Micro Biologie

482
MICROBIOLOG IE 1

description

microbiologie

Transcript of Micro Biologie

Page 1: Micro Biologie

MICROBIOLOGIE

1

Page 2: Micro Biologie

Introducere

Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot fi

observate decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem

discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în

discuţie şi alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate în cadrul

disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu înrudit cu microbiologia poate fi considerată şi

imunologia.

Se consideră că microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase şi diversificate

forme de viaţă. Pot fi identificate în mediul înconjurător, au rol în descompunerea materiei

organice şi menţin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau

făcând parte din flora normală a diferitelor gazde; o mai mică parte sunt implicate, în

diferite grade, în patologie. În acest caz, bolile infecţioase pot să afecteze o persoană, un

grup de persoane sau o întreagă comunitate. Pe măsură ce bolile infecţioase au fost

identificate a apărut şi disciplina de epidemiologie, născută din necesitatea studiului

izbucnirilor epidemice. Datorită faptului că iniţial nu era cunoscută etiologia epidemiilor,

acestea au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la

cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Există o serie de documente istorice care

atestă existenţa epidemiologiei ca ştiinţă privind patologia în masă, precum tratatele lui

Hipocrate (460-377 înainte de Iisus Christos), cele 7 cărţi „Despre epidemii” şi „Despre aeri,

apă şi locuri”.

Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei ştiinţe relativ simple la un nivel care

a determinat progrese însemnate în diagnosticul, prevenirea şi tratamentul bolilor. În bună

parte datorită aplicaţiilor microbiologiei, speranţa de viaţă a crescut semnificativ. La

începutul secolului, se înregistrau frecvent decese datorită unor cauze infecţioase (difterie,

oreion, pestă, poliomielită, rubeolă, rujeolă, tifos exantematic, tuberculoză, sifilis, varicelă,

variolă, etc).

În acest moment variola este eradicată.

Pentru poliomielită a fost stabilită ţinta eradicării, iniţial pentru anul 2000, ulterior

pentru 2012. Izbucnirea epidemică din 2010 ”a împins” această ţintă peste alţi ani (unica

boală infecțioasă eradicată rămâne variola).

Pentru alte maladii sunt propuse alte ţinte de prevenire şi control iar evoluţia gravă,

letală, survine numai în anumite situaţii (forme clinice avansate, atipice, neglijate).

Datorită cunoştinţelor în domeniul microbiologiei s-au îmbunătăţit condiţiile sanitare, s-

au descoperit şi aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea „tehnologiei

ADN” (în special după anul 1973), bazată pe cunoştinţele acumulate pe parcursul ultimelor

trei-patru decade de studiu şi practică privind genetica microbiană, are o însemnătate

deosebită. Există de un număr de ani posibilitatea inserării de material genetic provenit de

2

Page 3: Micro Biologie

la oricare organism viu în bacterii selecţionate şi adaptate astfel încât să poată realiza

„sarcini” speciale, normale la celula donatoare, ajungându-se până la posibilitatea ca tulpini

deEscherichia coli modificate genetic să sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul

bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular.

Microbiologia ca ştiinţă este strict necesară pentru sănătate, pentru menţinerea

sănătăţii şi prevenirea îmbolnăvirilor. Cunoaşterea modului de transmitere a diferitelor

microorganisme reduce numărul cazurilor de toxoplasmoză, tuberculoză sau gripă.

Cunoaşterea noţiunilor privind sterilizarea-antisepsia-dezinfecţia poate permite (în

cazul aplicării corecte în practică a acestor noţiuni) evitarea infecţiilor de spital sau a altor

infecţii produse în unităţi sanitare cu sau fără paturi. Cunoaşterea imunologiei şi

imunopatologiei permite înţelegerea legăturilor şi interrelaţiilor microorganism-gazdă,

precum şi importanţa procedeelor de imunizare şi supravegherea aplicării acestora.

Măsurile generale aplicate pentru evitarea apariției bolilor infecțioase sau a transmiterii

ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunoștințe microbiologice.

Studiul microbiologiei nu este dificil în cazul în care se înţelege faptul că

microbiologia este o ştiinţă foarte logică (cele mai multe principii pot fi învăţate prin

simpla înţelegere a acestora). Pe de altă parte, pe măsură ce reuşeşti să îi descifrezi o

parte dintre taine poţi realiza că este una dintre cele mai fascinante ştiinţe.

Microorganismele au fost descoperite relativ târziu, în 1680, cu toate că primul

instrument de mărire asemănător cu dispozitivele actuale a fost realizat în 1590 de către

Zacharias Janssen.

În 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oară celulele, el a studiat o secţiune

dintr-un dop de plută şi a descoperit că structura plutei era formată din nişte „cutii” micuţe.

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind să examineze ţesătura hainelor fine (deşi

era la bază un vânzător de mărunţişuri), se pare că a fost prima persoană care a văzut şi a

descris diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe

care l-a construit singur, a constat dintr-o lentilă biconvexă într-un cadru metalic, cu o

mărire de până la 270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniţial diferite ţesături, însă

manifestând o curiozitate deosebită a dorit să studieze ulterior apa din bălţi, tartrul dentar,

materiile fecale provenite de la un pacient cu „dizenterie”, etc. A fost mirat să observe în

toate aceste substanţe, mici organisme sferice, altele în formă de „bastonaş”, spirale, unele

aflate în mişcare rapidă, pe care le-a numit „animalicule”. Desenele pe care le-a făcut

probează că a observat cu adevărat bacterii, protozoare şi alte microorganisme. Pornind de

la condiţia sa iniţială, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat

125 de scrisori traduse în engleză şi predate Societăţii Regale din Londra. în plus, 27 dintre

lucrările sale au fost publicate în Memoriile Academiei Franceze de ştiinţe. Se pare că unul

dintre microscoapele originale ale lui van Leeuwenhoek se află în muzeul Universităţii din

Utrecht.

În urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus întrebarea „de unde au apărut aceste

organisme?”. Până la mijlocul secolului al nouăsprezecelea cea mai acceptată teorie a fost

„teoria generaţiei spontane”. Învăţaţii epocii credeau că bacteriile apăreau spontan din

materie anorganică. În 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de „biogeneză”. Această

3

Page 4: Micro Biologie

teorie susținea faptul că un organism viu poate să apară numai din alt organism viu.

Controversele între cele două teorii s-au păstrat până în 1861 când Pasteur a infirmat

”teoria generaţiei spontane”. Geniul lui Pasteur a demonstrat că aerul contaminat cu

microorganisme poate cotamina o soluţie sterilă, în schimb aerul steril nu poate să

determine apariția unor bacterii.

Cu mult înainte de a se fi cunoscut faptul că microorganismele sunt cauza bolilor

infecţioase au fost imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu,

Edward Jenner (1796) a arătat că variola ar putea fi prevenită prin vaccinare. Semmelweis a

avut contribuţii importante privind prevenirea răspândirii bolilor în maternităţi şi spitale

utilizând substanţe chimice „dezinfectante”.

Regulile principale (unele valabile şi astăzi) precum şi metodele ştiinţei microbiologice

inclusiv principiile imunizării, utilizarea microbiologiei în medicina preventivă, prevenirea şi

controlul bolilor infecţioase se bazează pe activitatea a doi cercetători înzestraţi atât cu

geniu cât şi cu tenacitate, probabil având şi şansa de a fi trăit în „perioada marilor

descoperiri”, Louis Pasteur (1822-1895) şi Robert Koch (1843-1910). Pe bună dreptate,

perioada 1857-1914 e considerată drept ”epoca de aur a microbiologiei”.

Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei.

Tot el a demonstrat că fermentaţia şi putrefacţia sunt cauzate de organisme vii şi a notat o

asemănare între aceste procese şi bolile infecţioase luând în discuţie degradarea vinurilor şi

berii ca şi „boli” ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin

care a arătat că, atât cât era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat

naştere numai din organisme vii, şi nu din materie moartă. În 1861 a descoperit fenomenul

de anaerobioză şi fermentarea butirică (produsă de Vibrion butyrique, numit

ulteriorClostridium butyricum). După elaborarea procedeului numit „pasteurizare”, a

expus în 1877 teoria pasteuriană cu privire la germeni desfiinţând (așa cum am mai

menționat) „teoria generaţiei spontanee”. Utilizând substanţe simple, de origine naturală şi

gaze, vapori şi arcuri electrice sub temperatură şi presiune crescută, microbiologii şi

biochimiştii pot sintetiza o serie de compuşi organici care au fost descoperiţi iniţial doar în

celulele vii. După studiul fermentării vinului, Pasteur a investigat o boală transmisibilă la

viermii de mătase şi ca rezultat a formulat teoria legată de implicarea germenilor în

producerea unor boli. În ceea ce priveşte maladiile umane, a insistat ca bandajele să fie

curăţate şi instrumentele din spital să fie fierte.

Louis Pasteur a demonstrat în anul 1857, la aproape o jumătate de secol după lucrările

redactate despre vaccinare de către Edward Jenner, legătura dintre infecţii şi

microorganismele susceptibile a fi cultivate şi studiate. în diferite experimente ingenioase,

Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras

din Bacillus anthracis. „Tratamentul profilactic” al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de

material uscat obţinut din măduva spinării de la animalele care au murit de rabie. Joseph

Meister, un băiat muşcat de un câine turbat, a fost primul om a cărui viaţă a fost salvată

prin această metodă fiind protejat de injecţiile făcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a

descoperit bacteriile anaerobe şi a studiat septicemia şi gangrena. Ca atare, a devenit

posibilă punerea la punct a tehnicilor de distrugere şi de control al diferiţilor germeni

4

Page 5: Micro Biologie

(stafilococi, streptococi, pneumococi etc). În 1880, Louis Pasteur a demonstrat că putem fi

protejaţi contra bolilor infecţioase prin injectarea unor germeni atenuaţi.

Primul medic care a observat transmiterea infecţiilor în instituții sanitare a fost Ignaz

Semmelweis. Femeile ce nășteau acasă sufereau mai puține infecții comparativ cu cele ce

nășteau la spital. A impus spălarea riguroasă şi ”dezinfectarea” cu clor a mâinilor

personalului înainte de a aplica intra în sala de naștere sau de a consulta o femeie

însărcinată.

Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur în

chirurgie chiar înainte ca bacteriile care determină infecţiiile chirurgicale (nosocomiale) să fi

fost descoperite. Lucrările lui Lister reprezintă baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de

astăzi.

Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumiţi microbiologi germani. El

a extins cercetările lui Pasteur lucrând cu bacterii, alge şi fungi. Fiind foarte interesat de

bacteriologie, a scris una dintre primele cărţi referitoare la bacterii, realizând una dintre

primele clasificări bacteriene în genuri şi specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru

Robert Koch, încurajându-l să îşi publice lucrările cu privire la antrax.

Cu două secole înainte de apariţia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat că anumite

boli sunt provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat că bolile infecţioase ar

putea fi determinate direct de către microorganisme.

Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a

demonstra „teoria microbiană a bolii”. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor

în cultura pură a fost printre cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice

şi a fost în mare parte opera lui Robert Koch. O cultură pură de microorganisme se dezvoltă

atunci când pornim de la un singur tip de microorganism care se dezvoltă în eprubetele test

sau în plăcile cu mediu de cultură (în colonii izolate).în condiţii naturale, mai multe

microorganisme din specii diferite pot coexista în acelaşi mediu. Spre exemplu, în materiile

fecale ale unui pacient cu febră tifoidă, Salmonella typhi se află „amestecată” cu un număr

extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe şi anaerobe) sau chiar şi alte

forme de microorganisme. În cadrul diagnosticului medical microbiologic este importantă

izolarea în cultură pură a germenilor patogeni. În exemplul menţionat, pentru diagnostic

este necesară folosirea metodelor care permit izolarea S. typhi în cultură pură, singura care

permite identificarea şi stabilirea sensibilităţii / rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. în

1876 Koch a izolat în „cultură pură” bacteria care determină antraxul. Pornind de la splina

recoltată de la vite infectate şi procesată pentru a permite obţinerea unui produs patologic;

a fost capabil să infecteze şoareci de laborator utilizând această cultură. Implicat în

cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecţioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a

considerat că reprezintă datele esenţiale pentru a demonstra că un anume germen este

cauza unei infecţii. Aceste date sunt cuprinse în patru postulate, denumite Postulatele lui

Koch, respectiv:

1. Microorganismele care determină boala trebuie să poată fi identificate în toate

cazurile de boală, în relaţie patogenică directă cu simptomele şi leziunile pe care le

determină;

5

Page 6: Micro Biologie

2. Microorganismul trebuie să poată fi izolat de la victimele bolii, în cultură pură, pentru

studiul în laborator;

3. Când cultura este inoculată la un animal susceptibil, trebuie să reproducă boala (sau,

cum s-a stabilit ulterior, să inducă apariţia anticorpilor specifici la noua gazdă);

4. Microorganismul trebuie să poată fi izolat din nou în cultura pură din infecţia produsă

experimental.

Utilizând aceste reguli precum şi diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit

bacilul tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum şi modul de transmitere

pentru numeroase alte boli infecţioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodiumetc.).

Descoperirile menţionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei,

parazitologiei şi imunologiei ca ştiinţe. în doar aproximativ 15 ani (după 1880) au fost

descoperite şi izolate în cultură pură microorganisme implicate în multe dintre bolile

infecţioase importante. Aceste descoperiri au făcut posibilă stabilirea ca entităţi bine

definite a medicinei preventive şi respectiv a terapiei specifice (etiologice).

Ilia Mecinikov a evidenţiat modul natural de apărare a organismului faţă de agenţii

infecţioşi prin anumite celule care au proprietăţi fagocitare şi a scris în 1901 primul tratat

de imunologie.

În şcoala germană apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat

toxinele bacteriene, imunitatea umorală şi seroterapia precum şi Paul Ehrlich (1854-1915).

Cercetările lui Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivaţilor

arsenicali în tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult decât atât, în

anul 1878 Ehrlich realizează că există diferenţe de afinitate tinctorială faţă de coloranţii pe

bază de anilină. Această descoperire îl ajută să studieze efectul diferitelor substanţe

chimice, dar stă şi la baza apariţiei coloraţiilor în microbiologie.

Ehrlich arată că mycobacteriile au proprietatea de acido-rezistenţă iar doi ani mai târziu

(1884), cercetătorul danez Christian Gram pune bazele coloraţiei care îi poartă numele şi

care are o remarcabilă utilitate după aproape 125 ani de la această descoperire.

Deşi asistenţa medicală într-o anumită formă a existat încă de la debutul vieţii umane

pe pământ, începuturile nursing-ului profesional au fost realizate de către Florence

Nightingale (1820-1910), care a început munca sa cu mai bine de 140 de ani în urmă, în

cursul războiului din Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaţia dintre

microorganisme şi boală, au necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe

şi mai rafinate decât cele utilizate de „îngerii din Crimeea”.

Descoperirea măsurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de

toxoizi şi antitoxine (în difterie şi tetanos), a serurilor imune (von Behring, Fränkel şi

Kitasato, 1890), a vaccinurilor polio şi rujeolos (Enders, Weller şi Robins 1949; Salk 1954;

Sabin şi alţii, 1954-1967), precum şi utilizarea de gama globuline pentru prevenirea

pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au făcut necesară dezvoltarea de noi concepte şi

educaţie în prepararea şi administrarea acestor substanţe.

Identificarea căilor de transmitere a infecţiilor a condus la dezvoltarea de metode

eficace de prevenire a răspândirii bolilor.în 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic

militar în India, a demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul

6

Page 7: Micro Biologie

ţânţarilor. Parazitul a fost vizualizat în eritrocitele umane în 1881 de către Laveran, chirurg

al armatei franceze în Algeria. în 1900 a fost demonstrată transmiterea virusului febrei

galbene de către o specie particulară de ţânţari (Aedes aegypti), în Cuba.

Descoperirea unor teste de diagnostic în domeniul microbiologiei a necesitat o pregătire

microbiologică mai avansată a medicilor, asistentelor şi a altor profesionişti ai sănătăţii în

metode pentru colectarea produselor şi raportarea specifică de laborator, astfel încât

terapia să demareze cât mai precoce. Descoperirea de substanţe chimice specifice (de

exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) şi substanţe antibiotice (de exemplu penicilina,

streptomicina, tetraciclina şi cloramfenicolul) a contribuit la îmbunătăţirea modului de

abordare medicală a problematicii bolilor infecţioase. Primul medicament anti-tuberculos

este descoperit în anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman).

Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fără dezinfecţie şi sterilizare. Industria

laptelui, a conservelor, a hranei ambalate şi congelate sunt dependente de microbiologie.

Sanitaţia sistemelor de apă şi tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorită

cunoştinţelor acumulate prin microbiologie în cursul ultimului secol. în multe moduri

profesiunea medicală şi fiecare latură a ei este dependentă de cunoaşterea, înţelegerea şi

utilizarea informaţiilor din microbiologie.

La şcoala română de microbiologie înfiinţată de profesorii Victor Babeş (1854-1926) şi

Ion Cantacuzino (1863-1934) s-au pregătit multe generaţii de microbiologi, viitori

cercetători şi profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ţara noastră.

Victor Babeş s-a născut la Viena în anul 1854, a studiat la Facultatea de medicină din

Budapesta, apoi în Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condusă de

profesorul Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de

Anatomie patologică la Facultatea de medicină din Budapesta. A fost în acelaşi timp

anatomopatolog şi microbiolog. A fost atât elevul lui Robert Koch, cât şi al lui Louis Pasteur.

A fost numit docent şi profesor la Facultatea de medicină din Budapesta la o vârstă foarte

tânără (27 ani). Cu patru ani mai târziu, în anul 1885, publică împreună cu A.V. Cornil

primul tratat de bacteriologie medicală din lume (în 1891 apare a treia ediţie a tratatului). A

doua ediţie a acestui tratat se află în Biblioteca Institutului Naţional de Cercetare-

Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”. Victor Babeş a demonstrat

importanţa introducerii tehnicilor microbiologice în anatomopatologie. Ar putea fi menţionat

şi faptul că pe parcursul celor 10 ani de activitate la Facultatea din Budapesta, a dat

indicaţiile necesare pentru construirea unui nou Institut de anatomie patologică iar în cadrul

acestuia a unei secţii dedicate bacteriologiei. A evidenţiat proprietăţile neutralizante ale

serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babeş-Ernst), o

nouă metodă de preparare a serului antidifteric etc. în 1886 a fost numit profesor de

anatomie patologică şi bacteriologie la Facultatea de Medicină din Bucureşti. Este

fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza căruia s-a dezvoltat actualul Institut „Victor

Babeş”. În 1889 a preparat vaccin antirabic,ţara noastră fiind a treia ţară din lume

care a reuşit să prepare acest vaccin. A condus institutul creat până aproape de

sfârşitul zilelor sale, care a fost la puţin timp după pensionarea sa.

7

Page 8: Micro Biologie

Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fie găsit un spațiu în

care să-şi poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des

întâlnit în istoria medicinei noastre.

Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a fi foarte

asemănătoare peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii

noastre este într-o direcţie pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul

profesorului Victor Babeş, ţinut la Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea

civilizată aşteaptă deci lucruri mari din partea noastră; nu îmbogăţirea oligarhiei

politice în afaceri, certuri politice, persecuţiuni şi denunţuri infame pentru

interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor mai valoroase

achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi ştiinţa,

spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de

exemplu popoarelor din Orient.

Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare

desorganizare, desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi

nepăsare ca ţărănimea să fie azi degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată

peste măsură; politicienii noştri au reuşit să oprime toate valorile, înlocuindu-le

prin clientela lor politică; au adus funcţionarismul, birocratismul, nepotismul la

culme; politicienii noştri în nepăsarea lor pentru interesele ţării au lăsat armata la începutul

războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase prin care a trecut ţara şi din

care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român.

Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu

este o datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l

înlocuim cu o altă putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul.

În adevăr trebue să fim profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom

putea să eşim din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am

contractat-o faţă de lumea civilizată.

Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice,

aceeaşi nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate,

acelaşi egoism care ne-a condus la degenerare ca şi înainte războiului,aşteaptă cu

nerăbdare o schimbare radicală a moravurilor politice care să ne pună în

poziţiunea de a îndeplini măreaţa noastră misiune.

Faţă de aceste adevăruri ar fi trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul

în prag şi să rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre

profunda noastră descurajare; că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze

goale domină şi politica de astăzi şi că mergem orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca

întinderea şi bogăţia acestei ţări binecuvântate să ne asigure un loc de frunte şi stare

economică briliantă, ne găsim astăzi în deplin faliment, expuşi ruinei şi foametei şi mai mult

decât oricând sub dependenţa şi exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari.”

Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într-o

trecere atât de sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia şi

Literele, ştiinţele naturale şi Medicina. Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe

8

Page 9: Micro Biologie

parcursul a 9 ani, în laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi

străine, inclusiv latina şi greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru satisfacerea

stagiului militar (genişti, Jilava). A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886,

medicină 1887). Lucrează în Institutul Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină

în 1894 şi este numit profesor suplinitor de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din

Iaşi (1894). A fost numit profesor la Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a

grupat în jurul său un mare număr de tineri medici, care au devenit la rândul lor

îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C. Ionescu-Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D.

Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I. Nicolau, Lidia şi I. Mesrobeanu şi

mulţi alţii).

În perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al

Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, înfiinţează sanatoriile

Bisericani, Bârnova, Nifon, Cărbuneşti, Filaret precum şi primele laboratoare regionale de

bacteriologie şi igienă (Craiova, Galaţi, Constanţa, Iaşi, Sulina). Începe în 1912 prepararea

vaccinului contra febrei tifoide şi a holerei asiatice, ulterior începe prepararea serului

antidifteric. Este numit în 1917 Director al Directoratului Sănătăţii Publice civile şi militare,

calitate în care coordonează combaterea epidemiilor de holeră, tifos exantematic, febră

recurentă. În 1920 începe prepararea serurilor antimeningococic şi anti gangrenos (în

Laboratorul de Medicină experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim

delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai târziu se înfiinţează Institutul de Seruri şi

Vaccinuri, în 1926 începe vaccinarea BCG în România iar în 1928 înfiinţează „Archives

Roumaines de Pathologie Expérimentale et de Microbiologie”. Din păcate, în momentul de

faţă „Romanian Archives of Microbiology and Immunology” (numele actual al revistei, care

a ajuns la volumul cu numărul 69) nu apare listată între publicaţiile recunoscute oficial în

ţara noastră, cu toate că începând cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial

străduindu-se să refacă prestigiul revistei, ca o datorie morală faţă de înaintaşi.

În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de

ministru al sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă

zile înainte de a înceta din viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfiinţarea

Ligii contra Tuberculozei.

Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului

Cantacuzino a fost înfiinţarea în anul1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit

astăzi INCDMI „Cantacuzino” (Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru

Microbiologie şi Imunologie), centru de cercetare ştiinţifică fundamentală şi aplicativă,

centru de învăţământ de specialitate, instituţie care a preparat şi prepară seruri, vaccinuri

şi alte produse biologice utile în diagnosticul bolilor transmisibile.

Alexandru Slătineanu (1873-1939) a organizat învăţământul universitar de

microbiologie la Iaşi (cercetări în domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului

exantematic, etc.).

Constantin Ionescu-Mihăieşti (1883-1962) a abordat teme importante în domeniul

virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice

şi epidemiologiei. A avut contribuţii deosebite în studierea mycobacteriilor şi

9

Page 10: Micro Biologie

enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului „Cantacuzino” a cărui

director a fost începând cu anul 1934. A continuat activitatea ştinţifică şi administrativă

promovată de Ion Cantacuzino.

Mihai Ciucă (1883-1969) a dezvoltat o bogată activitate ştiinţifică în domeniul

bacteriologiei şi epidemiologiei, experimental, terapeutic şi clinic. A studiat împreună cu

Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuţii deosebite în domeniul malariei

fiind numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lângă Liga Naţiunilor. A fost profesor de

microbiologie întâi la Iaşi şi din 1934 în Bucureşti fiind al treilea profesor de bacteriologie

din Bucureşti după Victor Babeş şi Ion Cantacuzino.

Alexandru Ciucă  (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din

Bucureşti. Activitatea lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri

hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al

Institutului Cantacuzino.

Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase

(febra tifoidă, febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A

avut contribuţii deosebite în domeniul rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului

război mondial a organizat măsuri de prevenire a tifosului exantematic.

Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în

România, în domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul

Pasteur din Paris şi ulterior a intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”,

lucrând alături de Ion Cantacuzino, Mihai Ciucă, I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician

a devenit şi întemeietorul şcolii moderne de bacteriologie clinică. Tehnicile şi metodele de

diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete şi inovaţii care îi poartă numele atât în

ţară cât şi în străinătate.

Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa

românească, pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică.

După 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat în Reţeaua Internaţională a Institutelor

Pasteur şi a Institutelor Asociate ceea ce a permis obţinerea unor rezultate, importante.

INCDMI „Cantacuzino” trebuie să continue tradiţia înaintaşilor şi să îşi menţină poziţia

importantă în cadrul instituţiilor care se ocupă de sănătatea publică la nivel naţional şi

internaţional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 şi respectiv eforturile

depuse în perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important în acest sens.

George Emil Palade (1912-2008)

Absolvent al facultăţii de medicină din Bucureşti, a desfășurat o prodigioasă activitate

ştinţifică, în Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice şi a

fracționării celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniţial cercetător şi ulterior

profesor de biologie celulară al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al

universităţii Yale din New Haven. Ultimul loc în care George Emil Palade a fost profesor a

fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul

celular.   

Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite

(mitocondria în detaliu cu structura membranei și a cristelor, a definit rolul reticulului

10

Page 11: Micro Biologie

endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un

articol publicat în 1955, Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronică ce

reprezenta reticulul endoplasmic rugos şi a explicat legătura între cele 2 structuri şi rolul lor

în eliberarea produşilor de secreţie).

Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi

iniţial ”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici)

rezultând altfel denumirea de „ribozomi”.

În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie.

Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut.

Trebuie avută însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii.

Microbiologul, medicul clinician şi asistenta medicală trebuie să aplice cunoştinţele de

microbiologie în practica de zi cu zi. Deşi anumite tehnici pot fi învăţate din rutină,

persoana cu adevărat profesionistă înţelege faptele ştiinţifice precum şi principiile aflate la

baza acestor tehnici. Profesionistul ştie de asemenea în ce mod ar trebui adaptate aceste

tehnici în cazul anumitor tipuri de pacienţi (ex. pentru cei supuşi chirurgiei cardiace,

pacienţilor care au suferit arsuri pe suprafeţe întinse), ce tehnici trebuie utilizate în sălile de

operaţie, de aşteptare şi în instituţiile unde sunt îngrijiţi copii mici sau foarte mici, cum pot

fi modificate acestea în condiţii de urgenţă (de exemplu în caz de război sau alte calamităţi

produse de om sau calamităţi naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor,

populaţiei, de exemplu referitor la imunizări. Un membru antrenat alechipei medicale

poate să diferenţieze adevărul de interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa

„literatură medicală” scrisă pentru publicul larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass

media, dacă are noţiunile necesare de microbiologie.

Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente

interesată, constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o

aplicabilitate a cunoştinţelor microbiologice.

Povestiri Adevarate1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553)

S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu

Nicolaus Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie,

matematică, poezie, geografie, muzică etc.

Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între

ciumă şi tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de această

minte luminată, în 1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere

epidemiologic, în lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi

tifosul exantematic.

A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de

corecte, dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape în totalitate.

11

Page 12: Micro Biologie

Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la

Veneţia [Syphilis sive morbus Gallicus(Sifilisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele

se datorează faptului că se presupune că sifilisul ar fi fost răspândit în Italia de trupe

franceze asediatoare]. În primele două volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte

sifilisul; a descris şi luesul ca entitate în cadrul acestei patologii, a discutat modalităţile de

debut şi chiar diferenţele între cele trei stadii ale bolii. Apar menţionate şi informaţii despre

modalităţi de diagnostic şi „tratament” (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur şi

extracte vegetale etc). În această scriere sunt discutate chiar şi metode de prevenţie. În al

treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date privind călătoriile lui Columb în Indiile de

Vest (se pare că boala era foarte răspândită printre băştinaşi) dar şi o poveste din

mitologie, povestea păstorului Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte

mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin această boală.

Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione („Despre contagiune,

boli contagioase şi tratamentul lor”), publicată tot la Veneţia, la vârsta de 68 de ani, include

toate cunoştinţele şi teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri.

În mod uimitor, cu sute de ani înainte ca aceste aspecte să fie studiate şi parţial

demonstrate ştiinţific de către Louis Pasteur, într-o vreme când bolile erau considerate

drept „pedeapsa zeilor”, teoria „miasmelor morbigene” a lui Hipocrate este combătută iar

Fracastoro emite ipoteza conform căreia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul

unor „fiinţe invizibile” [Seminaria morborum (seminţele bolilor)]. După mai mult de 130 de

ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizează microscopul pentru a studia câteva dintre

microorganisme. În plus, Girolamo Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în

organism: a. pe gură, b. prin respiraţie, c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât,

clasifică „contagiul” drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră,

sifilis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă

(„seminţele morbigene” fiind purtate la distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca

în cazul ciumei). Cu toate că a oferit incredibil de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale

au fost în bună parte confirmate ulterior, la acea vreme nu au fost acceptate iar teoria

„miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp considerată ca fiind valabilă.

Cu toate acestea, se poate spune că Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut în istoria

medicinei ca „părintele patologiei infecţioase”.

revenire sus

 

1.1.2. Robert Koch (1843-1910)

Alături de Louis Pasteur poate fi considerat “părintele bacteriologiei”. În 1905 meritele

sale au fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetările în domeniul

tuberculozei.

S-a născut în 1843 în Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen şi

Hanovra iar în 1866 a absolvit facultatea şi a fost numit medic de circumscripţie. A practicat

medicina în mai multe localităţi germane. În 1868 s-a stabilit în Wolstein (astăzi această

localitate se află în Polonia). În timpul şederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis într-un

laborator improvizat în propria locuinţa. Aici a creat celebrele postulate.

12

Page 13: Micro Biologie

Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer şi Davaine dar Robert Koch a

fost cel ce a demonstrat că această bacterie e cauza îmbolnăvirilor cu antrax “cărbune”

(nume dat datorită culorii închise a leziunilor din această boală). Prin studiile amănunţite a

descoperit fenomenul de sporulare şi a fost primul cercetător care a folosit tehnica

fotografiei în microbiologie, el fotografiind câmpurile microscopice.

În 1880 a fost angajat în ministerul sănătăţii unde şi-a continuat cercetările avându-l

colaborator printre alţii pe Lofler. În 1891 s-a înfiinţat Institutul pentru Studierea şi

Combaterea Bolilor Infecţioase din Berlin, instituţie care la 30 de ani de la descoperirea

bacilului tuberculozei a primit numele marelui savant.

Infecţia cu Mycobacterium era o mare problemă în secolul 19. Unul din 7 oameni

suferea de această boală, multe dintre îmbolnăviri evoluând nefast, spre deces. În 1881

Robert Koch a izolat bacilul cauzator şi a reuşit să îl cultive pe medii artificiale. În 1901 la

congresul britanic despre tuberculoză, savantul a dăruit organizatorilor 5 eprubete în care

se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care îi

identificase cu 20 de ani în urmă (în 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a

fost internat şi după câteva zile a murit, se pare, datorită unei tuberculoze miliare; la

necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniţial pe animale de laborator

bacteriile provenite din acest material, ulterior reuşind să le cultive şi în vitro; în 24 martie

1882, Robert Koch a făcut publice descoperirile sale privind izolarea şi identificarea

agentului patogen al tuberculozei).

Cercetările nu s-au oprit aici, Robert Koch continuând să aprofundeze studiul

mycobacteriilor dar abordând şi alte microorganisme. După succesul identificării bacilului

tuberculos a urmat o perioada mai puţin fastă, el încercând să folosească iniţial ”Alt-

Tuberkulin” ulterior ”Neu-Tuberkulin” (un filtrat de cultură bacteriană) ca şi tratament.

Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut şi o parte bună, aceste

încercări reprezentând momentul de pionierat pentru evidenţierea hipersensibilităţii de tip

IV, tuberculinică, iar tuberculina va fi ulterior utilizată în diagnostic și studii epidemiologice.

revenire sus

1.1.3. Institutul Ion Cantacuzino

Institutul Cantacuzino a existat cu mulţi ani înainte de a fi primit prin legea din 1921 o

confirmare pe tărâm administrativ. Încă din anul 1904, doi ani după chemarea profesorului

Cantacuzino la Catedra de Medicină Experimentală de la Facultatea de Medicină,

laboratorul său, destinat iniţial exclusiv învăţământului şi cercetărilor pur experimentale,

instalat în câteva încăperi din institutul de Patologie şi Bacteriologie condus de profesorul

Victor Babeş, a fost însărcinat de către Direcţia Sanitară să studieze metodele de preparare

şi valoarea practică a două ”seruri curative” de mare interes pentru medicină, serul

antistreptococic şi serul antidizenteric. Primele încercări de aplicare la bolnavi s-au arătat

foarte încurajatoare; ca atare s-a trecut de la faza experimentală la prepararea pe o scară

mai întinsă și la utilizarea lor în practică.

În perioada 1910-1913 a început experimentarea şi prepararea vaccinurilor contra

febrei tifoide şi holerei asiatice.

13

Page 14: Micro Biologie

Rezultatele obținute convingeau şi pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat

întrebuinţarea acestor metode în combaterea epidemiilor de febra tifoida şi holeră, iar

Serviciul Sanitar al armatei a decis aplicarea consecventă a vaccinării antitifoidice la recruţi

realizând prin aceasta dispariţia aproape completă a cazurilor de febra tifoidă din armată.

Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, într-un modest laborator

de învăţământ, în care încăperea cea mai impunătoare - sala de lucrări practice pentru

studenţi - nu putea primi deodată mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului

crea o atmosferă de munca entuziastă şi dezinteresată, o motivaţie admirabilă printre

colaboratori. Personalul tehnic se întărea, numărul asistenţilor benevoli de asemenea. Prin

activitatea practică, laboratorul putea pune la îndemâna studenţilor mijloace de lucru care

nu puteau fi găsite într-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de

fapt. Războiul din 1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate

înființării, așa cum am menționat. De altfel, istoria ”nu se schimbă”; în ultimii 20 de ani

aproape fiecare pas realizat în dezvoltarea sistemului de sănătate publică din România a

”beneficiat” de câte o problemă de sănătate care a demonstrat autorităților (cel puțin

pentru o perioadă de timp) că este necesară o intervenție concretă.

Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o țarăa întregităa, cu o

populaţie de trei ori mai mare şi care suferise pe timpul şi din cauza ocupaţiei străine. În

reorganizarea sanitară a țării, s-a impus, ca o măsură de primă necesitate, organizarea unui

Institut central de seruri şi vaccinuri, echipat în aşa fel încât să corespundă nevoilor

considerabil crescute ale României Mari, institut de producţie, de cercetare dar și de

învăţământ.

Prin Legea din 1921, grație guvernului de atunci, s-a creat o instituţie având

următoarele scopuri:

- să prepare toate serurile, vaccinurile, precum şi alte produse similare, necesare în

profilaxia şi tratamentul specific al maladiilor infecţioase din țară;

- să facă toate lucrările necesare pentru cercetarea ştiinţifică a acestor maladii şi să

stabilească metodele tip pentru serologie şi de microbiologie;

- să servească drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice şi să-și dea

avizul în ce priveşte introducerea în țară a serurilor şi vaccinurilor ”preparate aiurea”;

- să pregătească medici specialişti în microbiologie;

- să tipărească publicaţii periodice în legătură cu activitatea ştiinţifica a acestui Institut,

precum şi cu activitatea medicală şi biologică din întreaga țară.

Institutul prepara şi da spre întrebuinţare numai serurile şi vaccinurile care făceau

dovada eficacităţii lor. În acelaşi timp, în laboratoarele institutului se  cerceta şi se încercau

metodele noi de diagnostic microbiologic şi serologic, sau de tratament.

Una dintre remarcabilele realizări ale cercetărilor din institut a fost realizarea vaccinului

BCG şi începerea vaccinării tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea

numai în cadrul Institutului Pasteur din Paris.

Astăzi în cadrul institutului există laboratoare naționale de referinţă (multe dintre

acestea fiind certificate internațional, de către Organizația Mondială a Sănătății), inclusiv un

laborator foarte performant de biologie moleculară. Producţia încă mai continuă, chiar dacă

14

Page 15: Micro Biologie

preparatele pentru uz uman includ în principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut,

INCDMI ”Cantacuzino” a fost una dintre puținele instituții la nivel mondial care a reușit să

producă în timp util vaccinul gripal pandemic.

În clădirea principală se găseşte sala de curs și lucrări practice în care se predă

bacteriologie, noțiuni de imunologie și micologie, pentru studenţii de anul doi ai facultății de

medicină. La parter există sala de curs și seminarii pentru studenţii din anul cinci,

epidemiologie.

Institutul Cantacuzino rămâne cel mai important centru de cercetare din România. În

ceea ce privește capacitatea de producție, existența acestuia este indispensabilă (oricărei

țări). Avem speranța că în ciuda anumitor ”evenimente” din ultimii ani, nu vom vorbi

niciodată despre Acest Institut la timpul trecut, ci doar la prezent și viitor.

15

Page 16: Micro Biologie

2.STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

2. 1. CaracteristiciBacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este

clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi:

- rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma

micelii (ex. bacterii din genurileMycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia);

dacă majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii

care pot fi denumite ca paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia);

- flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.);

- lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma).

Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în

comparaţie cu celula eucariotă

Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariotă / celula procariotă)

Celula eucariotă Celula procariotă

Nucleul - prezintă membrană

- are mai mulţi cromozomi

- prezintă aparat mitotic

- nucleul este tipic,

prezintă nucleol

- nu prezintă membrane

- are un singur cromozom, circular

- absenţa mitozei

- nu este tipic ci apare ca nucleoid

Citoplasma prezintă:

- reticul endoplasmic

- mitocondrii

- lizozomi

- ribozomi 80S

- membrana

citoplasmatică conţine sterol

nu prezintă:

- reticul endoplasmic,

- mitocondrii,

- lizozomi

prezintă ribozomi 70S

membrana citoplasmatică nu conţine

steroli (excepţieMycoplasma)

Peretele

celular

- absent sau compus din

celuloză sau chitină.

- nu prezintă glicopeptid

- are structură complexă, prezentând

glicopeptid, proteine, lipide etc.

Diviziune Mitoză diviziune directă (binară)

Capsula Absentă adesea prezentă

Forma2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea:

16

Page 17: Micro Biologie

a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat.

Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii

sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi.

Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta

culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea

în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele

genuri de bacterii, de ex.:

- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);

- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă

comună (în diplo);

- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;

b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii),

drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite

(Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în

palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);

c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);

d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător

mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare

(ex. Actinomyces israelli);

e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).

Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule

„mamă” prezintă un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).

În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu

antibiotice etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care

pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o

examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură

proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă

de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.

Dimensiunile2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi

stadiul de dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor,

de exemplu, pentru coci 0,5-2 µm, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 µm. Dintre bacteriile

vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile

atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 µm / 0,2 µm. Rickettsiile,

chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorită dimensiunilor

17

Page 18: Micro Biologie

foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10µm. Formele filamentoase rezultate

după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din

genul Proteus pot prezenta „în mod natural” forme filamentoase, de dimensiuni mari.

Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fishelsoni (60-800 µm / 200-500 µm),

cea mai mare bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie

Gram negativă, potenţial vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între  100–300 µm şi până la

750 µm). (1999)

Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului,

fie clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10× şi

un obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplificare a

dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utilizând alte tipuri de microscoape. Spre

exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe

fluorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate fi mai

redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul

referitor la genul Mycobacterium).

Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea

agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira

spp.), inclusiv mobilitatea acestora.

Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica

examenului microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 1.

2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene

Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între

celula procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne

cât şi structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre

celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele

dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite

numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de:

- perete,

- membrană citoplasmatică,

- citoplasmă (cu ribozomi şi facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) şi de

- nucleu.

2. 3. 1. 1. Peretele bacterian

18

Page 19: Micro Biologie

Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipseşte la bacteriile din

genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm.

Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid

parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri

polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri

zaharidice:

- acidul N-acetil-muramic (NAM) şi

- N-acetil-glucozamina (NAG).

Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se

consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele

proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc

legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale

libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de

complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.

Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”)

şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este

acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid

teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la

peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi

sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile

Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul

listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.

În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire

dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-

20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre

membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul

periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide,

proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la

acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri

esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-

acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre

bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile,

vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae,

Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.

Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o

cantitate substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid-alcool (au

culoare roşie pe fond albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen); această coloraţie continuă să

reprezinte o etapă esenţială în diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele

mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor

nucleotidice sau amplificarea genetică). În afară de mycobacterii (în special M.

tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii „atipice” (non-tuberculous mycobacteria,

NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), există şi alte specii bacteriene care pot

19

Page 20: Micro Biologie

apărea colorate asemănător după utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul

difteric (C. diphteriae).

Rolurile peretelui bacterian:

- prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc);

- asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni

interioare care pot ajunge până la 20 atm.);

- flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât

prin flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului;

- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul

bacteriilor Gram-negative etc);

- prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;

- are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal;

- la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-

cicloserina);

- la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul

periplasmic şi la nivelul membranei externe).

Protoplastul (formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică) reprezintă

bacteria Gram-pozitivă după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acţiunea

lizozimului care lizează mureina. În medii hipotone protoplastul se lizează. Este o structură

care nu se poate multiplica.

Sferoplastul reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parţială a peretelui

(conţine o cantitate mai mică de mureină). Lizozimul poate acţiona asupra peptidoglicanului

numai după alterarea membranei externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone

sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica.

Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul,

spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă

un rol în creşterea şi multiplicarea bacteriană.

Formele L

În 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme

„L”, după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme

noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se

lizozim sau penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea

bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism,

anumite infecţii cronice (de exemplu infecţii ale aparatului urinar).

2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatică

Între perete şi citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm;

poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian.

Electronomicrografic apare formată din 2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar.

Este considerată un „mozaic fluid”, compusă dintr-un film fosfolipidic în care flotează

proteine globulare cu extremităţile polare hidrofile expuse spre spaţiul intracelular,

extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri

de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în

20

Page 21: Micro Biologie

dublu strat, au extremităţile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele feţe ale

membranei şi extremităţile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al

membranei. Nu conţine steroli (excepţie Mycoplasma spp).

Rolurile membranei citoplasmatice sunt de:

- filtru selectiv, datorită permeazelor (rol în permeabilitate şi transport);

- barieră osmotică;

- a conţine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi);

- a fi sediul majorităţii activităţilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu

intervine activ în procesele de biosinteză);

- excreţie a unor enzime hidrolitice;

- a interveni activ în procese de biosinteză;

- a contribui la formarea septului transversal (rol în diviziunea celulară);

- a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaţa sa.

Asupra membranei pot acţiona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele).

2. 3. 1. 3. Mezozomii

Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice

de care rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura

chimică a membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un

capăt se pot fixa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului

între cele două celule fiice. Au rol şi în formarea septului transversal.

      2. 3. 1. 4. Citoplasma

La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma

bacteriană, intens bazofilă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot

observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structură mai simplă faţă de

citoplasma eucariotelor. Este constituită dintr-un sistem coloidal format din proteine,

enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale şi apă. Conţine în mod

caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, săruri

etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt).

Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă

pot exista şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial).

La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate

mare, este clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular.

2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol

Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea

lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în

citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din

punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de

70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În

subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine

ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S).

Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm

21

Page 22: Micro Biologie

(mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii,

aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul

bacterian fiind foarte intens.

Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în

polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un

moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic

mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom.

Biosinteza proteică

Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.

Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa

de baze azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi

aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul

viitoarei proteine.

Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta

această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare.

Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine.

Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.

ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid

poartă numele de ARNm monocistronic.

La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară

pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm

policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor

procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi

multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial

3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură

moleculă de ARNm policistronic.

De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm.

Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de

terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.

Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a

moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei

20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime

specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi

pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon)

complementar codonului care corespunde aminoacidului.

ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii

ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de

aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.

2. 3. 1. 6. Incluziile

Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere

activă. Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile

22

Page 23: Micro Biologie

externe. Pot conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai

genului Corynebacterium, la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor

Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la

germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc.

2. 3. 1. 7. Vacuolele

Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o

membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice

şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.

2. 3. 1. 8. Nucleul

Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a

celulei. Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe

preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN.

Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu

catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el

însuşi, superspiralat. Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană

(şi respectiv numărul de perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea

de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E.

coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea

bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor,

pentru ca materialul genetic să poată fi conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie

compactat într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi

diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi

o cantitate variabilă de ARN.

Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari

(ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare.

Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa

cum am menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există

posibilitatea ca înainte ca prima replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în

acest caz celula bacteriană va putea fi meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale

sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai

multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum

se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai multor

cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică

diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta).

Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi

multiplicare.

Codonul

Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de

ADN formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită

secvenţă un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul

ribozomilor.

Cistronul

23

Page 24: Micro Biologie

Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine

independent sinteza unui lanţ polipeptidic.

Gena

Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de

nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei

genetice. Poartă înscrisă în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei

proteine specifice, structurale sau funcţionale (enzime).

2. 3. 2. Structuri facultativeStructurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii),

fimbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă).

2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere

Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care

formează în jurul celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.

La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula.

Există bacterii care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S.

pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică

(Bacillus anthracis etc).

La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în

mediu şi poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu

este vizibilă la microscopul optic.

Roluri:

- factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea;

- rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi;

- permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);

- barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;

- conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre

exemplu, în cazul S. pneumoniaeexistă peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E.

coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.

Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că

prin coloraţia cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un

halou necolorat. Există şi coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss.

Structura antigenică a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia

de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri polivalente sau monovalente

anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor.

2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare

Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în

preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU).

Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe

care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).

24

Page 25: Micro Biologie

Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal.

Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri

aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este

plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de

natură proteică (flagelina).

Roluri:

- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie,

asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia

opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din

ATP;

- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);

- în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi

- monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio

cholerae, Pseudomonas aeruginosa;

- lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);

- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de

exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.

2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii)

Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât

cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la

microscopul electronic.

Există pili comuni, cu următoarele roluri:

- în aderenţa bacteriană (adezine);

- conţin receptori specifici pentru bacteriofagi;

- antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae.

Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia

îndeplinesc rolul canalului de conjugare.

2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare

Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit

la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost

de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani.

Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este

înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale).

„Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.

Roluri:

- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate

transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi

considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de

reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);

- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.

Sporul poate fi localizat:

- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);

25

Page 26: Micro Biologie

- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);

- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).

Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia

Gram (locul sporului rămâne necolorat).

Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

2. 4. Povestiri adevărate2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tipA în

rândul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia

În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent

de îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60

de cazuri (23 confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre

care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri

administrate prin injecţie intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un

preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat

către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au

dezvoltatedem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie.

În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confirmate au existat

legături familiale sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost:

durere şi edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de

aceste semne, pacienţii au prezentat insuficienţă multi-organică. O caracteristică a

sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu

leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase

leucocite tinere, nesegmentate).

Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi

fragmente tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către

laboratoarele de referinţă din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru

prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele

de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis.

Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă

cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită

condiţiilor precare de obţinere, stocare şi transport ale acestora). Autorităţile au emis

ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla în circulaţie şi această

situaţie ar putea fi considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru populaţia

consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de

la pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen)

a fost Clostridium novyi.Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium

perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică

nu s-ar fi gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii

anaerobi să fie implicaţi, izbucnirea epidemică ar fi putut să rămână fără diagnostic

etiologic.

26

Page 27: Micro Biologie

Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată

testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a

demonstrat prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate.

Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde

prin realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi

bacteriile sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns

inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în

situaţiile cu evoluţie spre insuficienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială,

reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece

soluţia de heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în

cazul în care soluţia ar fi fost injectată intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către

mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).

În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe

ar fi fost emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri)

antibioterapia empirică cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării

probelor, procentul de infecţii cu etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare.

S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a

alerta comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri.

2. 4. 2. Capsula bacteriană

Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru

izbucniri epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile

meningococice rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea

mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei

este foarte importantă. Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare,

aderând la celulele umane şi invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în

mare parte, un mister.

Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat

de capsula polizaharidică, cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fluidele

extracelulare. Studii recente au arătat că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea

intracelulară.

Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia

subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a

dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement.

Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită”

structurile proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează

germenul de la liză celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte

eficient proprietăţile, atât extra- cât şi intracelular.

Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare

de celule fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi

multiplicării intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care

diminuează capacitatea de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în

celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil

27

Page 28: Micro Biologie

mecanism prin care se produce această supravieţuire ar fi cel al rezistenţei capsulare la

peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente

ale sistemului imun înnăscut.

Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate fi legată de o multitudine de

mecanisme, printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a

peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect,

cu oricare din aceste mecanisme. În particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei

pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către capsula sa, polizaharidică.

În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile

necapsulate sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B,

asemănătoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca

model al CAMPs datorită proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a

germenilor Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor

timp de 45 de minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confirmat că

absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe

culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un

mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei.

2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic

Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar

şi pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul

pentru respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul

preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea

rar); informaţiile obţinute pot fi însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu

diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni

rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic

pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a

materiilor fecale, de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu

albastru de metil, s-au văzut (datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu

capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii cu criptococ, care ulterior s-au identificat

după culturi şi repicări repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este că

schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi

îmbunătăţirea stării pacientului.

2. 5. Evaluarea cunoştinţelor1. Alegeţi afirmaţia falsă:

a. Bacilii au formă rotundă şi se adună în grămezi

b. Haemophilus influenzae este un cocobacil

c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot

examina la microscopul optic

d. Aspectul “in diplo” este caracteristic pneumococilor

28

Page 29: Micro Biologie

e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care

nu pot fi vizualizate la microscopul optic

2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevărată următoarea

afirmaţie:

a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conţine mureină

b. Membrana celulară este o structură facultativă

c. Nucleul bacterian este învelit de membrană nucleară şi conţine numeroşi nucleoli

d. Capsula bacteriană reprezintă un factor de virulenţă şi favorizează invazivitatea

e. Bacteriile cu flageli sunt imobile

3. Peretele bacterian:

a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile

b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei)

c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive

d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic

e. Conţine antigene capsulare

4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene:

a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului

b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fimbrii

c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană

d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene

e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel

5. Sporii bacterieni:

a. Nu se distrug prin autoclavare

b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative

c. Nu se vizualizează microscopic

d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central

e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene

3. Fiziologia bacteriană3. 1. Constituţia chimică a

bacteriilor3. 1. 1. Apa: procent, rol

Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu

de dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special

29

Page 30: Micro Biologie

apă legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice

care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică

numită tonoplast. Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol

în plutirea acestora.

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de

dispersie, este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii

oxidative etc.

Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp

îndelungat. O metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea).

Studiile ştiinţifice au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp

liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire

de peptidoglican. (1) 

3. 1. 2. Substanţele minerale

Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în

funcţie de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în

compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în

structura fosfolipidelor etc).

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:

·         favorizează schimburile cu mediul,

·         participă la reglarea presiunii osmotice,

·         pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului

difteric, care condiţionează şi producerea de toxine),

·         activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a

potenţialului de oxido-reducere.

Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+.

3. 1. 3. Glucidele

În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar

glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de

roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor

bacterii etc.

Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui

anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei

respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc).

Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).

3. 1. 4. Proteinele

Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine

complexe, cum ar fi:

·         mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul

hialuronic din structuri de tip capsular),

·         cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),

·         nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).

30

Page 31: Micro Biologie

Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul

diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare

biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).

3. 1. 5. Lipidele

Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în

funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un

semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai

mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice,

inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând

parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).

Dintre lipidele bacteriene putem aminti:

·         acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),

·         cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate

mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc).

Dintre acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip

IV).

·         fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema

pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului

bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxică.

3. 1. 6. Pigmenţii

Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de

condiţiile de cultivare.

Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul

tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus).

Trebuie să reţinem încă de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este

doar un caracter orientativ şi nu vom clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în

funcţie de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ

privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu

pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi.

După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:

·         cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);

·         paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de

exemplu la S. aureus sau laStaphylococcus epidermidis);

·         cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas

aeruginosa).

În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc.

în cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul

de laborator se poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context

clinic şi microbiologic.

31

Page 32: Micro Biologie

Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie

faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată

de P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic.

3. 1. 7. Enzimele

În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de

a elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi

genetici diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic

în funcţie de necesităţi.

După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în:

·         enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;

·         enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea

selectivă), de exemplu permeazele;

·         enzime intracelulare.

În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze,

liaze, izomeraze etc.

După modul de apariţie, enzimele pot fi:

·         constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului);

·         inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi

compuşi apăruţi în mediu).

Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate

taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu;

studierea acestuia poate avea o deosebită importanţă în identificarea bacteriilor.

3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică:

·         plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu

efect asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);

·         unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.

licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B.

polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi

capitolul nr. 48).

3. 1. 9. Vitaminele bacteriene

Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de

exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E.

coli, riboflavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B.

megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa

florei bacteriene intestinale umane.

3. 1. 10. Factorii de creştere

Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe

baza substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat

incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv,

numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare

pentru Haemophilus influenzae).

32

Page 33: Micro Biologie

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin

dependente de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât

nu pot fi cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

3. 2. Metabolismul bacterian3. 2. 1. Nutriţia bacteriană

Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea

de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt

substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în

reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.

În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:

·         bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi

·         bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate

enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).

În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:

·          bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie

anorganică şi

·          bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.

 

Nutriţia principalelor bacterii studiate

Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante

pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul

respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile

paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din

genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie).

Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma:

proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de

cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi

legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate

se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.

Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite

macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este

determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru

proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.

După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri

supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi

activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a

biosintezei).

Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de

căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui

singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi

reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice

33

Page 34: Micro Biologie

este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine

specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de

la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul

determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc

numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată

variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.

În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori

specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).

De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este

(poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde

de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de

faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de

legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule

reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare

conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie

allosterică) sau creşte (activare allosterică).

Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând

o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se

dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se

îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent

în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa

înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de

receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi

la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi

capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat

experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe

scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie

de sursă).

Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism

care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea

unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie

tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.

Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la

o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie

responsabilă de:

·         chemotaxie;

·         aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);

·         fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);

·         deplasarea spre acceptorul de electroni etc.

 

3. 2. 2. Respiraţia bacteriană

34

Page 35: Micro Biologie

Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de

energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea

ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor

pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce:

AH2 + B <=> A + BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă

sau anaerobă.

Respiraţia aerobă (oxibiotică)

În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia

aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la

un oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător

frecvent utilizat este NADPH-ul.

Enzimele catenei respiratorii sunt:

- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);

- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);

- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre

exemplu citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).

NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin

mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).

Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)

cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.

Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)

În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă

anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se

face la nivelul substratului.

Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia

zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere

taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai

mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP,

iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită

de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă deVibrion butyrique, numit ulterior Clostridium

butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de

obţinerea unor produşi finali.

Sinteza ATP-ului

Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de

fosforilare.

În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)

cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.

În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii

fiind metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).

Energetica respiraţiei bacteriene

Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.

Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.

35

Page 36: Micro Biologie

Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.

 

Tipul respirator

În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din

mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1):

- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă

numai în prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic.

Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface

H2O2 toxic pentru celula bacteriană; vezi Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de

respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii

lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;

- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium

botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2.

Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au

catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii

folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este

necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut.

- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc)

se dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta

ambele tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau

citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea

bacteriilor studiate.

- anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează

mici cantităţi de O2.

3. 3. Căi metaboliceMetabolismul glucidic

Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt

degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile

monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care

hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au

o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi.

Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:

a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol

de glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;

b). calea pentozo-monofosfaţilor;

c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).

Metabolismul lipidic

Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi

liberi. Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru

degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime

36

Page 37: Micro Biologie

specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana

hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză.

Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi

reprezintă surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de

ATP).

Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea

grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin).

Metabolismul proteic

În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite

polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu

capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de

exemplu D-Ala).

Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:

a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi

proprii de catabolism, utile în identificare);

b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Căi biosintetice particulare3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se

realizează utilizând inclusiv structuri chimice care în lumea vie sunt utilizate numai de către

bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic.

3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului

Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr.

3). Începe prin sinteza în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM).

Această structură se ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care

urmează un lanţ de reacţii biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o

reacţie de transpeptidare în care terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc

reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de

transpeptidaze, un set de enzime numite şi PBPs (penicillin binding proteins) care au

atât activitate de transpeptidaze şi carboxipeptidaze, dar controlează şi gradul de legare a

peptidoglicanului (aspect foarte important în diviziunea celulară). La nivelul lor se pot lega

penicilinele şi alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4).

Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza

acţiunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină,

cicloserină etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu

fluidele organismului. În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor

depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice

compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va

putea produce liza bacteriană (efect bactericid).

3. 4. 3. Sinteza LPZ

37

Page 38: Micro Biologie

Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de

subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt

transferate în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate

componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice.

3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare

Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei

extracelulare (poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide

transportoare de provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de

condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest

lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu.

3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă

Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de

rezervă (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o

bacterie la alta.

3. 5. Cultivarea bacteriilor3. 5. 1. Definiţii utile

Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un

anumit biotop.

Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă

(diviziune binară).

Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări

în cultură pură.

Temperatura de dezvoltare

În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;

- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi

apropiate de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la

temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi

nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se

corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se

topeşte sau se solidifică lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi

joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află

în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct

capacitatea de a funcţiona.

- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la

temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt

adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii

graşi din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor

să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.

38

Page 39: Micro Biologie

- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi

o temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.

Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.

3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană

Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea

volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se

ajunge la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte

raportul optim dintre volumul şi suprafaţa celulei.

Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu

reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).

3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor

Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la

pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior

să îi putem studia diferitele caractere în vederea identificării.

Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:

·         obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile

propuse,

·         prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi

·         izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în

culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”.

Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul

„însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu

de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales

animale de experienţă folosim termenul „inoculare”.

Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide

sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi

multiplicării bacteriene se numesc medii de cultură.

Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă

numele de cultură bacteriană.

Mediile de cultură

Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale.

Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot

fi cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale

de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule.

Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale.

Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere

necesari), să fie sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită

presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.

Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt

capabile să le sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi

mici. Îndeplinesc anumite roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot fi grupați în:

1.      Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN);

39

Page 40: Micro Biologie

2.      Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;

3.      Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime.

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot

sintetiza purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de

carbon.

Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte.

Aceşti compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură.

Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci  sunt asimilaţi de către bacterii pentru

a-și îndeplini rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de

creştere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numiteauxotrofe. Spre

exemplu, o tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-

triptofan şi va fi desemnată E. coli trp- (2).

Clasificarea mediilor de cultură artificiale

Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după

complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de

transport, de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de

cultură simple (agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe

(agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)

Medii speciale

Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite

bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura

nr. 5).

Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea

altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de

potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care

bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă) (Figura nr. 6)

Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând

dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca

mediu selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau

mediile de îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).

Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate

fi sau nu metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu,

agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-

pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte

exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate

indol uree). (Figurile nr. 7-10).

Colonia izolată

Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este

totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie

este o clonă bacteriană.

Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin

dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei

40

Page 41: Micro Biologie

porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se

resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă

neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se

resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge

prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după

trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.

(Schema nr. 1)

Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare

pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia

unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare

(asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30

minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz

cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară

incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate

reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în

condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate

(Figura nr. 11).

Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi

Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu,

care nu este reînnoit şi continueatunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O

populaţie bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă

se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi

evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit

chemostat sau turbidostat).

Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în

concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de

cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul

limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare

constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele

sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare

a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).

În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.

Timpul de generaţie

Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu

raţia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de

generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este

determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru

majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie

poate avea o valoare între 12-27 ore.

Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene

Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial.

Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie

41

Page 42: Micro Biologie

caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare

logaritmică; faza staţionară şi faza de declin (Figura nr. 13).

Faza de lag

Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la

condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie

incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu

se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această

fază este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului,

timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru

sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza

a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu. (2)

Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)

Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva

mai mari), citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt

foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau

pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială

durează aproximativ 2-3 ore.

Faza staţionară

Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor

care sunt distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de

creştere devine nulă.

Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea

germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor.

Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile.

Faza de declin

Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv,

se produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi

butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul

celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale

de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care

permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de

sporogeneză devine foarte intens.

Aspectul culturilor pe medii solide

Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea

bacteriilor. Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri

definitive de specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi

în contextul general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc

într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea

între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează:

·         dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici,

sub 1 mm),

·         conturul (circular, lobat, zimţat),

42

Page 43: Micro Biologie

·         relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),

·         suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),

·         culoarea (pigmentate, nepigmentate),

·         opacitatea (transparente, opace),

·         consistenţa,

·         aderenţa la mediu,

·         prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14)

Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect

strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie

salină fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată.

Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E.

coli etc). (Figura nr. 15)

Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate.

Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este

conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis,Corynebacterium

diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o

enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex.

aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai

târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar

identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă. (Figura nr. 16)

Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de

bacteriile care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17)

Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.

În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom

putea obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura

se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive.

Fenomenul de „invazie” poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri

biliare, tiosulfat de sodiu etc.

Aspectul culturilor pe medii lichide

Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l.

Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect

particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la

suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5.

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen

mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)

Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede,

formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul

difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)

Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea

culturilor bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul

microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 2.

43

Page 44: Micro Biologie

3. 6. Povestiri adevărate3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... născută dintr-o mică neglijenţă

Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a

descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja

cunoscut drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită

descoperirii lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de

neglijenţă în activitatea de laborator.

Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior,

contaminate cu un fung din genulPenicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de

dezinfectat. Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii

sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a

observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care

bacteriile nu s-au dezvoltat.

Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu

proprietăţi bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest

extras penicilină.

A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929.

Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui

extract, şi în anul 1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit

penicilină.

Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul

Howard Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.

3.6.2. O fostă rickettsie rescrie vechile clasificări

În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din

mediul intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre

exemplele stereotipe de bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artificiale.

Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă

minuţioasă de studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au

evoluat progresiv: într-o primă etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artificial, care

reproducea condiţiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în

care Coxiella spp. se multiplică în celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit

ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii şi-a putut desfăşura activitatea

metabolică timp de aproximativ 24 de ore.

Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria

este microaerofilă. Au adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidified Citrate

Cysteine Medium).

Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artificiale ar putea permite studierea

factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de

abordare pentru alţi germeni strict intracelulari. (3-4)

3. 7. Evaluarea cunoştinţelor44

Page 45: Micro Biologie

La următoarele întrebări alegeți un singur răspuns corect:

1. Care dintre următoarele bacterii este cromopară?

A. Staphylococcus aureus

B. Staphylococcus epidermidis

C. Pseudomonas aeruginosa

D. Escherichia coli

E. Bacillus anthracis

 

2. Unul dintre următoarele este un microorganism strict aerob:

A. Clostridium tetani

B. Clostridium botulinum

C. Bordetella pertussis

D. Escherichia coli

E. Staphylococcus aureus

 

3. Penicilina se leagă la nivelul:

A. hidrolazelor

B. oxidoreductazelor

C. izomerazelor

D. permeazelor

E. transpeptidazelor

 

4. Se cultivă numai pe gazde vii:

A. Staphylococcus aureus

B. Chlamydia trachomatis

C. Streptococcus pyogenes

D. Streptococcus pneumoniae

E. Haemophilus influenzae

 

5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorită prezenţei

unui substrat?

