot supravietui

timp indelungat chiar pastrate la temperatura camerei.

RADIATIILE U.V. – LUMINA SOLARA • Lumina solara, datorita continutului in U.V. are

efect bactericid, efect influentat de permeabilitatea atmosferei.

• Lumina solara constituie factorul principal de reducere a florei microbiene a aerului, de pe suprafata solului si in apele limpezi, putin adanci.

• Timpul de distrugere este variabil in functie de specia bacteriana: 1h pentru E.coli, 2 – 3 h pentru Salmonella typhi si 5 – 7 ore pentru Mycobacterium tuberculosis.

RADIATIILE U.V.

• U.V. (240 – 280 nm.) distrug bacteriile pe de o parte direct prin absorbtia lor de catre acizii nucleici si proteinele bacteriene, absorbtie urmata de rupturi ale legaturilor chimice cu formarea de noi legaturi intre pirimidine si pe de alta parte indirect prin modificari ale mediului – producerea de ozon in aer si peroxizi in ape, compusi care nu au actiune antibacteriana.

RADIATIILE U.V. • In practica U.V. se folosesc pentru

decontaminarea suprafetelor si a aerului in incaperi de policlinica si spital, in Sali de operatie si laboratoare.

• Fotoreactivarea – fenomenul prin care bacteriile au fost “distruse” prin U.V. sunt reactivate prin expunere la lumina puternica, cu lungimea de unda de 400 nm.

• In aceste conditii se activeaza o enzima care desface dimerii pirimidinici formati sub actiunea U.V.

RADIATIILE RADIATIILE IONIZANTE

• Radiatiiile X si gamma au efect bactericid prin ionizare cu formare de radicali de oxigen bactericizi.

• Radiatiile ionizante se folosesc indeosebi pentru sterilizarea produselor termolabile (ex. instrumentar medical din material plastic de unica folosinta).

ULTRASUNETELE

• Efectul bactericid se exercita datorita fenomenului de cavitatie prin activarea gazelor dizolvate in citoplasma, urmata de ruperea peretelui celular.

• In medicina ultrasunetele se folosesc la sterilizarea unor instrumente medicale.

PRESIUNEA MECANICA

• Majoritatea bacteriilor in forma vegetativa rezista bine la 3.000 atm., pierderea viabilitatii producandu-se dupa 14 ore la 6.000 atm.

• Sporii bacterieni sunt mult mai rezistenti, necesitand pentru inactivare 12.000 – 20.000 atm.

PRESIUNEA OSMOTICA

• La o presiune osmotica mai mare, in mediu hipertonic se produce “uscarea osmotica” a bacteriilor prin trecerea in stare de latenta sau moartea lor. Apa iese din celula, citoplasma se retracta impreuna cu membrana citoplasmatica care se desprinde de peretele bacterian.

• Hiperosmolaritatea se foloseste in conservarea alimentelor prin concentratii mari de sare sau de zahar.

PRESIUNEA OSMOTICA

• In medii hipotone celula bacteriana se hidrateaza , devine turgescenta, se rup invelisurile obtinandu-se moartea celulei.

DEZINFECTANTE

• Substante chimice elementare: - O2, H2,

- metale grele: Ag., Hg., Cu.

• Compusi anorganici: - acizi: acid boric, acid salicilic, H2SO4, HCl. - baze: NaOH - saruri: AgNO3, clorura de Hg., permanganat de

potasiu, bicromat de potasiu, sulfat de cupru

DEZINFECTANTE

• Compusi organici: - Detergenti – anionici si cationici - Fenoli, alcooli, eteri - Aldehide - Coloranti

TEMA PENTRU STUDENTI

• Continuati prezentarea Power Point cu detalii despre dezinfectante si antiseptice

• Clasificarea lor • Mecanisme de actiune • Cateva notiuni despre fiecare dintre ele • Trimiteti pe mail la adresa:

Sterilizarea

DEFINITII 1.Sterilizarea -distrugerea tuturor microorganismelor

patogene/nepatogene de pe o suprafata/din interiorul unor obiecte

-se poate face prin: caldura , cu substante chimice , cu

radiatii ionizante, prin filtrare 2.Dezinfectia -distrugerea UNOR microorganisme in special patogene -se face prin:caldura,radiatii,substante chimice

3.Asepsia -ansamblul masurilor luate pentru prevenirea contaminarii unor materiale si organisme cu microorganisme. 4.Antisepsie -distrugerea/indepartarea temporara a formelor vegetative microbiene de pe substraturile

vii(mucoase,tegumente,plagi)cu ajutorul antisepticelor 5.Antiseptic -substanta chimica netoxica pentru tesuturile vii,cu

actiune reversibila ,bacteriostatica asupra microorganismelor

In alegerea metodelor folosite pentru

sterilizare trebuie sa se tina cont de:

1.sensibilitatea microorganismelor fata de actiunea unor factori de mediu externi 2.calitatile fizice si chimice ale materialului supus sterilizarii

I.Sterilizare prin caldura : a.uscata 1.incalzire la incandescenta 2.sterilizare cu aer supraincalzit b.umeda 1.sterilizare prin vapori sub presiune(autoclavare)

Metode de sterilizare prin caldura uscata 1.Incalzirea la incandescenta -mentinerea obiectului in flacara pana devine rosu,dupa care se lasa sa se raceasca la temperatura camerei. -se aplica pentru ANSA BACTERIOLOGICA inainte si dupa fiecare folosire -microorganismele sunt carbonizate 2.Sterilizarea cu aer supraincalzit Se realizeaza- in cuptorul Pasteur (sau Poupinel) - 180°C ,1h Determina carbonizarea : -microorganismelor -formelor vegetative /spori Se aplica pentru obiecte din sticla/ portelan NU se aplica obiectelor cu parti metalice, a celor din cauciuc, lichide

Cuptorul cu aer cald (Poupinel)

Controlul sterilizarii se urmareste prin: -controlul temperaturii interioare cu termonetrul -culoarea hirtiei / dopurilor din vata care trebuie sa fie galbuie.

3.Autoclavarea -cea mai sigura metoda de sterilizare -formele vegetative si sporii sunt distrusi -h=30min,p=1 atm,120°C In autoclav se sterilizeaza : -medii de cultura -material infectios -obiecte de cauciuc -casete cu material chirurgical NU se sterilizeaza-lichide alterabile peste 100°C

Autoclave

http://www.systec-lab.com/cgi-bin/oe2edit.cgi?site=002002001001&language=en&session_id=29HteX&kill_access=002000_en.htm&kill_access=002000_en.htm

http://www.caloris.ro/_content/output/item.galPhoto.php?id=211

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Sapphire.jpg

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Autoclaves.jpg

Controlul sterilizarii in autoclav Se realizeaza prin:- teste chimice - teste biologice -termometre Testele chimice: -se folosesc tuburi din sticla ce contin substante sub forma de pulbere cu punct de topire cunoscut in jur de 120°C (parachinona, sulf, acid benzoic) -se aseaza in autoclav odata cu obiectele de sterilizat -daca in autoclav s-a ajuns la temp. de topire a acestor substante, dupa

deschiderea autoclavului se va observa ca sint solidificate in bloc. Teste biologice: -se folosesc culturi sporulate de Bacillus anthracis cu care se impregneaza fire de

bumbac -se introduc in tubusoare -daca s-a atins 120°C sporii sunt distrusi iar reinsamantarea lor pe medii de

cultura nu va fi urmata de o dezvoltare a culturii de bacili carbunosi

II.Filtrarea -metoda de sterilizare la rece -microorganismele sunt retinute de o

substanta poroasa -este aplicata solutiilor denaturabile termic -dupa filtrare este obligatoriu controlul

sterilitatii solutiei (filtratul este insamantat pe medii de cultura adecvate ,este termostatat si poate ficonsiderat steril daca in 24-48 de ore nu se dezvolta nici o colonie)

A typical set-up in a microbiology laboratory for filtration sterilization of medium components that would be denatured or changed by heats

sterilization of medium components

Controlul calitatii

-insamantari din filtrat pe medii de cultura adecvate

-daca in 3-4 zile de mentinere la termostat nu se dezvolta microorganisme,filtratul

este steril

Sterilizarea cu substante chimice Substantele folosite pot fi: Glutaraldehida Peroxid de hidrogen stabilizat Acid peracetic Timpul de contact al substantei cu substratul

tratat difera in functie de produs :vor trebui respectate recomandarile producatorului privitoare la conditiile de lucru atat pentru o sterilizare corecta cat si pentru evitgarea accidentelor

Sterilizarea cu oxid de etilena –se foloseste numai cand nu exista alt mijloc de sterilizare adecvat

-metoda este delicata iar erorile de procedura pot sa conduca fie la o sterilizare ineficienta fie la accidente(toxice)

Sterilizarea prin radiatii ionizante

-razele gama sunt cele mai penetrante Razele gama pot fi obtinute dintr-o sursa de cobalt 60 cesiu

137 Este o metoda de sterilizare la rece folosita pentru

medicamente ,instrumentar confectionat din material degradabil termic

Dezinfectia

se poate face prin :caldura uscata(flambarea),caldura umeda(fierberea,pasteurizarea tindalizarea ) ,radiatii , substante chimice

Dezinfectia prin caldura uscata Flambarea -trecerea repetata,rapida a obiectelor sau a

unor parti a obiectelor prin flacara -se sterilizeaza–pipete -orificiul baloanelor,eprubetelor -inainte si dupa utilizare NU se flambeaza obiecte de metal

Metode de dezinfectie prin caldura umeda

Fierberea - sterilizare incompleta deoarece nu actioneaza

asupra tuturor sporilor -timpul de sterilizare =minimum 30 min., din

momentul inceperii fierberii -se foloseste pentru sterilizarea instrumentelor ce

se utilizeaza imediat.

PASTEURIZAREA -sterilizare partiala (sunt distruse doar formele vegetative

prin coagularea proteinelor la temp.<100°C) -incalzirea se face in baia de apa 60-65°C timp de 30 min. 70-75°C timp de 15 min. 85-90°C timp de citeva secunde urmata de racirea brusca la 4°C. Aceasta metoda: -reduce nr. microorganismelor - opreste trecerea sporilor in forme vegetative -se utilizeaza in special pt conservarea unor produse alimentare ( produse lactate, alcoolice).

Equipment for the high-temperature short-time pasteurization of milk.

Tindalizarea

-sterilizare fractionata/discontinua -solutia se incalzeste in baia de apa 1-3 pe zi,3-8 zile

consecutiviar intre incalziri se pastreaza la temperatura laboratorului(21ºC);

-dupa ultima incalzire se raceste brusc la 4ºC. -la temperatura laboratorului sporii(eventual

prezenti)fermineaza iar formele vegetattive vor fi distruse de o noua incalzire

Aceasta metoda: - este aplicata in special pt lichidele care peste 100°C se altereaza ( unele medii de cultura).

Dezinfectia cu radiatii ultraviolete:este indicata pentru suprafetele de lucru ,aerul din boxele de lucru

Este o metoda complementara masurilor de curatenie si dezinfectie chimica

Sunt folosite lampi fixe sau mobile ,cu tuburi de UV intre 15-30W

DEZINFECTIA CHIMICA Poate fi clasificata in : – dezinfectie de nivel inalt - dezinfectie de nivel mediu - dezinfectie de nivel scazut

Dezinfectia de nivel inalt Distruge toate microorganismele cu

exceptia unui numar redus de spori bacterieni

Timpul de contact trebuie sa fie de cel putin 20 minute

Substantele utilizate sunt : glutaraldehida peroxidul de hidrogen stabilizat acidul peracetic

Dezinfectia de nivel mediu Distruge Mycobacterium tuberculosis

,forme vegetative ale bacteriilor ,fungi,virusuri.

NU distruge sporii bacterieni Tipul de contact necesar este de 10

minute Substantele utilizate

sunt:fenolii,iodofori,alcooli,compusi pe baza de clor

Dezinfectia de nivel scazut Distruge majoritatea bacteriilor in forma

vegetativa ,unele virusuri si unii fungi NU distruge sporii bacterieni NU distruge Mycobacterium tuberculosis Substante

utilizabile:fenoli,iodofori,hipoclorit de sodiu

AGENTI CHIMICI Substatele antiseptice si dezinfectante: -au actiune antimicrobiana neselectiva -antisepticele sunt utilizate pe tegumente si mucoase -dezinfectantele sunt utilizate numai pe structuri inerte Aceiasi substanta chimica in raport cu concentratia poate fi antiseptic sau dezinfectant In functie de mecanismul de actiune antisepticele si dezinfectantele se clasifica in

substante care: a.Denatureaza proteinele(efect bactericid):acizi,baze alcooli b.Oxideaza gruparile chimice libere ale enzimelor:hipermanganat de potasiu,peroxid de hidrogen c.Blocheaza gruparile chimice libere ale enzimelor:azotat de Ag,oxid de etilen d.Lezeaza membranele celulare:clorhexidina,detergenti e.Altereaza acizii nucleici:rivanol,violet de gentiana,albastru de metil,fucsina bazica

Studiul morfologiei bacteriene Coloratia simpla Coloratia Gram

Examinarile bacteriologice urmaresc: -evidentierea -identificarea bacteriilor din produse patologice. Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o etapa foarte importanta.

