Reactii antigen-anticorp

Lp.9

agenda

• Reactii antigen anticorp- generalitati, clasificare

• Reactii antigen-anticorp de precipitare in mediu lichid, calitative si cantitative.

• Reactii antigen-anticorp de precipitare ingel, calitative si cantitative

• Imunodifuzia radiala simpla

• Reactia de dubla difuzie

• Imuno-si contra imuno electroforeza

Generalitati Reactia antigen –anticorp necesita interactiunea determinantului antigenic cu situsul de combinare al anticorpului

Factori care conditioneaza interactiunea atg-atc:

1. Complementaritatea structurala dintre epitop si paratop- presupune adaptarea conformationala a celor doua grupari de tipul cheie in broasca

2. Complementaritatea electrochimica a gruparilor care intra in reactie este o consecinta a complementaritatii structurale

Acestea nu sunt suficiente fiecare in parte pentru a forma legaturi stabile, este necesara indeplinirea ambelor conditii

Cu cat energia de legare a reactantilor este mai mare cu atat complexele ag-ac sunt mai stabile

Click to edit the outline text format Second Outline

Level Third Outline

Level Fourth Outline

Level Fifth

Outline Level

Sixth Outline Level

Seventh Outline Level

Eighth Outline Level

• Ninth Outline LevelClick to edit Master text styles

– Second level

• Third level

– Fourth level

» Fifth level

Interactiunea dintre epitop si paratop Afinitatea

• Masoara forta de legare dintre epitop si paratop

• Este rezultanta fortelor de atractie si respingere care mediaza interactiunea dintre cei 2 reactanti

• O afinitate inalta presupune structuri complexe perfecte

• Complementaritatea imperfecta a gruparilor reactante determina o afinitate scazuta

• Se poate masura prin dializa la echilibru

Aviditatea• Un parametru al interactiunii ac-ag

care rezulta din multivalenta ag

• Cele mai multe ag poseda mai mult decat un epitop

• Aviditatea caracterizeaza energia medie de legare a unui ag multivalent cu ac specifici si masoara forta rezultanta a afinitatii dintre epitopii multiplii ai unui ag si paratopii complementari

• Complexele at-ac formate de antigenele multivalente sunt stabile , disocierea lor fiind dificila deoarece este necesara ruperea tuturor legaturilor existente

Reactii incrucisate

• In anumite cazuri pot avea loc reactii incrucisate

• Un Ag reactioneaza cu un Ac care a fost sintetizat fata de alt antigen

Stadiile reactiilor Ag-Ac Interactiunea primara

• Se datoreaza legarii efective a AC de AG si depinde de cantitatea si afinitatea Ac

Interactiunea secundara

• Apar la cca 30 min dupa interactiunile primare

Interactiunea tertiara

• Definesc manifestarile in vivo ale reactiilor Ag-ac si depind special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei

Tipuri de reactii antigen-anticorp 1.Reactii de precipitare

In gel –imunodifuzia radiala Mancini

- dubla difuzie ouchterlony

In mediu lichid – reactia Ramon

- pp in inel Ascoli

2.Reactii de aglutinare

Se pot folosi in diagnosticul bacteriologic – reactia Huddleson

Se pot folosi in diagnosticul serologic ( reactia Wright)

3.Reactii de fixare a complementului

In diagnosticul serologic al sifilisului, leptospirozei

In diagnosticul serologic al infectiilor virale

4.Reactii de seroneutralizare

Reactia ASLO ( in diagnosticul serologic al infectiilor streptococice

Diferite intradermoreactii cu mecanism imun umoral

Reactii in care componentele sunt marcate

Izotopic( radio imuno assay; RIA)

Enzimatic( enzyme linked immuno assay, Elisa)

Fluorescent ( fluorescent immunoassay, FIA)

Chemiluminiscent( chemiluminiscent assay, CLA)

Reactii de precipitare In mediu lichid

In amestec, reactii de floculare:

- Titrarea toxinei difterice( metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici

- VDRL,USR,RPR in diagnosticul serologic al sifilisului

De pecipitare in inel

- Reactia Ascoli, determinarea grupului streptococic

De precipitare in tub capilar

- Determinarea prezentei proteinei C reactive

- Determinarea prezentei tipului M streptococic( streptococi de grup A)

Dozajul nefelometric

In mediu gelificat

- Imunodifuzia radiala simpla ( metoda Mancini)

- Difuzia dubla: - metoda Elek

- difuzia dubla radiala( Ouchterlony)

- Cu difuzie in gel si migrare in camp electric

- Imunelectroforeza

- Contraimunelectroforeza

- Electroforeza urmata de imunofixare

- Electroimunodifuzia

Reactii de precipitare in mediu lichid

Au la baza unirea Ag cu Ac in mediu lichid formandu-se complexe Ag-Ac care vor precipita atunci cand Ag si Ac se gasesc in anumite proportii

Reactia de precipitare in amestec Se poate cuantifica si este foarte utila pentru a demonstra prezenta sau respectiv absenta precipitatului in functie de concentratiile relative ale Ag si Ac