A. Mediu electiv

B. Mediu selectiv

C. Mediu diferenţial

D. Mediu Lőffler

E. Mediu de îmbogăţire

45

Page 46: Micro Biologie

4. Acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici asupra bacteriilor

4. 1. Definiţii de bazăSeptic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei

plăgi).

Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau

nepatogeni.

Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului

ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor,

mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc.

Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de

pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice,

netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO40,1%, detergenți

cationici etc).

Contaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea

radioactivă) care se referă, în general, la contactul cu microorganisme condiţionat

patogene sau patogene (capabile să producă infecţii sauboli infecțioase ).

Decontaminarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici / chimici pentru a îndepărta, a

inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau

46

Page 47: Micro Biologie

patogene de pe suprafeţe sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o

sursă de infecţie sau de transmitere a infecției, iar obiectele sau suprafeţele să poată fi

manipulate şi / sau utilizate în siguranţă.

Sanitizarea reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice.

Prezervarea presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse

farmaceutice, vaccinuri, alimente etc.

Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta

murdăria (materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte,

prin procedee mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru

utilizare în siguranţă sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.

Detergentul este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot fi anionici,

cationici, amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană.

Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă.

Echipamentul de protecţie este un echipament special (îmbrăcăminte, mănuşi, ochelari

etc) purtat de personalul care manipulează produse dezinfectante şi realizează dezinfecţia.

Enzima este o proteină care descompune murdăria într-o formă care poate fi uşor

îndepărtată de produsul de curăţare. Are rol de catalizator pentru reacţie, mărind puterea

de curăţare a produsului. De exemplu: amilaza acţionează asupra urmelor de amidon;

lipaza acţionează asupra urmelor de grăsimi şi uleiuri; proteaza acţionează asupra materiei

proteice.

Produsul de curăţare este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie

organică şi/sau anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, dar nu prezintă activitate

antimicrobiană (bactericidă, virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de

contaminare microbiană.

Spălarea mâinilor este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce flora

tranzitorie prin acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun (Figura nr. 1, Film nr. 1).

Factori care influenţează eficacitatea metodelor de control:

- mărimea populaţiei bacteriene;              

- timpul de expunere la agentul decontaminant (creşterea timpului de expunere creşte rata

distrugerii);

- efectul concentraţiei, a temperaturii și a pH-ului (o concentraţie mai mare creşte rata

distrugerii);

- stabilitatea agentului;

- structura microorganismului etc.

Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor)

din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor

agenţi fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative

asupra ţesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea bolilor infecţioase.

Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune

directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona

asupra florei rezidente.

47

Page 48: Micro Biologie

Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu

acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune

asupra florei rezidente.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge

bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari

necapsulate.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge

bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiţii bine

definite de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi

reprezintă un potenţial sterilizant chimic (Figura nr. 2).

Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru

sterilizarea dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un

sterilizant chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de

supravieţuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenţei unui singur

microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu

1/1.000.000).

Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant

este eficient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi eficacităţii

antimicrobiene.

Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul

dezinfectant este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat.

Perioada de timp în care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii.

Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor

patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un

mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie

să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie

sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:

- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);

- Metode de sterilizare prin filtrare;

- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi

- Metode chimice de sterilizare.

Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi

metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul

de microbiologie.

Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să

fie sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate,

necontaminate) urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor

contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale

etc. trebuie curăţateperfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste

materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de

laborator este colectată în recipiente speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele

48

Page 49: Micro Biologie

vor fi menţinute în amestec dezinfectant până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi

acele (deşi este necesară utilizarea pe scară largă a seringilor şi acelor de unică

întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute,

se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor spăla cu jet de apă pentru

îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3).

Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi

izolate (aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot fi

furnizate în seturi de instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se

face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de

unică utilizare (”disposable”) conferă un plus de siguranță, în pofida unui preţ relativ ridicat.

Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex.

termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus

stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu

ajutorul radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici

Cuprins:

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate

4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scazute

4. 2. 1. 3. Filtrarea

4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc)

4. 2. 1. 5. Ultrasunetele

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate asupra microorganismelor

În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

·         mezofile (temperatură optimă 30-37ºC),

·         psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi

·         termofile (temperatură optimă 50-60ºC).

Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se

produce după atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare,

mai ales a punţilor de hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare

49

Page 50: Micro Biologie

nativă. Ca urmare protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai

sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt

liofilizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul

său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură uscată și

umedă.

 

Sterilizarea prin căldură:

a). Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea

structurilor bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice:

a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi

menţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care

urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau

pentru spatulă (Figura nr. 5, Film nr. 2).

 

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge

temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient

de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă

sterilizare.

a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr.

6). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui

termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii

în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).

Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă

trebuie să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot

exista și alte variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan,

pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru

instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la

decălirea oţelului) etc.

Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc,

vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din

laborator.

a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există

anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În

cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare

respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea

aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de

spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind

stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră.

În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări

servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea

50

Page 51: Micro Biologie

fi supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi,

cadavrele animalelor de experienţă etc.

b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca

mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite

substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical

(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.

b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi

pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă

realizează

·       la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,

·       la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv

·       134ºC la 2 atmosfere.

Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu

un capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă

sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).

Există mai multe tipuri de autoclave:

- autoclave cu perete simplu

·         verticale

·         orizontale

- autoclave cu manta de aburi

·         verticale

·         orizontale.

În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu,

vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de

sterilizare de jos în sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de

un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul

superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi

unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele

există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când,

accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru

evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune,

autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când

presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus

într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de

căldură.

În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă

de metal perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar

faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea

apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:

·                      verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie

până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează

(recomandabil se va utiliza apă distilată);

51

Page 52: Micro Biologie

·                      aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate

corespunzător;

·                      închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care

este dotat autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;

·                      conectăm sursa de căldură;

·                      deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne

aer în cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind

mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va

atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;

·                      închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu

de vapori;

·                      presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul

manometrului; atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm

sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata

sterilizării (de ex. 30 minute) ;

·                      după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm

autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii

atmosferice;

·                      deschidem lent robinetul de vapori;

·                      deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;

·                      lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;

·                      atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate

materialele sterilizate.

b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură

umedă care evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin

la 56-100ºC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care

permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele

vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin

încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc

germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi

utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu

se va depăşi în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare

se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.

b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate

în anumite situaţii.

Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă

durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC),

o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-

90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.

Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de

sterilizare, iar mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30

minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii

52

Page 53: Micro Biologie

bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei

metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.

^inapoi sus

4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor

Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La

temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată.

Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea

germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa

4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o

durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de

identificare etc.

În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele

posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene.

a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin

formarea de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;

b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în

masă a apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;

c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia

(deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi

păstrată în fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

^inapoi sus

4. 2. 1. 3. Filtrarea

Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea

unui lichid printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul

respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare.

De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă,

azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din

ce în ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi

0,025 mm (Figura nr. 11). În vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un

recipient în care se introduce lichidul care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va

colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă

de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin membrana filtrantă.

Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea filtrării.

Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat

filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III),

filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).

Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de

cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la

temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.

^inapoi sus

 4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide

prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile

53

Page 54: Micro Biologie

în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre

aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi

atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete de siguranţă biologică şi dorim să

sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care există Mycobacterium

tuberculosis. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de

ex. şi în instituţiile sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13).

Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente,

seringi de unică întrebuinţare etc).

^inapoi sus

4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă

a conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se

mişcă energic şi se izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii

la 50-80ºC. Sporii rezistă acestor efecte.

^inapoi sus

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică

Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra

unor bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta

devine turgescentă şi peretele bacterian cedează.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici

Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte

substanţe chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic

selectiv.

Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,

alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.

Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.

Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.

O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior,

trebuie să existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de

laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin

spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge,

înainte de spălare se vor dezinfecta.

Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de

acţiune, după cum urmează:

a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele,

alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru

antiseptizarea tegumentelor).

b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):

hipermanganatul de potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de

hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi 54

Page 55: Micro Biologie

derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi

halogenaţi cu potență mai mare, cum ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -

C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea concentraţiei

corespunzătoare.

c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):

metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu

merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal

(exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], grupările alchil ale formaldehidei,

glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc.

d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări

limitate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se

măsoară activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic),

crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc],

detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de

exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de

exemplu propilenglicolul)].

e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru

de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.

Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi,

hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de

substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor

cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să

aibă concentraţia corespunzătoare, să fie aplicată pentru o durată de

timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică (de

ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în

funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).

În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim

să menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există

numeroase substanţe şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.

Hipocloriţii:

soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),

concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor

activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni,

fungilor (100 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);

efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special

proteine), maselor plastice, detergenţilor.

Derivaţii fenolici:

din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc

ca atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;

soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);

55

Page 56: Micro Biologie

concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri

(ex. HIV este inactivat de soluţia 0,5%);

efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.

Glutaraldehida:

cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;

are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor

este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;

datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul

substanţelor prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;

nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de

expunere; ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o

perioada mai mare de timp în containere menţinute închise.

Iodoforii:

sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni,

fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);

sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;

pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.

Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):

exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea

hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);

sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;

acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt

supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament

electronic etc.);

·         fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se

menţine o presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi

combinat cu această substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi

combinarea cu hidrocarburi fluorinate.

indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;

există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară

efecte carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea

întregului organism);

sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură,

umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la

jumătate timpul necesar pentru sterilizare).

4. 2. 3. Produsele biocide56

Page 57: Micro Biologie

Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active

şi preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în

care sunt furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă

şi să prevină acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism

dăunător, prin mijloace chimice sau biologice” (vezi directiva CE).

Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub

formă de pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect

biocid.

Produsele biocide includ:

produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a

echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora;

produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin

imersie;

produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante,

săpunurile antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare

antibacteriene / antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după

cum sunt denumite de producător);

produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală, ş.a.;

şerveţele umede dezinfectante,

detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau

inhibă multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme).

În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus

thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid.

4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici

4. 2. 4. 1. Interrelaţiile microbiene în cadrul nişelor ecologice proprii

În natură microorganismele nu se dezvoltă izolat. Relaţiile pot fi de comensualism,

simbioză sau antagonism, noţiuni care vor fi prezentate ulterior.

În cadrul relaţiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalităţii mai mari a speciilor

antagoniste sau elaborării de către specia antagonistă a unor substanţe nocive pentru

speciile concurente. Aceste substanţe pot avea (ex. antibioticele şi bacteriocinele) sau nu

(ex. acidifierea mediului) acţiune selectivă.

4. 2. 4. 2. Bacteriofagul

Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7

cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai

Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un

Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a

virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14):

57

Page 58: Micro Biologie

1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu

catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic);

fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150

gene;

2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie,

ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:

- cilindrul axial;

- teaca cozii;

- placa bazală (cu croşetele de fixare);

- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).

Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în

studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.

Relaţii bacteriofag-bacterie

Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:

- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);

- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).

Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.

Ciclul litic are mai multe etape şi anume:

1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul

bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este

iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia

fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.

2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele

bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian,

ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;

3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată

şi preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează

un număr însemnat de proteine virale.

4. Maturarea (ansamblarea) fagului

5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi

eliberarea bacteriofagului matur, virulent.

Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi

până la realizarea lizei celulei bacteriene.

Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene

·         în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva

zeci de minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;

·         pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei

zone de liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;

·         dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană,

iar tulpina respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor și această suspensie se

amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri;

58

Page 59: Micro Biologie

·         bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi

eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi

ciclul se reia;

·          o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în

timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem

observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii

nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii

virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii

temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic)

 

Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial.

După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic:

·         fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu

aceasta,

·         fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu

diviziunea bacteriei.

Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent

(profag, fag temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul

temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat

(K12).

Proprietăţile bacteriei lizogene:

1. este imună faţă de un fag omolog profagului;

2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:

·         transducţia;

·         conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii

lizogenizate, cum ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);

·         recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar

înrudiţi, eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care

însumează unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;

·         inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan,

profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).

Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor

specifici, fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi

omologi profagului găzduit.

Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se

reactivează).

Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie:

·         fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al

bacteriilor (în nişa ecologică respectivă);

·         fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al

bacteriilor, întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot

antrena porţiuni din ADN-ul bacterian;

59

Page 60: Micro Biologie

·         fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită

specificităţii relaţiei fag-bacterie);

·         anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN

recombinant (ex. fagii Charon Lambda);

·         fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi

oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;

·         s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi

antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una

dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru

identificarea lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei

epidemii.

4. 3. Povestiri adevărate4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană

În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe

continentul american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor.

Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire

la raportul risc / beneficii adus declorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi

istoria epidemiei de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată

sănătatea publică de către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod

negativ).

Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor

microorganisme ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de

tipul trihalometanului. În USA se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei

substanţe.

Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca

metoda clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit

multă vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă

clorinarea apei va fi stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au

ajuns să prezinte o situaţie foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3

milioane de cazuri de holeră soldate cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a

afirmat că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a

precipitat apariţia unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui

enorm număr de decese datorate infecţiei cu Vibrio cholerae.

A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe

următoarele idei generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care

să se adreseze tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce

îţi propui şi alege varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu

eşti sigur de calea pe care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează

cele mai mici probleme mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează

rezultatele şi asigură-te că iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o

60

Page 61: Micro Biologie

problemă şi e. consultă-te în permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile

pe care le-ai stabilit.

Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră.

În final, reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea

intermitent şi nu continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea

continuă) şi nu au fost influenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei

cancerului.

Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că

epidemia de holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind

reprezentaţi de: a. clorinarea intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau

amatoristic făcute la linia de aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor

ilegale de irigaţie la liniile de aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a

avut o presiune scăzută sau nu a existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi

multiplicarea bacteriană este favorizată; e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii

neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor canalizări construite corespunzător, care au permis

refularea apei din zonele poluate în reţeaua de apă potabilă etc.

Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre

aceştia a fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile.

            Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul

44. 8. 2.

4. 3. 2. Epidemia de holeră din Dhaka - bacteriofagii

Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini

de Vibrio cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice

şi de mediu obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în

Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea

limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în

sursele de apă contaminată, sau chiar şi în cazul unor persoane infectate.

Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul

relaţiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior

densitatea bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica

exponenţial şi densitatea bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire

epidemică (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu atât mai mare cu cât densitatea

bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea

epidemică este datorată multiplicării bacteriene, necorelat cu diminuarea densităţii fagice,

introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar putea reduce amploarea izbucnirii

epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia.

În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se

stabileşte între rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.

În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa

infecţiilor, b. densităţile tulpinilor deV. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la

streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4),

atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă.

61

Page 62: Micro Biologie

Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor

monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.

Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de

consumul de apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi

interacţionează independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice

au creat condiţiile unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a

vibrionilor în sursele de apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă,

s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea

rezervorului datorită igienei precare şi astfel epidemia s-a amplificat. După un timp

producţia de fagi a început să crească, datorită concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi

în persoanele infectate. Amplificarea densităţii fagice a dus la un declin al densităţii

bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane infectate, până la dispariţia

cazurilor.

Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi

posibilitatea ca fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi

să ajungă în rezervor (datorită lipsei de igienă). Această amplificare (numerică şi

funcţională) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea /

controlul epidemiilor de holeră.

5. Genetica bacteriană5. 1. Suportul eredităţii

Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.

Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic).

Molecula de ADN conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor

proteine şi se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea

funcţională a eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.

Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu

bacteria „mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură

(având la dispoziţie nutrienţii necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de

pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.

Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui

fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin

apariția spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea,

substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului.

Structura acidului dezoxiribonucleic

ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.

Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G)

sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic.

62

Page 63: Micro Biologie

Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al

moleculei adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în

baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită

compoziţie care diferă la diversele specii.

Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a

citozinei şi guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele

eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în

funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în

decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor în general şi a

omului în particular.

Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost

folosite drept fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina fiind

susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este

posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor

temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în locuri mai

protejate.

Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în

funcţie de specie, dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.

Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest

raport diferă la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium

perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7%

la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a

fost precizat de către diverși autori, compoziţia de baze azotate este un index

taxonomic. (1)

La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La

bacteria intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă

de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene

deja secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este

extrem de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din diametrul celular.

ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele

şi complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de

hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a

fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este

cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-

ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei genetice.

Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările

lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe

care au confirmat rezultatele obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc

Carthy demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă

materialul genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la

ribovirusuri).

63

Page 64: Micro Biologie

La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale,

datorită legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura

depăşeşte 65ºC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să

se desfacă şi rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică).

Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC.

Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar

prin acest proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie

de procentul de renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E.

coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop (ex.

C14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va fi fracţiunea din ADN

care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza

brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât

denaturarea.

Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în

tehnologia ADN-ului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii.

Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad

de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).

 

Genom. Genotip. Fenotip

Genomul reprezintă suma genelor unui organism.

Totalitatea informaţiei genetice a unui organism se numeşte genotip.

Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în

interacţiune cu mediul ambiant se numeşte fenotip.

Funcţiile ADN-ului ca material genetic sunt:

- conservarea informaţiei genetice;

- replicarea;

- transcrierea şi traducerea materialului genetic;

- protejarea materialului genetic propriu („self”);

- reglarea şi controlul activităţii celulare.

Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente

Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic

urmată de diviziune.

Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula

parentală şi identice între ele, pe bază de complementaritate (replicare

semiconservativă). După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene,

fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este

una dintre cele mai importante reacţii din lumea vie. Watson şi Crick au fost primii care au

propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.

În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei

replicări să se iniţieze încă o replicare. În acest caz celula bacteriană va putea

64

Page 65: Micro Biologie

fi merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât în

mod normal) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în

mod normal).

În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa

cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa

cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o

informaţie genetică diferită, pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt

identici cu acesta).

 

Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)

In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare

independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula

eucariotă este diploidă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie să

fie replicat.

Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin:

- o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării;

- gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;

- o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.

Exemple de repliconi:

- cromozomul şi plasmidele bacteriene;

- genomul bacteriofagilor.

Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O

genă structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării

(o proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în

momentul când se ajunge la dedublarea cromozomului.

Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care

fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot

replica dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul

cromozom în cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian.

Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică”

apariţia de nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de

eveniment nucleotidul este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este

realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).

5. 2. Hibridizarea acizilor nucleiciReacţia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorită complementarităţii

nucleotidelor (structura primară). Prin această tehnică se poate demonstra înrudirea sau

eventual identitatea a două microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a

secvenţelor nucleotidice.

Din punct de vedere tehnic, cultivăm o bacterie de referinţă (cunoscută) în aşa fel încât

să putem marca ADN-ul cromozomial (însă uneori aceste experienţe se fac prin marcarea

65

Page 66: Micro Biologie

ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate fi reprezentată de cultivarea în mediu

cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul

extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente monocatenare.

ADN-ul dublu catenar se reface, dacă fragmentele de ADN (ţintă) ale bacteriei testate au

secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sondă moleculară) de referinţă.

Cu cât gradul de complementaritate dintre sonda moleculară şi ţintă este mai mare, cu atât

structura hibridă formată va fi mai stabilă şi mai greu de disociat. Actualmente sondele

moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.

Utilitatea hibridizării acizilor nucleici

Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării

sondelor nucleotidice, care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme

sau numai unii determinanţi genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat

de specificitatea sondei utilizate. Se apreciază, că pentru a elimina riscul unei hibridizări

întâmplătoare, sonda nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea geneticăconceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis,

dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial.

Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus

la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de

polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR).

ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN,

întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca

„matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer”

(amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt

complementari pentru două secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului ţintă.

Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este

denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care

sunt furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de

ADN-polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor

rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare

dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de

ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii, dacă procesul se repetă de 10 ori şi

la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea

loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în

denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului

(la 65-75ºC), folosind ADN-polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o

bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus

aquaticus.

Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică

66

Page 67: Micro Biologie

PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale

fundamentale.

Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de

recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea

datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator

poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între

probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima

variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de

biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile

erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ)

la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a

rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat.

Principalele măsuri de precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru

separate pentru manipularea produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea

celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi

fără ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă

cu flux laminar de aer.

Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-

ul dublu catenar contaminant.

Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de:

includerea unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-

3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat

din RT-PCR (transcriere inversă).

Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase

PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.

În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt

detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în

situaţia unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu

citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme

decât sunt identificate antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în

identificarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic)

precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor

enterovirusuri.

Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare

prin amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile

identificării agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei

(Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei

(Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis),

gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei

(Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter

pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae),

septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei

67

Page 68: Micro Biologie

(Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative

bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt implicate

microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se

izolează relativ dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând

pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identificării fenotipice

clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de

altă parte,Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de cultură. Cu alte

cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară.

Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor

grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis

carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cuCoccidioides

immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei

moleculare în domeniul afecţiunilor produse de fungi.

În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de

diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine

parazitară (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum)

sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).

Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în

diagnosticul sau în identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod

suplimentar dorim să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei

moleculare (hibridizarea moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau

neradioactiv, amplificarea genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de

lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de

o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de

ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar

zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în care este necesar

să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte de care are loc o

revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând ADNc); Nested PCR (în care are

loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferiţi) etc. Pe de

altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca o completare esenţială a

unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR;

DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR,

single universal primer-PCR; spoligotyping etc).

5. 4. Organizarea genomului bacterian

Plasmidele

Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:

68

Page 69: Micro Biologie

1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi

2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:

- plasmidelor şi

- elementelor genetice transpozabile.

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic

independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul

bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt

transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa

200 kb. Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide

liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există şi

plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar

reprezintă de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate

de ex. la Staphylococcus aureus).

Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în

citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F,

bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă

(de exemplu plasmida R, Col, F etc).

Clasificarea plasmidelor

În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în:

1. plasmide care codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni:

- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae);

- plasmidele de rezistenţă la UV etc.

2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni:

- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică)

etc.

3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:

- hemolizine;

- factori de colonizare;

- enterotoxine sau alte exotoxine etc.

4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare:

- în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu

potenţial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi

dezvoltarea în aceste condiţii se numesc plasmide degradative;

5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine

respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;

6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.

Plasmidele R

Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul

sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite

din: 

- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;

- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).

69

Page 70: Micro Biologie

Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două

tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia).

Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia

mediată de bacteriofagi.

Plasmidele „Col”

Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice

de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).

Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare

genetică, transducţie fagică sau prin conjugare.

Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia

omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.

Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)

Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donoare de material

genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) şi

enzimele necesare transferului de ADN.

În funcţie de prezenţa plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de

modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru

categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’.

Bacteriile F -

Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se

comportă ca receptoare de material genetic.

Bacteriile F +

Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule

„masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.

Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)

Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în

cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvenţă

de conjugare şi recombinare. De obicei prezenţa factorului F integrat determină transferul

unui număr variabil de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F.

Bacteriile F’

Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate

recombinant) care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din

acesta, încorporând în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de

„mascul” şi se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’).

Elemente genetice transpozabile

O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă

îşi menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de

la o poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite

(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc la nivelul oricărui

replicon, la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone

specifice unde se va insera (zone „calde”).

70

Page 71: Micro Biologie

Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în

trei categorii:

- secvenţe de inserţie (IS);

- transpozoni (Tn);

- bacteriofagi.

Secvenţele de inserţie (IS)

Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în

afară de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor pot

apărea modificări în expresia unor gene sau modificări în rata incidenţei deleţiilor în

regiunile adiacente situsului lor de inserţie.

Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită

importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS6110 se întâlneşte în una sau mai

multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate fi pus în evidenţă prin reacţia

PCR pornind fie de la cultură, fie chiar şi de la produsul patologic, permiţând un diagnostic

mai rapid.

Transpozonii (Tn)

Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă

gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:

- rezistenţa la antibiotice;

- capacitatea de sinteză a unor enzime;

- producerea de enterotoxine;

- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K88 la E. coli);

- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.

Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de

determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a

fost identificat la o tulpină de E. coli. El codifică 3 elemente: tnpA- cu activitate de

transpozază, rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate

beta-lactamazică.

Bacteriofagii

Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că

a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură

lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la

„întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului

nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o

parte din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb)

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacteriană

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un

singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară

transferarea de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor 71

Page 72: Micro Biologie

(„acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie

fac parte din aceeaşi specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt

diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini

din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune

modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor

ei şi pot exista în principiu două variante:

- variabilitatea fenotipică şi

- variabilitatea genotipică;

Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ,

care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.

Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic

(cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenţilor.

Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:

- mutaţie;

- transfer genetic urmat de recombinare genetică.

Mutaţia

Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene,

ducând la modificări ale mesajului genetic.

Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:

- substituţii;

- inversii;

- inserţii;

- deleţii.

Mutaţia spontană

Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil

se numesc mutaţii spontane.

Mutaţia indusă

Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii

ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi

mutageni, se numesc mutaţii induse.

Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.

Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui

singur codon.

Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta

secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).

Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea

acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.

Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a

secvenţei bazelor nucleotidice persistă.

Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o

bacterie receptor sunt:

- transformarea;

72

Page 73: Micro Biologie

- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);

- conjugarea.

Transformarea

Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber

provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie

„competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.

Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare

la virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.

Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a

ciclului celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin

recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un

caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).

Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt

„natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară

tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.

Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:

- transducţie;

- conversie lizogenică.

Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau

extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un

fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte

transductant.

Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au

proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în

imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.

Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele

cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod

accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate

transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare

număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.

Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc

un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C.

diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea

toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A

este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifică un anumit produs

din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică

leucina).

Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic

(cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare

directe. Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.

Receptorii specifici

73

Page 74: Micro Biologie

Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de

suprafaţă atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite

„recunoaşterea reciprocă”.

Fiziologia conjugării bacteriene

După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi

de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul

de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul

transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la

apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevărată„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv”

Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o

cunoaştere aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate fi utilă atât în obţinerea unor

diagnostice de mare precizie, cât şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în

medicina legală.

Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în 2001 în urma atentatelor teroriste

din SUA, când o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit plicuri având un

praf alb sau maroniu, care în unele cazuri (au existat şi „alarme false”) s-a dovedit a

conţine spori de Bacillus anthracis. Câteva elemente concrete cu privire la situaţia din acea

perioadă vor fi prezentate în capitolul dedicat genului Bacillus.

După cartografierea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat ca fiind posibile circa

3.500 de mutaţii nucleotidice unice. În funcţie de acestea se ştie actualmente, că tulpinile

cunoscute pot fi împărţite în 8 grupe, fiecare grup fiind la rândul său divizat în mai multe

subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibilă variaţie

genetică (nu există „cross-link”-uri între grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis să

reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în scopul punerii

la punct a unor teste, care să identifice cu mare fineţe o anumită tulpină, inclusiv „originea”

acesteia.

Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B.

anthracis folosită în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a

putut să fie stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel

cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02).

Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii

genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de

laborator se poate stabili originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice.

6. Antibiotice şi Chimioterapice74

Page 75: Micro Biologie

6. 1. DefiniţieAntibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe

medicamentoase capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor

microorganisme implicate etiologic în bolile infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra

celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra celulelor organismului

gazdă. Aceste substanţe pot fi:

- antibacteriene,

- antivirale,

- antifungice,

- antiparazitare.

În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex.

dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:

·         inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),

·         imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),

·         hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),

·         insecticide,

·         ierbicide etc (1).

6. 2. Date cu privire la descoperirea antibioticelor (Figura nr. 1)

Antibioticele au revoluţionat lumea în multe aspecte. Nenumărate vieţi au fost salvate.

Din nefericire însă, există şi aspecte mai puţin plăcute legate în special de apariția și

dezvoltarea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice precum și de înregistrarea diferitelor

reacții adverse. O bază de date recent întocmită arată prezenţa a mai mult de 20.000 de

gene potenţial rezistente (2).

Încă din 1820 chinina a fost folosită drept chimioterapic în tratamentul malariei,

antimalaricele de sinteză fiind introduse în practică o sută de ani mai târziu, în 1926. În

acelaşi an (1926) Fleming testează penicilina pentru efectul ei antimicrobian „in vitro”,

pentru ca în 1946 să se demonstreze în practică utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul

penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie stafilococică). În 1935 sunt descoperite

primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistenţa la aceste molecule a fost

raportată spre sfârşitul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în

anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). În 1949 se pune în evidenţă în

structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanţele

antibiotice cu o astfel de particularitate structurală au primit numele de betalactamine. În

1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat începând cu 1977 de obţinerea

75

Page 76: Micro Biologie

inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se

folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducând cu sine

utilizarea în clinică a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg.

Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape

exclusiv în perioada 1946-1950 (numită din acest motiv „era sulfamidelor”). Anul 1948

impune în tratamentul antiinfecţios clasa tetraciclinelor, începînd cu clortetraciclina şi

continuând cu oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina.

Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obţinut în

1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scară largă în clinică începând cu anul 1969.

În 1979 este pus în evidenţă nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariţia

unei noi clase de substanţe antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanţii acestei clase se

numără tienamicina, imipenemul, care este asociat în terapie cu cilastatina. Ulterior s-au

realizat structuri chimice rezistente la acţiunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv

biapenemul şi meropenemul.

În perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina,

ofloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu

activitate pe germenii Gram-negativi (ex. aztreonam).

La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de

antibiotice şi chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin

raţională a acestor medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o

listă a medicamentelor esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar

medicamente betalactamice (penicilină, amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc),

medicamente antituberculoase şi antileproase (clofazimină, dapsonă, ethambutol,

izoniazidă, pirazinamidă, rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase (cloramfenicol,

co-trimoxazol, doxiciclină, eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină,

sulfadiazină etc), medicamente „complementare” (ciprofloxacină, clindamicină, acid

nalidixic etc) dar nu apar pe lista principală nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce

demonstrează cel puţin indirect recomandarea de reducere a utilizării în exces a

medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o legătură directă cu subiectul

prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui document relativ recent

(„How to improve the use of medicines by consumers”, OMS, 2007), adresat atât

specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv

antibiotice şi chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că

editarea acelui manual a fost făcută cu asistenţă financiară de la Comunitatea Europeană.

6. 3. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor

Clasificarea se poate face după:

a) originea lor;

b). efectul bacteriostatic sau bactericid;

c). mecanismul de acţiune;76

Page 77: Micro Biologie

d). spectrul de acţiune şi

e). structura chimică (Tabelul nr. 1).

6. 3. 1. În funcţie de originea lor, agenţii antimicrobieni pot fi clasificaţi în următoarele

categorii:

a). Substanţe cu origine biologică elaborate de anumite microorganisme (antibioticele),

de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologică, dar nu

pot fi utilizate în tratamentul infecţiilor umane;

b). Produşi de semisinteză realizaţi pornind de la un nucleu elaborat de un

microorganism, nucleu care suferă apoi prelucrări chimice (de exemplu meticilina);

c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu

acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele).

Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt

produse prin metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este

mai rar întâlnită în limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente

fiind numite „antibiotice” (totuşi trebuie să cunoaştem că există această diferenţă).

6. 3. 2. în funcţie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice şi

bactericide.

Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării

bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele

etc).

Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex.

penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina,

streptograminele etc).

Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic

bacteriostatic, precum şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui

antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).