Morfologia bacteriana se refera la forma, dimensiunile si asezarea bacteriilor.

Microscopia optica permite evidentierea

formei si a dimensiunilor bacteriilor. Microscopia electronica permite

cunoasterea structurii bacteriilor.

Bacteriile avind dimensiuni de ordinul µm, nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.

Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

Examenul microscopic se executa : - direct din produsele patologice (examen

microscopic direct) - din culturi pure.

Preparatele microscopice sint de 2 feluri: - preparat nativ-cu germeni vii - frotiu / preparat colorat- cu germeni

omoriti

Examenul microscopic da indicatii asupra: 1. prezentei microorganismelor in preparat 2. proprietatilor morfotinctoriale: - forma (bacili, coci, spirili) - marimea - mobilitatea ( in preparatul nativ ) - existenta eventuala a formatiunilor neobligatorii ( cili, capsula, spori)

- asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-, tetrade, etc) - proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )

Examenul microscopic - direct din produsele patologice -permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos, stafilococ ) - constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/69/Bacterial_morphology_diagram.svg

Forme fundamentale bacteriene COCII Au in general diametrul de 1µ Prezinta forma rotunda doar unele

bacterii:stafilococi, micrococi . Majoritatea bacteriilor au forma ovoida. Dispozitia bacteriilor rezulta in urma

diviziunii lor, putand ramane in urma diviziunii asociate fie pe verticala fie pe orizontala

Cocii pot prezenta dispozitia in: I.diplo:diplococi Ex:Pneumococii :coci ovoizi cu aspect de flacara de

lumanare Neisserii:coci cu aspect reniform II.lanturi: Streptococi:coci, diviziune ordonata pe orizontala Tetrade:Micrococi:4 coci reuniti Octade:Sarcina:8 coci reuniti Gramezi:Stafilococi :aglomerari neordonate de coci cu

aspect de ciorchine de strugure(staphylos=ciorchine),acestia putand avea si dizpozitie de diplococi sau de lanturi scurte

BACILII Sunt bacterii de forma cilindrica de bastonas Dispozitia in frotiu:

izolati:Enterobacterii :bacilul coli Diplobacili: Bacilul carbunos Streptobacili:reprezentantii genului

Bacillus:Bacilul carbunos Bacili uniti la capete: Mycobacterium tuberculosis (aspect de majuscule

X,Y,W) Corynebacterium diphteriae(aspect de litere

chinezesti) Bacili uniti in palisade:Bacilii pseudodifterici

COCOBACILII Sunt bacili scurti si subtiri Ex: Haemophilus Bordetella Brucella

FORME SPIRALATE 1.Bacili incurbati: Vibrionul holeric – bacil incurbat,mobil, cu

aspect de virgula Helicobacter:mai multi bacili incurbati uniti

la capete – produc gastrita ,ulcer duodenal 2.Bacterii spiralate Spirochete : bacterii spiralate, lungi,

mobile prin aparata locomotor Ex:Treponema pallidum

Dichotomous keys

Examenul microscopic - direct din produsele patologice -permite in unele infectii stabilirea diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos, stafilococ ) - constituie o etapa esentiala in identificarea bacteriana.

Preparatul nativ ( cu germeni vii )

Ex. microscopic al preparatului nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela :

-a unei suspensii de germeni vii

intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu de cultura lichid

-a produsului patologic (singe, sediment urinar, lcr).

Examinarea prep. nativ -are implicatii restrinse -nu da informatii asupra tuturor

proprietatilor morfologice ale bacteriilor Este obligatorie completarea lui cu examinarea preparatului colorat.

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frotiu)

Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detailat pe preparate fixate si colorate, cu germeni omoriti .

Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex. in reactia de umflare a capsulei .

Timpii de executie a preparatului colorat

Timpi pregatitori: 1. - etalarea = intinderea frotiului 2.- uscarea 3.- fixarea ( procedee fizice : prin incalzire procede chimice: cu alcool

metilic, etilic, alcool -eter, acid acetic )

Fixarea Scopul fixarii este multiplu: - microorganismele sint omorite=preparat

neinfectios - preparatul adera mai bine de lama - prin omorirea microorganismelor se mareste

permeabilitatea peretelui celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de coloranti = detalii fine de strucura

Coloratia

Procedeu fizico-chimic complex, in care colorantii se combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la microscop.

Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeaza in continutul celular , unde are loc formarea unei combinatii stabile.

Colorarea se executa de obicei prin acoperirea suprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa sa actioneze un timp limitat, la cald sau la rece.

Tipuri de coloratii

Coloratia simpla- se executa cu un singur colorant Coloratia combinata-care se realizeaza prin

actiunea succesiva sau simultana a mai multor coloranti, fiecare colorant actionind independent si fixindu-se pe anumite elemente

Coloratii speciale- pentru formatiuni morfologice

celulare si extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula

Coloratia simpla

- frotiul fixat - se acopera complet cu un singur

colorant: albastru de metilen sau fuxina, timp de 1-2 min.

se spala cu apa si se usuca in coloratia cu albastru de metilen toate

elementele se coloreaza in albastru in coloratia cu fuxina, toate elementele se

coloreaza in rosu

Coloratia simpla

Permite stabilirea unor proprietati morfotinctoriale ca:

-forma si marimea microorganismelor -existenta unor elemente celulare Este utila in diagnosticul prin examenul

microscopic direct din produsul patologic in: - gonoree -meningita cerebrospinala epidemica

Coloratii combinate: coloratia Gram

-larg utilizata in microbiologie -deosebeste germenii gram pozitivi

de cei gram negativi -orienteaza cercetarea in directia

identificarii lor.

Hans Christian Gram (medic danez)

Coloratia Gram

Tehnica de colorare

1. Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2 min. (Se spală cu apă de la robinet ).

2. Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2 min. (Se spală cu apă).

3. Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu se mai dizolva colorant. (Se spală cu apă).

4.Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se spala cu apa )

Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

Germenii gram + -rezista la decolorare -isi mentin culoarea albastru violet initiala

Germenii gram – -se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu

fuxina/safranina.

Coloratia Gram stanga:bacterii gram + dreapta:bacterii gram-

colorate-violet colorate-rosu

Diferenta de comportament in

coloratia Gram se explica prin structura si compozitia chimica diferita a peretelui celular la bacteriile gram+ si gram -.

Peretele celular la bacteriile Gram pozitive Este gros de 15-50 nm ,dar are structura mai

simpla Este format din pana la 40 de straturi suprapuse

de peptidoglican dar si acizi teichoici atasati de peptidoglican

Acizii teichoici au rol in aderarea bacteriilor de celule epiteliale ale mucoaselor si sunt antigene de suprafata ale bacteriilor gram pozitive, inducand anticorpi specifici de specie (anticorpii pemit identificarea bacteriilor ,diagnosticul indirect al bolilor infectioase si protectie fata de reinfectia cu bacteria respectiva)

Peretele celular la bacteriile Gram negative

Este subtire dar are o structura mai complexa

Compozitie chimica:peptidoglican in proportie redusa ,glucide,lipide, proteine in cantitate mare

Este multistratificat:detine peptidoglica,strat lipoproteic ,membrana externa , lipopolizaharid(LPS)

Lipopolizaharidul – este format dintr-o componenta lipidica- lipidul A si o componenta polizaharidica si lanturi oligozaharidice la exterior

Lipidul A este endotoxina la bacteriile Gram negative

Este responsabila de toxicitate , de fenomene toxice care apar in infectiile cu bacterii Gram negative:febra,diaree, greturi varsaturi,scaderea tensiunii arteriale

Lanturile oligozaharidice laterale – proemina la suprafata bacteriei ca spini si sunt in numar mare

Reprezinta Antigenul O responsabil de specificitatea bacteriilor Gram negative

Christian Gram recognized two different types of bacteria based on reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea urmatoarelor grupe de bacterii:

- COCI GRAM+ : - Streptococi - Stafilococi Pneumococi - COCI GRAM - : - Meningococ - Gonococ - BACILI GRAM+ : - Bacillus antracis ( bacilul carbunos), - Corynebacterium diphteriae ( bacilul

difteric) Clostridium botulinum ( bacilul botulinic) Clostridium tetani ( bacilul tetanic)

BACILI GRAM - : - E. Coli ( bacilul coli ) - K lebsiella -Pseudomonas ( bacilul piocianic) -Salmonella typhi ( bacilul tific ) COCOBACILI GRAM - : - Haemophilus influenzae - Bordetella pertusis - Brucela

Coci Gram +, dispusi in gramezi

COCI GRAM+ STAPHYLOCOCCUS AUREUS(coci,asezare in gramezi,ciorchine de strugure)

COCI GRAM + STREPTOCOCCUS PNEUMONIE

coci lanceolati , in diplo , capsula unica pentru ambii coci

Coci Gram+, dispusi in lanturi(streptoccocus pyogenes))

Bacili Gram – E.Coli (bacil cu capete rotunjite)

Cocobacili gram- Haemophilus infuenzae

Bacili gram- (diplobacili) Klebsiella

Frotiu lcr colorat Gram bacilul carbunos gram+,bacili cu capetele taiate

drept

Bacil carbunos-prezenta endosporilor Baci gram+

Trusa comerciala pt coloratia Gram 1.Violet de gentiana 2.Solutie de lugol 3.Alcool-acetona 4.Fuxina diluata/safranina

PREPARATE MICROSCOPICE

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 2

• In microbiologia clinica, microscopul este indispensabil.

• Microscopia uzuala o facem cu fond luminos.

• Numai in circumstante speciale recurgem la:

- microscopia cu fond negru, - cu contrast de faza sau - cu luminiscenta.

Microscopia optica pe fond luminos

• Bacteriile, fungii, protozoarele le urmarim: in produse patologice sau in culturi

fie in stare nativa, vie (preparate umede), fie dupa fixare si colorare (preparate colorate).

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice umede

• Indicatii: - depistarea rapida si - identificarea spirochetelor, fungilor sau

protozoarelor - observarea rapida a mobilitatii

microorganismelor - depistarea si identificarea unor elemente

celulare si necelulare in expectoratie, lavaj bronsiolo – alveolar, urina, materii fecale, secretie vaginala, lichid duodenal etc.


• Materiale necesare: - lame de sticla: 76/25 mm., grosime 1 – 1,1mm. - laméle de sticla: 18/18, 20/20, 22/22, 24/24 mm., grosime 0,1 - 0,17 mm. - microscop optic: obiective uscate de 4x, 10x, 20x si 40x.


• Interpretare: - Miscarea browniana determina oscilatia

pe loc a particulelor. Curentii de fluid antreneaza o multime de

particule care traverseaza campul microscopic in aceeasi directie.


- Un microorganism este mobil cand isi modifica pozitia fata de un reper din vecinatate.

- Bacteriile monotriche sau lofotriche au miscari rapide de rostogolire,

- Bacteriile peritriche au miscari oscilatorii.

Microscopia optica pe fond luminos Preparate microscopice colorate

• Principiu: Fixarea colorantilor (ex. coloranti bazici de

anilina etc.) pe structurile protoplastului mareste refringenta microorganismelor si permite observarea detaliilor morfologice.


• Structuri speciale asociate peptidoglicanului bacterian determina anumite afinitati tinctoriale care apar dupa coloratii diferentiale: Gram, Ziehl – Neelsen etc.


• In coloratiile negative particulele insolubile ale colorantului (carbonul din tusul de India, nigrozina) formeaza fondul negru al campului microscopic pe care se observa usor, ca un halou incolor, capsula unor microorganisme ca: pneumococii, Cryptococcus neoformans etc.


• Indicatii: identificarea microscopica a microorganismelor.


• Procedura: 1. Efectuarea frotiului: Frotiul este materialul microbian etalat in

strat subtire pe suprafata unei lame de microscop marcata cu indicativul produsului examinat.


