Metode microscopice de investigatie

Microscopia electronica si microscopia optica

Microscopia optica- generalitati

Microscopul optic este aparatul bazat pe

principiul formării imaginilor virtuale a unor obiectele reale ale căror dimensiune limită este de cca. 0,2 m.

Imaginea mărită este rezultatul interacţiunii radiaţiei electromagnetice din domeniul vizibilului a cărei lungime de undă este = 390 nm ….750 nm, cu elementele optice ale microscopului.

Lentilele componente au indici de refractie diferiti si distante focale diferite.

Parametrii unui microscop optic

Marirea transversalaMarirea transversala= raportul dintre lungimea imaginii si lungimea obiectului, ambele fiind perpendiculare pe axa axa optica.

Puterea=Puterea= raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede obiectul prin microscop si dimensiunea liniara a obiectului situat perpendicular pe axa optica.

GrosismentulGrosismentul= marirea unghiulara= raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede obiectul prin instrument si tangenta unghiului sub care se vede obiectul cand este privit cu ochiul liber de la distanta de 25 cm.

Puterea de rezolutie (de separare) = distanta minima dintre doua puncte ale obiectului care mai pot fi vazute separat unul de celalalt prin microscop.

u = unghiul format de razele extreme care pleaca de la obiect inspre marginile obiectivului

Fig. 1. Porcine hepatocytes after 1-hour culture (phase-contrast microscopy, original magnification×400).Fig. 2. Porcine hepatocytes after 24-hour culture (phase-contrast microscopy, original magnification×400).Fig. 3. Ultrastructure of porcine hepatocytes after 24-hour culture (transmission electron microscopy, original magnification×4000). M: mitochondrion; R: ribosome; ER: endoplasmic reticulum; N: nucleus; CJ: cell junction.Fig. 4. Spheroids of porcine hepatocytes after 24-hour culture (scanning electron microscopy, original magnification×300).

Fluorescence microscopy of endothelial cells using three labels. Red lables the mitochondria, green lables the F-actine cytoskeleton and blue lables the nucleus.

This confocal microscopy image of the organ of Corti

Microscopia electronica

Microscopul optic nu poate oferi imagini clare ale obiectelor mai mici decat 0,15 μm deoarece puterea separatoare a instrumentelor este invers proportionala cu lungimea de unda a radiatiilor utilizate.

Puterea de separare (rezolutia) unui microscop poate fi marita daca in loc de lumina vizibila se utilizeaza un fascicol de electroni, deoarece lungimea de unda asociata electronilor este mult mai mica decat cea a radiatiei vizibile sau UV pe care le utilizeaza microscopul optic.

Microscopie electronica Viteza unui electron in miscare, accelerat sub o diferenta de potential U

este

Lungimea de unda asociata unui electron in miscare (conform teoriei lui de Broigle) este

unde m= masa electronului, h= constanta lui Plank, e= sarcina electronului

m

eUv

2

meU

h

2

MICROSCOPUL ELECTRONIC

Sursa de iluminare este un fascicol de electroni, emisi de un catod de tungsten incalzit pana la incandescenta.

Intre catod si anod este o diferenta de potential de 50 000-100 000 V, numita tensiune de accelerare.

Lentilele sunt de fapt electromagneti. Lentilele condensor fcalizeaza electronii pe proba, iar lentilele obiectiv si proiector focalizeaza in continuare electronii care au trecut prin proba , asigurand formarea imaginii pe un ecran sau computer.

Coloana microscopului trebuie mentinuta la un vid inalt de 10-6 torr.

TEM- microscopie electronica de transmisie

Este cea mai utilizata varianta de microscopie electronica pentru cercetari structurale, se utilizeaza pentru probe transparente.

Transmission electron microscopy (TEM) scan of Salmonella typhi, the bacteria which causes typhoid fever in humans.

SEM- microscopie electronica tip scanning

Se utilizeaza pentru studiul suprafetelor. Permite observarea aspectului tridimensional al celulelor,

tesuturilor, pe cand prin TEM se poate observa doar imaginea bidimensionala.

Tesuturile si macromoleculele biologice prt fi vizualizate folosind diverse tehnici auxiliare:

- metalizarea= pulverizarea unor vapori de metal (argint) pe suprafata probelor pentru a produce un efect de umbrire.

- criofracurarea- permite vizualizarea interiorului membranelor dupa ce au fost congelate in azot lichid (-196ºC).

- Contrastare negativa- pentru observarea macromoleculelor izolate (ADN, proteine). Suprafata probei se trateaza cu o solutie concentrata de metale grele, dupa uscare metalul formeaza o pelicula, iar la microscop se observa doar conturul macromoleculei investigate.

SEM- microscopie electronica tip scanning

Limfocit

Tesut osos tanar-22 ani

Tesut osos varstnic (osteoporoza)

Imagini SEM ale componentelor sangelui uman: hematiile (celule rosii, rotunde si plate) , lymphocytes, monocyte, neutrophile, si plachete (trombocite de forma unor discuri mici)

Furnica