6. 3. 3. Clasificarea după mecanismul de acţiune

a). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au

efect bactericid şi sunt reprezentaţi de antibioticele beta-lactamice (peniciline,

cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina,

cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc;

b). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membranei celulare; au

efect bactericid şi sunt reprezentaţi de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină,

tirocidină, imidazoli, nistatină, amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente

antifungice);

c). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul

ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele,

lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc;

77

Page 78: Micro Biologie

d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de

exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina

etc.

Antibioticele beta-lactaminice inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la

bacteriile Gram-pozitive faţă de cele Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în

ceea ce priveşte structura peretelui). Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară

legarea de receptori celulari numiţi PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele

inhibă de exemplu reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice) între lanţurile

adiacente de peptidoglican. Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când

microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-

lactamic. Alte mecanisme de rezistenţă sunt reprezentate de: alterarea porinelor din

membrana externă (Gram-negativi) ceea ce afectează transportul beta-lactaminelor către

sediul de acţiune, mutaţii care afectează structura PBSs şi respectiv afinitatea faţă de beta-

lactamine etc.

Polimixinele (polimixina B, colistinul) acţionează selectiv pe membrana germenilor

Gram-negativi, printr-un mecanism asemănător cu cel al detergenţilor cationici deteriorând

membrana. Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a

microbilor Gram-negativi. Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale

generală. Rezistenţa la polimixine apare rar.

Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina

etc) se ataşează iniţial de o proteină receptoare specifică aflată pe subunitatea 30S a

ribozomului bacterian şi blochează ulterior activitatea normală a complexului de iniţiere

necesar formării de peptide. În final determină dezintegrarea poliribozomilor şi separarea

lor în ribozomi, incapabili de sinteză proteică. Rezistenţa la aminoglicozide apare în special

dacă există o modificare a procesului de transport activ în interiorul celulei bacteriene. La

streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu există un astfel de sistem de transport şi

în aceste condiţii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. În cazul bacteriilor

sensibile, rezistenţa poate apărea de ex. prin producerea de enzime care adenilează sau

fosforilează grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile

reacții adverse putem aminti nefrotoxicitatea și ototoxicitatea.

Ciclinele (ex. tetraciclina) se leagă de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni şi nu

permit introducerea de noi aminoacizi într-un lanţ polipeptidic în curs de formare.

Rezistenţa este de regulă mediată plasmidic, dar şi prin intermediul transposonilor, ducând

de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediază un aflux excesiv de tetraciclină şi

astfel nu se mai pot atinge concentraţiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb în stomac şi

intestin. Sunt bacteriostatice. Acţionează pe germeni gram pozitivi și gram negativi,

spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reacţiile adverse amintim senzațiile

de greaţă, voma, diareea, toxicitatea renală şi hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar.

Cloramfenicolul se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni şi inhibă peptidil-

transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de formare.

Rezistenţa poate apărea de ex. prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a

unei nitrat-reductaze. Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi  gram pozitivi și gram

78

Page 79: Micro Biologie

negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă,

salmoneloze sistemice, infecţii severe cu anaerobi. Printre reacţiile adverse cele mai grave

la care poate să ducă enumerăm anemia aplastică cu leucopenie şi agranulocitoză.

Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) şi lincosamidele (lincomicina și

clindamicina) se leagă de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interferând cu formarea

complexului de iniţiere pentru sinteza lanţurilor proteice. Rezistenţa poate apărea datorită

unei alterări a proteinelor ribozomale sau datorită sintezei unei enzime care metilează

reziduuri de adenină la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acționează pe cocii

gram pozitivi și gram negativi, bacili gram pozitivi și unii bacili gram negativi. Pot acționa

pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma și Chlamydia. Sunt

indicate în infecţiile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în

difterie, tuse convulsivă, pneumonii atipice etc. Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă,

vomă, diaree, febră, rash, reacţii anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe

germeni gram pozitivi aerobi şi anaerobi şi pe germeni gram negativi anaerobi.

Rifampicina inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-

dependentă. Acţionează pe mycobacterii, coci gram pozitivi și gram negativi, unii bacili

gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Dintre indicații putem

menționa tratamentul tuberculozei, leprei, infecţiilor stafilococice meticilino-rezistente

sensibile (testarea sensibilității tulpinilor respective este necesară).

Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhibă

sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acţionează pe unii bacili gram

negativi și gram pozitivi, coci gram negativi și gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre

posibilelel reacții adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii.

Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic

(PABA) şi inhibă dihidro-pteroat-sintetaza. Se formează analogi nefuncţionali ai acidului

folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistenţa apare prin alterarea

dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a sulfonamidelor şi este mediată

plasmidic. Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de

celelalte substanţe cu structură similară.

Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhibă reductaza acestui acid.

Sulfamidele şi trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creşterea

bacteriană. Dacă sunt însă utilizate împreună, vor produce o blocare dublă în secvenţa

sintezei de ADN, rezultând o creştere marcată a activităţii lor (sinergism). O astfel de

substanţă, frecvent folosită în practica medicală, este cotrimoxazolul (ex. biseptol),

conţinând sulfametoxazol şi trimetoprim.

Pirimetamina, la fel ca şi trimetoprimul, inhibă dihidro-folat-reductaza.

Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficienţi ai sintezei de ADN;

dar realizează această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei

animale, nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate în terapia antibacteriană.

6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor după spectrul de acţiune

Prin spectrul de acţiune antimicrobiană se înţelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii

asupra cărora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. În practică, trebuie

79

Page 80: Micro Biologie

cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniţial al fiecărui preparat antimicrobian, ci şi

modificările ulterioare, survenite în urma apariţiei germenilor rezistenţi.

Spectrul antimicrobian iniţial este stabilit pentru fiecare antibiotic în parte, o dată cu

introducerea sa în terapeutică.

Antibiotice cu spectru „îngust”

Aceste antibiotice pot fi subîmpărţite în două subgrupuri:

- antibiotice cu spectru „de tip penicilinic”, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-

pozitivi şi coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor,

macrolidele, lincosamidele etc;

- antibiotice cu spectru „de tip streptomicină”, active pe bacili Gram-negativi, coci

Gram-negativi, coci Gram-pozitivi. În acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele

etc.

Antibiotice cu spectru „larg”

Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi şi negativi, coci Gram-

pozitivi şi negativi. Sunt active şi pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii,

mycoplasme. În acest grup au fost incluse cloramfenicolul şi tetraciclinele.

La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot adăuga alte antibiotice, cum ar

fi: penicilinele cu spectru lărgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele,

tienamicinele, cefalosporinele din generaţiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide

etc.

6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor antibacteriene după structura

chimică

1. Antibioticele betalactaminice

a). Penicilinele

- penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);

-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina,

dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina);

- aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina);

- alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul,

ciclacilina, epicilina);

- peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii

(temocilina; în această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi

piperacilina);

- peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina,

azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina);

- alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic +

amoxicilină / ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);

b). Cefalosporinele

- din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);

- din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);

- din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);

- din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).

80

Page 81: Micro Biologie

Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în:

-          cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);

-          cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola

etc);

-          cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor

(cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc);

-          cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima,

cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc).

c). Alte antibiotice beta-lactaminice

- monobactamii (de exemplu aztreonamul);

- penemii (de exemplu ritipenemul);

-carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina;

cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei);

- oxacefemii (ex. latamoxef);

- carbacefemii (ex. loracarbef).

d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).

2. Glicopeptidele (teicoplanina şi vancomicina);

Vancomicina este utilizată în tratamentul infecţiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se

administrează intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre

reacţiile adverse amintim reacţiile anafilactice, febră, eozinofilie, neutropenie, pierderea

auzului.

3. Aminoglicozidele

- streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);

- kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;

4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);

5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);

6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7.

Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul);

8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus

- cloramfenicolul;

- lincosamidele (lincomicina şi clindamicina);

- acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);

- streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);

- oxazolidinonele (linezolid);

- mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca

răspuns la apariţia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc.

Chimioterapicele

1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);

2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)

3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);

4. Ethambutolul;

5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);

81

Page 82: Micro Biologie

6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina,

levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc);

7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);

8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

6. 4. LantibioticeleDenumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, fiind vorba de un grup

special de substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost

clasificate între antibiotice şi bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-

pozitive (ex. din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă

un spectru de activitate specific faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de

vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice.

Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi

3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A

şi B.

Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex.

nisina, subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5.

Lantibioticele îşi au originea în proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice)

sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere

biologic. În privinţa mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate

bactericidă depolarizând membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi

inducând autoliza acesteia. Datorită faptului că există o specificitate a lantibioticelor faţă de

anumite bacterii se consideră că există şi alte mecanisme implicate.

Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau

plasmidic. De ex. în cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene

(15) de Lactococcus lactis, iar informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este

localizată pe plasmidul pTu 32.

Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală

Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina

inhibă tulpinile din genurileStreptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la

o concentraţie ≥ 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă

sporularea bacteriilor din genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor

Gram-negative sau asupra fungilor. Nisina este folosită pe scară largă în industria

alimentară drept „conservant natural” pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi

procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă dezavantajele

nitraţilor şi nitriţilor (produc nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală este

utilizată în unguente cosmetice. Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară

(în tratamentul local al infecţiilor bacteriene).

Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de

germeni care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium

acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina

82

Page 83: Micro Biologie

(sintetizată de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru

derivatele de vitamina A şi eritromicină, de ex. în cazurile de acnee juvenilă, eczemă,

foliculite etc.

Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are acţiune

antivirală faţă de virusul Herpes simplex.

6. 5. Rezistenţa microbiană la antibiotice

Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate fi compromisă de dezvoltarea

rezistenţei. Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul

infecțiilor bacteriene cât şi pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru

medicamentele utilizate în tratamentul unor boli cronice.

Trei condiţii trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă:

antibioticul trebuie să poată să ajungă la ţintă într-o concentraţie suficientă;

antibioticul nu trebuie să fie inactivat înainte să se lege de ţintă;

trebuie să existe în celula bacteriană o ţintă vitală susceptibilă la acţiunea

antibioticului.

Cititorul este rugat să consulte și http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx.

Rezistenţa microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a

supravieţui şi de a se multiplica în prezenţa antibioticului.

Fenomenul de rezistenţă la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea

acestora (ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus

aureus rezistent la penicilină sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în

practica medicală.

Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase

afectează multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune

al beta-lactaminelor) au fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă

de acţiunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-

lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).

Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită.

6. 5. 1. Rezistenţa naturală (intrinsecă) reprezintă rezistenţa tuturor membrilor unei

specii bacteriene faţă de un antibiotic şi este determinată genetic, de exemplu rezistenţa

bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G.

6. 5. 2. Rezistenţa dobândită este acea rezistenţă necaracteristică unei specii

bacteriene, dar achiziţionată de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date;

de exemplu, antibioticul acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în care

majoritatea populaţiei bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există tulpini

care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse în

timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situaţie nu poate fi detectată decât

83

Page 84: Micro Biologie

utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi chimioterapice, de ex.

antibiograma difuzimetrică standardizată).

Rezistenţa dobândită poate fi cromozomială sau extracromozomială.

Mecanisme biochimice implicate în rezistenţa la antibiotice

- producerea de către bacterie a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu

penicilinaza stafilococului auriu (codificată plasmidic) care inactivează nucleul beta-

lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-

negative (ex. de enterobacterii);

- scăderea permeabilităţii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de

exemplu formele L);

- elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează

sau anulează acţiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei

respective;

- alterarea ţintei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale);

- amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se astfel prin „diluare”

acţiunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2)

6. 5. 2. 1. Rezistenţa cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii

spontane, la întâmplare, la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea faţă de un

anumit produs antimicrobian (deleţie, substituţie sau adiţie de bază). Prezenţa substanţei

active antimicrobiene serveşte ca un mecanism selector, suprimând organismele sensibile

şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite din organismele mutante, rezistente la

antibiotic. Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10-12-10-7. Mutaţiile

cromozomiale sunt definitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de

antibiotice şi se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă.

Pot fi clasificate în:

·         mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură mutaţie duce

la creşterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la eşuarea tratamentului atunci când

acesta este instituit cu un singur antibiotic.

·         mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale care duc la

creşterea gradată a CMI.

6. 5. 2. 2. Rezistenţa extracromozomială este mult mai frecventă decât cea

cromozomială, reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea

materialului genetic pentru rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii

populaţiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic

sau transpozoni.

Transferul materialului genetic se poate realiza prin:

- transducţie;

- transformare;

- conjugare;

- transpoziţie.

Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian

încorporat în capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru

84

Page 85: Micro Biologie

rezistenţa la un antibiotic (factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate

deveni rezistentă la antibioticul respectiv şi este capabilă să transmită descendenţilor

această rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul respectiv.

Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică

încorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l

conţin) într-o altă bacterie.

Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat

prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în

răspândirea rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan

pentru germenul receptor rezistenţa faţă de mai multe antibiotice.

Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente

transpozabile) în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă

şi o porţiune a cromozomului bacterian.

6. 5. 3. Tipuri de rezistenţă

6. 5. 3. 1. Rezistenţa faţă de un agent antimicrobian poate fi:

- monovalentă (monorezistenţa), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic;

- plurivalentă (rezistenţa multiplă, la mai multe antibiotice);

6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta:

- direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);

- încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură

şi/sau mecanism de acţiune asemănător); de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o

tetraciclină conferă rezistenţă la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce

stafilococii rezistenţi la meticilină (MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-

lactamice;

6. 5. 3. 3. După ritmul de instalare, rezistenţa poate fi:

- cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”;

- de ritm intermediar, „tip eritromicină”;

- cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”;

- cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”.

6. 5. 4. Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial

Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de

rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea

tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în

spitale, alte unităţi sanitare sau în ambulator (inclusiv prin fenomenul numit

„automedicaţie”), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi, apariţia şi

transmiterea germenilor de spital, devalorizarea şi pierderea unor medicamente

antibacteriene etc. O problemă deosebită este şi utilizarea medicamentelor antibiotice şi

chimioterapice în domeniul veterinar. Se estimează că anual se consumă circa 100.000

tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună parte în ferme de animale, piscicole etc (Levy

2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de „poluare” a mediului cu

substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”.

85

Page 86: Micro Biologie

Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui

să avem în vedere: utilizarea acestora în beneficiul pacientului; evaluarea clinică riguroasă

însoţită de teste de laborator sugestive sau care să confirme infecţia şi respectiv

sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt

timp posibil în cazul pacienţilor cu infecţii severe, ameninţătoare de viaţă; tratamentul

trebuie să fie „ţintit”, să fie îndreptat strict către bacteria care a produs respectiva infecţie,

să se utilizeze calea de administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare, intervalul

între doze, durata optimă a tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele

care vor permite ca acesta să fie compliant şi să respecte indicaţiile medicale.

Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi

chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică,

publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate

acestea, datele menţionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naţional. În România,

profesioniştii din sistemul sanitar se bazează fie pe experienţa proprie, fie pe datele

statistice din literatura internaţională.

Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii

rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii,

Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile,

Enterobacterspp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M.

tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus

aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de „superbug” se refer la microbi care

duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată datorită mutaţiilor multiple și respectiv

rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate

iar spitalizarea este de durată mare şi poate duce la costuri deosebit de mari. (3)

NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou

descoperită. Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și

inactivează carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această

cauză poate fi ușor transmisă. A fost prima dată identificată în India; a fost ulterior

recunoscută în Pakistan, Bangladesh,  UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7).

6. 5. 5. Date privind  controlul extinderii rezistenţei la antibiotice

Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au

realizat și aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de

curând de către ECDC, pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre

exemplu:

·         controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu

pentru un guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene)

·         achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției

medicale

·         controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe

dintre moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub

alte denumiri comerciale şi în tratamentul animalelor)

·         prevenirea bolilor infecţioase etc.

86

Page 87: Micro Biologie

Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru

animale a devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union

Ministers of Health” a adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor

în medicina umană. Prima recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să

întărească un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea

rezistenţei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobiană

(European Antimicrobial Surveillance System – EARSS) oferă date legate de prevalenţa şi

răspândirea majorităţii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe

antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afirmă că „datele pe care EARSS le-a adunat

de-a lungul anilor aduc un mesaj neplăcut dar important: rezistenţa la antibiotice devine o

problemă tot mai mare de sănătatea publica an după an şi doar un efort cumulat poate

schimba această situaţie”. (8)

Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale

tractului respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la

antibiotice și chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt

duşi la creşă sau la altă formă de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva

iniţiative, s-a făcut mult prea puţin în ceea ce priveşte această grupă de vârstă. Ar fi totuși

de menționat înfiinţarea Reţelei de Prescriere şi Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE

(The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network – ARPEC) care are

următoarele scopuri:

·         să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere

pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din

UE

·         să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care

apar între diferite comunităţi şi spitale

·         să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice

administrate zilnic copiilor

·         să colecteze date

·         să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu

Societatea Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric

Infectious Diseases – ESPID)

·         să trimită rezultatele obținute în cadrul fiecărui proiect către toate ţările membre.

(9)

CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice

care cuprinde patru mari puncte:

·         Supraveghere,

·         Prevenire şi Control,

·         Cercetare şi

·         Producţie. (10)

87

Page 88: Micro Biologie

6. 6. Noţiuni legate de alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase

Instituirea şi continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durată optimă (nici prea scurtă

şi nici prea lungă, existând recomandări specifice în funcţie de agentul etiologic şi respectiv

în funcţie de patologie) trebuie să urmeze întotdeauna parcurgerea unor etape minimale

care să justifice această opţiune terapeutică. În acest mod s-ar putea evita principalele

erori în utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente în momentul actual, inclusiv la

nivel mondial, erori care favorizează în principal abuzul de antibiotice / chimioterapice şi

permit selectarea de microorganisme rezistente.

6. 6. 1. Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice

Etapa în care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei

Această etapă se bazează pe o serie de date concrete (însă uneori pornim doar de la

ipoteze) într-un anumit contextclinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator. Este strict

necesar să reţinem că întotdeauna există un context şi că nici una dintre informaţii luată

singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu există o prioritate pentru clinică sau o

prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate şi integrate în contextul general.

Pentru a susţine decizia încercăm să răspundem cât mai precis posibil la cel puţin două

întrebări, respectiv:

1. Este în discuţie o infecţie certă sau cel puțin foarte probabilă?

Argumentele principale în favoarea unei infecţii pot fi: creşterea temperaturii, prezenţa

frisoanelor, identificarea unor supuraţii sau inflamaţii locale, modificarea evidentă a stării

generale, icterul (colorarea în galben a tegumentelor şi mucoaselor), prezenţa unor erupţii

la nivel tegumentar sau pe mucoase, modificări ale tranzitului intestinal însoţite de

eliminarea de scaune mai numeroase sau de consistenţă scăzută (diaree), tusea,

condensările pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologică, sindromul

meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza

(atât ca număr cât şi ca procent în analiza formulei leucocitare), testele nespecifice de

inflamaţie (număr de leucocite, VSH, proteină C reactivă, fibrinogen etc.), identificarea

prezenţei bacteriilor la nivel tisular sau în umori în mod normal sterile prin examene simple

în cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc.

Sindromul de răspuns inflamator sistemic (SIRS) sugerează de cele mai multe ori o

infecţie, dar el poate fi produs şi de cauze neinfecţioase (imunologice, cancer,

politraumatisme, alte agresiuni fizice etc.). În acest sindrom este evaluată prezenţa a cel

puţin două din următoarele condiţii: temperatură centrală peste 38°C sau mai mică de

36°C, frecvenţă cardiacă peste 90 de bătăi pe minut, frecvenţă respiratorie peste 20 de

respiraţii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numărul leucocitelor periferice peste 12.000

pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (în bandă).

88

Page 89: Micro Biologie

Noţiunea de sepsis include prezenţa infecţiei alături de sindromul de răspuns inflamator

sistemic. În prezent, este recomandată o nouă terminologie care să înlocuiască vechile

denumiri de septicemie, stare septică, septicopiemie etc. Sepsisulreprezintă SIRS

determinat de infecţie. Sepsisul sever se defineşte ca un sepsis asociat cu disfuncţie

organică, hipoperfuzie sau hipotensiune. Şocul septic este sepsisul însoţit de hipotensiune

(indiferent de aportul normal de lichide) şi de anomalii de perfuzie (cel puţin acidoză

lactică, oligurie sau alterarea acută a stării mentale). Hipotensiunea este definită ca

tensiune arterială (maximă) sub 90 mmHg sau reducerea tensiunii arteriale maxime cu

peste 40% faţă de nivelul obişnuit. Prezenţa sau suspiciunea sepsisului, şocului septic sau a

sindromului de disfuncţie multiorganică, chiar şi atunci când nu sunt clar demonstrate,

constituie un argument hotărîtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice

datorită gravităţii deosebite a acestor entităţi clinice. Totuşi, chiar şi în această situaţie nu

există nici un argument logic de a institui antibioticoterapia înainte de a recolta produse

pentru a fi examinate în cadrul diagnosticului bacteriologic direct.

2. Care este terenul pe care s-a instalat infecţia?

Evaluarea terenului, a situaţiei gazdei care urmează a fi tratată, are un rol important în

stabilirea oportunităţii antibioticoterapiei. Infecţiile uşoare, apărute la persoane tinere

anterior sănătoase, de obicei nu necesită tratament cu antibiotice sau chimioterapice.

Aceleaşi infecţii apărute la pacienţii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesară

(şi este indicat să utilizăm medicamente bactericide). Existenţa unor factori favorizanţi

măreşte prezumţia de infecţie şi necesită instituirea terapiei cu antibiotice, chiar în

contextul unor semne fizice (exemplu febră) aparent minore. Aceşti factori sunt de obicei

reprezentaţi de imunodepresia la nivelul întregului organism (la pacienţi cu diabet, ciroză,

cancer, SIDA, politraumatisme, operaţii extinse etc.) sau de imunodepresie locală (datorită

prezenţei unor catetere, sonde, şunturi, proteze implantate etc.). La bolnavii

imunodeprimaţi se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; în această situaţie este

de obicei acceptată asocierea de antibiotice.

Etapa în care se alege medicamentul antimicrobian care urmează a fi administrat

Din gama largă de antibiotice disponibile la ora actuală (peste 250 de molecule

diferite), selectarea celui mai indicat se face după mai multe criterii.

Relativ frecvent, alegerea se bazează pe criteriul prezumţiei etiologice, cu condiţia

începerii diagnosticului microbiologic direct anterior începerii terapiei (nu există nici o

justificare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra întâi antibiotice

şi apoi a-ţi aduce aminte că era preferabil să recoltezi produsul patologic, să îl trimiţi către

laborator în vederea izolării, identificării şi stabilirii sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi

chimioterapice a germenului implicat în respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi

corectată pe baza precizării definitive a etiologiei (cu condiţia ca diagnosticul microbiologic

direct să fi fost „lansat”), dar şi pe baza aprecierii eficienţei clinice şi a efectelor adverse ale

terapiei iniţiale.

În vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmează să îl administrăm

pacientului cu o boală infecţioasă este strict necesar să: a). stabilim diagnosticul etiologic,

să încercăm şi să reuşim diferenţierea infecţiilor bacteriene (tratabile cu antibiotice şi

89

Page 90: Micro Biologie

chimioterapice anti-bacteriene) de infecţiile virale; elementele care ne permit orientarea

spre etiologia bacteriană ar fi: un tablou clinic mai sever (există şi infecţii virale foarte

grave, însoţite de modificări substanţiale ale stării generale a pacienţilor), febra mai

„înaltă”, frisoanele, inflamaţia mai accentuată, prezenţa supuraţiilor, leucocitoza (numeric

şi procentual în analiza formulei leucocitare). Trebuie să realizăm de asemenea o

examinare clinică în detaliu a pacientului („din creştet şi până la tălpi”), examenul

microbiologic (inclusiv examinarea microscopică citobacteriologică); b). testăm

sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate şi implicate în infecţia supusă

antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizăm sau primim informaţii privind

diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoaştem proprietăţile farmacologice ale

antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem în vedere şi criteriul economic (raportul cost-

eficienţă); f). analizăm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.

Trebuie de asemenea să avem în vedere şi să decidem care este calea şi modul de

administrare pentru antibioticul ales în funcţie de gravitatea, localizarea infecţiei, caracterul

acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, toleranţa pentru acest antibiotic a

pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare orală) în infecţii

de gravitate medie sau chiar şi în unele infecţii grave, în funcţie de localizare, ca alternativă

pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dacă bacteria izolată îşi păstrează

sensibilitatea faţă de penicilină, dacă gazda nu prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de

penicilină şi dacă vom reţine care este procentul de absorbţie al acestui medicament şi în

acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea

parenterală şi „pe stomacul gol”.

În cazul în care analiza noastră a permis răspunsul la toate întrebările listate mai sus se

vor stabili dozele necesare, intervalele între administrări, durata tratamentului, precum şi

momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul

administrării incluzând metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor şi simptomelor) şi

metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor în ser etc.).

6. 7. Erori în practica antibioticoterapiei

Antibioterapia se află într-un impas constatat clinic prin diferite eşecuri terapeutice (în

cadrul tuturor specialităţilor atât medicale dar mai ales chirurgicale) şi confirmat de

numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate în special în SUA şi Europa de

Vest şi sunt mai puţine şi mai puţin semnificative în ţara noastră; constatările diferitelor

eşecuri există, chiar dacă sunt prezentate de regulă „anecdotic” şi nu în publicaţii

accesibile întregului sistem sanitar). În străinătate, există o tendinţă de a atrage în echipe

mixte microbiologi, farmacişti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizării antibioticelor

şi chimioterapicelor, mai mult, de a pregăti specialişti pentru formarea de echipe

multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor sanitare, pentru limitarea

problemelor legate de numeroasele erori comise în antibioticoterapie (Arnold 2004).

90

Page 91: Micro Biologie

Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi

folosirea iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi

chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de

specii sau de tulpini („mutante”) bacteriene cu rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor

adverse la antibiotice şi chimioterapice precum şi modificarea tablourilor clinice „clasice“

ale patologiei infecţioase.

Cel puţin teoretic soluţia ar fi descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai

multe companii farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente

antivirale şi antifungice şi au tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea

producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi

mai la îndemână estefolosirea raţională a medicamentelor antimicrobiene deja existente

şi evitarea erorilor făcute în practica antibioticoterapiei.

Dar, care sunt cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor?

În primul rând este incorect să începem un tratatament antibiotic fără să fi examinat

clinic (complet) pacientul şi fără să utilizăm informaţiile pe care le putem obţine printr-o

anamneză riguroasă. Este incorect să indicăm folosirea acestor medicamente în stări febrile

în care există doar „bănuiala unei infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la

întâmplare” sau „pe încercate” (cu o eventuală eroare suplimentară reprezentată de

schimbarea succesivă a antibioticului în „raţionamentul” că „poate de data aceasta va

merge” fără să încercăm să ne fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe

criterii de probabilitate). „Raţionamente” simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi

chimioterapice (deseori întâlnite în practică, din păcate) nu pot conduce decât la eşec, la

modificarea evoluţiei bolii şi la împiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului („mascare”

clinică şi bacteriologică) şi tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este

adevărat că în România nu există ghiduri şi recomandări privind utilizarea corectă a

antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate peeşantioane reprezentative

statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este reprezentată de studiile

făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea Angelescu

(1998).

În al doilea rând este incorect să utilizăm antibiotice fără a solicita, fără a obţine şi

fără a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medicală,

chirurgicală) şi indiferent de supra-specialitate este necesară cunoaşterea şi utilizarea

corectă a unor noţiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect să începem

antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic. În funcţie de contextul clinic şi

de gravitatea patologiei în cazul căreia presupunem drept etiologie o infecţie bacteriană

este recomandabil să solicităm şi efectuarea unor examene paraclinice de bază

(leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că atunci când

suspicionăm o infecţie bacteriană, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate

chiar şi personal; ca alternativă trebuie să stabilim o foarte bună colaborare între

clinică şi laborator) avem la îndemână posibilitatea şi necesitatea efectuării de preparate

între lamă şi lamelă (native) şi frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.)

din produsul obţinut prin recoltare de la pacientul cu o presupusă infecţie bacteriană.

91

Page 92: Micro Biologie

Realizarea şi examinarea frotiurilor poate dura chiar şi numai 5 minute, permiţând în scurt

timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui să indicăm

tratamentul cu antibiotice fără a ţine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. În

cazul unor infecţii grave se poate începe antibioticoterapia, după „criterii de

probabilitate”. Însă, în cazul în care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost

transmis către laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat şi s-a stabilit

care este sensibilitatea la antibiotice şi chimioterapice iar evoluţia clinică şi paraclinică nu

este favorabilă, demonstrând că antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru că avem

rezultate de laborator vom putea „schimba” tratamentul, de această dată pe criterii

ştiinţifice evitând schimbări repetate şi „la întâmplare” sau chiar inducerea unui prognostic

rezervat pacientului supus tratamentului din clinica în care ne desfăşurăm activitatea).

Trebuie să nu greşim şi să luăm în considerare drept agenţi etiologici diferiţi germeni

saprofiţi sau condiţionat patogeni, cultivaţi din focare sau cavităţi septice deschise, sau

izolaţi din produse contaminate în cursul recoltării.

O altă eroare ar fi ignorarea posibilităţii ca germenul izolat să fie doar unul dintre cei 2

sau mai mulţi germeni implicaţi.

Încă din anul doi de studiu se obţin primele date cu privire la toate aspectele descrise

mai sus precum şi cu privire la testarea sensibilităţii la antibiotice (de ex. antibiograma),

metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu trebuie nici subestimată şi nici

supraevaluată (mai ales atunci când este efectuată difuzimetric şi / sau nu este

standardizată).

Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm

datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare în parte şi „scoase” din

contextul general. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator;

datele trebuie interpretate, integrate şi utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de

laborator general. Aceasta reprezintă, după opinia noastră, un aspect esențial al

medicinii pe care dorim să o practicăm la cel mai înalt nivel, în favoarea pacienţilor pe care

trebuie să îi tratăm.

În al treilea rând este incorect să prescriem fără justificare antibiotice şi

chimioterapice, spre ex. în stări febrile neinfecţioase (maladii cu mecanism prin

hipersensibilitate, maladii ale ţesutului colagen, neoplazii etc), în boli infecţioase cu agenţi

patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd să utilizăm penicilină sau orice

alt antibiotic antibacterian în „tratamentul” gripei). Este de subliniat că este incorect să

indicăm antibioterapia (şi să aşteptăm ca indicaţia noastră să aibă efect curativ) în cazul

unor supuraţii colectate neglijând şi / sau temporizând incizia şi drenajul (antibioticul nu

difuzează în focarul purulent; în plus, va fi inactivat la acest nivel).

În al patrulea rând, atunci când este necesară antibioterapia, este incorect să alegem

eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (în cazul în care această asociere este

strict necesară), prin necunoaşterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin

nefolosirea antibioticului de elecţie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau

tetraciclinei în angina streptococică la pacientul care nu prezintă hipersensibilizare la

penicilină), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile în focar (infecţia urinară nu se poate

92

Page 93: Micro Biologie

trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimină prin bilă sau prin urină sub

formă de metabolit inactiv). În plus nu trebuie să uităm faptul că lucrăm cu bolnavi şi nu cu

boli şi în acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaţii specifice

(ex. hipersensibilizare faţă de antibioticul pe care dorim să îl utilizăm, cu posibilitatea

apariţiei unui şoc anafilactic).

Este incorect să indicăm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al

mecanismului (ex. penicilină G + tetraciclină) sau să indicăm asocierea de antibiotice cu

acelaşi spectru (eroare poate fi dramatică în cazul asocierii a două aminoglicozide sau a

două antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenţia privind

eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacţii adverse serioase (ex. afectarea până la

determinarea apariţiei surdităţii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacţie de

notorietate în cazul aminoglicozidelor (streptomicină, kanamicină, gentamicină, amikacină

etc.).