• Frotiul se efectueaza in 3 timpi:

- Etalarea - Uscarea rapida a frotiului in aer cald - Fixarea frotiului pentru bacterioscopie


• 2. Colorarea frotiului • 3. Protejarea frotiului prin montarea in

balsam de Canada


Coloratia Gram

1. Colorare cu sol. Violet de gentiana (cristal violet) 1% - 1’. Spalare cu apa de robinet. 2.. Mordantare cu sol. Lugol (sol. de I2 in KI) – 1’. Spalare cu apa de robinet. 3. Decolorare cu sol. alcool – acetona – 30” – 1’ Spalare cu apa de robinet. 4. Colorare cu sol. Safranina (fucsina bazica diluata) – 1’. Spalare cu apa de robinet.

Coloratia Gram

Link-uri • http://www.microbiologybytes.com/LabWork/LabWork.ht

m • http://www.ncl.ac.uk/dental/oralbiol/oralenv/tutorials/chris

tian_gram.htm • http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/g

ram.htm • http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/mi

croscopy/gramstain.html • http://homepage.ntlworld.com/diamonddove/01_Content

s/Contents.htm • http://micro.digitalproteus.com/morphology.php

http://www.microbiologybytes.com/LabWork/LabWork.htm

http://www.microbiologybytes.com/LabWork/LabWork.htm

http://www.ncl.ac.uk/dental/oralbiol/oralenv/tutorials/christian_gram.htm

http://www.ncl.ac.uk/dental/oralbiol/oralenv/tutorials/christian_gram.htm

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html

http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html

http://homepage.ntlworld.com/diamonddove/01_Contents/Contents.htm

http://homepage.ntlworld.com/diamonddove/01_Contents/Contents.htm


• Cautati si alte link-uri despre coloratia Gram (“staining Gram”) si imagini cu bacterii Gram (+) si Gram (-).

• Desenati in caietul de lucrari bacteriile pe care le-ati gasit.

PREPARATE MICROSCOPICE


COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA ZIEHL - NEELSEN

INDICATII: - colorarea la cald a micobacteriilor din

prelevate patologice sau culturi


• Reactivi: 1. Solutie de fucsina fenicata Ziehl 2. Solutie decoloranta: amestec acid –

alcool (H2SO4 + alcool etilic 95°) 3. Solutie recoloranta: albastru de metilen


Procedura: 1. Se aseaza lama cu frotiul fixat pe un

suport metalic 2. Se acopera frotiul din abundenta cu sol.

de fucsina fenicata 3. Se lasa 15’, timp in care se fac 3 treceri

cu flacara becului de gaz Bünsen pe sub lama de sticla, astfel incat sa incalzim colorantul pana la emitere de vapori.


• Atentie! Colorantul nu trebuie sa ajunga la fierbere!

• Daca colorantul se evapora sau se usuca pe lama, trebuie sa adaugam colorant proaspat!

4. Se spala frotiul din abundenta cu apa de robinet


5. Se decoloreaza frotiul cu amestec acid – alcool – 2’

6. Se spala cu apa de robinet 7. Recolorare cu sol. albastru de metilen – 1’


• Citire si interpretare: - bacilii acido – alcoolo - rezistenti (BAAR) – apar rosii stralucitori - celulele inflamatorii, celulele de descuamare sau celulele tisulare, bacteriile neacido – alcoolo – rezistente – se vor colora in nuante de albastru

COLORATII DIFERENTIALE COLORATIA KINYOUN

• INDICATII: Coloratie la rece a micobacteriilor din

prelevate patologice sau culturi


• Reactivi: A. Solutie de fucsina fenicata Kinyoun B. Solutie decoloranta de acid – alcool (HCl + alcool etilic 95°) C. Solutie recoloranta: albastru de metilen


Procedura: 1. Colorare la rece cu sol. de fucsina fenicata

Kinyoun – 5’ 2. Spalare cu apa de robinet 3. Decolorare cu amestec acid – alcool – 30” 4. Spalare cu apa de robinet 5. Recolorare cu albastru de metilen – 1’ 6. Spalare cu apa de robinet.


• Citire si interpretare: - bacilii acido – alcoolo - rezistenti (BAAR) – apar rosii stralucitori - celulele inflamatorii, celulele de descuamare sau celulele tisulare, bacteriile neacido – alcoolo – rezistente – se vor colora in nuante de albastru

COLORATII SIMPLE

• Coloratia cu albastru de metilen: 2’ • Coloratia cu albastru de metilen, varianta

Wayson: 10”

COLORATII NEGATIVE

1. Coloratia negativa cu tus de India Principiu: particulele colorate nu pot penetra capsula

bacteriilor sau levurilor, care apare necolorata pe fondul colorat al preparatului

Indicatii: depistarea Cryptococcus neoformans,

depistarea capsulei bacteriene in primoculturi, urmarirea reactiei de umflare a capsulei etc.

COLORATII NEGATIVE

• Citire si interpretare: Bacteriile si levurile capsulate apar

inconjurate cu un halou clar pe fondul uniform intunecat al preparatului.

COLORATII NEGATIVE

2. Coloratia negativa cu nigrozina

COLORATII FLUORESCENTE Coloratia cu auramina – rhodamina Principiu: • Structuri speciale, lipoidice, asociate peretelui

unor bacterii confera rezistenta la decolorarea protoplastului prin solutii de acizi sau/si alcool. Bacteriile care nu poseda asemenea structuri sunt decolorate si trebuie recolorate pentru a putea fi observate.

• Endosporii bacterieni, ascosporii, chistele unor protozoare (ex. Cryptosporidium) sunt de asemenea acidorezistenti gratie invelisurilor lor.

COLORATII FLUORESCENTE

• Invelisurile unor microorganisme (micobacterii,endospori, chiste de Cryptosporidium etc.) sunt impermeabile si pentru colorant, care trebuie sa actioneze in solutii concentrate fie la cald, fie in prezenta unor detergenti.


Indicatii: Triajul frotiurilor din prelevate patologice pentru depistarea rapida a bacililor tuberculozei.


Reactivi: 1. Solutie coloranta cu Auramina O –

Rhodamina B 2. Solutie decoloranta (HCl conc. + alcool

etilic 95°) 3. “Contracolorant”: KMnO4


Procedura: 1. Colorare cu sol. Auramina O –

Rhodamina B– 15’ 2. Spalare cu apa de robinet 3. Decolorare cu acid – alcool – 2’ 4. Spalare cu apa de robinet 5. “Contracolorare” cu KMnO4 – 2’ 6. Spalare cu apa de robinet


• Examinare la microscopul cu fluorescenta cu obiectivele de 20x si 40x, asociate cu oculare de 10x.


Citire si interpretare: Bacilii acido – alcoolo – rezistenti se

coloreaza fluorescent stralucitor in galben – portocaliu cu Auramina O – Rhodamina B.

“Contracolorarea“ cu KMnO4 face fondul frotiului negru eventual numai cu resturi celulare cu fluorescenta galbena slaba.

ALTE TIPURI DE COLORATII

1. Coloratia May – Grünwald – Giemsa (aprecierea celularitatii)

2. Coloratia pentru Fe. (hemosiderina, sangerari tisulare)

3. Coloratia PAS (depistarea fungilor – se coloreaza in rosu)

4. Coloratia cu albastru de toluidina (pentru Pneumocystis carinii, P.jirovecii)

ALTE TIPURI DE COLORATII

5. Coloratia cu SUDAN III – pentru lipide 6. Coloratii imunocitochimice, reactii

peroxidaza – antiperoxidaza etc.

MEDII DE CULTURA


• Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:

izolarea bacteriilor din prelevatele patologice identificarea bacteriilor testari pentru initierea si monitorizarea

terapiei antimicrobiene.

• Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca:

mediile de cultura si metodele indicate pentru

izolare atmosfera, temperatura si intervalul de timp,

necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat

izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora daca antibiograma este indicata si care din

rezultatele ei se impun communicate.

• Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor.

• Ele se comercializeaza ca atare, sub

forma liofilizata, gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare.

• Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar – agar.

• agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic, hidro - coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbinți.

• se prezintă sub formă de fâșii

semitransparente de culoare cafenie-gălbuie.

• conține: 70–80% polizaharide, 10–20% apă și 1,5–4% substanțe minerale.

• este format din resturi galactozidice

esterificate la C6 cu o grupare sulfonică. • are o putere de gelificare foarte mare.

• Agarul este folosit la prepararea mediilor

de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii.

• Cresterea bacteriilor nu distruge structura

gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism.

• Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica.

• Mediul cu agar este un mediu relativ inert.

• Alte ingrediente, nutrienti, factori de crestere, indicatori de pH sunt adaugati in mediul cu agaroza.

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE

• Din punct de vedere a starii de agregare: medii lichide medii solide medii semisolide


• Medii lichide – bulioane Au utilizare restransa: izolarea din prelevate necontaminate (ex.

sange, exsudate din seroase, aspiratii din colectii purulente profunde, biopsii tisulare prin ac

MEDII DE CULTURA Medii lichide

• Izolarea in medii lichide: Avantaje: cea mai sensibila metoda de izolare in vitro

(cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut) neutralizeaza prin dilutie factori

antimicrobieni din prelevatul examinat


Mediile solide pot fi: neselective diferentiale selective

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE

• Medii neselective: agarul imbogatit cu 5% sange de berbec –

mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate

Ex.: - exsudate din caile respiratorii si din cavitatile conecte - exsudat conjunctival - puroi


• Medii diferentiale – contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de pH

Ex.: - geloza – sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice

- medii lactozate, cu variati indicatori de pH, diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo – pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo – negative)


• Medii selective – contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor.

• Exista o diversitate de medii selective.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE

• Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate: slab selective: - mediul Mac Conkey (agenti

inhibitori: saruri biliare si cristal violet) - mediul EMB (Levin) (agenti

inhibitori: eozina Y si albastru de metilen) Inhiba bacteriile Gram (+).


moderat selective: - mediul Salmonella – Shigella

- mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza)

- mediul Hektoen - mediul XLD - mediul Istrati – Meitert Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii

Gram (-) comensali.


medii inalt selective: - mediu Wilson – Blair Agent inhibitor: verde briliant Inhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor.


• Agarul – sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice: colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (–) si favorizeaza dezvoltarea celor Gram (+) bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si favorizeaza izolarea hemofililor kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea bacililor Gram (-) anaerobi etc.

MEDII DE CULTURA

• MEDII DE IMBOGATIRE: - medii lichide, care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala.

Ex.: bulion cu selenit acid de Na.: preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37°C in acest mediu, favorizeaza izolarea salmonelelor.

INCUBAREA CULTURILOR

- temperatura: 37°C – majoritatea bacteriilor 20 - 30°C – unele bacterii (Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes) 42°C – altele: Campylobacter jejuni / coli Se foloseste pentru incubare termostatul.

INCUBAREA CULTURILOR

• Atmosfera: in prezenta O2 – bacterii aerobe si facultativ

anaerobe in mediu cu 5 – 10 % CO2 – bacterii

carboxifile in mediu cu O2 (5 – 7 %), CO2 (8 – 10%), N2

(85%) – bacterii microaerofile

INCUBAREA CULTURILOR in mediu anaerob: Procedee chimice: bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic

sau thioglicolat de Na. tehnica OTT: incinta etansa in care O2 este

indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin. Procedee biologice: procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in

care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi)

CARACTERE DE CULTURA

• Exigente de cultivare • Intervalul necesar pentru obtinerea culturii • Aspectul si consistenta coloniilor • Modificari ale mediului • Mirosul degajat de cultura

Aceste caractere orienteaza identificarea

izolatelor!

CARACTERE DE CULTURA Exigente de cultivare

• Bacterii nepretentioase • Bacterii cu anumite exigente nutritive:

- Strict aerobe - Strict anaerobe - Facultativ anaerobe - Microaerofile - Carboxifile

CARACTERE DE CULTURA Intervalul necesar pentru aparitia

culturii

• Microorganisme cu crestere rapida: cultura apare dupa 18 – 24 h. (frecvent peste noapte)

• Microorganisme cu crestere lenta: necesita zile sau saptamani pentru aparitia culturii

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor

1. Dimensiune: mm. colonii mici (Ø < 1 mm.) colonii mijlocii (Ø ~ 1 mm.) microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul) colonii mari (Ø > 2 mm.)