Titrarea toxinei difterice( Ramon):

- Se pun in contact, in amestec in tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata( toxina difterica_ antigenul) si cntitati variabile de Ac la care titrul este cunoscut

- Cantitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul unde exista raportul de echivalenta

- Cunoscand titrul anticorpilor , se afla imedia titrul toxinei( daca pp maxima apare in tubul in care titrul Ac este 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf( cantitatea de toxina care se combina cu unitatile de Ac)

Reactia de precipitare in inel Consta in punerea in contact a Ag si Ac astfel incat sa nu se amestece

Reactia care apare la interfata dintre Ag si Ac duce la aparitia unui inel de precipitare albicios

Are utilizari in :- medicina legala- identificarea originii petelor de sange

- industria alimentara-identificarea provenientei unor preparate pe baza de carne

Reactia Ascoli Se poate utiliza pentru identificarea prezentei antigenului carbunos ( obtinut de la Bacillus anthracis)

Se utilizeaza 3 tuburi, 1 pentru reactie si 2 tuburi martor

In primul tub se pipeteaza 0.5 ml ser anticarbunos si 0.5 ml solutie salina fiziologica

In al doilea tub se pipeteaza 0.5 ml ser normal de cal si 0.5 ml solutie de antigen

In tubul de reactie se pipeteaza 0.5 ml din serul anticarbunos, iar solutia de antigen se pipeteaza f lent, picatura cu picatura pe peretele interior al tubului astfel incat cele doua solutii sa nu se amestece

In cazul reactiei pozitive ( prezenta de antigen carbunos in solutia antigenica) dupa circa 5 minute la interfata dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare

Reactii de precipitare in mediu gelificat• Se utilizeaza geloza pentru a realiza mediul in care pot sa migreze cei doi

reactivi( se va utiliza o anumita concentratie de agar in solutie de tampon veronal, in asa fel incat porii gelului sa permita migrarea)

• Se va vizualiza reactia Ag –Ac printr-o linie de precipitare

Dubla difuzie ELEK

• Permite depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae

• In cazul unei tulpini toxigene, toxina acesteia va difuza in mediu, iar dupa legarea de Ac antitoxina vor aparea linii de precipitare ( complexele Ag- Ac)

• Intr-o cutie Petri cu mediu Elek se decupeaza un sant pe unul din diametre

• In sant se pipeteaza 0,5 ml ser antidifteric( contine Ac anti-toxina difterica) in concentratie de 1000 UI/ml

• Anticorpii antitoxina vor difuza in mediu

• Dupa cca 2 ore se insamanteaza perpendicular pe santul cu Ac antitoxina, de fiecare parte a santului o tulipna de Corynebacterium diphteriae toxigena ( martor pozitiv), o tulpina de Corynebacterium diphtriae ne-toxigena ( martor negativ) si tulpini de cercetat , cate un striu ( de fiecare parte a santului) pentru fiecare tulpina

• Se incubeaza la 37 g C, 48 ore, se urmareste zilnic aparitia culturii si precipitatului

• De-a lungul liniilor de insamantare apare cultura bacteriana

• Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeza in mediu

Click to edit the outline text format Second Outline

Level Third Outline

Level Fourth Outline

Level Fifth

Outline Level

Sixth Outline Level

Seventh Outline Level

Eighth Outline Level

• Ninth Outline LevelClick to edit Master text styles

– Second level

• Third level

– Fourth level

» Fifth level

Testul Elek

Testul Elek

Imunodifuzia radiala simpla (Mancini)• Se bazeaza pe difuzia spontana si radiala a Ag

din proba de cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de anticorpi, determinind aparitia unui cerc de precipitare al carui diametru este direct proportional cu concentratia de antigen din proba

• Permite determinarea cantitativa a imunoglobulinelor ( IgG, IgM, IgA) , fractiunii C3 a complementului, alfa 1- antitripsinei, siderofilinei

• Sunt necesare placute in care se toarna un gel care include Ac fata de structura a acrei concentratie dorim sa o determinam

• Placutele au culori diferite, pt IgG sunt rosii, pt IgA sunt albastre, etc

• In gel sunt perforate mici godeuri

• Sunt necesare seruri de cercetat si un ser de referinta in care se cunoaste concentratia diferitelor componente

• Inainte de pipetarea serurilor in godeuri se realizeaza dilutia acestra, ¼ pentru IgG, IgA, si siderofilina si respectiv ½ pentru IgM, complement C3 si alfa1 antitripsina

• Cantitatea de ser introdusa in fiecare godeu este de 5microl

• Se incubeaza 48 ore pt IgA si IgM, si 24 ore pt restul la 37 g C, cu gelul pozitionat in sus

• Citirea se realizeaza cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, speciala

• Se va citi initial ciametrul cercului de precipitare din jurul godeului cu serul de referinta

• Apoi se face citireadiametrelor din serurile de cercetat

Reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migarea in camp electric

• Electroforeza proteica in gel

• Imunelectroforeza

• Contraimunelectroforeza

• electroimunodifuzia