În al cincilea rând, este incorect să indicăm „din start” antibiotice şi chimioterapice

într-un aşa-zis scop profilactic. Spre ex. în cazul în care pacientul prezintă un panariţiu la

degetul inelar singura atitudine corectă este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea şi

pansarea locală, vindecarea urmând a se produce; nu este necesar ci este chiar

contraindicat să recomandăm administrarea de antibiotice şi chimioterapice. Încă din primii

ani de studenţie se poate reţine faptul că, în principiu, utilizarea antibioticelor în scop

profilactic trebuie privită cu rezerve serioase. Pe de altă parte, trebuie cunoscute situaţiile

în care antibioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă (de ex. înainte şi după efectuarea

unei extrageri dentare, manevră sângerândă, la un pacient care are stenoză mitrală).

În al şaselea rând, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele

necesare de microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medicală, medicină

internă, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau /

şi greşelilor în tehnica de administrare; cunoştinţele acumulate ne permit să avem în

vedere posibilele reacţii adverse şi să evităm situaţii care pot deveni dramatice.

Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în

momentul eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât

pentru evaluarea efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei

fenomenelor toxice (de ex. vom indica substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insuficienţă

renală numai în condiţiile monitorizării valorii creatinei şi creatininei sanguine, a ureei

sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei şi a sedimentului urinar).

Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substanţă antimicrobiană.

Datele farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret

al bolnavului tratat. Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de

administrare, difuziunea în organism (ţesuturi şi fluide), metabolizarea substanţei în

organism, eliminarea (căi şi forme de eliminare) etc.

După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea fi

reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, flebite

etc.), sau la distanţă (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare

93

Page 94: Micro Biologie

(erupţii, şoc anafilactic etc.) şi c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea

antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecţii, reacţii autoimune etc.).

În al şaptelea rând, este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia

pe care urmează să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna

cea mai bună variantă posibilă. Considerăm că tăria este atunci când ne recunoaştem

limitele şi nu atunci când încercăm să demonstrăm că acestea nu ar exista.

6. 8. Povestiri adevărate6. 8. 1. Gentamicina administrată în aerosoli

Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac

terorist cu arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate

fi o mai bună formă de apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un

program naţional de protecţie anti-bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă

numele de „BioShield”.

Iniţial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate în

cazul unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinică, Bacillus anthracis,

virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic.

În afară de identificarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de

prevenire / control / combatere.

În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut,

dar condiţionat într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi

respectiv mecanismul de acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel

încât administrarea să poate fi făcută pe care inhalatorie prezintă o serie de avantaje,

spre exemplu: a. eliberare mai rapidă; b. biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai

bună; d. posibilitate de dozare mai bună; e. capacitatea de a ajunge mai uşor şi mai direct

la nivelul organelor afectate. Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul pestei, formele

pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate şi cu cea mai mare

contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boală reprezintă o prioritate.

Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie

trebuie avută în vedere atât pentru tratament cât şi pentru profilaxia post-expunere în

cazul unui atac bioterorist.

Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a

anului 2007.

6. 8. 2. „A da sau a nu da” aceasta este intrebarea!

Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic

adecvat la pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnificativ cu cât se

face mai precoce (de ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic

depinde de capacitatea de a recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia

infecţioasă a stării critice nu face decât să confirme decizia. Dacă va fi incriminată, ulterior,

o altă etiologie a stării critice (IMA, pancreatita acută, HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului

nu afectează în sens negativ evoluţia, aşa cum ar fi fost afectată de întârzierea

94

Page 95: Micro Biologie

administrării acestuia. La vârstnici, infecţia urinară poate fi frecvent o cauză de sepsis. La

un pacient vârstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecifică pentru un IMA

(posibil in primele ore), aşteptăm chiar şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la

elucidarea modificărilor EKG, dar dacă sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare

renal, sau altul, atunci mortalitatea poate creşte de la simplu la dublu (17%-30%).

La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu

administrarea antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase.

Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia

care va fi luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte

produse, care pot fi trimise către laborator înainte de începerea tratamentului

antibiotic.

6. 8. 3. S-a întâmplat nu demult în România ...

 Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la

medic pentru o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se

tăiase în marginea unei conserve pe care o desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă

profundă şi secţionase coronar pulpa degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea

abundentă şi îndelungată a plăgii, dar şi durerea pulsatilă la nivelul policelui, apărută după

aproximativ o oră, au fost motivele prezentării la medic. Pacienta a menţionat faptul că

acasă a aplicat apă oxigenată pe plagă (a procedat corect, fiindcă apa oxigenată, prin

efectul de spumare, antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul

leziunii, dar realizează şi o uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel

dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de

pulbere (ceea ce nu este la fel de corect).

La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la

articulaţia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza

plăgii şi efectuând în continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi

apă oxigenată. Leziunea s-a dovedit a fi minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi,

medicul curant cunoştea faptul că pacienta este studentă la facultatea de medicină şi

studiind în diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical,

dar şi cu celelalte cadre medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi membrii

personalului sanitar se pot infecta dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă

măsurile de prevenire şi control. În acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea

unei antibioterapii cu oxacilină (menţionând că stafilococul alb şi auriu „răspund bine”),

timp de cinci zile, pentru a preveni apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de

îngrijorare îl constituia durerea chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un

fenomen însoţitor pentru un panariţiu subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; în

cazul de faţă durerea s-a instalat la o oră de la lezarea zonei).

Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop profilactic, pacienta a acceptat,

convinsă de către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare.

A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine

acest risc, ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe

necesară. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care

95

Page 96: Micro Biologie

antibioterapia ar fi putut să fie instituită în scop profilactic (înainte de realizarea

contaminării plăgii) sau metafilactic (în contextul unei inoculări bacteriene prezumtive). O

altă eroare, de această dată a pacientei, a fost aplicarea locală de pulbere antimicrobiană

imediat după lezarea zonei. Evident că riscul apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în

„povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să urmeze antibioterapia timp de trei zile în

loc de cele cinci recomandate; evoluţia a fost favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără

complicaţii. Suntem convinşi că acest lucru a fost posibil nu datorită antibioticelor

administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost minoră, precum şi datorită capacităţii de

răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii similare, să analizeze mai

atent beneficiile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un elocvent

contra-exemplu.

În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut

şi înţeles, iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice

„zgaibă”!

6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante

Nu doar fiinţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de

fermă. Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică

parte din totalul situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor,

medicamentele antimicrobiene sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru

efectul biostimulant.

Încă din anii ’40, antibioticele au început să fie folosite în fermele din toată lumea

pentru capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă

consecinţă este că acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot fi

apoi transferaţi omului. Producţia de carne creşte spre beneficiul câtorva producători, dar

creşte concomitent şi ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei

lumi întregi.

În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care

interzice folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop

decât cel terapeutic s-a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii

europeni, pe deplin convinşi de concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le

interzică complet.

Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca

și cea a antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander

Fleming avertiza în legătură cu uşurinţa cu care pot fi produse microorganisme rezistente la

invenţia sa - penicilina. Nu este nevoie de altceva decât ca acestea să fie expuse la doze

mai mici decât doza bactericidă. Aceasta se întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale

s-au adeverit, începând să apară primele tulpini rezistente.

În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil -

stafilococul auriu rezistent la meticilină (MRSA).

Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor

rezistenţi, sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de

priorităţi. (11)

96

Page 97: Micro Biologie

6. 8. 5. Antibiotice fără rețetă?

Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verificarea numărului de

site-uri care oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo

au găsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar

63,8% ofereau o reţetă online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri,

macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6%

exportau spre SUA.

Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în

SUA care nu este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi

care poate contribui la extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice.

Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile

farmaceutice trebuie să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În

timpul anamnezei medicul poate oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la

antibiotice şi posibilele interacţiuni între antibiotice.  Pacienţii au nevoie să fie educaţi în

acest sens! (12)

6. 8. 6.  Și care să fie soluția?

În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S.

aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai

mică parte din aceste tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de

rezistenţă la vancomicină. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate în tratamentul

MRSA şi chiar şi a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă

mult timp până se va dezvolta rezistenţa şi la ele. Este o soluţie inventarea continuă de noi

antibiotice?

Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice

din şase clase diferite incluzând cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult

decât atât, în sudul Asiei şi în China, 60-70% E. coli  sunt rezistente la fluoroquinolone. (13)

Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut?

Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri?

Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau

omul care doreşte pur şi simplu să se informeze?

Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile

învățate ”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai

frecvente erori în utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.

6. 9. Evaluarea cunoştinţelorAlegeți răspunsul corect

1. Neutralizează acţiunea unei clase de antibiotice:

A. nucleul betalactam

B. nucleul carbapenem

C. betalactaminele

D. betalactamazele

97

Page 98: Micro Biologie

E. inhibitorii de betalactamaze

 

2. Au/Are efect bactericid:

A. cefalosporinele

B. tetraciclinele

C. sulfonamidele

D. cloramfenicolul

E. eritromicina

 

3. Inhibă sinteza peretelui celular:

A. macrolidele

B. tetraciclinele

C. cloramfenicolul

D. sulfonamidele

E. penicilinele

 

4. În cazul rezistenţei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se

poate realiza prin:

A. transducţie

B. transformare

C. mutaţie spontană

D. conjugare

E. transpoziţie

 

5. NU se obişnuieşte administrarea de antibiotice bactericide la pacienţii cu:

A. cancer

B. SIDA

C. politraumatisme

D. proteze valvulare

E. gripă

7. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice

Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de

vedere didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru

majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei

şi extinderii rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate

98

Page 99: Micro Biologie

fi naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa

dobândită este „achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană,

în circumstanţe date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.

Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni

În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod

eficient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi

de administrare „obişnuite”. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt

afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii

speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu

pe kilogram/corp; utilizarea unor căi de administrare speciale – injectare intravenoasă,

intrarahidiană etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o tulpină este

rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem

în vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.

7. 1. Metode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni

Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista

anumite diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:

a. metode de testare a sensibilităţii „in vitro”;

b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).

7. 1. 1. Metode de testare a sensibilităţii in vitro

Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda

de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la

bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită

dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu

pe agar Mueller-Hinton).

Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină

bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici

sunt:

·         Tehnicile calitative

o   antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)

o   antibiograma difuzimetrică comparativă

o   antibiograma difuzimetrică standardizată

o   antibiogramele difuzimetrice rapide

·         Tehnicile cantitative

o   metoda diluţiilor în mediu lichid

99

Page 100: Micro Biologie

o   metoda diluţiilor în agar

o   metoda microdiluţiilor în agar

o   metoda „punctelor de ruptură”

o   testul „E”

o   metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.

7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună

Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar

Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin

„inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui

tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se

lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică

microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată.

Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau

cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de

marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu

ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile

peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de

multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie

în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).

Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil.

Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se

dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).

Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt

numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor

foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)

Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de

referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii

Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de

referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.

Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente,

spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru

microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu

termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a

multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează

comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a

microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru

microorganismul testat.

Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale

marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie

100

Page 101: Micro Biologie

microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru

care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la

apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm

microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste

noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.

(Figura nr. 5)

7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar

este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional,

care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite

(Film nr. 1).

Elementele necesare standardizării sunt:

·         mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare

nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)

o   există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor

microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când

este testată sensibilitatea la aminoglicozide);

o   se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);

o   există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor

microorganisme pretenţioase;

o   grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);

·         inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să

aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa

108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;

·          timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de

2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

·         concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea

microcomprimatelor (6 mm diametru);

·         alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;

·         păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de

polietilenă, la +4°C);

·         utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;

·         interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară

rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de

referinţă).

Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace

ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.

7. 1. 1. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de

microorganismul testat. CMI =concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică

101

Page 102: Micro Biologie

concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o

acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi

cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la

16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor,

fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul

standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml

de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor

timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă

la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de

tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare

citim şi interpretăm rezultatele.

Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia

finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de

16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu

fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie

prezentă (Figura nr. 7).

În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător

datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.

În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea

microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie

de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3mg/ml vor fi eficient

inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.

CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la

amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus,

0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentruHaemophilus influenzae,

2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”)

pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)

Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca

sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (Figura nr. 8).

Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare,

numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană.

Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul

de placă corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va

corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate

(sectoare de placă fără apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va fi

eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să

depăşească de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii

antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul

102

Page 103: Micro Biologie

infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la

imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

7. 1. 1. 6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints)

Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a

defini sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele

sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru

(mm). (1)

Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă

volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe

microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o

anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce

priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan

cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt

incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile

din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic

(considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul

în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată

rezistentă.

Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date:

distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele

obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului

de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările

concentraţiilor medicamentului în timp.

”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi

trebuie să fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de

”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii

epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone

geografice. (1-2)

7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”

„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru

diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E

test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu

cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică

permite determinarea valorii CMI. (3)

Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul

standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la

un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru

fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm

microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem radiar

langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii “E-test” pe suprafaţa mediului de

cultură; Film nr. 2).

Principiu:

103

Page 104: Micro Biologie

Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca

turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit

microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri.

Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare.

În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-

32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la

35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde

creşterea bacteriană intersectează banda „E test” (Figura nr. 12 ).

Materiale şi reactivi necesari:

·         plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării);

·         bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează

câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);

·         medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene

necesare efectuării controlului de calitate ;

·         tulpini martor;

·         inocul bacterian;

·         soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea

inoculului bacterian;

·         benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi

antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării (Figurile nr.

13-14. Modul de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru

prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani

·         tampoane sterile;

·         standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;

·         pipete Pasteur sterile;

·         foarfece;

·         plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;

·         incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă

îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;

·         sursă de lumină;

·         aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).

Tehnica de lucru (Film nr. 2):

A. Benzile „E test”

·         scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la

temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai

observăm nici o urmă de umezeală

·         înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă

există perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se

mai pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o

foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile

·         scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri

sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat

104

Page 105: Micro Biologie

·         păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru

a le proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea

directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)

B. Inoculul bacterian:

·         cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură

bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm

(există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore

până când obţinem densitatea dorită)

·         ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un

standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la

standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu

garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).

C. Inocularea plăcilor:

·         introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat,

rotim de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii

interiori ai tubului;

·         depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să

acoperim complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu

câte o treime);

·         lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile

„E test”.

D. Aplicarea benzilor „E test”:

·         luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus

agentul antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat

cu E (benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe

suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E

test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului);

·         aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine

concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;

·         dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă

lucrăm cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun

la distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată

cu E trebuie să atingă marginea plăcii);

·         banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule

de aer de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în

sus pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul

testării);

·         banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu

mediul de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat);

dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce

şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau

105

Page 106: Micro Biologie

un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă

lichidă.

E. Incubarea:

·         timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent

antimicrobian ce urmează a fi testate;

·         incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta

activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele

supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp.,Neisseria

gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).

Interpretarea rezultatelor:

·         putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau

aproape confluentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);

·         ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton);

citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”;

dacă am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-

chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă

de lumină reflectantă şi o lupă;

·         pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie

a hemolizei;

în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai

mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”

(Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dacă zona de inhibiţie nu

intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI se

raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian

de pe banda „E test”;

·         în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii,

rezultatul pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;

·         raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul

obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate);

·         rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National

Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru

enterobacterii).

7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice

·         Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe

o   metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice,

dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă

o   se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în

mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.

·         Testarea sensibilităţii mycobacteriilor

o   se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al

Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări)

106

Page 107: Micro Biologie

o   se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda

rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc (Figura nr. 18).

·         Testarea sensibilităţii altor bacterii

o   există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare

o   spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se

recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a

streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc. (4)

·         Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)

o   ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru

bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud

o   se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid (Figura nr. 19).

·         Testarea producerii de β-lactamaze

o   este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor

care pot produce β-lactamază (ex.Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc)

o   se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine

cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu

spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20).

·         Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex.

ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice,

utilizând criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21).

7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la

antibiotice şi chimioterapice

Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a

optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la

sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care

au la bază tehnicile de biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai

ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii

de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele

clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia

diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor

studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei

truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identificarea M.

tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a

unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice

(Figura nr. 22).

Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR

(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor

linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate

(cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază

alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea

în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor

benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia

107

Page 108: Micro Biologie

unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei

(gena rpoB). (5-6)

Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu

ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează

fiecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate

control).

Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care

hibridizează cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai

multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23).

Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite

suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie

în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a

(histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot

fi identificate prin această metodă.

7. 1. 2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice

Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există

unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice,

precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH,

proteina C reactivă etc.

Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru

evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:

·         determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte

umori (Figurile nr. 24-26 - Citirea NEI din hemocultură sub terapie cu ertapenem; Film nr.

3);

·         determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte

umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din

serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant;

se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă

(Figurile nr. 27-29);

·         utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene,

osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de

imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi

cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 –

Citirea NEI, Efectuarea NEB)

·         determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin

metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

108

Page 109: Micro Biologie

7. 2. Povestiri adevărate7.2.1. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România,

comparativ cu EU

În statele Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în

ultimii ani către stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii

microbiene fiind într-o permanentă creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele

comunitare. Alături de alţi agenţi patogeni care stau la baza declanşării de infecţii

nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella

spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din totalul

acestor infecţii.

În vederea monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la

antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct

EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) – un program de

supraveghere a sensibilităţii la antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor

izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis

/ faecium, K. pneumoniae şi P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit

a MRSA este realizată începând cu anul 1999.

În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării

sensibilităţii la antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre

acestea, 7.037 (23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au

raportat o incidenţă a infecţiilor cu MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia,

Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precădere în unităţile de terapie intensivă (peste

60% din totalul tulpinilor de MRSA).

Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata

infecţiilor nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu

partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500

şi 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între

1.300 şi 2.000 de tulpini pe an, Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între

150 şi 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an.

În comparaţie cu aceste stateRomânia a raportat în perioada 2002-2006 un număr

foarte scăzut de tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul

de tulpini raportate de Slovenia şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia); în acest

context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnificative.

În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”,

un studiu al cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice

pentru un număr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost

izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini şi din leziuni cutanate, prin hemocultură

etc. Testarea sensibilităţii la antibiotice a fost efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92

(15,61%) tulpini de MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate fi corelat, printre

altele, cu numărul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de

meticilino-rezistenţă este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele

109

Page 110: Micro Biologie

şi cotrimoxazolul constituie în prezent alternative terapeutice compromise, rămânând

active (pentru tulpinile identificate în institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi

aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de

26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină

de S. aureus, penicilina este „uitată” complet).

Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei.

Totuşi, faptul că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este

în scădere, reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi

respectiv a celor comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA.

7.2.2. Este începutul sfârşitului erei antibioticelor?

Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta

lactamază sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate fi

copiată cu uşurinţă şi transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care

purta gena NDM a fost izolată de la un pacient suedez de origine indiană care a avut

infecţie urinară în timp ce vizita New Delhi. Studiile arată că între 1 şi 4% dintre bacteriile

Gram negative din sudul Asiei poartă gena NDM.

NDM a fost identificată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile

devenind înalt rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există

cazuri în care nici aceste antibiotice nu sunt eficiente. În prezent nu există alte antibiotice

pentru a distruge bacteriile purtătoare ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite

precum infecţiile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O

încercare pentru tratarea acestor infecţii ar putea fi administrarea unor ”cocktail-uri” de

antibiotice în sparanţa că acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar

există pericolul de intoxicaţie sau a altor reacții adverse.

Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia

estetică această nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui

studiu s-a constat că NDM1 a fost identificată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a

ajuns în Marea Britanie prin intermediul unor pacienţi care s-au întors din aceste ţări după

tratament.

Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)

8. Relaţiile microorganism - gazdă

Fiinţa umană poate intra în contact cu microorganismele încă din perioada intrauterină,

însă acest contact se realizează numai în cazuri patologice (infecţioase, traumatice etc). În

perioada postnatală începe stabilirea relaţiilor operaţionale între fiinţa umană şi populaţia

microbiană din mediul înconjurător, fie prin colonizare saprofitică, fie prin agresiune ce

110

Page 111: Micro Biologie

devine evidentă. Imediat după naştere, microorganismele se stabilesc treptat pe

tegumente şi pe majoritatea mucoaselor. Este vorba în principal de microorganismele care

vor alcătui microflora normală a organismului.

Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană

ulterioară, acţionând prin următoarele mecanisme:

- competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă);

- competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism);

- producţia de bacteriocine (colicine, piocine);

- producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;

- stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant)

al exprimării moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte

celule prezentatoare de antigen;

- stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-

numiţii anticorpi naturali.

Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează

antibiotice cu spectru larg, care vor scădea numărul microorganismelor la nivel intestinal şi

vor permite multiplicarea fungilor şi a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca

urmare, la oprirea terapiei pot apărea fenomene de „rebound”, manifestate prin

repopularea tractului digestiv în avantajul enterobacteriilor faţă de germenii anaerobi.

8. 1. Flora microbiană a organismului

Flora microbiană a organismului poate fi divizată în două grupuri:

- flora normal rezidentă, care se găseşte în mod regulat şi care dacă este perturbată se

restabileşte prompt (sau destul de prompt)

- flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioadă variabilă de timp, de la ore la

săptămâni.

 

Flora microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1) 

a). La nivelul tegumentului

În funcţie de contactul cu mediul înconjurător, flora bacteriană prezintă un grad marcat

de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi  Staphylococcus epidermidis,

Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu

germeni coliformi, chiar stafilococi potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă

fără manifestări nete de agresivitate.

b). La nivelul conjunctivei oculare

Conjunctiva este puţin colonizată, deoarece secreţiile lacrimale conţin substanţe

bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini,

inclusiv a bacteriilor. Pot fi totuși identificați Staphylococcus epidermidis,Propionibacterium

spp., Corynebacterium spp.

c). La nivelul mucoasei nazale

111

Page 112: Micro Biologie

În mod normal se pot găsi stafilococi aurii şi albi, streptococi, corynebacterii,

pneumococi etc, floră supusă numeroaselor contaminări prin contacte şi traumatisme

locale.

d). La nivelul cavităţii bucale

La nivelul cavităţii bucale flora conţine diferiţi coci şi bacili Gram-pozitivi şi Gram-

negativi, aerobi şi anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precumS. salivarius, S.

sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobiiVeillonella spp.,

Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas

spp.), de origine aeriană sau alimentară. Există o adevărată microbiologie orală, cu

diferenţe în funcţie de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la nivelul dosului limbii

există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100.000.000 bacterii, iar

la nivelul plăcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii

bacteriene diferite, cele dominante fiindStreptococcus sanguis şi Streptococcus mutans).

Placa dentară, cariile şi boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora

normală bucală.

e). La nivelul tractului respirator

Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase

contaminări prin contacte şi traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaţie), streptococi,

corynebacterii, pneumococi etc.

Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu flora cavităţii bucale. Astfel

se pot găsi streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp,

Bacteroides spp.

Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar.

f). La nivelul tractului digestiv

La acest nivel există o diferenţă evidentă în funcţie de segmentele acestuia, exprimate

mai ales prin chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare şi al adultului, la

acest nivel se găsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum şi foarte

numeroşi germeni anaerobi (Bacteroides spp., enterococi) etc, în total existând aproximativ

1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziţia şi

funcţiile florei normale digestive.

g). La nivel urogenital

Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micţiunii bacteriile de pe tractul urinar

inferior sunt cel mai frecvent îndepărtate. Totuşi, în uretra anterioară poate exista o floră

care este cel mai frecvent alcătuită din fungi, staflococi, corinebacterii şi enterobacterii.

Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite

cu mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp.,

Bacteroides spp. etc. Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil

multiplicării altor germeni (în special patogeni). Mucusul cervical are în plus o acţiune

bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la

restul compoziţia florei este mixtă.

112

Page 113: Micro Biologie

8. 2. Flora microbiană normală din sistemul intestinal

Cea mai puţin înţeleasă parte a organismului îndeplineşte funcţii esenţiale fiziologice,

nutriţionale şi de protecţie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce

influenţează anatomia, fiziologia, cât şi patologia umană. Flora normală intestinală

cântăreşte aproximativ 1 kg şi conţine o bună parte din celulele corpului uman.

Speciile bacteriene ce colonizează sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normală

este unică, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziţia ei se menţine

constantă lungi perioade de timp. Astfel a apărut noţiunea de „amprentă microbiană

unică”.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase decât celulele eucariote ale corpului

uman. În colon există cele mai multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul

este organul cel mai activ metabolic din întreg organismul. (Figura nr. 1)

8. 2. 1. Achiziţia florei normale

Înainte de naştere, în condiţii fiziologice, fătul este „germ-free” (nu prezintă

microorganisme). Apoi, întreg corpul uman și implicit şi tractul gastro-intestinal este

colonizat de bacterii aerobe ce aparţin microflorei materne, de ex. Escherichia

coli sauStreptococcus spp.

După aproximativ o săptămână, încep să predomine bacteriile anaerobe.

În cazul în care nou-născutul este hrănit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii

Gram-pozitive, de tipulBifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp.

În cazul alăptării artificiale, situaţie nedorită şi nerecomandată pentru dezvoltarea

sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbiană intestinală va

deveni foarte asemănătoare cu cea a adultului incluzând Enterobacteriaceae şi specii din

genul Bacteroides.

Flora normală a adultului conţine reprezentanţi din toate cele 3 domenii de

viaţă: Eukaryota, Bacteria, Archaea, după cum urmează.

Din domeniul Bacteria, regăsim microorganisme din genurile Bacteroides (care

reprezintă circa 30% din flora

normală),Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostre

ptococcus, Bifidobacterium, Escherichia şi Lactobacillus.

Din domeniul Archaea, regăsim microorganisme din genul Methanobrevibacter.

Iar din domeniul Eukaryota, regăsim microorganisme din

genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus şi respectivPenicillium.

8. 2. 2. Cultivarea în laborator

Majoritatea speciilor bacteriene rezidente în intestin nu au putut fi cultivate pe medii

standard de laborator. Acestea necesită condiţii speciale, cât mai asemănătoare celor din

sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complexă: interacţiunile

dintre factorii secretaţi de bacterii nu sunt înţelese complet, iar efectele per ansamblu ale

substanţelor proprii organismului asupra florei microbiene sunt, de asemenea, puţin

cunoscute.

113

Page 114: Micro Biologie

Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, în timp util şi într-un

mod foarte eficient, ADN-ul bacterian.

Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puţin variabilă. S-a

demonstrat că anumite porţiuni ale secvenţei ADNr a diferitor organisme înrudite între ele

sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce următoarea idee: secvenţierea genelor

unor organisme apropiate filogenetic poate fi aliniată foarte precis, astfel obţinându-se o

evaluare mult mai exactă a diferenţelor existente. Cum? Prin compararea zonelor

hipervariabile ale ARNr, extrem de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele

care codifică pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia

şi pentru a specifica ratele de diferenţiere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza

după realizarea secvenţierii ARNr 16S oferă numeroase informaţii asupra evoluţiei

bacteriene şi asupra relaţiilor dintre specii. Iniţiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel

care a propus ulterior clasificarea microorganismelor în sistemul celor trei

domenii Archaea, Bacteria şi Eucarya.

Spre exemplu, într-un studiu s-a analizat prin secvenţierea ARNr 16 S (aparţine

subunităţii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au

descoperit 1.250 secvenţe diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea

nu aparţin  grupurilor taxonomice cunoscute şi clasificate până în momentul de faţă, în timp

ce mai mult de jumătate nu au mai fost descoperite în nici un alt situs sau în afara

organismului.

Până în prezent au fost identificaţi aproximativ 420 membri ai florei normale, făcând

parte din 117 genuri diferite. Se presupune că există peste 1.000 de specii bacteriene în

sistemul nostru intestinal.

Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi următorul:

1. Prelevarea de produs (materii fecale)

2. Depozitarea preparatului în una din următoarele variante:

-procesare imediată

sau

- îngheţare la -80° C

sau

-depozitare într-un aparat de depozitare şi prelucrare special (PSP® Spin Stool DNA Plus

Kit), la temperatura camerei

3.  Purificarea acidului nucleic

      -există și kituri comerciale

      -liza celulară cu ajutorul unui kit

4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utilizând primeri ale căror ţinte sunt regiunile

variabile ale genei ARNr 16S

5. Analiza şi interpretarea rezultatelor

8. 2. 3. Modificări ale florei intestinale normale

Compoziţia florei microbiene normale este influenţată de numeroşi factori, precum stilul

de viaţă, dieta, starea de sănătate versus starea de boală, vârsta. Astfel, dacă este

114

Page 115: Micro Biologie

urmărită evoluţia în timp a prezenţei speciilor de Bifidobacterium şiEnterobacteriaceae în

sistemul intestinal, se vor observa diferenţe semnificative:

Bifidobacterium spp. se află în cantitate maximă la copil, în cantitate medie la adult şi

respectiv în cantitate minimă la persoanele în vârstă, în timp ce Enterobacteriaceaele se

află în cantitate maximă tot la copil, în cantitate minimă la adult şi în cantitate medie la

persoanele în vârstă. (Schema nr. 1; Factori ce determină modificarea compoziţiei florei

normale)

De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizează o selecţie prin cooperarea dintre

gazdă şi diferitele bacterii. O serie de factori locali determină o distribuţie neuniformă a

florei, dintre aceştia putem aminti:

-factori fizici:

•      temperatura;

•      gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe);

-factori chimici:

•      pH-ul (între mese, nu există microorganisme la nivel gastric);

•      procentul de H2O;

•      acizii biliari;

•      secreţia pancreatică;

•      nivelele diferiţilor nutrienţi;

•      secreţia locală de imunoglobuline;

•      diferitele substanţe produse tocmai de către bacterie;

-factori mecanici:

•      peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataşa de mucoasă atunci când

peristaltismul este scăzut; iată şi unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-

peristaltice nu sunt benefice în infecţiile digestive); (Tabelul nr. 2)

•      fenomenul de competiţie între diferitele specii bacteriene etc.

8. 3. Funcţiile florei microbiene normale din sistemul intestinal

8. 3. 1. Flora normală şi sistemul imun

8. 3. 1. 1. Dezvoltarea sistemului imunitar

În studiul unor cercetători de la Harvard Medical School au fost urmărite efectele

colonizării cu Bacteroides fragilis a unor şoareci „germ-free”(crescuţi în mediu steril). Dacă

în lipsa bacteriilor animalele prezentau timusul şi splina incomplet dezvoltate şi un număr al

limfocitelor T CD4+ naive foarte mic, după colonizarea cu Bacteroides fragilis toate

defectele au dispărut. Mecanismul prin care flora determină o dezvoltare normală a

sistemului imunitar se pare că este următorul:

- bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structură

specială;

- PSA este recunoscut şi cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinală;

115

Page 116: Micro Biologie

- celulele dendritice îl prezintă limfocitelor T naive şi determină proliferarea limfocitelor

Th1, cu adoptarea unui răspuns imun de tip celular .

Dacă în lipsa florei, organismul tinde spre un răspuns imun de tip umoral, realizat prin

limfocitele Th2, în prezenţa acesteia se echilibrează reacţia sistemului imunitar Th1-Th2.

Astfel, flora microbiană normală „educă” sistemul imun şi contribuie la dezvoltarea şi

funcţionarea normală a acestuia. Toleranţa faţă de bacteriile nepatogene, precum şi

sensibilitatea faţă de bacteriile patogene se dezvoltă începând cu primele zile de după

naştere, iar echilibrul dintre ele este esenţial. (Figura nr. 2)

8. 3. 1. 2. Flora microbiană intestinală ar putea reprezenta cheia în prevenirea

unor stări de hipersensibilitate

Conform acestor explicaţii, în lipsa florei, sistemul imun tinde „să se orienteze” spre un

răspuns de tip umoral. Acest tip de răspuns imun poate fi implicat în apariţia stărilor de

hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreţie excesivă de imunoglobuline. Într-un studiu

al cercetătorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o

hipersensibilitate la nivel respirator, apărută faţă de ovalbumină (un cunoscut alergen) la

şoarecii cu flora normală gastro-intestinală distrusă de antibiotice.