2. Forma: punctiforme circulare neregulate (“in harta geografica”) filamentoase dendritice lenticulare


3. Relieful: plane aplatizate convexe bombate acuminate pulvinate ombilicate


4. Marginile: intregi ondulate lobate zimtate filamentoase cu valuri succesive de invadare a mediului

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor

• Neteda, umeda, lucioasa – forma de cultura S – conditionata de hidrofilia si incarcatura electronegativa a structurilor microbiene de invelis

• Mata, uscata, rugoasa – forma de cultura R a microorganismelor cu hidrofilie si incarcatura electronegativa reduse

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor

• Alte aspecte: - suprafata papilata - cu striuri radiare - zbarcita - catifelata - pufoasa - lanoasa - prafoasa

CARACTERE DE CULTURA Densitatea optica

Colonii: • transparente • semitransparente • opace


• Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare

• Culoarea coloniilor: - alba - galbena - aurie - neagra,

in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a virajului de culoare a unor indicatori introdusi in mediu.


• Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine, enzime sau pigmenti difuzibili. Hemoliza pe agar – sange Reactii pe medii diferentiale zaharate Reactii pe mediul cu galbenus de ou Pigmentogeneza

CARACTERE DE CULTURA Hemoliza pe agar - sange

• alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale

• beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete

• alfa – prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara, completa

• gamma: absenta hemolizei • cald – rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta

dupa incubare la 37°C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara, dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider)

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii diferentiale

zaharate

• Virajul de culoare a mediului • Culoarea coloniilor in functie de indicatorii

de pH • Fermentarea / Nefermentarea substratului

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii cu galbenus de ou

• Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor

• Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor

• Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor

CARACTERE DE CULTURA Pigmentogeneza

• Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul: - fluoresceina - piocianina - melanina

CARACTERE DE CULTURA Mirosul degajat de cultura

• Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie

• Proteus: socolata arsa • Clostridii: putri, fecaloid, de corn ars • Prevotella melaninogenica: acru • Nocardiile si streptomicetele: de subsol

mucegait

CARACTERE DE CULTURA Consistenta coloniilor

• untoasa • mucoasa – filanta • “albusului de ou bine batut spuma” • friabila • cretoasa • pasloasa • pieloasa

CARACTERE DE CULTURA Aderenta la mediu

• neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului)

• putin aderente • aderente • incastrate in mediu

MEDII DE CULTURA

suporturi materiale si nutritive care

servesc la cultivarea bacteriilor amestecuri de substante care asigura

cultivarea microorganismelor

Scopuri Izolarea in cultura pura Identificare Diagnostic, tratament Producerea industriala a unor substante

(prepararea vaccinurilor) Controlul sterilitatii sau incarcarcaturii

microbiene a unor elemente de mediu (apa, alimente)

Conditii 1. Surse de C, N, apa, substante minerale, energie,

substante nutritive, factori de crestere

2. pH optim, temperatura optima

3. Aero/anaerobioza 4. Sterile

Ingrediente

Peptona Extracte sau infuzii de carne Agenti de solidificare: agar Indicatori de pH: turnesol, rosu fenol Agenti selectivi Zaharuri

Prepararea mediilor de cultura

Amestecul ingredientilor: proportie, ordinea indicata Ajustarea pH-ului Repartizarea in recipiente adecvate Sterilizarea Controlul sterilizarii si al calitatii mediului

Clasificarea mediilor de cultura Dupa consistenta: lichide

solide semisolide Dupa provenienta: naturale sintetice Dupa compozitie si scop: simple complexe speciale

Clasificarea mediilor de cultura

Medii complexe de utilitate generala: - uzuale - cu proteine native Medii speciale selective de imbogatire anaerobi teste biochimice

Medii simple: Apa peptonata Bulion simplu Geloza simpla Medii complexe: bulion sange geloza sange geloza chocolatie

Medii lichide- bulion simplu

Categoria: Mediu de bază Componente: macerat de carne + peptonă + NaCl 0,5% Utilizare: pentru germeni nepretenţioşi

Geloza simpla Categoria: Mediu de bază Componente: bulion simplu + agar-agar

Geloza lactozata

Categoria: Mediu diferenţial Componente: geloză simplă + lactoză + albastru bromtimol

Utilizare: studierea fermentării lactozei

Geloza sange

Categoria: Mediu compus Componente:

geloză simplă răcită la 45°C + sânge defibrinat 10-20%

http://www.umftgm.ro/mbl/atlas/general/medsol/ge.html

Geloza socolatie Categoria: Mediu

special Componente:

geloză simplă răcită la 60-80°C + sânge Utilizare:

cultivarea neisseriilor, hemofililor


Mediul Chapman

Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial (evidentiaza o proprietate

biochimica a tulpinii) Componente: geloză simplă + NaCl 7,5% + manitol + roşu fenol Utilizare: selectiv pentru stafilococ

α Hemoliza

PROPRIETATI DE CULTURA

ATMOSFERA DE CO2 5-10%

Medii folosite pentru enterobacterii

(agar, lactoza, indicatori de pH) Drigalski Istrate McConkey Levine

Bacteriile care degradeaza lactoza din mediu =

lactozo pozitive Bacteriile care nu degradeaza lactoza din mediu =

lactozo negative

Mediul Levine

Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial

Componente: geloză simplă + eozină + lactoză + albastru de metilen

Utilizare: cultivarea enterobacteriilor (E.coli)



GENUL ESCHERICHIA E.COLI

LEVINE

E.COLI

DRIGALSCHI

ADCL (Leifson)

Categoria: Mediu selectiv şi diferenţial

Componente: geloză simplă + săruri biliare + lactoză + roşu neutru

Utilizare: cultivarea shigelelor şi salmonelelor

E.COLI-ADCL

Fermentarea lactozei pe geloză lactozată

http://www.umftgm.ro/mbl/atlas/general/carbio.html

KLEBSIELLA

GELOZA-SANGE

COLONII MUCOASE

KLEBSIELLA

ADCL

COLONII MUCOASE

PROTEUS- INVAZIE

GENUL SALMONELLA

HECTOEN ADCL-H2S

- Mediul BSA: vibrionul holeric - Mediul Chapman : stafilococi - Mediul Lowenstein-Jensen: bacilul

TBC - Mediul OCST: bacilul difteric - Mediul Sabouraud: fungi

Mediul Chapman

Mediul Muller - Hinton

Categoria: Mediu special Utilizare: Efectuarea antibiogramelor

Mediul OCST

Categoria: Mediu de îmbogăţire (favorizeaza X bacteriilor, mai ales cand acestea sunt in concentratie mica)

Componente: ou + cisteină + ser + telurit de potasiu

Utilizare: cultivarea bacililor difterici

Mediul Sabouraud

Categoria: Mediu special

Componente: geloză

simplă + maltoză/glucoză + antibiotice

Utilizare: cultivarea

levurilor



Mediul Lowenstein-Jensen

Medii pentru anaerobi: - Bulion cu acid thioglicolic (mediu lichid; la

suprafata se adauga ulei de parafina - Tarozzi (mediu lichid, cu albus de ou; la suprafata

se adauga ulei de parafina) - Geloza Veillon (se obtin culturi in profunzimea

mediului, realizate prin incorporare) Tehnica Ott (se insamanteaza pe mediu solid,

agenti reducatori si se sigileaza cu parafina)

Metode de insamantare

Insamantare = punerea in contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultura.

Izolare = repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultura cu scopul de a obtine cultura pura

Cultura bacteriana = totalitatea bacteriilor crescute in/pe suprafata unui mediu de cultura

Tehnici de insamantare

Tehnica insamantarii prin epuizare: Scop: obtinerea coloniilor izolate

Insamantarea prin intepare (pe medii solide aflate in tuburi) Insamantarea in panza

Caracterele culturii microbiene In mediu lichid se descrie: Turbiditatea Formarea de depozite Culoarea Suprafata

Medii lichide - Tulburare uniforma a mediului: E. coli - Tulburare + pelicula la suprafata: b. piocianic - Mediu limpede + pelicula: b. carbunos - Grunji: streptococul

Caracterele culturii microbiene pe medii solide

Colonia= ansamblu localizat, alcatuit din populatie pura de bacterii provenite

dintr-un singur parental. Pe mediu solid se descrie: - forma coloniei - culoarea - marimea - consistenta - suprafata - emulsificabilitatea - margini - mirosul culturii Colonii S (smooth) Colonii R (rough)

CARACTERE DE CULTURA BACILLUS- GELOZA SIMPLA

CARACTERE DE CULTURA BACILLUS GELOZA SANGE

GENUL CORYNEBACTERIUM

CORYNEBACTERIUM “FLOARE DE MARGARETA”

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PE MEDIUL LOWENSTEIN

PIGMENT

Pigment

HEMOLIZA

α β

STAFILOCOC - α COMPLETA

- β CALD-RECE (se clarifica la 4°C)

STREPTOCOC - α INCOMPLETA

VERZUIE

- β COMPLETA

Clasificare – hemoliza pe geloza sange

hemoliza β: = streptococi β -

hemolitici hemoliza α -

incompleta, verzuie streptococi γ -

nehemolitici,

CORYNEBACTERIUM

TINSDALE

PRELUCRAREA PRELEVATELOR PATOLOGICE

TEHNICI DE INSAMANTARE PENTRU IZOLAREA SI

IDENTIFICAREA BACTERIILOR

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP5

• Insamantarea prelevatelor patologice, in functie de natura lor, se realizeaza:

• direct sau • dupa o prealabila prelucrare

(concentrare, decontaminare, omogenizare, inactivarea unor substante antimicrobiene)

• Prelevatele omogene, fluide – sange, exsudate seroase prelevate pe anticoagulant, puroi

• Prelevatele emulsionabile - materii fecale - se pot insamanta direct

CONCENTRAREA PROBELOR

• Centrifugare – probele fluide

• Omogenizare - sputa

DECONTAMINAREA PROBELOR

• Spalare in solutie salina izotona – utila pentru:

• sputa muco – purulenta, • portiunile muco – sangvinolente din scaun

• Tratarea cu NaOH: • decontamineaza probele pentru izolarea

micobacteriilor • fluidifica si omogenizeaza sputa

OMOGENIZAREA PROBELOR

• Omogenizarea sputei pentru izolarea bacteriilor neacido – alcoolo – rezistente:

• se realizeaza cu N – acetil – cisteina.

• Omogenizarea tesuturilor:

• se realizeaza prin mojarare in tub Griffith

TEHNICI DE INSAMANTARE

1. Epuizarea inoculului cu ansa pe placi cu mediu agarizat si obtinerea culturilor pure necesare identificarii

- initial, este necesara “uscarea placilor”, prin mentinerea placilor ~ 30 min. la 37°C, cu capacul Intredeschis – pentru evaporarea condensului de pe suprafata mediului

TEHNICI DE INSAMANTARE Epuizarea inoculului

- pe placile cu medii agarizate neselective, uzuala este izolarea prin epuizare semicantitativa a inoculului in 4 cadrane, cu arderea ansei cand schimbam directia striurilor de insamantare. - metoda permite aproximarea relativa a cresterii.


- pentru izolari pe medii selective, cantitatea de inocul trebuie sa fie mai mare, iar epuizarea mai putin drastica. - initial, se etaleaza in aria A una sau mai multe anse cu inocul ori inocul prelevat pe tampon. - epuizam apoi inoculul, fara sterilizari intermediare ale ansei, prin 3 serii de striuri: B, C, D.


- cantitatea de fluid prelevata in ansa difera cu pozitia de scufundare si retragere a ansei: cantitate minima si constanta - la scufundarea si

retragerea verticala cantitate maxima – la scufundare cat mai oblica si

retragerea ansei prin “smulgere” din fluid


• Cultura pura – acea cultura formata din descendentii unei singure colonii rezultate dupa o epuizare a materialului microbian, care duce la cresterea sub forma de colonii bine izolate pe un mediu neselectiv.


• Ideal, ar fi ca asemenea crestere sa porneasca de la indivizi izolati.

• Practic ea porneste de la unitati formatoare de colonii (UFC) –

poate indivizi, poate o mica grupare de organisme asemanatoare.


2. Insamantarea in medii lichide se face: - direct cu seringa de prelevare

(hemoculturi) - cu pipeta (sedimentul LCR) - cu ansa incarcata cu prelevat patologic monomicrobian ori cultura pura

TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea in medii lichide

• inclina tubul si descarca ansa pe peretele tubului

• cand readucem tubul la pozitia verticala,

inoculul ajunge submers si difuzeaza in mediu.


3. Izolarea bacteriilor sporulate de cele nesporulate pe baza termorezistentei sporilor.

TEHNICI DE INSAMANTARE Izolarea bacteriilor sporulate

• Mentine in baia de apa la 80 °C, timp de 10 min., produsul microbian suspensionat in solutie salina izotona, apoi epuizeaza suspensia pe o placa cu mediu agarizat.


4. Insamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta.

Indicatii: - mentinerea pe durata limitata (cateva zile

/ 1 - 2 saptamani) a culturilor pure (ex.: tulpini de identificat, tulpini de referinta)

TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu ansa a mediilor

solidificate in panta

- preleva cu ansa inocul din mai multe colonii ale culturii purificate pe placa cu mediu agarizat.

- depune inoculul in partea inferioara a pantei, imediat deasupra apei de condens si retrage ansa spre partea superioara a pantei descriind miscari in “S” pe suprafata mediului.

TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu ansa a mediilor

solidificate in panta

• izolarea in cultura pura a tulpinilor de Proteus din prelevate contaminate.

• descarca o ansa din prelevatul patologic strict in apa de condens a tubului.

• incubeaza tubul in pozitie verticala. • singura, cultura de Proteus va invada prin

“catarare” suprafata pantei de mediu.


5. Insamantarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale.

Indicatii: - testarea mobilitatii bacteriilor - conservarea pe durate mai lungi (1 – 6

luni) a tulpinilor bacteriene

TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu firul drept a

coloanei de agar nutritiv moale

• incarca firul cu inocul din cultura pura si inteapa central coloana de agar nutritiv pana aproape de fundul tubului.

• la testarea mobilitatii retrage acul cat mai exact pe acelasi traiect pentru a evita dilacerari suplimentare ale mediului in care cresterea poate da impresia falsa de mobilitate a bacteriei.


mediilor solidificate in coloana si panta.

6. Insamantarea cu firul drept a mediilor

solidificate in coloana si panta. Indicatii: - testarea unor activitati biochimice


mediilor solidificate in coloana si panta.

• Incarca firul cu inocul din cultura pura si

procedeaza mai intai la insamantarea prin intepare a coloanei, apoi retrage acul, insamanteaza prin miscari in “S” pana in partea sa superioara.


7. Insamantarea uroculturilor se realizeaza cu ansa calibrata de 10 µl. pentru a estima semicantitativ concentratia bacteriana / ml. urina

Recoltarea produselor patologice


Recoltarea produselor patologice

Diagnosticul etiologic al unei boli infectioase depinde in mare masura de recoltarea corecta a produsului patologic, care trebuie organizata si controlata de medic, fiind o problema de responsabilitate medicala.

Produsele patologice sunt probe in care se banuieste prezenta microorganismelor.

Produsele patologice pot fi:

produse normale, care prezinta modificari in caz de boala (singe, fecale, urina, l.c.r.)

sau produse care apar in urma unei imbolnaviri

(puroi, lichid peritoneal, lichid articular, sputa etc.).

Produsele patologice se pot recolta de la bolnavi, convalescenti, purtatori sanatosi (personal spitalicesc, sector alimentar), cadavre.

Mai pot fi analizate: probe de apa, aer, alimente.

Reguli generale:

A. Pentru fiecare boala infectioasa trebuie cunoscut:

1. de unde se pot obtine prelevatele patologice cele mai reprezentative, in ce loc se afla agentii etiologici in cursul bolii.

2. cand este momentul cel mai potrivit pentru recoltare in raport cu perioada de evolutie a bolii.

3. cum trebuie recoltat (tehnica) 4. cat trebuie recoltat (cantitatea necesara) B. Stabilirea acestor parametri se face in

raport cu natura infectiei si a produsului patologic recoltat.

Prelevarea trebuie facuta steril, aplicand metodele de asepsie si antisepsie.

Instrumentarul si recipientele vor fi sterilizate prin caldura, fara urme de antiseptice.

Produsul trebuie etichetat corespunzator si insotit de un bilet de trimitere care sa cuprinda: numele si prenumele bolnavului varsta diagnosticul prezumtiv data, ora si locul recoltarii natura produsului examinarile cerute se noteaza daca s-a facut tratament antibiotic numele persoanei care a recoltat

Produsul se va ambala corespunzator, in recipiente de unica folosinta, bine inchise

Transportul probelor se realizeaza in cutii / genti de transport corespunzatore, inscriptionate cu pictograma “BIOHAZARD” pentru a preveni deteriorarea lor si eventualele accidente (contaminarea mediului, a omului).

PICTOGRAMA BIOHAZARD

Daca se expediaza la distanta se specifica : “material infectios” si sunt inscriptionate

Transportul probelor se va face cat mai repede, intarzierea scazand posibilitatea evidentierii germenilor existenti initial si permitand inmultirea celor contaminanti.

In cursul transportului se asigura conditii de temperatura corespunzatore:

uneori e necesara o temperatura de 37° C (meningococ), alteori temperaturi scazute (4°C) in lazi izoterme sau recipiente speciale (virusuri).

Pentru transport la distanta se pot adauga lichide conservante sau medii speciale de transport, care asigura supravietuirea germenilor.

Insamantarea se face cat mai repede

dupa recoltare, daca este posibil chiar la patul bolnavului.

Recoltarea produselor patologice din tractul respirator

Secretiile respiratorii se recolteaza in raport cu localizarea infectei.

In interpretarea rezultatelor se tine cont de

microorganismele normal intalnite in tractul respirator superior.

Secretia faringiana

Se recolteaza cu tampon faringian. Recoltarea se face dimineata, inainte de igiena cavitatii

bucale, inainte de masa, cu retinerea de la fumat. Pacientul asezat pe scaun, cu gatul in extensie, deschide cavitatea bucala cat mai larg, rosteste vocala “A”, iar medicul / asistenta sterge cu tamponul de vata peretele posterior al faringelui si amigdalele

(!! recoltare de pe zonele inflamate, leziuni, depozite purulente!!).

Se introduce tamponul in tubul protector din plastic (cu mediu de transport Amies sau Stuart, in cazul in care produsul nu ajunge imediat in laborator).

Secretia faringiana

Secretia faringiana se recolteaza in: angine, scarlatina, difterie, infectii virale respiratorii etc.

Secretia nazala

Se recolteaza asemanator, folosind cate un tampon pentru fiecare nara.

Se recolteaza in:

sinuzite, rinite etc.

Sputa

Se recolteaza in: bronsite, pneumonii bronhopneumonii, tuberculoza

de preferinta dimineata, cand bolnavul isi face “toaleta bronsiilor”. Recoltarea se face dimineata, dupa igiena cavitatii

bucale sau dupa clatirea gurii cu ser fiziologic steril, inainte de alimentatie.

Important este sa se obtina secretie din bronsii, nu saliva!

Secretiile traheobronsice

recoltare prin cateter (aspirate traheo - bronsice),

dau informatii fidele asupra microorganismelor prezente in infectiile tractului respirator inferior.

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DE TRACT RESPIRATOR

INFERIOR

Sputa Secretii traheo - bronsice

Frotiu colorat Gram, Ziehl etc.

Cultura

Frotiu din sputa (coloratie Gram -pneumococi)

Secretia conjunctivala Secretia otica

Recoltarea secretiei conjunctivale in conjunctivite

si recoltarea secretiei otice in otite, se

realizeaza cu tampoane sterile (similare celor faringiene) cu mediu de transport.

Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului digestiv

Lichidul de varsatura se recolteaza in: toxiinfectii alimentare, gastro-enterite acute etc.

Materiile fecale: se recolteaza pentru examinari bacteriologice, virusologice, parazitologice, biochimice etc.

Recoltarea si insamintarea fecalelor in scopul cultivarii germenilor, se numeste coprocultura.

Prelevarea se face fie din scaun emis spontan, fie pe sonda Nélaton direct din rect, fie cu tampon rectal la copii mici), fie scaun dupa purgatie salina (pentru detectarea purtatorilor de germeni).

De obicei se recolteaza 2 - 3 g fecale (pe “lingurita”coprorecoltorului) in coprorecoltoare de unica folosinta din material plastic cu mediu de transport Carry-Blair.

Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului digestiv

Insamintarea materiilor fecale trebuie facuta cat mai repede dupa recoltare (mai ales in dizenterie), iar

transportul in laboratoare aflate la distanta, trebuie facut in lazi izoterme la 4°C.

Coprocultura se practica in: salmoneloze, dizenterie, holera, gastroenterite, enteroviroze etc.

DIAGNOSTICUL ENTERITELOR

Materii fecale

Examen coproparazitologic

Coprocultura Examen pentru digestie

Mediu Leifson Salmonella (sus) E.coli (jos)

Salmonella (mediu ADCL)

Salmonella Mediu

Hektoen

Bila: se recolteaza dimineata cu sonda Einhorn, dupa clatirea gurii cu ser fiziologic steril.

Examinarea bacteriologica a bilei se numeste bilicultura. Se poate examina si parazitologic, biochimic etc.

Bilicultura se indica: in colecistopatii, pentru detectarea purtatorilor de salmonele etc.

Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului uro-genital

Urina: pacientul trebuie educat (trebuie explicat pe intelesul fiecarui bolnav) cum sa recolteze proba si sa evite contaminarea ei.

Momentul recoltarii: prima urina de dimineata / recoltare dupa cel putin 3 ore de la mictiunea anterioara.


Recoltarea se face dupa toaleta riguroasa a organelor genitale externe cu apa si sapun (la femei se recomanda utilizarea unui tampon intravaginal, pentru evitarea contaminarii urinii cu secretii vaginale), se elimina prima portiune de urina, apoi mictiunea se intrerupe si urmatoarea portiune se recolteaza intr-un recipient steril denumit urocultor.


Cantitatea necesara: min. 10-20 ml. Pentru nou-nascut se folosesc pungi recoltoare sterile din

material plastic. Se mai poate preleva urina prin punctie suprapubiana

sau prin cateter. Indiferent de prelevare, examenul microbiologic al urinei

trebuie efectuat in cel mult 2 ore de la prelevare Daca acest interval nu poate fi respectat, probele trebuie

pastrate la 4°C imediat dupa recoltare.

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR URINARE

Urina

Preparat nativ din sedimentul urinar Preparat colorat

Gram, MGG (f. rar ) Urocultura

(semicantitativa, cantitativa)

Examen sumar de urina

Determinari biochimice

Dish for urine - Dish for feces - Dish for sputum - Dish for sampling

Containere pentru recoltat: urina, materii fecale, sputa, alte lichide

Leucocite in sediment urinar

Bacili (in sedimentul urinar)

http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.genomics.princeton.edu/ryulab/images/ecoli_A1_Run0000.jpg&imgrefurl=http://www.genomics.princeton.edu/ryulab/movies/movies_v6.html&h=401&w=443&sz=16&hl=ro&start=101&usg=__l3c6fsL9S5hW1sCuQ6wsu1LyUC8=&tbnid=RWBQaBg9pjCqBM:&tbnh=115&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3De.coli%26start%3D100%26gbv%3D2%26ndsp%3D20%26hl%3Dro%26sa%3DN

http://images.suite101.com/180490_e.coli.jpg

E.coli Mediul Levin Mediul CLED

Staphylococcus saprophyticus (din urina, pe agar-singe)

Secretiile genitale feminine

Secretia vaginala (in vaginite): se recolteaza din fundul de sac vaginal Douglas, cu tampon steril care apoi se introduce in tubul cu mediul de transport.

Secretia endocervicala

Cervicite: cu un tampon steril se indeparteaza mucusul de la nivelul cervixului, cu alt tampon se recolteaza produsul patologic prin introducerea si rotirea in canalul cervical;

la fetite: tamponarea secretiei de la nivelul vulvei, cu ajutorul unui cateter se introduc in vagin 2 ml

ser fiziologic steril, apoi se colecteaza lichidul de spalatura Atentie! Probele nu se pastreaza la frigider! Neisseria gonorrhoeae foarte sensibil la frig!.

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR GENITALE FEMININE

Secretia vaginala

Frotiu (colorat MGG etc.) Cultura

Preparat nativ

Trichomonas vaginalis

Candida spp. (levuri si pseudohife)

Secretiile genitale masculine

la barbati in uretrite: se recolteaza secretie uretrala cu tampon steril, care se introduce in mediu de transport;

se poate recolta urina, primul jet; in prostatite: se recolteaza secretie

prostatica dupa masaj prostatic, ejaculat in recipient steril.