Un alt argument al implicaţiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferenţa

cunoscută dintre compoziţia florei normale a copiilor cu diversele forme de

hipersensibilitate, comparativ cu flora intestinală la copiii sănătoşi; copiii din prima

categorie prezintă un nivel crescut al speciilor de Clostridium difficile şi Staphylococcus

aureus, în timp ce speciile din genurileBacteroides şi Bifidobacteria sunt în cantitate mică.

8. 3. 1. 3. Stresul produs de către sistemul imunitar pare să reprezinte un

semnal de atac pentru bacterii

S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine florei normale la 3% din

oameni, deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea

răspunsului imun, inclusiv în cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină

este „recunoscută” drept o structură negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează

genele de patogenitate. În aceste condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze

răspunsului imun, se multiplică, selectează factori de rezistenţă la antibiotice, secretă

toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolată în sepsis, iar unica

sursă posibilă era reprezentată de flora intestinală). În urma unor intervenţii chirurgicale

majore a fost raportată o frecvenţă crescută a sepsisului cu implicarea Pseudomonas

aeruginosa.

Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate

de cercetători din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu

„intenţionează” să descopere o oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate,

dezvoltă un plan de reacţie.

8. 3. 1. 4. Bacteriile au „propriul sistem imunitar”

La întrebarea privind modul de răspuns al bacteriilor faţă de informaţia genetică

externă sistemului în care se dezvoltă în mod obişnuit, cercetătorii au lansat o serie de

ipoteze. Se pare că bacteriile au capacitatea de a recunoaşte ADN-ul străin. În materialul

nuclear bacteriile deţin proteina H-NS care are funcţia unui receptor pentru moleculele de

116

Page 117: Micro Biologie

adenină şi timină din structura ADN-ului existent în mediul exterior. Această proteină

previne activarea lui şi blochează exprimarea informaţiilor ce ar putea dăuna bacteriei. Se

pare că microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de

patogenitate. Cercetătorii sugerează un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute în prezent

drept patogene, în trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia

pestis etc., ar fi devenit patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern).

Aceste studii oferă şi o nouă viziune asupra evoluţiei bacteriilor dar şi asupra utilizării

capacităţii unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La

bacteriile lipsite de H-NS, care nu inactivează structurile genetice umane, producţia de

proteine este mai eficientă.

8. 3. 1. 5. Diferenţierea bacteriilor comensale de cele patogene

Mecanisme ale gazdei

Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care

include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide

binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de

receptori intracelulari. (Figura nr. 3)

Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt:

- enterocitele de suprafaţă;

- celulele M din foliculii limfoizi şi

- celulele intestinale dendritice.

Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA,

chemokine, citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale

către celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă

în continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi

trimit dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le cooptează şi le transportă către

ganglionul limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În ganglion este declanşat

răspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau

reglator, prin limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun.

La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns inflamator sau

chiar poate să apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor inflamatorii care ar putea

fi declanşate de bacteriile patogene.

Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related

molecule) şi NOD2 determină toleranţa faţă de flora normală gastro-intestinală, prin

inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele

intestinale dendritice deprimă la rândul lor reacţia inflamatorie.

Mecanisme ale florei

Toleranţa faţă de flora normală nu este determinată doar de structurile gazdei.

Bacteriile comensale deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul

intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei

(ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediază eludarea mecanismelor de

apărare ale gazdei. Recent s-a demonstrat că secreţia se realizează prin sisteme de

secreţie de tip III (injectarea unor molecule în celulele eucariote, prin intermediul unui

117

Page 118: Micro Biologie

flagel) şi de tip IV (transportul ADN-ului sau a unor proteine în celulele eucariote,

asemănător mecanismului de conjugare), mecanisme până acum descrise doar la bacteriile

patogene. (Figura nr. 4)

Flora normală limitează semnalele inflamatorii declanşate de bacteriile patogene prin

următorul mecanism (Figura nr. 5):

- NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene

transmit semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor

determină transcripţia genelor p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine.

- flora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated

receptor) care exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de

asemenea şi cascada inflamatorie.

Spre exemplu, flora intestinală normală scade răspunsul inflamator faţă de Salmonella

typhimurium.

8. 3. 2. Flora microbiană normală inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene

prin „efectul de barieră” sau fenomenul de competiţie

Într-un organism gazdă sănătos, flora normală realizează un „strat protector” de-a

lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei

şi consumă factorii nutriţionali produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale

secretă produşi anti-bacterieni, chemokine, citokine şi IgA. (Figura nr. 6)

În anumite condiţii, spre exemplu atunci când:

- există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;

- este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg);

- există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de

imunosupresie, o modificare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.);

- se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.)

flora microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală.

8. 3. 3. Flora normală intestinală „determină” greutatea fiecărui individ

Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în

polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi

cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de

grăsime în comparaţie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat că:

- Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale;

induce formarea reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în

timp ce

- Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi

prin sinergie cu B. thetaiotaomicronstimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia

caloriilor.

Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbiană normală

intervine în reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)

Primul dintre acestea ar fi influenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice.

S-a demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile

transformându-le în produşi digerabili, astfel crescând extracţia energetică. 

118

Page 119: Micro Biologie

O altă ipoteză stabileşte o legătură între flora normală intestinală şi homeostazia

metabolică. O dieta bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel

intestinal: cresc bacteriile Gram negative şi scad bifidobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides

spp.                                             Această modificare determină creşterea nivelului plasmatic

al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un răspuns inflamator cronic de mică intensitate la

nivelul ficatului, al ţesutului adipos şi al hipotalamusului. Apare o creştere în greutate şi o

acumulare excesivă a lipidelor la nivel hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei rezistenţei la

insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8)

Un al treilea mecanism este acela prin care flora normală induce reglarea unor gene ale

gazdei. Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic.

Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât

şi în tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi

cantitate de hrană, prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor.

Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în flora normală a

pacienţilor obezi este cauza sau consecinţa obezităţii?

8. 3. 4. Fermentarea şi absorbţia polizaharidelor în colonul proximal

Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală

îndeplineşte această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu

lanţ scurt de carbon şi gaz.

Microorganismele florei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor

intestinale (epiteliale şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari.

Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă.

Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de floră, au ca efect scăderea pH-ului în

lumenul intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o

rezistenţă scăzută la pH acid.

Prin fermentarea zaharolitică, flora are o importantă funcţie energetică, creşte

reabsorbţia apei, precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe).

8. 3. 5. Alte funcţii          

8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitică în colonul distal - importanţa dietei reduse

în proteine

Prin fermentarea proteolitică flora normală intestinală produce o serie de toxine şi

substanţe cu posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie

directă cu cantitatea de proteine ingerate.

      8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari în cocarcinogeni

Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare

sau hidroliză acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie de cocarcinogeni. Lactobacillus

bifidus blochează acidul colic intracelular şi astfel împiedică formarea de cocarcinogeni.

      8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K

Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides

fragilis şi Escherichia coli participă la sinteza vitaminei K2.

8. 3. 5. 3. Absorbţia vitaminei B12

A fost dovedit rolul florei intestinale normale în absorbţia de vitamină B12.

119

Page 120: Micro Biologie

8. 3. 6. Flora microbiană normală - partenerul silenţios în manifestarea bolii

Boala inflamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu

care trebuie luat în discuţie şi aflat în relaţie cu flora intestinală normală. (Figura nr. 9)

Boala inflamatorie intestinală include:

- boala Crohn, în care procesele inflamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la

nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului

subţire; în cazul afectării colonice pot apărea fistule şi abcese în regiunea anală.

- colita ulcerativă include răspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte

interiorul rectului (proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă).

În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi

patologice. Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la

persoanele afectate:

- o predispoziţie genetică;

- lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut;

- „igiena excesivă”în copilărie, cu o insuficientă dezvoltare a răspunsului imun;

- excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi;

- tratament cu antibiotice utilizat frecvent.

Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar fi pierderea toleranţei faţă

de flora normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de

hipersensibilitate şi reacţii autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută.

Compoziţia florei normale este modificată (de ex. specii din genul Clostridium apar în

proporţie mai mare faţă de normal), dar nu s-a putut demonstra dacă aceasta determină

boala sau dacă este doar un efect al inflamaţiei intestinale.

Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată flora normală, spre ex.

neoplazii (digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după

modificarea habitatului (ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul

urinar), obezitate, stări de hipersensibilitate, autism, depresie etc.

8. 3. 7. Farmabioticele

Reprezintă orice formă de „exploatare farmaceutică” a florei normale (probiotice,

prebiotice, sinbiotice).

Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme vii (bacterii, fungi)

cu efecte benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt în general cele

producătoare de acid lactic (scad pH şi împiedică dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura

nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus şi Bacteroides.

Prebioticele reprezintă ingrediente alimentare non-digerabile care afectează în mod

pozitiv gazda, stimulând în mod selectiv creşterea şi/sau activitatea unei sau a unui număr

limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidraţi iar bacteriile stimulate

sunt Bifidobacteria sau bacteriile producătoare de acid lactic.

Sinbioticele sunt produse care conţin atât probiotice, cât şi prebiotice.

Există dovezi ce susţin rolul terapeutic al probioticelor în boala inflamatorie intestinală,

infecţii, cancer, artrită.

120

Page 121: Micro Biologie

8. 4. Relaţii microorganism-gazdăCu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză,

convieţuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la

care participă unii coliformi intestinali).

Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii

de comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi

creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor

tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor)

pot modifica aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din flora normală pot

manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene.

Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în

detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.

Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta

decât în organismul gazdei (de exempluMycobacterium leprae, Treponema

pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi

libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism

(de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

8. 5. Povestire adevăratăRolul şi importanţa florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine

stabilite. Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse

afecţiuni, să afecteze cât mai puţin această floră. O primă idee este utilizarea de antibiotice

cu spectru cât mai „ţintit” (îngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte

„piatra de încercare” a medicilor, credem, o reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice

inutile. Câţi dintre medici nu recomandă scheme după scheme de medicamente anti-

stafilococice doar pentru că la exsudatul faringian se izolează un stafilococ, fie el chiar şi

„auriu”? Mai toţi. Încercăm „sterilizarea” de acel stafilococ, doar dacă pacientul urmează să

primească un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens

imunosupresor, altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe de altă parte, rămâne o întrebare pe

care o punem tuturor generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de

infecţii stafilococice întâlnite şi raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este

menţionat şi testul coagulazei? Însă, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie să

uităm niciodată că utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice, în special a celor

cu spectru larg, afectează uneori decisiv flora microbiană normală a cărei utilitate este în

momentul de faţă binecunoscută.

8. 6. Ştiaţi că .......Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea şi Dezvoltarea

Probioticelor a afirmat: “Lactobacilul este doar o bacterie. Să spui că un produs conţine

lactobacil este ca şi cum ai spune că îl aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi

121

Page 122: Micro Biologie

actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care întâmplător  îl cheamă

George Cloney. În cazul probioticelor există diferenţe importante între tulpini”?

....atunci când doriţi să achizionaţi produse ce conţin probiotice ar trebui să le căutaţi

pe acelea pe a căror etichetă este specificată tulpina conţinută şi care oferă cititorilor acces

liber la studiile ştiinţifice de suport? O sursă bună pentru informarea asupra efectelor

variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov.

....puteţi să vă faceţi singuri iaurt cu probiotice? Aveţi nevoie de 1l lapte steril-orice tip,

chiar şi de soia, un iaurt-sursa de probiotice şi de un recipient în care doriţi să faceţi iaurtul.

Cuptorul se încalzeşte timp de 15 minute la 180 grade, se lasă să se mai răceasca timp de

10 minute. Se aşează în cuptor recipientul şi compoziţia pentru iaurt. Se închide uşa de la

cuptor şi se lasă 12 ore, peste noapte. Dacă dimineaţă observaţi că nu a ajuns la

consistenţa dorită mai lăsaţi-l în cuptor timp de 12-24 ore.

9. Patogenitate şi Virulenţă9. 1. Agenţii infecţioşi

Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai

ales germenii patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:

- virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care

provoacă boli infecţioase numite viroze;

- chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în

citoplasma celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;

- mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se

pot dezvolta pe medii artificiale îmbogățite;

- rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu

se pot cultiva în afara celulelor vii;

- bacterii propriu-zise;

- fungi;

- protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;

- metazoare.

În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni,

constituiţi dintr-o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid

nucleic, cu potenţial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a

numeroşi factori fizici şi chimici care inactivează virusurile. Sunt capabili de a se reproduce.

Afectează atât oamenii cât şi mamiferele. Sunt implicaţi etiologic în maladii cu evoluţie

122

Page 123: Micro Biologie

lentă, precum encefalopatia spongiformă transmisibilă care include spre exemplu boala

Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatală familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni

degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiformă bovină, începând

cu anul 1996 au fost descrise afecţiuni umane, după consumul de carne de vită; maladia

poartă numele de „Creutzfeldt-Jacob noua variantă”. Principalele manifestări sunt

reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somn-veghe. La o treime din

pacienți, manifestările oculare pot masca demența. Deteriorarea mentală este rapid

progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în medie 7-9 luni. (1)

Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând

un proces infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale

mucoaselor, multiplicarea ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi

vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt influenţate în largă măsură de:

- factorii de patogenitate ai microorganismului;

- factorii de apărare ai gazdei.

9. 2. Patogenitate şi virulenţă. Caracterele de patogenitate ale bacteriilor

Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă

fenomene morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa”. Patogenitatea

este un atribut de specie şi este determinată genetic.

Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este

un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii

depinde de condiţiile în care trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie

bacteriană care a pierdut virulenţa în condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în

anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV /

SIDA). Virulenţa poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în

condiţii standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit

DL50, adică doza letală 50%).

Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene

pot fi:

- multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;

- multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general

„exotoxine”).

9. 2. 1. Multiplicarea şi invazivitatea

123

Page 124: Micro Biologie

Germenii patogeni se multiplică la poarta de intrare şi invadează organismul prin

formarea de abcese şi prin propagarea din aproape în aproape în „pată de ulei”, dar pot

trece şi direct în circulaţia generală. În acest caz produc infecţii la distanţă. Pentru a avea

loc această succesiune a evenimentelor, germenii trebuie să poată rezista reacţiilor de

apărare nespecifică a gazdei (de exemplu fagocitozei) şi să poată adera de celulele

mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Există o aderenţă nespecifică, de fapt

un proces chimic şi fizic, reversibil, cu implicarea atracţiei hidrofobe, electrostatice dar şi a

mişcării browniene şi a existenţei biofilmului de polimeri. Aderenţa specifică poate fi la

rândul său reversibilă dar, dacă implică suficient de mulţi factori (structurali, diferite forţe

de legătură), poate deveni ireversibilă.

Biofilmul include populaţii bacteriene aparţinând uneia sau mai multor specii,

înconjurate de polimeri extracelulari (EPS -extracellular polymeric substances).

Microorganismele aderă între ele, dar şi la suprafeţe, formându-se o structură

asemănătoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienţilor şi eliminarea

substanţelor reziduale, precum şi comunicarea interbacteriană. Dezvoltarea biofilmului

cuprinde 5 etape (Figura nr. 1):

·         ataşarea reversibilă,

·         ataşarea ireversibilă,

·         maturarea 1,

·         maturarea 2 şi

·         dispersia.

Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare şi de

înfundarea conductelor de apă. Din punct de vedere medical, se pot observa în cazul

endocarditei (pe valve), otitei medii, plăcii dentare şi pot reprezenta o problemă pentru

pacienţii cu fibroză chistică. Biofilmele se dezvoltă şi pe implanturi sintetice cum ar fi:

catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc.

O caracteristică foarte importantă a biofilmelor este reprezentată de rezistenţa crescută

la antibiotice, de până la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt atât EPS, care

acţionează ca o barieră sau care pot chiar inactiva antibioticele, cât şi faptul că în cadrul

biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel încât o activitate metabolică scăzută va

conduce la o asimilarea mai lentă a antibioticelor.

Dintre bacteriile implicate în producerea de biofilme amintim: Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi

β hemolitici etc. (2)

Poate fi luat în discuţie şi „tropismul”, care poate fi specific pentru anumite structuri ale

gazdei [ex. tulpinile de E. coliuropatogene aderă cu ajutorul unei

adezine papG (pyelonephritis-associated pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa

celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din

grupul A, meningococul sau gonococul infectează numai gazda umană).

9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor

- pilii comuni (fimbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe

tipuri de pili, astfel că cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a

124

Page 125: Micro Biologie

infecta un anumit tip de ţesut. De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau

Pap, având tropism pentru tractul urinar. (3)

- lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi);

- liganzii (molecule care realizează legături specifice cu anumite molecule

complementare de la nivelul substratului);

- glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei

bacteriene);

- „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe

polimerice extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifică a

bacteriilor într-un strat vâscos);

- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în

cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice);

- adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot fi definiţi drept „adezine”);

- substanţe componente ale peretelui bacterian

- proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un

dimer ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui

bacterian, măsurând de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza

sau opsonizarea de către PMN, în lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la capătul

variabil N-terminal al dimerilor.

- antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella

typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împiedica

acţiunea anticorpilor, are proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid.

Serotipurile care prezintă acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini

de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor două

serotipuri, fiind sursa ideală de antigen Vi, necesar preparării antiserului.

- polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic);

- antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din

lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de

enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă

rezistenţă împotriva sărurilor biliare, complementului (diminuând activitatea MAC –

membrane attack complex) şi fagocitozei; prezintă şi activitate mitogenă, stimulând

diferenţierea policlonală şi multiplicarea limfocitelor B, determinând astfel secreţia de

imunoglobuline, precum IgM şi IgG. LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o porţiune

centrala rugoasă polizaharidică (regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).

- antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus

anthracis) etc.

În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect aflat în

imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria

coloidală DLVO (după numele autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie

există 2 poziţii de stabilitate termodinamică, prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei,

forţelor de tip van der Waals, forţelor electrostatice şi tensiunii superficiale (Schema nr. 1).

125

Page 126: Micro Biologie

Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a

particulelor spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest

„minim secundar” corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces

reversibil.

Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice,

hidrofobe) care vor duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate

ireversibil de substrat. Aderenţa se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul

secundar” şi intră în „minimumul primar”. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele

tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea este destinaţia finală, în timp ce

pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o etapă, urmând

penetrarea tisulară şi / sau diseminarea în organism.

9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor

(agresine) (Tabelul nr. 1)

- coagulaza liberă şi/sau legată a S. aureus care transformă fibrinogenul în fibrină şi pe

de o parte poate „masca” bacteria înconjurată de structuri asemănătoare cu ale gazdei, pe

de altă parte poate preveni fagocitarea sau chiar împiedica ajungerea antibioticelor şi

chimioterapicelor la sediul infecţiei;

- leucocidina secretată după ce stafilococul a fost fagocitat şi care transformă leucocitul

în piocit (se inseră în membrana leucocitului şi produce pori sau degradează enzimatic

fosfolipidele de la nivelul membranei);

- producerea unor substanţe care cresc concentraţia intracelulară de AMPc până la

concentraţii ce inhibă fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium

tuberculosis);

- producerea de catalază (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium

fortuitum), glutation peroxidază, superoxid dismutază, citocrom oxidază (Vibrio spp.,

Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhibă sau inactivează radicalii activi de

oxigen;

- producerea unor factori care conferă rezistenţă la enzimele lizozomale, după

fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc);

- producerea de enzime litice:

1. colagenaza (este produsă de Clostridium histolyticum şi Clostridium perfringens şi

distruge colagenul prezent în muşchi facilitând răspândirea procesului infecțios),

hialuronidaza (scindează acidul hialuronic, o componentă a ţesutului conjunctiv),

fibrinolizina (determină liza cheagului prin convertirea plasminogenului în plasmină) etc

(streptococ, stafilococ, unele clostridii);

2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de

exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis);

3. fosfolipaza (toxina a) (realizează hidroliza fosfolipidelor din membrana celulară, prin

îndepărtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens);

4. neuraminidaze (degradează acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella

dysenteriae);

126

Page 127: Micro Biologie

5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra

ADN şi ARN, generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc;

6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge

(streptococ, stafilococ, unele clostridii) etc.

- producerea unor substanţe care inhibă sau modifică răspunsul imun

1. IgA proteaza (clivează IgA în regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H.

influenzae);

2. proteina A stafilococică (inhibă opsonizarea);

3. endotoxina care creşte sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α etc;

4. inducerea apariţiei unor reacţii autoimune;

5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicată

în sindromul de şoc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt

printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorată lor poate determina

atât anergie, cât şi hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezultă o secreţie în exces

de IL-2 care interferă cu sinteza altor citokine (TNF-α, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de

superantigene ar fi: toxina pirogenică streptococică (produsă de tulpinile lizogenizate),

enterotoxinele stafilococice (S. aureus), subtanţe cu efecte asemănătoare hormonilor (ex.

toxina stabilă termic produsă de E. coli enterotoxigen) etc.

Fiecare din substanţele de mai sus are un rol bine definit în evoluţia reacţiei inflamatorii

locale.

9. 2. 2. Multiplicare şi toxinogeneză

Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări

celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi

prin „functio laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci).

Din punct de vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni:

9. 2. 2. 1. Exotoxinele

Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu

bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat

plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin

mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas

aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)

Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar

legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active).

Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din

structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă.

Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg

corp în cazul toxinei botulinice).

127

Page 128: Micro Biologie

Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard,

SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă

(când toxina este deja fixată pe celulele ţintă).

Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale,

toxina putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.

Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.

Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse

de Clostridium difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind

responsabile de o boală diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel

leziuni microscopice, dar şi leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor

identifica noduli.

Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor

structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic

alterarea microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în

morfologia citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea

microvililor). (Figura nr. 5)

Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea

permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine,

acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea

mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea

joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă

de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din

lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie.

9. 2. 2. 2. Antitoxinele

Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi

specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare

specifică cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia

specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea

exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).

Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii

preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi

timp cât mai curând posibil.

Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui

manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale

hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la

seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de

imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile.

9. 2. 2. 3. Anatoxinele

Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a

temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin

puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor

produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum

128

Page 129: Micro Biologie

şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric,

antitetanic, antibotulinic etc).

9. 2. 2. 4. Endotoxinele

Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei

externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în

urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor

intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide. (Figura nr. 6)

Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare

indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în

comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei,

leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps,

sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în

apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu

numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie

destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se

identifică 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă.

Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică

este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la

patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor

distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se

cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin

intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul

inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final poate rezulta şocul.

Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor

stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect

de creştere a fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi

sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma

tratamentului.

Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de

mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.

În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:

- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul,

deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;

- Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.

9. 3. Apărarea organismului faţă de infecţii

Apărarea organismului faţă de infecţii se realizează prin diferite mijloace nespecifice şi

specifice. Acestea exprimă împreună capacitatea normală de păstrare a homeostaziei

organismului prin rezistenţa faţă de aderarea microorganismelor de celulele ţesuturilor

129

Page 130: Micro Biologie

expuse, faţă de colonizarea şi multiplicarea germenilor în organism, prevenind invazia

agenţilor patogeni.

Principalele componente ale apărării antiinfecţioase sunt reprezentate de:

9.3.1. bariera anatomică cutaneo-mucoasă, care acţionează prin:

- Integritatea sa anatomică: Pielea este o barieră în fața invaziei microorganismelor

deoarece este formată din straturi de celule strâns unite între ele, dar şi datorită stratului

de keratină. Descuamarea continuă a straturilor pielii are rol în eliminarea

microorganismelor. În general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecțios poate

debuta în urma unor traumatisme, intervenţii chirurgicale, utilizarea de catetere iv,

intervenției unor vectori. (3)

- Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidină, β-defensină. Acestea au şi rol de

chemokine, favorizând migrarea celulelor cu rol în fagocitoză.

- Mucoasele sunt umede şi deţin mai multe bacterii decât pielea. Majoritatea celulelor

epiteliale secretă aceleaşi peptide ca şi cele ale pielii. În plus conţin salivă, mucus, lacrimi,

cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector şi prin conţinutul crescut de lizozim.

- Prezenţa de:

·         IgA secretorii (sunt secretate IgA şi IgG cu rol în aglutinarea, dar şi blocarea

competitivă a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este

mai mare decât IgG datorită rezistenţei acesteia la proteoliză prin cuplarea cu un

polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare împiedicând pătrunderea

acestora în celule.),

·         lactoferină (proteină cu rol în legarea fierului. Fierul este un element important

pentru supravieţuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizează pielea şi

mucoasele au mecanisme de achiziționare a fierului chiar în prezenţa acestor proteine),

·         alfa 1 antitripsină, lizozim (joacă unul din rolurile cele mai importante, având

efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din

componenţa peptidoglicanilor) etc.;

- pH-ul acid al unor secreţii locale: pH-ul acid şi flora bacteriană au rol în inhibarea

invaziei bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescută  la colonizare.

- Prezenţa microflorei normale, ce constituie nişa ecologică pe care germenii nou veniţi

tind să o ocupe. Flora comensală este un ecosistem cu rol în apărarea împotriva invaziei

microorganismelor  patogene. Mecanismele competitive sunt: competiţia pentru aceleaşi

substanțe nutritive, competiţia pentru aceiasi receptori. Secretă şi bacteriocine, fiind toxice

pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeaşi specie, acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi

toxici.

9.3.2. barierele de organ

- Bariera hematoencefalică: este o barieră fiziologică între sistemul sangvin și sistemul

nervos central (SNC). Aceasta servește la menținerea unei homeostazii constante în SNC.

Această barieră are rolul de filtru, împiedicând pătrunderea în creier a unor substanțe

toxice, germeni patogeni, care se pot afla în sânge. În același timp bariera permite

pătrunderea din sânge a substanțelor nutritive necesare SNC.

130

Page 131: Micro Biologie

- Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieţui filtrării în tractul respirator

superior şi traheobronșic. Fluxul turbulent determină depunerea particulelor de dimensiuni

mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le îndepartează din

plămani. Efortul de tuse ajută la eliminare. Secreţiile bronşice conţin substanţe precum:

lizozim, β-defensine, lectine. Când particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor

îndepărtarea este realizată de macrofage şi histiocite. Toate aceste mecanisme de apărare

pot fi învinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere îndelungată.

Poluarea aerului, prezenţa traheostomei, agenţii ”alergici”, defectele genetice etc. pot

diminua mecanismele de apărare ale tractului respirator.

- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentată de aciditatea gastrică şi rolul

antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul şi

descuamarea celulelor epiteliale au şi ele rol în apărarea antimicrobiană.Salmonella

spp. şi M. tuberculosis produc infecţii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul încetinit

favorizează infecţia cuShigella spp. Pierderea joncţiunilor strânse dintre enterocite poate

favoriza translocarea bacteriilor în circulaţie.

- Tractul genitourinar: urina este în mod normal sterilă. Factorii care împiedică

colonizarea bacterienă sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall

(produsă de rinichi şi excretată în cantitate mare în urină). Glicoproteina Tamm-Horsfall

acţionează ca un burete, bacteriile leagându-se de aceasta şi astfel împiedicând

colonizarea ţesuturilor. Tractul urinar inferior este spălat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi,

eliminând organismele patogene. Retenţia urinară este una dintre principalele cauze ale

infecţiilor urinare.

9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10

9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de înglobare şi distrugere a

microorganismelor de către celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se găsesc

în toate ţesuturile corpului, iar celulele PMN şi monocitele circulă prin sânge şi sistemul

limfatic. Chemokinele au rol în iniţierea migrării celulelor fagocitare spre ţesuturi, având rol

în inflamaţie.

Când o bacterie este internalizată într-un fagozom, este distrusă de radicalii de oxigen,

şi de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cuplează cu

moleculele complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor

T, determinând multiplicarea acestora şi activarea răspunsului imun celular şi umoral.

Fagocitoza este mai eficientă în spaţiile intratisulare înguste (alveolele pulmonare),

decât la nivelul suprafeţelor întinse (sinovială) sau în sânge. Opsonizarea favorizează

fagocitoza.

9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement)

9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi)

- interferonii (alfa, beta, gamma);

- interleukinele;

- colony-stimulating factor (CSF);

- citolizinele-factorul de necroză al tumorilor (TNF) alfa şi beta;

- poliperforinele;

131

Page 132: Micro Biologie

- factorii de creştere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa şi beta;

- factorii supresori şi inhibitori ai multiplicării.

9.3.7. sistemul imun (umoral şi celular);

9.3.8. alţi factori:

- complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12

- imunitatea de specie (naturală, înnăscută);

- factorii nutriţionali (vitamine, fier, zinc etc): Scăderea fierului seric poate fi rezultatul

răspunsului inflamator. Bacteriile necesită fier pentru creștere. Transferina are rol în

legarea fierului şi transportarea sa în macrofage, scăzând astfel, cantitatea de fier pe care o

pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade în timpul inflamaţiei. Acesta grăbeşte vindecarea

rănilor, are rol în sinteza proteică şi creşte responsivitatea limfocitelor. Persoanele

malnutrite sunt predispuse la infecţii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct

de vedere) sunt vitaminele A şi D. Anecdotic, anterior descoperirii ”tuberculostaticelor”,

tuberculoza se trata prin dietă; pacientul consuma până la 30 de ouă zilnic.

- factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul

proteic produce aminoacizi care ulterior vor fi folosiţi la sinteza celulelor de apărare şi a

proteinelor. Estrogenii au rol în protecţie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T

este   inhibată în timpul sarcinii, astfel pot apărea infecţii severe cauzate de virusul

poliomielitei, streptococii β hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales până în trimestrul

al III-lea de sarcină.

- factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea şi morbiditatea legate de infecţie sunt

influenţate de bagajul genetic. Cauzele pentru această susceptibilitate crescută sunt

polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor,

chemokinelor sau ale receptorilor acestora.

- stresul: Stresul creşte susceptibilitatea organismului la infecţii.

- sistemul nervos central.

9. 4. Povestiri adevărate9. 4. 1. LPZ și CID

Coagulare intravasculară diseminată în cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un

prematur cu nutriţie parenterală totală (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-

negativi)

În primăvara anului 2007, într-o maternitate din Bucureşti s-a născut pe cale naturală

un prematur cu vârsta de gestaţie de 30 săptămâni şi greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar

7 (la 5 minute de la naştere). Mama copilului a prezentat în cursul sarcinii infecţii urinare

recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore înainte de naştere a avut loc ruperea

prematură a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implică riscul

producerii de infecţii).

Prematurul a prezentat de la naştere o detresă respiratorie, pentru care a necesitat

ventilaţie cu presiune pozitivă continuă şi nutriţie parenterală totală (având, în plus,

intoleranţă digestivă). Nutriţia parenterală continuă a presupus cateterizarea venoasă

132

Page 133: Micro Biologie

centrală a copilului. Întrucât această cateterizare, asociată cu ventilaţia asistată cresc riscul

infecţios al nou-născutului, s-a instituit antibioterapia empirică de protecţie cu ampicilină şi

gentamicină.

Evoluţia copilului a fost iniţial favorabilă timp de o săptămână, pentru ca ulterior acesta

să dezvolte o patologie digestivă manifestată prin abdomen meteorizat (mărit de volum),

vărsături bilioase şi scaune sanguinolente, asociate cu febră (39°C).

S-a pus diagnosticul clinic şi radiologic de enterocolită ulceronecrotică (necroză

intestinală de etiologie incertă) şi sepsis neonatal.

Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens

pozitive. Culturile din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli.