IN SECRETIE URETRALA GONOREE

Neisseria gonorrhoeae

HEMOCULTURA

Recoltarea singelui examen bacteriologic:

hemocultura examen serologic: testarea anticorpilor

examinari parazitologice examinari hematologice

examinari biochimice

Recoltarea se face dimineata pe nemancate, prin venopunctie la

nivelul plicii cotului (vena antecubitala) se folosesc recipiente speciale cu sau fara anticoagulant

in functie de specificul analizei / determinarii. pentru hemocultura (se presupune lipsa tratamentului

antibiotic), se recolteaza probe perechi: proba de singe in perioada de stare a bolii si o proba in starea de convalescenta,

(interval de 10 - 14 zile intre probe).

Daca bolnavul a fost tratat cu antibiotice se adauga la mediul de cultura substante neutralizante: PABA (acid para-aminobutiric) pentru sulfamide penicilinaza pentru peniciline cisteina pentru streptomicina MgSO4 pentru tetraciclina.

http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://beacononline.files.wordpress.com/2008/02/blood_cells-copy.jpg&imgrefurl=http://beacononline.wordpress.com/2008/02/02/give-blood-know-your-hiv-status/&h=734&w=974&sz=110&hl=ro&start=5&usg=__FRVzKRbvy2VXOzMYRBaheHe077g=&tbnid=7kZx5RgnozglvM:&tbnh=112&tbnw=149&prev=/images%3Fq%3Dblood%26gbv%3D2%26hl%3Dro

Flacoane pentru hemoculturi

Hemocultura

Detectarea prezentei germenilor se face automat (incubare la 37°C intr-un termostat special cu agitare continua;

daca intr-un interval de 7 zile in mediu se dezvolta germeni: atentionare => proba pozitiva;

daca in acest interval nu se dezvolta germeni => proba negativa.

proba pozitiva se insaminteaza pe medii corespunzatoare flaconului in care s-a recoltat: pentru bacterii aerobe sau anaerobe.

Pentru examinari parazitologice si hematologice, sangele se recolteaza prin intepare cu ac de unica folosinta, din pulpa degetului, dupa dezinfectie cu alcool .

Prima picatura se indeparteaza, urmatoarele se intind pe lama sub forma de frotiu (examen hematologic, bacteriologic direct) sau ca picatura groasa (malarie).

Lichidul cefalo-rahidian

Se recolteaza prin punctie lombara sau

suboccipitala. Se insaminteaza cat mai repede, daca este

posibil chiar la patul bolnavului, mai ales cand se suspecteaza meningita meningococica.

Transportul se face rapid asigurand mentinerea la 37°C (eprubeta cu LCR se tine strins in palma sau in buzunar la piept).

LCR – ul se poate incuba ca atare la 37 °C.

DIAGNOSTICUL MENINGITELOR

Lichidul cefalo-rahidian

Frotiu colorat Gram, MGG, Ziehl etc.

Cultura Reactii de latex aglutinare

Neisseria meningitidis

Exudate din seroase

Lichidul pleural, peritoneal, sinovial, se

recolteaza in pleurezii, respectiv, peritonite, sinovite, dupa asepsie locala prin punctie de partea decliva a regiunii. De obicei recoltarea se face pe citrat, deoarece continutul ridicat de fibrina determina o coagulare rapida.

Puroi

Este format din leucocite, microorganisme, resturi celulare, fibrina, etc.

Din colectii inchise (abcese) se recolteaza prin punctie cu o seringa sterila cu ac gros, sau cu pipeta Pasteur.

Puroiul din leziuni inchise profunde va fi studiat si in conditii de anaerobioza.

Din colectii deschise se recolteaza dupa curatirea plagii cu ser fiziologic steril si eliminarea primei cantitati care iese. Se poate recolta cu tamponul sau cu ansa.

COLECTIE PURULENTA

DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DE PLAGA

Puroi (secretii din plagi)

Frotiu colorat Gram

Cultura

Frotiu dintr-un abces (infectie cu anaerobi)

Staphylococcus aureus (Mediu Chapman)

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes pe EMB (Levine)

http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Atlas_EMB/E.coli_Pseudomonas_Klebsiella_Enterobacter_EMB_fig17.jpg







Fragmente de tesuturi

Se recolteaza prin punctie sau biopsie, fie tesut

ganglionar (adenopunctura), fie tesut medular (medulocultura), fie tesut hepatic etc.

Examinarea va fi bacteriologica si

histopatologica.

Produse de necropsie

Recoltarea se face cat mai rapid dupa deces, respectind masurile de asepsie. Inainte de deschiderea cadavrului se face dezinfectia tegumentelor cu tinctura de iod si alcool.

Se deschide cutia craniana, apoi toracele si abdomenul, recoltand fragmente de organe, singe, urina, continut intestinal.

Pentru fiecare produs se foloseste alt set de instrumente si alt recipient steril.

Prelevarea singelui din cord sau a lichidelor din cavitati se face prin punctie cu seringa sau pipeta Pasteur, dupa o prealabila aplicare pe locul punctiei a unei spatule inrosite in flacara.

Continutul intestinal se recolteaza prin prelevarea unui fragment de intestin de 10 cm intre doua ligaturi.

Schema de prelucrare a produselor patologice

Produs patologic

Preparat nativ (urina, lcr,

secretia vaginala, secretia uretrala)

Preparat colorat (Frotiu)

(Sputa, lcr, urina)

Cultura

Identificarea bacteriilor

Antibio-grama

EXAMENUL MICROSCOPIC

EXAMENUL MICROSCOPIC • I. PREPARATUL NATIV permite studierea

– Mobilitatii germenilor – Morfologiei bacteriene

este un preparat microscopic umed, intre lama si lamela examinarea microscopica se realizeaza cu microscopul

optic,obiectiv mic (10x, 20x, 40x), condensator coborat, microscopul cu fond intunecat, microscopul cu contrast de faza

Tehnica de lucru- suspensie de germeni vii intre lama si lamela

EXAMENUL MICROSCOPIC

• II. COLORATIA NEGATIVA – METODA BURRI-permite studierea – Germenilor greu colorabili – Germenilor cu capsula (Klebsiella spp.,

S.pneumoniae) Coloranti : tus de China, safranina

EXAMENUL MICROSCOPIC • III. PREPARATE COLORATE permit studierea

– Morfologiei germenilor – Dispozitiei germenilor – Afinitatii tinctoriale (colorabilitatea) BAZA PREPARATELOR COLORATE CONSTA IN

EFECTUAREA UNUI FROTIU Etapele realizarii frotiurilor etalarea uscarea fixarea colorarea

EXAMENUL MICROSCOPIC • TIPURI DE PREPARATE COLORATE 1.COLORATII SIMPLE se utilizeaza un singur colorant se inlatura colorantul in exces spalare, uscare examinare la microscop cu obiectiv de imersie 2. COLORATII COMPUSE COLORATIA GRAM COLORATIA ZIEHL-NEELSEN COLORATII SPECIALE

COLORATIA GRAM DIFERENTIAZA BACTERIILE GRAM POZITIVE DE CELE

GRAM NEGATIVE ETAPE 1. Colorare cu violet de gentiana (2 min). Inlaturare

colorant 2. Mordantare cu lugol (2 min). Spalare cu apa 3. Decolorare cu alcool-acetona (10-15 sec) 4. Recolorare cu fuxina (2 min) 5. Spalare cu apa 6. Uscare. Examinare ls microscop cu obiectiv de

imersie

EXEMPLE DE BACTERII GRAM POZITIVE SI GRAM NEGATIVE

• COCI GRAM POZITIV Staphylococcus spp., Streptococcus spp GRAM NEGATIV Neisseria spp. • COCOBACILI GRAM NEGATIV Haemophilus spp, Acinetobacter spp.

EXEMPLE DE BACTERII GRAM POZITIVE SI GRAM NEGATIVE

• BACILI GRAM POZITIV Clostridium spp, Bacillus spp.,

Corynebacterium spp GRAM NEGATIV E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Proteus

spp., Pseudomonas spp.

• Bacil carbunos-prezenta endosporilor • Baci gram+

REACTII ANTIGEN-ANTICORP

Antigen

• (greacă: anti=contra şi geano=a naşte, a genera)

• este termenul care defineşte orice substanţă de origine endogenă sau exogenă, care, ajunsă în organism, nu este recunoscută ca proprie şi determină apariţia unui răspuns imun, ce vizează neutralizarea şi eliminarea ei.

• Virusurile, bacteriile, parazitii si celulele alterate ale organismului (infectate cu un germene sau tumorale) reprezinta antigene.

Odată pătrunse în organism antigenele pot determina:

• 1. Sinteza de molecule de anticorpi, care le recunosc specific.

• 2. Instalarea memoriei imunologice ("amintirea" organismului despre întâlnirile anterioare avute cu acelaşi antigen).

• 3. Apariţia eventuală a unor reacţii imune aberante: reacţii alergice, autoimune

http://ro.wikipedia.org/w/index.php?title=Anticorp&action=edit&redlink=1

http://ro.wikipedia.org/wiki/Alergie

Anticorpii

• substante chimice produse de organism ca raspuns la patrunderea in sange a numeroase substante straine organismului (antigene) asa cum sunt :

bacteriile, virusurile, parazitii etc.

http://www.sfatulmedicului.ro/Dictionar_medical/sange_8207.html

REACTIA DE AGLUTINARE DEFINITIE Reactie Ag-Ac de agregare in care

antigenul este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie (antigen particulat)

=> retele tridimensionale agregate vizibile

REACTIA DE AGLUTINARE


SCOP identificarea unor bacterii pe

baza proprietatilor antigenice evidentierea Ac aglutinanti in

serul de bolnav


Aglutinarea pe lama Aglutinarea in tuburi Aglutinarea pasiva Inhibarea hemaglutinarii pasive

AGLUTINAREA PE LAMA SCOP identificarea rapida pe baza proprietatilor

antigenice a unor tulpini izolate din produsul patologic TEHNICA ser imun (Ac) + colonie bacteriana grunji fini ser fiziologic + colonie bacteriana susp.omogena

AGLUTINAREA PE LAMA

AGLUTINAREA IN TUBURI

PRINCIPIUL REACTIEI In dilutii crescande de ser se adauga

aceeasi cantitate de antigen. Titrul reactiei este reprezentat de

dilutia cea mai mare de ser la care se mai observa aglutinarea

AGLUTINAREA IN TUBURI SCOP identificarea unui microorganism (Ag) diagnosticul serologic al unei infectii

pentru evidentierea Ac din serul de bolnav fata de un Ag standard

AGLUTINAREA IN TUBURI TIPURI Aglutinarea “O”- somatica- polara - Ag “O”= endotoxina- perete bacteriilor

Gram - - natura glico-lipido-polipeptidica - termostabil - alcoolorezistent - distrus de formol


Aglutinarea “H”- flagelara - Ag prezent la bacteriile mobile - natura proteica - termolabil - distrus de alcool - rezistent la formol

AGLUTINAREA IN TUBURI EXEMPLE RC. WIDAL S.typhi, S.paratyphi A,B RC. WRIGHT bruceloze RC. WEIL-FELIX tifos exantematic


TEHNICA

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Ser cercetat Antigen x x x x x x

DILUTIA CEA MAI MARE DE SER LA CARE MAI APARE AGLUTINARE

AGLUTINAREA PASIVA

DEFINITIE Reactie Ag-Ac in care Ag este reprezentat de

o solutie moleculara. In urma fixarii pe un suport particulat acesta devine aglutinabil in prezenta serului imun.

SCOP Identificarea unui Ag cat si pentru cercetarea

anticorpilor corespunzatori folosind un Ag cunoscut.

AGLUTINARE PASIVA

PARTICULE - INERTE: latex, colodiu, bentonita - HEMATII DE OM grp. “O” HEMAGLUTINARE

- HEMATII DE ANIMAL PASIVA

Ag - PROTEIC adsorbit pe hematii native - POLIZAHARIDIC adsorbit pe hematii tanate (tratate cu acid tanic)

AGLUTINAREA PASIVA EXEMPLE Ag adsorbit pe particule de latex - Evidentierea Factorului Reumatoid (FR) - Detectarea Ag de Haemophylus,

pneumococ, meningococ in LCR, ser - Cercetarea Ac anti-ADN in dg. LES Ag adsorbit pe hematii - dg. Tiroiditei Hashimoto - dg. Poliartritei reumatoide (Rc. Waaler-

Rose)

TIROIDITA HASHIMOTO

POLIARTRITA REUMATOIDA

LUPUS ERITEMATOS SISTEMIC

INHIBAREA HEMAGLUTINARII PASIVE

SCOP Diagnosticul imunologic al sarcinii. TEHNICA I. (urina + ser imun anti-gonadotrofina) II. (…) + suspensie de hematii tanate Gonadotrofina (+) => hematii in suspensie Gonadotrofina (-) => hematii aglutinate

REACTIA DE PRECIPITARE DEFINITIE Reactie Ag-Ac de agregare, in care

antigenul este reprezentat de macromolecule in solutie coloidala.

Punerea in contact a Ag corespunzator duce

la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita atunci cand elementele ce participa in reactie se gasesc in proportia optima

REACTIA DE PRECIPITARE EXEMPLE PRECIPITAREA INELARA REACTIA DE FLOCULARE PRECIPITAREA IN GEL - SIMPLA DIFUZIE - DUBLA DIFUZIE - DIFUZIA IN CAMP ELECTRIC IMUNELECTROFOREZA CONTRAIMUNELECTROFOREZA

REACTIA DE PRECIPITARE INELARA

SCOP - IN MEDICINA LEGALA- identificarea

originii petelor de sange - IN DG. BOLILOR INFECTIOASE - Rc.Ascolidg.infectiei carbunoase - Rc Vincent-Bellotdg.meningitei

cerebrospinale - identific. de grp. a streptococilor

(grp.Lancefield)

REACTIA DE PRECIPITARE INELARA

INEL OPALESCENT DE PRECIPITARE

REACTIA DE FLOCULARE --TITRAREA TOXINEI DIFTERICE--

PRECIPITAREA IN GEL DEFINITIE Reactie Ag-Ac care utilizeaza gel de agar

sau agaroza ca mediu in care unul sau ambele elemente care intra in reactie (Ag/Ac) difuzeaza, diametrul moleculelor de Ag si Ac fiind mai mic decat diametrul porilor gelului.

PRINCIPIU Vizualizarea unei zone opace de precipitare

la intalnirea in proportie optima a celor doua elemente (Ag/Ac)

PRECIPITAREA IN GEL SCOP Evidentierea fractiunilor antigenice

multiple dintr-un amestec antigenic. Este o reactie de mare sensibilitate si

specificitate. Utilizeaza cantitati mici de reactanti.

PRECIPITAREA IN GEL

SIMPLA DIFUZIE—RC. OUDIN

PRECIPITAREA IN GEL

SIMPLA DIFUZIE – RC. MANCINI

PRECIPITAREA IN GEL SIMPLA DIFUZIE-RC MANCINI

PRECIPITAREA IN GEL

DUBLA DIFUZIE RC. OUCHTERLONY

PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE

TESTUL ELEK

PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE

TEST ELEK

TESTAREA REZISTENTEI MICROBIENE LA ANTIBIOTICE

ANTIBIOGRAMA


ANTIBIOTIC

• substanta de origine: • biologica • semisintetica • sintetica (chimioterapic)

cu activitate SELECTIVA impotriva bacteriilor potential utilizabil in tratamentul infectiilor

SUBSTANTE TEST

• reprezentanti ai unui grup de antibiotice care sunt in mod special potrivite pentru investigatii in vitro

• reprezinta in mod optim spectrul de activitate al grupului

• permit utilizarea unui numar minim de substante pentru testare

SUBSTANTE TEST • ideal, in aproape toate cazurile , trebuie sa

testam antibioticul care va fi utilizat in terapie. • aceasta este posibil numai daca clinicienii pe

care ii serveste laboratorul au o politica restrictiva,

• dar rezultatele obtinute prin testarea altor antibiotice poate fi utila in identificarea mecanismelor de rezistenta (citire interpretativa) si identificarea tendintelor epidemiologice.

CARACTERE DEPENDENTE DE AGENTUL PATOGEN

a. Susceptibil (S) – sensibil a.1. Sensibilitate microbiologica: bacteriile sensibile sunt

cele care apartin celei mai sensibile subpopulatii si carora le lipsesc mecanismele de rezistenta, uneori denumite populatie bazala (sensibila)

a.2. Sensibilitate clinica: bacteriile sensibile sunt acele bacterii, definite prin parametrii in vitro, pentru care s-a demonstrat ca raspund unui regim terapeutic standard atunci cand sunt implicate intr-o infectie.


- bacterii integral sensibile (sensibile d.p.d.v. microbiologic)

- bacterii sensibile la limita (“border – line”) sau moderat sensibile, care desi prezinta un mecanism de rezistenta de nivel jos, raspund de obicei la regimuri terapeutice standard.


b. Rezistent b.1. Rezistenta microbiologica: acele microorganisme

care poseda orice mecanisme de rezistenta demonstrate fenotipic sau genotipic. Termenul utilizat poate fi “moderat sau inalt rezistent” sau “rezistenta de nivel jos sau inalt”.

Rezistenta de nivel inalt este asociata cu lipsa sinergiei intre antibioticele β – lactam si aminoglicozide pentru enterococi.

Rezistenta disociata poate fi demonstrata fenotipic numai in prezenta unui al – II – lea antibiotic (ex. In cazul rezistentei la macrolide demonstrate in prezenta unei lincosamine).


b.2. Rezistenta clinica: apare cand este foarte putin probabil ca infectia sa raspunda chiar la doze maxime la un anumit antibiotic.


b.3. Rezistenta incrucisata: absenta completa sau partiala a sensibilitatii la un grup de antibiotice.

In sens strict, se aplica antibioticelor din aceeasi clasa chimica (ex. β – lactamine, aminoglicozide, macrolide etc.).

Totusi, mecanismele de rezistenta cum sunt cele care rezulta ca urmare a impermeabilitatii sau efluxului pot afecta mai multe clase chimice, fenomen denumit uneori “rezistenta asociata”.


c. Intermediar: bacterie care apartine grupului de tulpini care se situeaza intre tulpinile clinic sensibile si clinic rezistente.

Infectiile cauzate de astfel de bacterii raspund variabil sau indeterminat la chemoterapie, dar pot fi eliminate daca antibioticul este concentrat la locul infectiei sau daca se creste doza.


d. Profilul de sensibilitate / rezistenta si antibiograma: Acestea descriu pattern –ul de sensibilitate la o serie de antibiotice. Ex.: o bacterie rezistenta la: penicilina streptomicina tetraciclina, dar sensibila la: eritromicina poate fi descrisa ca avand profilul de rezistenta PST. Optional, un astfel de microorganism poate fi descris prin antibiograma RRRS pentru secventa predefinita de antibiotice.


e. Citire interpretativa: citirea interpretativa a datelor de sensibilitate este deductia mecanismelor biochimice de rezistenta sau a interferentei sensibilitatii sau rezistentei clinice pe baza fenotipului observat.

SPECTRU

• caracterizeaza profilul activitatii unui agent antibacterian asupra unor variate specii bacteriene sau grupuri de specii

ex: Gram (+), Gram (-), aerobi, facultativ – anaerobi, strict anaerobi • Rezistenta dobandita poate modifica, din timp in

timp si din loc in loc, pattern-ul de sensibilitate care defineste spectrul original.

PUNCTE DE RUPTURA (BREAKPOINTS)

• valori specifice ale unor parametri cum sunt: concentratiile minime inhibitorii (CMI) sau zonele de inhibitie, pe baza carora bacteriile pot fi incadrate in categoriile clinice:

“susceptibil (sensibil)” “intermediar” “rezistent”. Desemnarea ca “intermediar” ofera de asemenea un

spatiu de joc din punct de vedere tehnic, care minimizeaza confuzia intre microorganismele cu CMI apropiat de punctul de ruptura.

PROPRIETATILE ANTIBIOTICELOR

• Potenta: cantitatea de agent antibacterian activ dintr-o substanta test determinata cu ajutorul unui test biologic, de obicei exprimata in µg/mg.

• Concentratia: cantitatea dintr-un agent

antimicrobian intr-un volum definit de lichid, preferabil de exprimat in mg/l sau intr-o masa definita dintr-un solid, exprimata in µg/g.

ACTIUNE ANTIBACTERIANA • Concentratia minima inhibitorie (CMI): cea mai

joasa concentratie, exprimata in mg/l, care, in conditii in vitro definite, previne cresterea bacteriilor intr-o perioada definita de timp.

• Concentratia minima bactericida (CMB): cea mai

mica concentratie de antibiotic, exprimata in mg/l, care in conditii definite in vitro reduce cu 99,9% (3 log.) numarul de microorganisme

dintr-un mediu continand un numar definit de microorganisme, intr-un interval definit de timp.

PROPRIETATILE ANTIBIOTICELOR

• Farmacocinetica: studiul concentratiilor unui antibiotic in timp si in diferite compartimente ale organismului, dupa administrarea unei doze date din acel antibiotic.

• Farmacodinamica: studiul relatiei intre parametri farmacocinetici si magnitudinea si durata raspunsului patogenului.

EFECTUL COMBINATIILOR DE ANTIBIOTICE in vitro

• Efect indiferent al unei combinatii de antibiotice sau de antibiotice si substante inactive este acel efect egal cu efectele celui mai activ component.

• Efect aditiv al unei combinatii de antibiotice este acela in care efectul combinatiei este egal cu acela al sumei efectelor componentelor individuale.

EFECTUL COMBINATIILOR DE ANTIBIOTICE in vitro

• Actiunea sinergica a unei combinatii de antibiotice sau de antibiotice si substante inactive este prezenta daca efectul combinatiei depaseste efectele aditive ale componentelor individuale.

• Antagonismul este prezent daca se observa reducerea efectului unei combinatii de antibiotice in comparatie cu efectul individual al celei mai active substante.

TULPINI DE REFERINTA

• bacterii catalogate, caracterizate, cu fenotipuri de sensibilitate la antibiotice stabile, definite.

• se utilizeaza pentru controlul intern de calitate.

METODE DE TESTARE A SENSIBILITATII

• Dilutie in bulion: tehnica in care se introduc in recipiente: – volume identice de bulion inoculat, – volume identice de solutie de antibiotic, dar

concentratiile de antibiotic sunt crescatoare (de obicei, in progresie geometrica)

– un inocul definit Scop: determinarea celei mai joase concentratii care

inhiba cresterea bacteriana (CMI) Macrometoda: tuburi - volum minim de 2 ml. Micrometoda: placute de microtitrare – volum < 500 µl


• Dilutie in agar: incorporarea unui agent antimicrobian in mediu cu agar solid sau semisolid, in progresie geometrica a concentratiilor si aplicarea unui inocul bacterian definit pe suprafata mediului cu agar.

Scop: determinarea celei mai joase concentratii care inhiba cresterea bacteriana (CMI).


• Metoda difuziei in agar: difuzia antibioticului din discuri, tablete, strip-uri (benzi) in medii solide inoculate cu cultura bacteriana da nastere unor zone de inhibitie ale caror diametre sunt in corelatie cu CMI ale bacteriei.


• Pregatiti pentru ora viitoare o prezentare in format Power Point, .ppt, despre antibiograma difuzimetrica cu discuri de antibiotice, metoda E – test, metoda dilutiilor!

ANTIBIOGRAMA Tipuri de antibiograme

DEFINITIE • Prin antibiograma se intelege testarea

sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs patologic fata de diverse antibiotice.

• Astfel se caracterizeaza capacitatea acestora de a opri dezvoltarea microbiana si da informatii pentru selectarea celui sau celor mai active antibiotice fata de microorganismul testat.

• Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc ca sinonimi.

• Introducerea unui antibiotic in terapie este o mare responsabilitate medicala, cerind respectarea unor conditii bine determinate:

1. Antibiograma se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si prin identificarea agentului patogen.

In cazuri de extrema urgenta, se poate administra un antibiotic (inainte de efectuarea antibiogramei) dar numai dupa recoltarea produselor patologice.

2. Tratamentul se realizeaza in functie de rezultatele date de antibiograma, alegind antibioticul cel mai eficace, adica fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.

3. Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu antibiotice este de durata mai lunga; aceasta deoarece agentul patogen poate sa cistige rezistenta fata de antibioticul utilizat.

Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului din populatiile microbiocenozelor, poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o bacterie din aceste microbiocenoze.

• Principiul antibiogramei consta in capacitatea antibioticelor de a impiedica multiplicarea bacteriana, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic.

• Unele antibiotice au in anumite concentratii si proprietatea de a omori bacteriile: efect bactericid.