Hemocultura a fost negativă, ceea ce nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul

a primit tratament cu antibiotice anterior recoltării probelor.

Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID

(coagulare intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie

pulmonară, trombocitopenie, timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină

crescute, hipofibrinogenemie, prezenţa în cantitate mare a produşilor de degradare ai

fibrinei). S-a instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină (la care E. coli se

dovedise a fi sensibil), cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar. Starea

copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat,

ca ultimă alternativă, o transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în

sistem IPPV – Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluţia copilului a fost în

continuare nefavorabilă, hemoragia pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în final

la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare.

Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID.

Discuţii

Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut fi precizată cu certitudine (medicii au suspicionat,

totuşi, ca sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei).

Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit

factori de risc major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal

a favorizat diseminarea pe cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat

sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID.

Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de

gravitate care a condus în final la decesul copilului.

9. 4. 2. Infecțiile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la

pacienții transplantați renal

Tânăr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune și diabet zaharat tip 1, transplantat

renal în urmă cu 28 luni se internează pentru febră, durere în flancul stâng, și o scădere în

greutate de peste 10 kg în ultima lună. De aproximativ 6 luni pacientul acuză dureri

intermitente în flancul stâng. În ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de

furunculoză și celulită fesieră. Culturile efectuate evidențiază un Stafilococ auriu meticilino-

rezistent, cu următoarele rezultate la antibigramă: rezistent la oxacilină, eritromicină, dar

sensibil la vancomicină, biseptol, tetraciclină, rifampicină, linezolid. Leziunile au fost

133

Page 134: Micro Biologie

incizate și drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol și a

efectuat decolonizarea nazală cu mupirocin. (4)

În cursul anamnezei, pacientul relatează raporturi sexuale cu persoane de același sex și

i se efectuează serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuată

fără complicații cu tacrolimus, micofenolat mofetil și prednison.

La examenul obiectiv: temperatura 36,9˚C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvența

respiratorie 19/min.

Analizele de laborator evidențiază o leucocitoză (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de

107 mm/h, Proteina C reactivă 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.

Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe

8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului

vertebral L5 și a procesului stâng transvers.

Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent.

Culturile în anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.

A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de

tratament cu linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit

apoi Biseptol încă 8 săptămâni.

După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă

0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au înregistrat recăderi.

În afară de identificare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru

evidențierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea

genică responsabilă de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)

Discuţii: Infecțiile reprezintă complicațiile cele mai frecvente la pacienții transplantați.

Infecțiile cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecții intraspitalicești și

au devenit o problemă de sănătate publică. (6)

Un alt factor de risc important pentru infecția cu Stafilococ este și diabetul zaharat.

Leucocidina Panton–Valentine este un factor solubil, care permit multiplicarea şi

invazivitatea stafilococului. Determină liza polimorfonuclearelor și monocitelor. Este

considerată un factor de virulență, care determină creșterea severității bolii atât în

afecțiunile cutanate, cât și în osteomielită sau pneumonii necrotizante.

9. 5. Evaluarea cunoștințelor1. Prionii sunt constituiţi din:

A. ADN-înveliş proteic                                                                                                 

B. ARN-înveliş proteic

C. o particulă proteică

D. miez glucidic + înveliş proteic

 

2.      Lactoferina are capacitatea de legare a:

A.    fierului

B.     zincului

134

Page 135: Micro Biologie

C.     cuprului

D.    magneziului

 

3.   Biofilmul:

A.  reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii

B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele

C. se poate dezvolta pe un cord transplantat

D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină

E.   cuprinde bacterii și polimeri extracelulari 

 

4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor:

A. coagulaza, glicocalixul, capsula

B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi

C. leucocidina, catalaza, hemolizine

D. antigenul K, pilii, capsula

 

5. Una dintre următoarele reprezintă o substanţă ce modifică răspunsul imun:

A. neuramidaza

B. Ig A proteaza

C. pilii

D. “noroiul”

Noţiuni de imunologieImunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al

Microbiologiei, studiind mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de

agresiunea din cursul procesului infecţios.

În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii.

În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi,

Lucanus a considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”.

Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele

care mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că

pustulele care apăreau pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care

mulgeau se asemănau, au dus la concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În

1796, Jenner a realizat una dintre primele experienţe pe om (a inoculat secreţie din

pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreţie de la pacienţi cu variolă, iar

copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă). Cu toate acestea, reacţiile în „mass-media”

vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile din poza de la RM

Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur

şi Metchnikoff. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi

împotriva antraxului şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să

denumească procedeul de inoculare cu germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de

135

Page 136: Micro Biologie

boală, vaccinare(probabil pentru că Jenner a obţinut primele sale rezultate recoltând şi

inoculând produsul obţinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von

Behring şi S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior au

realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început

să se discute în 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste

studii şi multe altele, care ar merita dedicarea unui volum întreg, mult amplificate în

deceniile care au urmat sunt mai departe „în continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri

chiar şi în prezent.

Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc)

ar putea fi asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme

de control, sisteme de comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care

există implicare importantă şi din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în

exemplul privind situaţia la nivelul unei ţări, „soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT

citotoxice, celulele NK) pot avea atât o activitate efectoare cât şi de control şi retro-control

(îşi „depăşesc” limitele de „simpli soldaţi”).

S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?

Să nu uităm faptul că în fiecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile

microorganisme: bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în

nici un mod, altele au efecte benefice faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte

dintre microorganisme pot duce la apariţia unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun

„a fost nevoit” să găsească modalităţi prin care să „lupte” împotriva microorganismelor

patogene şi condiţionat patogene.

Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri

proprii modificate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care

în mod normal protejează organismul de eventualele infecţii pot fi implicate în

determinarea unor leziuni tisulare sau de organ.

Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu

mult mai complexă), o definiţie a imunităţii ar putea fi următoarea: imunitatea

reprezintă o reacţie faţă de orice structură non-self (fie microorganism sau o

substanţă străină de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o

celulă sau structură proprie care a suferit modificări.

Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi

discipline. Având drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit

să le introducem în „Manualul de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în

revistă” a organelor, celulelor, moleculelor şi mecanismelor implicate în imunitate.

Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate definiţiile şi explicaţiile; pentru aceasta

cititorul va trebui să parcurgă fiecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar

scop didactic; în realitate fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât

pot fi explicate într-un „simplu manual” sau chiar şi decât ar putea fi acestea explicate de

oamenii de stiinţă, în acest moment. Ceea ce noi cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-

un ocean”.

136

Page 137: Micro Biologie

Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în

cazul în care acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele,

mucoase etc) şi să pătrundă în ”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de

imunitatea înnăscută.

Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de

orice fel (recunoaşterea nu este specifică) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi

răspunsul inflamator.

Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor.

Aceasta din urmă este specifică deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule

specifice pentru a „lupta” strict împotriva acestui antigen.

O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată de

capacitatea limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un

anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu

acelaşi antigen, limfocitele îl vor recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult

mai rapid.

Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor fi

furnizate în capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul

pătruns în organism este captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC)

(macrofage, celule dendritice, limfocite B etc).

Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o

anumită parte a lui numită epitopprezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare

maximă şi poate declanşa un răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC,

prelucrat în lizozomi iar epitopii rezultaţi vor fi prezentaţi limfocitelor în complex cu

moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente

pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un răspuns

imun.

Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după

cum există două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine

care pot activa oricare din cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după

proliferare şi blastizare) secretă imunoglobuline (anticorpi) implicate în răspunsul imun

umoral.

Antigenele pot fi clasificate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/

timoindependente etc.

Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi

independente prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene

endogene timodependente prezentate pe MHC I.

În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară

răspunsul imun? O parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum

măduva osoasă hematogenă (sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B)

şi timusul (sediul maturării limfocitelor T) şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a

splinei unde se desfăşoară răspunsul imun umoral şi este iniţiat cel celular care se

desfăşoară apoi la locul infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10).

137

Page 138: Micro Biologie

Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine

balanţa între un răspuns imun eficace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui

RI exagerat). Când această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de

hipersensibilitate.

Povestire adevărată: Povestea vaccinului

Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de

mic el a fost interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele sunt

protejate de variolă, zvon pe care l-a auzit şi el.

La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit

chirurg din Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat

o prietenie adevărată. Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge

uman. A câştigat experienţă în biologie şi bineînţeles, în chirurgie.

De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola.

Punând lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar

putea avea o oarecare legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o

tânără lăptăreasă, Sarah Nelms, care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe

mâini şi braţe. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la băiatul unui

servitor în vârstă de 8 ani, James Phipps. Ulterior, băiatul a prezentat febră şi discomfort în

zona axilară. La 9 zile a prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut apetitul dar ziua

următoare era iar bine. În iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu

material dintr-o leziune nou apărută de variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că

Jenner a concluzionat că acesta era protejat complet.

În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind

experimentul şi observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai

experimentat pe câţiva oameni, Jenner a publicat o mică carte numită “O incursiune în

cauzele şi efectele vaccinului antivariolic, o boală descoperită în unele din ţările vestice ale

Angliei, mai ales înGloucestershire şi cunoscută sub numele de variola vacilor”.

Cuvântul latin pentru vacă este “vacca” iar pentru variola vacilor este “vaccinia”. Jenner

a decis să denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei

părţi. În prima parte Jenner prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor

transmisă la vaci. Teoria a fost infirmată în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza

că infecţia cu variola vacilor protejează de infecţia cu variolă umană. În cea de-a doua parte

sunt continuate observaţiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a

fost o discuţie lungă, în parte polemică, legată de descoperirile şi problemele variate legate

de variolă. Reacţiile la această publicaţie au fost din cele mai diverse.

Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu

găsise nici măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor

care prezintă rezistenţă la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul

acestui studiu i-a confirmat teoria. În ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea

vaccinării s-a răspândit rapid în întreaga Anglie şi până în 1800 a atins majoritatea ţărilor

Europene (Jenner a vaccinat în 1801 populaţia din Cluj şi Târgu Mureş, apoi această

procedură s-a extins în întreaga ţară în următorii 31 de ani (1).

138

Page 139: Micro Biologie

Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut

intenţia să se îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000

pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a

fost şi subiectul ridiculei şi atacurilor, nu doar al onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-

a continuat activităţile în slujba vaccinării.

Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifică de control a bolilor infecţioase

prin folosirea deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar

a fost primul care a oferit un status ştiinţific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care

a vaccinat primul împotriva variolei.

La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată

viaţa şi de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere,

dar epidemiile arătau că boala încă nu era ţinută sub control. În 1950 s-au implemantat mai

multe măsuri de control şi variola a fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America

de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci când

Adunarea Mondială a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de consecinţele

catastrofale ale variolei în 63 de ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de

Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai

1980 Adunarea Mondială a Sănătăţii a anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat

ca toate ţările să înceteze vaccinarea. (2)

Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă

introducem puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul

benefic pe care l-a avut această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea

rămâne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficienţă. Pe această cale

dorim să sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii acestei cărţi în ceea ce priveşte

vaccinarea şi să infirmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să circule în ultimul

timp.

10. Organele cu rol în imunitate10. 1. Organele suşă (stem)

10. 1. 1. Sistemul hematopoietic şi celulele stem

Sistemul hematopoietic cuprinde organele stem cu funcţie dublă, hematologică şi

imunologică. Celula multipotentă, primordială („suşă”, „stem”, „matcă”) se formează iniţial

la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din ficatul embrionului.

Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice (vezi şi 11.1.). Din celulele

stem multipotente rezultă celulele liniei limfocitare (din care iau naştere limfocitele B şi T)

şi celulele liniei mieloide (precursoare pentru liniile eritrocitară, megakariocitară, monocito-

macrofagică şi granulocitară).

10. 1. 2. Mezodermul embrionar şi ficatul fetal

Organele care conţin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieţii

embrionare şi fetale, într-o anumită succesiune. În primele săptămâni de viaţă, ele sunt

139

Page 140: Micro Biologie

situate în mezodermul intra-embrionar şi extra-embrionar (sacul vitelin). La făt, celulele

stem migrează şi se localizează la nivel hepatic. În cea de-a zecea săptămână de viaţă

intrauterină, apar primele celule stem în os. după cea de-a 20-a săptămână, la fătul uman,

hematopoieza devine exclusiv medulară.

10. 1. 3. Măduva osoasă

Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odată cu vârsta: la copil, toate oasele au

funcţie hematopoietică; la adult, teritoriul hematopoietic se restrânge la oasele trunchiului

şi bazinului, atingând un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele

vârstnice, funcţia hematopoietică se menţine la nivelul sternului, vertebrelor şi al oaselor

coxale.

10. 2. Organele limfoide primareorganele limfoide primare, numite şi centrale, sunt situate în afara căilor de acces şi

circulaţie antigenică. În aceste organe diferenţierea apare precoce, în viaţa embrionară,

înaintea celor secundare. Proliferarea limfocitară este intensă şi independentă de

stimularea antigenică.

Organele limfoide primare au următoarele roluri:

·       permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) şi B (dependente de măduva

roşie hematogenă / bone marrow - la mamifere).

·       găzduiesc primele stadii de diferenţiere, până la limfocitele T sau B mature, apte

să recunoască structurile antigenice şi să fie stimulate de antigene.

·       efectorii imuni „învaţă” la acest nivel să recunoască şi să tolereze constituenţii

propriului organism (auto-recunoaştere şi toleranţă faţă de „self”).

Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă,

nu mai revine niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a

limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare.

10. 2. 1. Timusul

Timusul se formează în perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial.

 Încă din stadiul de dezvoltare fetală, timusul este prezent în cavitatea toracică, fiind

dispus retrosternal, ca un organ bine diferenţiat, deja funcţional. Agenezia acestei regiuni

duce la apariţia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenitală timică

sau boala „pipernicirii”), caracterizat prin tulburări ale imunităţii celulare şi implicit prin

susceptibilitate crescută la infecţii (respiratorii, digestive şi cutanate, produse în special de

fungi şi virusuri şi mai rar de către bacterii), tetanie neonatală (datorată absenţei

paratiroidelor) şi malformaţii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot,

micrognatism, atrezie de esofag etc).

Timusul este un organ situat în mediastinul anterior şi superior, retrosternal, format din

doi lobi uniţi printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentaţi de

septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la

exterior) şi medulară (la interior). Iniţial se dezvoltă zona corticală.

140

Page 141: Micro Biologie

Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la

pubertate - dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie

lentă, fără să dispară total).

În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus

de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele

mici, denumite şi timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor

epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structurează în noduli limfatici.

În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii  lui

Hassal (formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, fiind mereu înlocuite cu alte celule

similare), caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi

ca dimensiuni, probabil datorită contactului cu microorganismele din flora normală, dar şi

contaminării cu alte microorganisme. Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage

şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate decât cele din zona corticală. La

acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor.

Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată

eliberate în circulaţie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut

structurile non-self şi prin selecţie negativă celulele care ar fi dat reacţii autoimune.

Populaţia limfocitară aflată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la

acţiunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele

cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are

loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea

supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară

sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din zona corticală. (Figura nr. 1)

Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă:

·       rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T

mature, cu achiziţia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare şi

diferenţiere are loc, în principal, în regiunea corticală. Celulele achiziţionează progresiv

markeri ai limfocitului T adult: molecule CD2, CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă

selecţie, pozitivă şi negativă. Înselecţia pozitivă, timocitele care recunosc antigenele

străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC

clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), în timp ce acele limfocite care

nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele

care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic

autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere.

În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are

loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune (experienţele

realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase a dus,

pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule

timice). (Figura nr. 2)

·       rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina,

timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii

dintre ei influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele

141

Page 142: Micro Biologie

limfoide periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii

despre factorii timici:

Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi

crescând sinteza de IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH.

Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării

protimocitelor în MOH.

Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral).

Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T.

10. 2. 2. Măduva osoasă hematogenă la mamifere

La mamifere, se menţine divizarea funcţională în limfocite T şi B, dar nu există bursa lui

Fabritzius. Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă

hematogenă (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât

de măduva din oasele late cât şi din oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor

lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se fibrozează, iar măduva activă

rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar

selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirmă existenţa unei autonomii a

acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea

umorală, ducând la dispariţia perturbărilor.

Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:

1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi

primele stadii ale seriei T şi B;

2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să

colonizeze organele limfoide secundare.

La nivelul măduvei există mai multe tipuri de celule: celule „cap de serie” şi celule

tinere care derivă din acestea, celule din seria granulocitară, celule din seria

megakariocitară, celule din seria eritrocitară, celule din seria monocito-macrofagică,

celulele din seria limfoidă (dar nu există LT, ci doar protimocite, limfocite T nediferenţiate).

10. 3. Organele limfoide secundare

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite şi periferice sau efectoare, este

tardivă faţă de cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după

stimularea antigenică. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii

limfatici, splina şi organele limfoide ataşate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plăci

Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantonează limfocitele T provenite din timus şi

limfocitele B provenite din măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului

circulator. În organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului

cu antigenele.

În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici

sau din splină, se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite

foliculi sau noduli limfatici. Înaintea stimulării antigenice, aceşti foliculi primari sunt în 142

Page 143: Micro Biologie

repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinând un aspect dens,

caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite „naive”, deoarece nu au avut contact

cu antigenul. După circa 3-6 zile de la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă

în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În

jurul foliculului există o zonă marginală puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu

memorie. Foliculul secundar persistă câteva săptămâni după care redevine folicul primar.

Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe:

10. 3. 1. Ganglionii limfatici

Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la

„intersecţiile” traseelor limfatice. Au următoarele roluri:

·         colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice

aferente (libere sau captate de macrofage şi/sau de celulele dendritice);

·         induc un răspuns imun faţă de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală

(dând naştere la limfocite T specifice) sau faţă de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici

cu limfocite B active, maturate în măduva osoasă hematogenăşi

·         stochează informaţiile imune datorită limfocitelor cu memorie dar au rol şi în

diseminarea răspunsului imun prin circulaţia limfocitelor pe calea traseelor limfatice

eferente, către torentul circulator şi ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice,

digestive sau respiratorii.

În secţiune anatomo-patologică transversală remarcăm la exterior o zonă

corticală (cuprinde în special limfocite B, „instruite” la nivel medular, aglomerate sub

formă de noduli limfatici. În mijlocul nodulilor se află centrii germinativi. Foliculii cresc mult

în dimensiuni după infecţie, iar ganglionii limfatici devin palpabili şi dureroşi.

Sub zona corticală se află zona paracorticală (cuprinde în special limfocite T). În

mijloc se află zona medulară, în care se găsesc atât limfocite B cât şi limfocite T. În

ganglionii limfatici se mai găsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2)

10. 3. 2. Splina

Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii:

·         joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele

antigen-anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex.

cu Plasmodium spp., Babesia microti);

·         are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab

opsonizate precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.);

·         eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;

·         reglarea volumului sângelui etc.

Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite

corpusculii Malpighi (foliculi splenici).

Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea

hematiilor şi pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este

organizată sub forma unor grupări de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a

arteriolelor (manşoane de limfocite T - teaca limfatică periarterială), iar spre periferia

143

Page 144: Micro Biologie

acestora se găsesc cordoane de limfocite B (zona marginală). Se consideră că zona bogată

în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp ce zona cu limfocite B este

zona medulo-dependentă.

Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic

iar ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste

artere se nasc ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase

care asigură irigaţia foliculilor limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu

sinusurile venoase ale pulpei roşii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele

postcapilare situate în zona sinusului marginal. (Figura nr. 3)

la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După

24 de ore, antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona

timo-dependentă.

La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de

anticorpi (în special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator).

După sinteză, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot

organismul. Splina reprezintă un organ în care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi

diferenţierea spre LB cu memorie în cadrul RI primar.

Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din

clivarea enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la

rândul ei are rol în creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism).

Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave,

inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează

eritrocitele. Este necesară aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând

vaccinarea şi uneori profilaxia cu antibiotice şi chimioterapice.

10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated

lymphoid tissue)

Căile respiratorii, tractul digestiv şi cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea

lor de ţesut limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B şi plasmocite care secretă sIgA.

Datorită particularităţilor funcţionale, MALT se subdivide în:

·      Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue)

reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringiană, linguale) şi

structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregaţi şi ţesut limfoid

difuz în strânsă asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la

fel ca şi splina. Amigdalele au un rol protector important în regiunea esofagiană, faringiană

şi a arborelui traheobronşic, constituind un prim obstacol împotriva infecţiilor. Cu toate că

după amigdalectomie nu rezultă infecţii severe, decizia privind această operaţie trebuie

luată numai după o analiză critică, punând în balanţă atât beneficiile cât şi posibilele urmări

negative. Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele şi

frecventele infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate;

·       Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue)

cuprinde plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele

intra-epiteliale şi limfocitele sub-epiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule

144

Page 145: Micro Biologie

limfoide (la nivelul jejunului, duodenului şi ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi

se pot uni în adevărate „cordoane” limfoide. Nu au vase limfatice proprii;

·       Sistemul imunitar asociat arborelui bronşic (BALT - bronchus associated lymphoid

tissue);

·       Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului;

·       Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid

tissue).

Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de

infecţiile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi

primit în timpul alăptării, asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de

patogeni, în primele luni de viaţă.

În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este

controlată de citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors)

(citokine implicate în reacţii inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea

normală a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceşti mediatori, acest

lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune în

evidenţă care este rolul lor.

Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T

prezintă receptori. Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în

zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care

receptorii CCR7 au fost distruşi s-a observat absenţa marcată a zonelor timodependente şi

un răspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina

MIP-3β şi pentru că sunt prezente în zonele timodependente, atrag acolo limfocite T

mature. Receptorul CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor B, lucru

care explică migrarea acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.

10. 4. Povestire adevăratăApendicele vermiform, o prelungire a cecumului, reprezintă un organ ce aparţine GALT

(Gut Associated Lymphoid Tissue). Rolul GALT este de a interveni în apărarea mucoasei

tractului digestiv, având în alcătuire ţesut limfoid abundent organizat în structuri

specializate (amigdale, apendice, plăci Peyer) sau distribuit difuz în submucoasa peretelui

tubului digestiv.

La scurt timp după naştere, apendicele, fiind un segment al intestinului gros, devine

colonizat de flora enterică ce populează cecumul şi colonul. Este presupusă ideea că un

contact îndelungat al ţesutului limfoid din componenţa apendicelui cu flora comensală a

intestinului, contribuie la menţinerea toleranţei imune faţă de populaţiile bacteriene.

Aşadar, funcţia apendicelui diferă de cea a plăcilor Peyer sau a amigdalelor prin faptul că

nu apără organismul de microorganisme potenţiat patogene nou-pătrunse în organism, ci

favorizează desfăşurarea relaţiei simbiotice între gazdă şi germenii saprofiţi.

145

Page 146: Micro Biologie

Inflamarea apendicelui (apendicită) este o afecţiune frecvent întâlnită în secţiile de

chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedură de rutină, având puţine riscuri (în

general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afirmă că apendicectomia

(desfăşurată în cazul unei apendicite acute şi nu atunci când nu există de fapt această

afecţiune) are efecte benefice în scăderea incidenţei dezvoltării colitei ulcerative. S-a

constatat că la pacienţii suferinzi de apendicită la vârste tinere care au fost supuşi

operaţiei, a scăzut riscul de apariţie a colitei ulcerative cu până la două treimi. Se pare că

efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine în urma procedurii

chirurgicale. Însă apendicectomia nu reprezintă o soluţie în cazul celor la care boala s-a

instalat deja.

Colita ulcerativă este o boală inflamatorie a intestinului caracterizată prin apariţia

ulceraţiilor în peretele colonului, diaree cu sânge şi crampe abdominale. Cauzele instalării

bolii sunt multiple, de natură genetică, cauză autoimună, alimentaţie necorespunzătoare.

Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera în cancer de colon sau cancer rectal.

Chiar dacă apendicectomiile au devenit „floare la ureche” pentru mulţi medici chirurgi

iar pacienţii nu se tem de o operaţie „uşoară”, este de reţinut faptul că diagnosticul trebuie

instaurat corect de către medic care adesea uită că durerea la nivelul zonei inghinale

drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicită şi nu se mai oboseşte să mai facă

alte teste, realizând uneori o operaţie inutilă şi netratând până la urmă suferinţa

pacientului.

10. 5. Verificaţi-vă cunoştinţeleLa întrebările următoare, alegeţi un singur răspuns corect.

1.Care este diferenţa dintre organele limfoide primare şi cele secundare?

1. localizarea lor: cele primare au localizare viscerală, cele secundare se localizează

în mucoase;

2. în organele limfoide primare nu apare răspunsul imun faţă de un antigen, pe când

în cele secundare da;

3. nu există diferenţe între cele două tipuri de organe;

4. organele limfoide secundare sunt sediul formării şi diferenţierii limfocitelor, iar

organele limfoide primare sunt destinaţiile la care ajung limfocitele mature.

 

2. Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în

ansamblu?

1. splina;

2. ganglionul limfatic;

3. timusul;

4. măduva osoasă hematogenă.

 

3. Ce este fenomenul de selecţie a limfocitelor?

146

Page 147: Micro Biologie

1. un mecanism prin care se generează un răspuns imun împotriva unei

substanţe non-self;

2. un proces generalizat ce are loc în toate organele limfoide, având ca rezultat

limfocite B şi T mature;

3. un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite să intre în

circulaţia sanguină (5% din limfocitele T totale);

4. totalitatea reacţiilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celulă

secretoare de anticorpi).

 

4. Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei?

1. rol în distrugerea hematiilor îmbătrânite;

2. rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar;

3. rol în apărarea mucoaselor, aparţinând MALT;

4. rol în selecţia şi maturarea limfocitelor T.

 

5. Care este afirmaţia adevărată?

1. un folicul secundar prezintă, din punct de vedere histologic, o zonă periferică şi un

centru germinativ;

2. plăcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente în timus;

3. ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaţiei sanguine;

4. în măduva osoasă hematogenă se maturează atât limfocitele T, cât şi limfocitele B.

11. Celulele imunităţii11. 1. Celula „stem”

Celula multipotentă, primordială, „suşă”, „stem”, „matcă”, se formează la circa 3

săptămâni de la nidaţia zigotului, iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul

hematopoietic din ficatul embrionului. După naştere, celula „stem” ar mai putea fi pusă în

evidenţă în măduva oaselor late şi lungi (la copii) şi în măduva oaselor late (la adulţi); un

număr foarte mic de celule „stem” mai pot fi identificate în circulaţie.

Primul derivat al celulei „stem” este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care

seamănă foarte mult cu celula „stem” dar deţine probabil un „semnal de orientare” către

măduva roşie hematogenă sau către timus. Există și un alt derivat, limfoblastul (lymphoid

progenitor).

Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice. În funcţie de gradul de

potenţialitate există celule „stem” totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M,

147

Page 148: Micro Biologie

GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de

autoîntreţinere („self-renewal”) şi generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici.

Răspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se

aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uşor de distrus de către

radiaţii dar nu şi de către chimioterapice.

Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă

speranţă: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave

(considerate astăzi ca fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nediferenţiaţi se pot

divide şi dezvolta într-o multitudine de alte tipuri de celule, putând duce la formare de

ţesuturi şi organe. Cercetătorii estimează că aceste celule ar putea fi folosite, în viitor,

pentru repararea diferitelor structuri distruse sau în suferinţă, dar chiar şi pentru „sinteza”

de organe. Totuşi, sunt încă destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate.

(Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)

11. 2. Celulele implicate în răspunsul imun

Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, în diferite măsuri, în imunitate. Aşa

cum am menţionat anterior, aceste celule acţionează ca nişte adevăraţi „soldaţi” (de ex. LT

citotoxice, celulele NK), care pot avea atât o activitatea efectoare cât şi de control şi retro-

control („depăşindu-şi condiţia” de „simpli ostaşi”).

Limfocitele T şi B suntelementele centrale alerăspunsului imun specific.

Celulele NK sunt celule fundamentale (alături de fagocite) în imunitatea înnăscută.

Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele şi

mastocitele acţionează în diferite momente ale răspunsului imun.

Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roşii participă la

eliminarea complexelor imune.

Celule pot reacţiona în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex.

granulocitele PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele

dendritice etc) sau pot participa la o reacţie specifică, condiţionată de structura moleculelor

antigenice, prin intermediul receptorilor (ex. limfocitele).

Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de

diferenţiat morfologic (în microscopia obişnuită sau chiar şi în microscopia electronică).

Pe baza caracterelor morfologice, este totuşi posibilă identificarea a două tipuri de

limfocite:

- limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numărul

total al limfocitelor); aici se încadrează majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor

dendritice şi rarelor celule stem hematopoietice aflate în circulaţie.

- limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes), reprezentând circa 5-

15% din totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigaşe în mod natural /

„natural killer”) şi limfocitele T citotoxice.

148

Page 149: Micro Biologie

Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară.

Dacă folosim culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifici [ex.

fitohemaglutinină, concavalină A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed

mitogen) etc] sau a unor antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior „în repaus”

cresc în dimensiuni, prezintă modificări la nivelul nucleului (cromatină fină, citoplasmă mai

abundentă şi mai albastră pe frotiu), fiind denumiteimunoblaste.

11. 3. Clasificarea limfocitelorClasificarea limfocitelor se realizează pe baza:

·         funcţiilor şi

·         identificării markerilor celulari.

Funcţiile limfocitelor.

S-a demonstrat că pe lângă limfocitele B, există o mare varietate funcţională de

limfocite T [ajutătoare (helper, LTh), supresoare, citotoxice sau „responsabile” de

imunitatea celulară]. Funcţionalitatea limfocitelor este dificil de studiat în practica curentă,

mai ales că o singură celulă poate avea mai multe funcţii.

Una dintre tehnicile de cercetare curentă, citometria în flux, utilizează anticorpi

monoclonali obţinuţi în urma imunizării şoarecilor cu limfocite umane normale sau

patologice. Markerii celulari sunt înregistraţi cu prefixul CD, termen derivat din „cluster of

differentiation” (clasă de diferenţiere), nomenclatură stabilită în anul 1982. De atunci au

fost identificaţi peste 300 markeri sau sub-markeri CD.

Celulele stem hematopoietice şi diferitele celule cu rol în imunitate pot fi împărţite în

grupe şi subgrupe.

Pentru activarea limfocitelor este nevoie de două semnale:

·         unul care provine de la antigen

·         altul provenit de la moleculele accesorii de pe suprafața APC (B7/CD80) pentru LT

sau de pe LTh (CD40L) pentru LB.

Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte

semnale antigenice și nici nu se activează pentru a reacționa față de primul semnal

antigenic.

Etapele activării limfocitelor:

·         sinteza de citokine dar și de receptori pentru acestea de către limfocitele naive

dar mature

·         proliferarea limfocitară (expansiunea clonală) - în unele infecții numărul LT poate

crește de 50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori

·         transformarea limfocitelor naive în limfocite efectoare cu rol în eliminarea

antigenului

·         diferențierea limfocitelor efectoare în limfocite cu memorie.

Așadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite:

·         naive – mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmează să fie

distruse în cazul în care într-o perioadă de 1-3 luni nu au contact antigenic

149

Page 150: Micro Biologie

·         efectoare

·         cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.

11. 3. 1. Limfocitele T (LT) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor)

Limfocitele T sunt majoritare în circulaţia sanguină, reprezentând circa 70% din totalul

limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) şi1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la

nivelul organelor limfoide secundare în zone speciale: zona paracorticală a ganglionilor,

manşonul limfoid în jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate în principal

în imunitatea mediată celular. Pe de o parte participă la eliminarea structurilor străine dar

şi a structurilor proprii modificate (prin îmbătrânire, în urma unei infecţii, cu multiplicare

neoplazică) iar pe de altă parte cooperează cu limfocitele B în răspunsul imun umoral. De

fapt, funcţiile exercitate de LT sunt mult mai complexe.