Metode folosite pentru testarea sensibilitatii in vitro

la antibiotice metode calitative

– metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasica – metoda cu antibiotic incorporat in mediu

semisolid – kit-ul comercial ATB Biomerieux, Franta - moderna

• metode cantitative – metoda dilutiilor in mediu lichid - clasica – metoda Etest – AB BIODISK , Suedia –

moderna

Metoda difuzimetrica(Kirby-Bauer) • Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi

Petri, pe care s-a insamintat in pinza cultura bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se va realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a antibioticului ( in imediata vecinatate a discului realizindu-se o concentratie mai mare de antibiotic care descreste pe masura indepartarii de acesta ).

Metoda difuzimetrica(Kirby-Bauer) • Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu

stabileste concentratia minima infibitorie (CMI), da informatii pretioase asupra sensibilitatii speciei testate fata de antibioticele utilizate si este folosita mai frecvent in laboratorele clinice.

Tehnica de lucru • Mediul de cultura indicat este geloza

Müller-Hinton deoarece are o valoare nutritiva care permite dezvoltarea optima a unei mari varietati de bacterii si nu contine inhibitori ai actiunii unor antibiotice.

• Pentru bacterii cu necesitati de cultura speciale, se utilizeaza medii adecvate ( de ex. pentru Streptococcus pyogenes se foloseste geloza singe ).

Tehnica de lucru • Coloniile izolate (5 colonii) obtinute din

produsul patologic, se insaminteaza in bulion, care se incubeaza la 37 °C ( ~ 5-10 min.), se determina turbiditatea culturii corespunzatoare etalonului 0,5 McFarland

( cu ajutorul scariiMcFarland cu sulfat de bariu sau automat pe densitometru ).

Tehnica de lucru • Se insaminteaza placile in maxim 15 min. de

la etalonare ; se lasa placa insamintata 3-5 min. (niciodata mai mult de 15 min.) pentru adsorbtia inoculului.

• Se depun discurile cu substante antibicrobiene la distanta de minimum 15 mm de marginea placii si 30 mm intre centrele a doua discuri vecine folosind o pensa sau, mai bine un dispersor automat de discuri.

Tehnica de lucru • Se incubeaza placile la 37° C pentru

16-18 ore. • Control de calitate : testeaza pe alta

placa, in aceleasi conditii , tulpina de referinta adecvata.

Dispersor de discuri pentru antibiograme, tuburi cu discuri impregnate cu antibiotice in diferite

concentratii, placa cu agar Müller-Hinton pentru realizarea antibiogramei difuzimetrice

Citirea si interpretarea • Se masoara cu sublerul sau cu rigla gradata

in mm , diametrul zonelor de inhibitie completa , in lumina reflectata, pe fond negru mat.

• In cazul mediilor transparente se masoara pe spatele placilor, iar in cazul mediilor cu singe pe suprafata agarului.

Antibiograme pe mediu Müller-Hinton

Antibiograma pe geloza singe

• Aspectul Zonei de Inhibitie trebuie sa fie clar si cu contur net.

• In situatia in care se observa chiar si o singura colonie in interiorul zonei de inhibitie, se va considera rezistenta la acel antibiotic, indiferent de diametrul zonei de inhibitie (vezi figura )

• In caz de urgenta , se poate citi antibiograma dupa 5-6 ore de incubare, cu conditia verificarii diametrelor si la 16-18 ore.

• Se verifica daca diametrele zonelor de inhibitie ale fiecarei substante antimicrobiene sint cuprinse in limitele variatiei admise conform tabelelor de interpretare furnizate impreuna cu discurile.

INTERPRETARE • Se interpreteaza astfel : Sensibil S • Intermediar I • Rezistent R • in functie de valorile din tabelele de

interpretare.

Metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid – kit-ul comercial ATB

Biomerieux, Franta • Principiu • Galeria ATB permite determinarea sensibilităţii

microbiene la un set de agenti antibacterieni / antifungici , incorporate într-un mediu semisolid. Este alcătuită din 16 perechi de godeuri, din care 2/4 nu conţin antibiotice/antifungice şi sunt martori de creştere.

• Celelalte perechi de godeuri conţin diferite antibiotice în cite două concentraţii (c = concentratie mai mica şi C = concentratie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpină testată ca fiind sensibilă, intermediară sau rezistentă.

Metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid – kit-ul comercial ATB

Biomerieux, Franta - Din tulpina de testat este preparată o suspensie

care este transferată în mediul de cultură cu care este inoculată galeria ATB.

- Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37°C.

• Citire si Interpretare - Dacă nu există creştere la nici o concentraţie

înseamnă tulpină sensibilă, daca exista creştere numai în godeul cu concentraţia mai mică c înseamnă sensibilitate intermediară, daca exista creştere în ambele godeuri (c şi C) semnifică rezistenţă la respectivul agent antimicrobian.

http://www.ac-strasbourg.fr/sections/enseignements/secondaire/pedagogie/les_disciplines/biotechnologies/ressources/phototheque/microbiologie/antibiogramme7227/view?no_cache=1207421736.73

E-Test

• E -Testul imbina acuratetea testarii cantitative si simplitatea testarii difuzimetrice cu mare economie de timp .

• Pe suprafata unei langhete/bandelete de 5 mm/50 mm din plastic inert, neporos, este fixat un gradient exponential de antibiotic , desicat si stabilizat, cu 15 dilutii intre 0,016 si 256 µg/ml sau 0,002 si 32 µg/ml, iar pe cealalta suprafata este marcata scala de lectura in µg/ml corespunzatoare CMI .

E-Test • Pe suprafata unei placi cu mediu agarizat

preinsamintata cu tulpina testata in conditii standardizate sint depuse radiar

langhetele/bandeletele cu antibiotic. Dupa incubare corespunzatoare, CMI este

indicata de intersectia dintre zona eliptica de inhibitie a culturii si scala de gradiente a langhetei

E-Test • Desi scump, testul este fiabil, reproductibil si

permite determinarea concomitenta, pe aceeasi placa, a CMI ale mai multor antibiotice pentru bacterii aerobe sau anaerobe, supravegherea pacientilor pe parcursul terapiei antimicrobiene pentru a surprinde selectarea de clone rezistente ( ex. fata de ampicilina in meningitele determinate de H. influenzae, testarea pneumococilor fata de β-lactamine, a enterococilor fata de aminoglicozide cu depistarea rezistentei cu nivel inalt, a enterobacteriaceelor producatoare de β-lactamaze cu spectru extins ).

Metoda dilutiilor in medii lichide

• Aceasta urmareste determinarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data, indicind concentratia de chimioterapice sau antibiotice necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale. In acest fel se determina ceea ce se cunoaste sub denumirea de concentratie minima inhibitorie ( CMI ).

Tehnica de lucru • In dilutii crescinde de chimioterapice si

antibiotice facute direct din mediul de cultura lichid se insaminteaza cantitati egale din cultura de cercetat, stabilindu-se dilutia maxima a substantelor in prezenta careia tulpina este inhibata.

• Pentru fiecare antibiotic se fac dilutii de pornire.

Tehnica de lucru • Concentratia initiala pentru penicilina

este 100 UI/ml; cea pentru streptomicina de 100 µg/ml, pentru cloramfenicol 50 µg/ml, etc. Mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2% preparat fara peptona daca se testeaza actiunea sulfamidelor.

Tehnica de lucru • Microorganismul testat se cultiva in bulion

glucozat, iar din cultura de 18-20 ore se face o dilutie de 1/100, care se insaminteaza in cantitati egale ( cite o picatura ) in toate dilutiile de antibiotic.

• Pentru dilutii se utilizeaza 10 tuburi, fiecare se repartizeaza cite 1 ml bulion glucozat.

Tehnica de lucru • In primul tub se adauga 1 ml din solutia de

antibiotic. Dupa omogenizare se trece 1 ml in al doilea tub si asa mai departe pina la tubul 9 de unde se indeparteaza 1 ml de solutie. Se insaminteaza tuburile cu cite o picatura din cultura testata. Tubul 10 este proba martor care serveste pentru controlul dezvoltarii tulpinii in mediul utilizat .

• Citirea se face dupa o incubare la 37° C , timp de 18-20 ore.

Citire si interpretare • Ultimul tub limpede indica limita

sensibilitatii germenului, fata de substante sau concentratia minima inhibitorie activa ( CMI). Adaugind la mediu un indicator de ph ( rosu fenol ) se poate reduce timpul de citire a rezultatelor la 3-6 ore intrucit virarea culorii mediului in urma modificarii ph-ului datorita dezvoltarii microbiene ( ph acid ) apare mai rapid decit tulburarea lui.

• Citire si interpretare Dilutia din ultima eprubeta in care nu exista crestere bacteriana (mediul este limpede) reprezinta valoarea CMI.

½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512

•Metoda dilutiilor succesive in mediu lichid

Discutii • Metoda dilutiilor in medii lichide este

tehnica cea mai precisa de determinare a sensibilitatii microorganismelor la antibiotice si chimioterapice si in plus permite determinarea concentratiilor bacteriostatice si bactericide ale substantelor testate.

Discutii • Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor din

umorile organismului este necesara pentru evaluarea in vivo a eficientei unui tratament cu chimioterapice sau antibiotice.

• Astfel se poate stabili daca concentratia substantei se mentine in umorile organismului la un nivel activ, permite controlul modului si ritmului de administrare , ajuta la aprecierea corespondentei intre eficacitatea in vivo si in vitro a substantei utilizate, etc.

Discutii • Aprecierea efectului bactericid prin

metoda dilutiilor se realizeaza astfel: din ultimele 2 eprubete in care dezvoltarea a fost inhibata, se insaminteaza cu un inocul mic, tuburi cu mediu similar, dar fara antibiotic.

• Lipsa dezvoltarii bacteriene in aceste tuburi indica efectul bactericid al antibioticului testat.

Concluzii • Antibiograma este una dintre cele

mai utile determinari de laborator care aduce informatii pretioase privind atitudinea medicului in terapia cu antibiotice.

Concluzii • Antibiogramele se vor repeta ori de

cite ori o dicteaza evolutia clinica dupa tratamentul cu antibiotice si eventual se vor utiliza asociatii de antibiotice pentru a obtine un efect terapeutic mai promt si prevenirea instalarii rezistentei bacteriei la antibiotice si chimioterapice.

VITEK 2 Compact Brings Rapid ID/AST Testing to Labs

• The newest product by bioMérieux Inc, VITEK® 2 Compact, is expected to bring these advantages to small and mid-size laboratories.

• Currently awaiting approval by the Food and Drug Administration (FDA), the VITEK 2 Compact uses the same technology as the VITEK 2 to deliver results the same day, but with a smaller footprint.

• The original VITEK was developed by the McDonnell Douglas Corp of St. Louis, Mo, for the aerospace program, but its clinical applications were realized and developed by what became the VITEK subsidiary of the company. The product was sold to bioMérieux, a French company, in 1992, before McDonnell Douglas’ merger with Boeing.

• bioMérieux immediately set out to bring the

product to the next level and introduced the VITEK 2 in 1998. The system was designed to introduce workflow efficiencies and sophistication for larger laboratories. In 2001, the company began development of the VITEK 2 Compact to offer the technology within a smaller unit.

How It Works • The VITEK 2 and VITEK 2 Compact use a standard inoculum

to prepare an organism suspension and sophisticated algorithms to analyze parameters and test conditions. A variety of susceptibility cards used in the instruments are available to allow an institution to match the susceptibility testing to its pharmacy antibiotic formulary.

• Each susceptibility card contains 64 small-volume wells, with representative antibiotics in each well. The optical system reads the wells every 15 minutes.

• The new photometric technology in the instrument takes advantage of advances in optics to detect changes in growth for each well. The system also can identify an organism’s phenotype based on the antibiotic susceptibility through pattern recognition using the Advanced Expert System (AES).

• According to Donahoe, portions of the setup and process can be completed by a low-level technologist or technician, but validation requires a laboratory technologist, though not necessarily one specializing in microbiology. The AES helps with verification. “This software package puts a PhD-level review in the hands of the small lab, which typically lacks the scientist traditionally needed to run this test,” Donahoe says.

• The VITEK 2 Compact does not feature as much automation as the VITEK 2, but it does eliminate a number of manual steps, allowing consistent handling of the test process as well as time and cost savings. In addition, the expanded menu eliminates the need to run extra tests

• Donahoe reports that the mean time for result delivery is 6–8 hours. “Roughly 80% of identification and susceptibility results are delivered in 6 hours, 90% within 8 hours,” he says. “This means that nine of ten patients could have their results in 8 hours or less.”

122307450 Lucrari Practice Microbiologie(1)

Documents

Transcript of 122307450 Lucrari Practice Microbiologie(1)