Cea mai importantă funcţie a limfocitelor T este inducerea unui răspuns sau a unei

reacţii imune specifice la antigene, prin recunoaşterea unor peptide antigenice fixate pe

moleculele MHC (complex major de histocompatibilitate). În acest scop pe limfocitul T

există un receptor pentru antigen (TCR), asociat întotdeauna cu un complex molecular

transductor CD 3.

Linia limfocitară T se maturează în două organe: (a) măduvă osoasă şi (b) timus.

Din celula stem hematopoietică multipotentă (CD34+, CD38-), prima diferenţiere

conduce la apariţia CFU-L (colony forming unit-lymphocyte) comună limfocitelor T şi

B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care rezultă protimocitul. Protimocitul părăseşte măduva

roşie hematogenă şi se cantonează în corticala timică.

Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiată la om, astfel încât datele se obţin prin

extrapolarea informaţiilor obţinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele şi

apoi timocitele imature se găsesc în corticala timică (subcapsular), în contact cu celulele

epiteliale şi cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate

foarte mare de multiplicare. Se deplasează prin cortex spre joncţiunea cortico-medulară şi

vin în contact cu celulele dendritice şi cu macrofagele. La acest nivel are loc o nouă

multiplicare relativ intensă. Este de remarcat faptul că în cursul acestui proces, doar 1-5%

din celulele tinere ajung limfocite T mature. Restul, de cel puţin 95% din celule, mor prin

apoptoză.

Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct)

celulă - celulă, cu o celulă prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirectă) de către

citokine: IL-1, IL-6, IFN-g şi IL-2. Limfocitul produce la rândul său atât IL-2 cât şi lanţul a al

receptorului Il-2, contribuind la activarea altor LT specifice.

LT sunt activate doar de către antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf

16.1.2.); procesul se desfășoară la distanță de locul de pătrundere al antigenului, și anume

în organele limfoide secundare unde o APC îi prezintă structurile antigenice. Consecința

activării LT este transformarea acestuia în limfoblast T.

Tipuri de limfocite T150

Page 151: Micro Biologie

Limfocitele T ajutătoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)

Limfocitul Th este un veritabil „coordonator”, orientând răspunsul imun (RI) către RI

celular sau către RI umoral. Există cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 și Th17):

-               limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influenţa unor stimuli moleculari, ex.

IL-4, IL-12, se vor transforma în limfocite Th1 sau în limfocite Th2);

-               limfocitele Th1 sintetizează limfotoxină, IL-2, IFN-γ, TNF-α și TNF-β

o   au rol foarte important în apărarea anti-virală, şi anti-neoplazică (dar și în apărarea

anti-fungică și anti-bacteriană),

o   sunt implicate mai ales în RIC,

o   stimulează switch-ul izotipic spre IgG2 și IgG3,

o   amplifică rolul citotoxic al macrofagelor și stimulează proliferarea LTc;

-               limfocitele Th2 sintetizează IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13;

o   au rol mai ales în RIU,

o   sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate,

o   stimulează proliferarea LB și secreția de anticorpi;

o   sunt stimulate de semnale venite de la bazofile și eozinofile (papaina duce la sinteza

de IL-4 de către bazofile care duce la stimularea răspunsului Th2) (1).

-               limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprimă funcția altor limfocite (CD4+,

CD8+, LB, NK); secretă Il-10 (inhibă Th1 și Th2, deci RIU și RIC) și TGF- β (inhibă răspunsul

imun); sunt CD4+ și CD25+;

-               relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se găsesc la

interfaţa dintre mediul extern şi mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul

tractului gastro-intestinal); sintetizează IL-6, IL-17 și TNF-α;

o   au rol de protecţie la nivelul acestor suprafeţe,

o   studii recente au aratat că sunt implicate în inducerea și exacerbarea autoimunității

și inflamației (datorită IL-17),

o   activează RIC (importante în RI prin recrutarea neutrofilelor și macrofagelor la locul

infecției),

o   sunt în relație cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii și mediază

toleranța imună (2),

o   secreția lor este stimulată de IL-23,

o   LTh-17 cu memorie reacționeaza față de antigenele Candida albicans (3).

Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)

Se referă în principal la LT CD8+, cu toate că această proprietate a fost observată şi la

unele LT CD4+, cu următoarele diferențe:

·         LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprimă molecule HLA

I (HLA - human leukocyte antigen system)

·         LTc CD4+ îşi limitează funcţia la celulele care exprimă molecule HLA II.

Au mai multe roluri, de ex. realizează „supravegherea imunologică” prevenind

multiplicarea anarhică a celulelor. Dacă de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea

de a le recunoaşte, de a se multiplica/activa şi de a le distruge. În această „supraveghere”,

LTc sunt ajutate de celulele NK.

151

Page 152: Micro Biologie

Distrugerea antigenelor este indusă prin două mecanisme:

·         inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al ”morții celulare”, ceea ce

duce la fragmentarea ADN-ului celulei țintă;

·         ”atacul” asupra celulei țintă prin perforine (proteine ce rup membrana

plasmatică sau lizozomală) și granzine(serin proteaze care lizează substraturi sau

activează diverse proteaze) sintetizate și eliberate de către LTc.

LTc au un rol important în apărarea împotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor

este intensificată de IFN-g.

Importanța activității litice a LTc a fost demonstrată atât experimental (pe modele

animale) cât și la pacienți care prezentau defecte ale citotoxicității. Există sindroame

genetice transmise autozomal recesiv în cadrul cărora este afectată citotoxicitatea sau

prezentând mutații la nivelul genei ce codifică informația pentru sinteza de perforine.

Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlării infecțiilor virale, mai ales cu

CMV, EBV și HSV (4).

Limfocitele T inductoare ale hipersensibilităţii întârziate

Sunt celule care secretă IL-2 şi în acelaşi timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T,

macrofage şi celulele NK.

Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)

Limfocitul T supresor este o celulă CD8+, ca şi LT citotoxic.

Limfocitele Ts au rol în reglarea răspunsului imun, menţinându-l în limite normale.

În lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhică a unei clone

de limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structură

antigenică).

În mod normal, între populaţiile de limfocite Th şi Ts există un echilibru, care se

cuantifică prin raportul Th/Ts, raport care trebuie să fie supraunitar. Exemplul cel mai

cunoscut în care valoarea raportului devine subunitară este infecţia HIV / SIDA.

O parte dintre limfocitele T nu au funcţie efectoare şi se transformă în LT cu memorie.

Limfocitele T γδ (γδ T cells)

Limfocitele T γδsunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului

inflamator și manifestă citotoxicitate față de diverse ținte.

Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fără a fi necesară

prezentarea în conjuncție cu MHC.

Reacționeaza față de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de grupările fosfat din

diverși compuși precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN și ARN). Teste efectuate pe

animale de laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania

spp., Mycobacterium spp., Plasmodium și Salmonella spp. au arătat un nivel de protecție

mediu realizat de aceste limfocite.

Se acumulează la nivelul focarului inflamator în boli cu implicare imună precum artrita

reumatoidă sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscută).

Sunt implicate atât în imunitatea înnăscută cât și în cea adaptativă, prin

·         secreția de citokine și chemokine

·          abilitatea de a ajuta LB să se transforme în limfocite cu memorie.

152

Page 153: Micro Biologie

Limfocitele T NK (NKT cells)

Limfocitele T NKintervin în RIP și produc cantități crescute de IL-4. ”Împrumută”

proprietăți atât de la LT cât și de la NK.

11. 3. 2. Limfocitele B (LB) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor)

Limfocitele B reprezintă 5% până la 15% din limfocitele din sânge (300 până la 600

elemente/mm3) şi constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni şi splină.

Rolul lor esenţial este sinteza anticorpilor, în cursul RIU specific. Au fost denumite astfel

deoarece s-a descoperit că la păsări LB se dezvolvă în bursa lui Fabricius. La om LB se

dezvoltă în măduva osoasă hematogenă (bone marrow).

Limfocitele B provin (la om şi la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+,

CD38-). Toată linia limfocitară B (celule imature sau mature) are markeri specifici de

suprafaţă CD19 şi CD20, utilizaţi pentru identificarea celulelor B (ex. în citometria în flux);

identificarea prin aceeaşi metodă a markerului CD10 permite încadrarea în stadiul de

limfocit matur.

Limfocitul B părăseşte măduva osoasă şi trece în „zonele B” din organele limfoide

secundare (ganglioni limfatici, splină etc). LB „naiv” (virgin) este pregătit pentru a răspunde

stimulului antigenic, deşi se găseşte în stare de repaus, în aşteptarea primei stimulări

antigenice. În acest stadiu, LB are următoarele caracteristici:

·       exprimă la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM şi IgD;

·       exprimă receptori pentru interleukinele IL-1 şi IL-4;

·       exprimă receptori pentru complement CR1 (CD35) şi CR2 (CD21). Ultimul

recunoaşte fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului.

Acesta contribuie la activarea limfocitului B.

·       exprimă receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru

transformarea limfoblastică a limfocitelor B, dar şi receptori pentru endotoxine bacteriene

(LPZ).

Transformarea unui LB naiv într-un LB activ şi apoi în plasmocit necesită intervenţia

succesivă a citokinelor (ca într-o „cascadă”).

Activarea are loc datorită recunoaşterii antigenice dar şi datorită secreţiei de IL-1 de

către celula prezentatoare de antigen (APC) şi respectiv secreţiei de IL-4 de către Th2.

Limfocitul B activ exprimă receptori pentru alte interleukine, în special IL-5 şi IL-6 şi

lanţul a al IL-2. LB se va divide şi va da naştere la numeroase celule identice în foliculul

limfoid secundar.

Limfocitul B se diferenţiază progresiv într-un limfoblast sau imunoblast care secretă

IgM. Sub acţiunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipică (isotypic switch) de la IgM

la IgG, IgA sau IgE; în urma acestei comutări plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De

153

Page 154: Micro Biologie

exemplu, sub acţiunea IL-4 are loc comutarea izotipică a IgM în IgG sau IgE iar sub acţiunea

IL-5 în IgA.

Există şi limfocite B active care nu se transformă în plasmocite ci persistă sub formă

de limfocite B cu memorie, cu o durată de viaţă lungă (asigurând spre exemplu protecţia

faţă de o nouă îmbolnăvire, de ex. după scarlatină/infecție cu streptococul piogen de grup

A, lizogenizat).

Limfocitul B are următoarele funcţii: 1. Prezentarea antigenelor către LT; 2. Sinteza

imunoglobulinelor (anticorpilor). În cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de

la răspunsul primar cu secreţie predominentă de IgM, la un răspuns secundar cu

predominenţa IgG sau mai rar a IgA sau IgE. În cazul antigenelor timo-independente, se

menţine sinteza anticorpilor din clasa IgM.

Limfoblastul (lymphoid progenitor) dă naștere la trei linii celulare (LT, LB și NK). Există o

genă (Pax5) care este esențială pentru maturarea LB (5).

11. 3. 3. Celulele NK (Natural killer cells)

Numele de celule NK a fost dat acestei populaţii celulare datorită puterii lor citotoxice

spontane, fără a avea nevoie de un stimul imun sau de prezenţa MHC (complexul major de

histocompatibilitate). Numite iniţial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule

nule (pentru că pe suprafaţa lor nu fuseseră, încă, puşi în evidenţă receptori), în final au

fost numite celule NK („ucigaşe în mod nativ”, „natural killer”).Fac parte dintre limfocitele

mari cu granulaţii (large granular lymphocytes).

Se găsesc în măduva osoasă hematogenă, splină și în sângele periferic.

Celulele NK reprezintă o linie primordială de apărare a organismului (imunitatea

înnăscută), pe care îl ajută să elimine celulele modificate datorită unor infecţii, sau celulele

modificate neoplazic, în special în neoplazii hematologice (ex. leucemie).

Spre deosebire de limfocitele Tc

·         celulele NK nu au TCR (au însă, de ex., receptori pentru molecule de IgG),

·         în cazul celulelor NK nu există răspuns imun secundar (de memorie).

11. 4. Celulele prezentatoare de antigen (antigen presenting cells)

Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI

specific, este asigurată de două categorii de celule prezentatoare de antigen (APC):

- celulele profesionale / specializate

·         celulele dendritice,

·         monocitele / macrofagele și

154

Page 155: Micro Biologie

·         limfocitele B;

- celulele ocazionale (îndeplinesc funcţia doar în anumite condiţii de activare celulară)

·         neutrofilele,

·         celulele endoteliale şi

·         celulele epiteliale.

Celulele prezentatoare de antigen (APC) au următoarele funcții (Figura nr. 3):

·         recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endocitează și

prelucrează,

·         transportă antigenele native de la țesuturi la organele limfoide secundare,

·         prezintă antigenele native LT urmând selecția clonei de limfocite specifice acelui

antigen,

·         activează fie LTc fie LTh.

Celulele dendritice se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând

sângele și organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se

extinde și în spațiile dintre celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice

microorganism aflat în acea zonă. Celulele dendritice posedă două sisteme de

supraveghere imunologică:

·         macropinocitoză (în fiecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă

pasiv apariția antigenului care să le stimuleze),

·         au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de

particule.

Sunt clasificate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în

trei mari clase și şase tipuri:

a). Celule dendritice tisulare

·         celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între

derm și epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale),

·         celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor;

b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare)

·         celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide

secundare,

·         celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare;

c). Celule dendritice circulatorii

·         celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, aflate în tranzit,

·         celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, aflate în tranzit.

Toate celulele dendritice au origine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară -

CDS (o parte dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu).

Pot să îndeplinească funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi

sintetizează molecule MHC II (cu excepţia CDF).

Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă

și se transformă în CDS. De aici pot urma două căi:

·         în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi

iau calea vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide

155

Page 156: Micro Biologie

secundare unde se transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu

MHC II.

·         în interstițiu se transformă în CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (și urmează

drumul de mai sus), fie trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină

unde fie

o   ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă filtre pentru

antigenele solubile,

o   ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID.

Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în

funcție de locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale.

Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri

numeroase, lungi şi efilate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor

dendritice se găsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se

dispun în grămezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule văluroase.

Au rol important în maturizarea precursorilor LT.

Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat

cu MHC și ar putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din

organismul uman și să genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat

selecției negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.).

Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor.

Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom

primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în

peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot

„încărca” aceste peptide. Fago-lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel,

peptidul de pe MHC II se exprimă la suprafaţa externă a macrofagelor.

Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia

de APC, respectiv:

·         cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în

răspunsul inflamator,

·         celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape

1.      captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori);

2.      endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic);

3.      prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rămâne un

epitop, format dintr-o haptenă cu specificitate maximă şi o proteină „carrier”);

4.      conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată

autoîntreţinerea RI în timp);

5.      prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule

MHC. Sistemul MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul

gamma (IFN-g). După contactul cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a;

TNF-a activează RI şi procesul inflamator local.

Limfocitele B pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare

metabolică. Au capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i

156

Page 157: Micro Biologie

prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-

dependente necesită cooperarea LB-LT). Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi

FcγR şi pot sintetiza molecule MHC II.

LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afirmă faptul că LB au o

mai mare eficienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele.

LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în

măduva osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul

BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi

epitopii în complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale

către alte LB prin citokine şi molecule de suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se

transformă în limfoblaste B, apoi în plasmocite care vor secreta anticorpi.

11. 5. Sistemul mononuclear fagocitar (sistemul MM)

Monocitele / macrofagele reprezintă o linie celulară cu funcţie importantă în

imunologie, prin intervenţia lor în imunitatea naturală, în prezentarea antigenică şi în

reacţia imună specifică. Principalele funcţii ale sistemului MM sunt reprezentate de:

·         recunoaşterea structurilor străine (non-self) sau modificate,

·         fagocitarea, prelucrarea şi prezentarea acestora (în context MHC),

·         citotoxicitate, citostatism,

·         secreţie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-α) şi

·         reglarea reacţiilor în cadrul răspunsului imun.

Macrofagele, alături de celulele dendritice şi celulele epiteliale, formează sistemul

reticulo-histiocitar (SRH).

Macrofagele pot fi observate în toate ţesuturile. Se formează în măduva osoasă

hematogenă, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast şi când devin mature poartă

numele de monocite. În acest stadiu, moleculele MHC II fie nu există fie sunt slab

exprimate, ca semn al unui status funcţional redus (devin foarte bine reprezentate după

stimulare).

Monocitele circulă în sânge 6-8 ore, după care migrează în ţesuturi unde iau nume

diferite şi îndeplinesc funcţii diferite: histiocite în ţesutul conjunctiv; celule gliale (microglii)

în ţesutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer în ficat;

macrofage splenice; macrofage peritubulare în rinichi; macrofage ganglionare, în măduva

osoasă şi timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele

dendritice, care pot avea, la rândul lor, o capacitate fagocitară faţă de limfocitele în

apoptoză).

Monocitele / macrofagele prezintăreceptori pentru carbohidraţi, receptori pentru M-CSF,

receptori pentru imunoglobuline şi complement.

În cadrul procesului de recunoaştere, fagocitare şi prelucrare a structurilor străine sau a

structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile

157

Page 158: Micro Biologie

fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor

specifice, necesare stimulării răspunsului imun.

Citotoxicitatea exercitată de macrofage poate fi

·         directă (în cursul procesului de fagocitoză),

·         în urma contactului cu membrana celulei ţintă sau

·         prin citotoxicitate mediată celular, dependentă de anticorpi (ADCC) (în acest caz,

anticorpii se fixează cu capătul Fab pe epitopii celulei ţintă şi cu fragmentul Fc de

macrofag).

Macrofagul produce substanţe litice cu care perforează membrana celulei ţintă

(asemănător cu acţiunea ADCC a celulelor NK).

Macrofagele secretă un număr foarte mare de substanţe:

·         cea mai mare parte a factorilor sistemului complement,

·         enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze),

·         proteine cu rol în adeziunea celulară (ex. fibronectină),

·         factori de coagulare,

·         interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de creştere al trombocitelor/fibroblastelor,

factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc.

Etapele fagocitozei (Schema nr. 1):

1.      Migrarea macrofagelor la locul infecției,

2.      Aderarea macrofagelor la celula țintă,

3.      Ingestia celulei țintă,

4.      Formarea fagolizozomului,

5.      Inactivarea intracelulară a celulei țintă,

6.      Digestia intracelulara a celulei țintă.

Iată câteva studii interesante legate de funcţiile macrofagelor și modul în care acestea

interacționează cu diferitele microorganisme.

Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulență

ai Mycobacterium tuberculosis. S-a demonstrat că LAM este incorporat în plutele lipidice din

interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducând la

reducerea maturării fagozomilor şi protejând astfel celula fagocitată (6).

Toxina pertusis (TP) produsă de Bordetella pertussis este implicată în tusea convulsivă.

S-a studiat interrelația dintre TP și macrofagele alveolare în cursul procesului infecțios. La

un lot de șoricei s-au ”eliminat” macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea

manifestărilor procesului infecțios, cu toate că imediat s-a produs un influx de neutrofile la

locul infecției. Mai mult decât atât, lipsa macrofagelor a dus la declanșarea procesului

infecțios chiar și cu tulpini care erau deficitare în sinteza TP (7).

Endocardita poate fi cauzată de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat,

dar se pare că monocitele au un rol important. Deși celulele monucleare din sângele

periferic sintetizează titruri crescute de IL-12, monocitele tind să dispară. Acest lucru scoate

în evidență faptul că monocitele infectate streptococic se transformă în celule dendritice

secretoare de IL-12 și nu în macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la

subiecți sănătoși au fost infectate cu șase tulpini de streptococi orali. S-a observat că

158

Page 159: Micro Biologie

monocitele stimulate de aceste antigene exprimă fenotipul și funcția celulelor dendritice

(8).

Mai multe studii au arătat că M. leprae activează puține macrofage și celule dendritice.

S-a demonstrat că la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de

citokine ce inhibă monocitele. M. leprae este implicat atât într-o stimulare cât și într-o

inhibare a monocitelor (9).

11. 6. Alte celule implicate în răspunsul imun

Neutrofilele

Sunt cele mai abundente granulocite din circulația periferică.

Neutrofilele intervin în:

·         imunitatea naturală prin fagocitoză şi

·         imunitatea specifică, datorită receptorilor proprii pentru imunoglobuline şi

complement, în colaborare cu limfocitele şi alte APC.

Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecţios sunt:

·         complexele Ag-Ac,

·         subcomponenta C5a a sistemului complement,

·         derivaţii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4).

După fagocitare, PMN utilizează pentru degradarea structurilor străine diferite enzime

precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze).

Sunt generaţi şi radicali activi de oxigen.

S-a studiat relația între neutrofile și macrofage în cadrul infecției cu Mycobacterium

tuberculosis. După infectarea experimentală a cobailor, neutrofilele au fagocitat microbul și

au secretat IL-8 și TNF-α (cu rol activator asupra macrofagelor). Neutrofilele și macrofagele

au fost prelevate și cultivate împreună și separat, apoi infectate. IL-8 a fost detectată la

nivele mult crescute în culturile care conțineau atât macrofage cât și neutrofile în

comparație cu situația în care culturile conțineau separat macrofage, respectiv neutrofile.

S-au folosit mai multe tehnici de cultivare și s-a ajuns la concluzia că și TNF- α este la un

nivel mai înalt în culturile ce conțineau ambele tipuri de celule. Ulterior, cultura a fost

tratată cu anticorpi policlonali anti TNF-α iar răspunsul macrofagelor la stimularea

neutrofilelor infectate a fost complet anulat. Acest studiu demonstrează că TNF-α produs de

neutrofilele infectate ar putea fi responsabil de activarea macrofagelor alveolare (10).

Eozinofilele

Eozinofilele reprezintă în mod normal între 1% şi 3-5% din leucocitele sanguine.

Procentul eozinofilelor creşte în alergii sau în infecţiile parazitare.

Funcţia lor fagocitară, prin receptorii de IgG şi IgE şi mecanismul ADCC, este relativ

limitată. Totuşi, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor

conţin produşi toxici pentru diferiţi paraziţi.

159

Page 160: Micro Biologie

Pe de altă parte, eozinofilele produc histaminază şi arilsulfatază care inactivează

histamina şi respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceşti factori se reduce

răspunsul inflamator şi migrarea leucocitelor în focarul infecţios.

Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor în cadrul imunității înnăscute și

adaptative îndreptate împotriva infecțiilor cu paraziți. Nu a fost dovedit că eozinofilele ar

iniția răspunsul imun față de paraziți. Plecând de la ipoteza că eozinofilele ar putea fi celule

prezentatoare de antigen în infecțiile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit

parazit și s-a examinat expresia diferiților markeri de suprafață implicați în activarea

celulară. S-a remarcat o creștere de 6 ori a CD69 și MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula

costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorată

și prin cultivarea lor împreună cu LTCD4+. Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma

LT naive în LTh2 producătoare de IL-5 (11).

Bazofilele şi mastocitele

Conţin granule metacromatice şi receptori pentru IgE. Au rol în reacţia de

hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalul mediator în declanşarea HS de tip I este

histamina.

Ambele sunt implicate în apărarea anti-parazitară.

Mastocitele nu se găsesc în cantitate mare în sânge, dar sunt întâlnite la nivelul

țesuturilor conjunctive în apropierea vaselor sanguine și limfatice, aproape de sau în

interiorul nervilor și sub epiteliile organelor care vin în contact cu mediul extern (plămân,

intestin, piele).

Bazofilele se diferențiază și maturează în măduva osoasă hematogenă, apoi circulă

prin sânge. Atât bazofilele cât și mastocitele secretă citokine dar spre deosebire de

mastocite, bazofilele secretă și IL-4. A fost studiat un eventual rol în diferențierea

limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesită IL-4) (12).

A fost demonstrată prezența bazofilelor în ganglionii limfatici, în apropierea LT ca și

faptul că secreția de IL-4 poate fi declanșată de un stimul independent de IgE (13).

Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boală în care apare hiperplazia

mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, măduvei

osoase hematogene, ficatului, splinei și ganglionilor limfatici. Incidența bolii este de 3-

7/1.000.000 locuitori. Poate apărea la orice vârstă (valorile cele mai mari sunt înregistrate

în primii doi ani de viață și în decada a treia și a patra). Se datorează mutației genei ce

activează factorul de creștere pentru mastocite.

Plachetele

Plachetele au un rol accesoriu în reacţia imună. Ele conţin serotonină şi exprimă

receptori pentru IgG şi IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă şi eliberează

substanţe care cresc permeabilitatea capilară şi activează sistemul complement. Datorită Ig

fixate pe membrana lor, plachetele pot adera la paraziţi şi pot elibera radicali liberi ai

oxigenului cu efect toxic pentru aceştia.

Globulele roşii

Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la ţesuturi şi bioxidul de carbon la

plămâni, globulele roşii deţin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul

160

Page 161: Micro Biologie

complexelor imune din sânge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii

pentru complement.

11. 7. Evaluarea cunoștințelor1.       Una din următoarele afirmaţii legate de celula stem este adevărată:

     A.    Se formează la circa 3 luni de la nidaţia zigotului;

     B.     Dă naştere hemocitoblastului şi limfoblastului;

     C.     Poate fi găsită în măduva spinală;

     D.    Se află la originea unor linii hematopoietice.

2.      Legat de limfocite, o afirmaţie este falsă:

     A.    LT sunt majoritare în sânge;

     B.     LT se găsesc în paracorticala ganglionilor şi manşonul limfoid din jurul arterelor

centrale splenice;

     C.     LT induc o reacţie specifică antigenică;

     D.    LB au rol esenţial în sinteza anticorpilor în cursul RIC specific.

3.       LTh:

     A.    LTh1 stimulează switch-ul izotipic spre IgM;

     B.     LTh0 sunt limfocite tinere care dau naştere celorlalte tipuri de limfocite;

     C.     LTh2 sunt implicate în apărarea antineoplazică;

     D.    LTh17 duc la reacţii de hipersensibilitate;

     E.     LTh0 generează inflamaţie tisulară.

4.      Una din următoarele celule nu este APC:

     A.    Celula Langerhans;

     B.     Celula dendritică;

     C.     Monocitul/macrofagul;

     D.    LT

5.       Eozinofilele:

     A.    Procentul lor creşte în alergii sau infecţii parazitare;

     B.     Sunt majoritare în infecţiile bacteriene;

     C.     În mod normal reprezintă 50% din leucocitele sanguine;

     D.    Pot duce la o boală numită mastocitoză.

12. Complexul major de histocompatibilitate12. 1. Definiţie şi istoric

Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde

unor moleculele exprimate pe membrana celulară.

161

Page 162: Micro Biologie

Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme

alternative = alele în cadrul unei specii;alloantigenul induce răspuns imun atunci când este

transferat la indivizii din aceeaşi specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului;

exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor

cutanate sau de organ.

Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă

face parte din aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o

nouă grefare, cu acelaşi tip de ţesut, eliminarea este mai rapidă.

Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de

histocompatibilitate [primul rol identificat pentru acestea (dar existenţa lor nu este

legată doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ].

Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifică pentru

sinteza de proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate).

Există antigene majore de histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în

care eliminarea grefelor are loc, de regulă, tardiv).

Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive:

·       Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe

grefe tumorale prelevate de la un şoarece şi grefate la altul, au arătat că grefa este

respinsă în caz de histo-incompatibilitate sau tolerată în caz de histo-compatibilitate.

Rejetul sau toleranţa sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major

numit H2 la şoarece şi a mai multor sisteme minore. Ulterior, existenţa MHC a fost

confirmată la toate mamiferele, regiunea fiind denumită în funcţie de specie (ex. H2 la

şoarece, ChLA la cimpanzeu).

·       Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie

medulară şi politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi.

Aceasta stă la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A),

evidenţiat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Există o împărţire a

sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul

supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi receptor HLA identic sau diferit a dovedit că

sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu MHC uman.

·       Răspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a

răspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale

răspunsului imun. Doherty şi Zinkeragel au demonstrat în 1974 că răspunsul imun este

limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.

12. 2. Structură şi clasificareSistemul HLA cuprinde un ansamblu de gene localizate pe un segment al braţului scurt

al cromozomului 6 (Figura nr. 1).

Genele HLA posedă trei caracteristici importante:

1.      polimorfismul - fiecare genă este polialelică (cu excepţia HLA-DRA), fiind

evidenţiate peste 50 de alele în sistemulMHC uman; aceasta este principala caracteristică a

162

Page 163: Micro Biologie

HLA ce face ca organismul uman să fie capabil de recunoașterea a miliarde de antigene din

natură prin arsenalul de MHC cu conformație specifică fiecărui antigen.

2.      codominanţa - la un subiect heterozigot, sunt exprimate două alele diferite;

3.      legătura strânsă -toate genele situate pe acelaşi cromozom se transmit în bloc

descendentului, sub formă de haplotip.

Moleculele HLA aparţin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de bază

fiind motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidică intramoleculară.

Sistemul HLA este împărțit în două grupe principale: HLA clasa I și HLA clasa II,

denumirea respectând cronologia descoperirii lor, și nu organizarea pe cromozom. Există și

HLA clasa III (nu este implicată în histocompatibilitate).

Moleculele HLA clasa I

Aceste molecule sunt heterodimeri formaţi prin legătură noncovalentă între un lanţ greu

polimorf a şi un lanţuşor nonpolimorf β2m (Figura nr. 2)

·         lanţul greu a (44 kDa) este o proteină transmembranară cu polimorfism alelic,

codată de o genă a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o porţiune

transmembranară şi o parte intracitoplasmatică scurtă;

·         lanţul β2m (11,5 kDa) este codat de o genă de pe cromozomul 15 şi cuprinde un

singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanţul a.

Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formând pe

suprafața acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt

adesea absente la nivelul globulelor roşii dar prezente în cantitate mare la nivelul

plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabilă, în funcţie de tipul

celular: pe limfocitele T sau B şi polimorfonucleare sunt exprimate 104-5

´105 molecule/celulă în timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase

şi spermatozoizi aproape lipsesc.

Pentru HLA-I există 3 gene ce codifică antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A,

HLA-B, HLA-C și 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G.

Moleculele HLA clasa a II-a

Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinzând un lanţ polipeptidic a şi un lanţ

polipeptidic β (Figura nr. 3)

·         lanţul greu a (33-34 kDa) cuprinde două domenii externe a1 şi a2, o porţiune

transmembranară şi o terminaţie carboxilică scurtă intracitoplasmatică;

·         lanţul uşor β (28 kDa) are o structură asemănătoare, cu două domenii externe

β1 şi β2.

Moleculele clasei a II-a au o distribuţie mult mai restrânsă în comparaţie

cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pecelulele prezentatoare de antigen (APC):

·         celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare şi

din timus, celule dendritice din epiteliul căilor respiratorii),

·         monocite / macrofage şi

·         limfocite B.

Limfocitele T nu exprimă astfel de molecule decât după activare.

163

Page 164: Micro Biologie

Moleculele clasei a II-a au fost descoperite şi la nivelul endoteliului vascular şi al

celulelor epiteliale ale intestinului gros.

În cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor β din

insulele lui Langerhans în diabetul insulinodependent, al canalelor biliare în ciroza biliară

primitivă şi al celulelor tiroidiene în afecţiunile tiroidiene autoimune.

Expresia moleculelor este indusă de mediatori precum: IFN-g, TNF-a şi β, IL-4, IL-13 şi

GM-CSF cu rol esențial în răspunsul imun. Prostaglandina E2 inhibă sinteza lor pe monocite /

macrofage.

Regiunea HLA-II conține gene ce codifică HLA-DR, DQ, DP, DM, și pe lângă acestea,

câteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2.

Moleculele HLA-III nu sunt implicate în histocompatibilitate.

Sunt total diferite de cele de clasele I și II.

Nu se află atașate pe membranele celulare și nu intervin în recunoașterea peptidelor

antigenice.

12. 3. RoluriLimfocitele T protejează organismul uman de 2 mari categorii de agenţi patogeni:

virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infectează (devenind astfel antigene

endogene) și bacteriile care se replică autonom, majoritatea extracelular.

Cele 2 clase ale MHC sunt esenţiale în recunoaşterea şi răspunsul imun față de peptide

derivate din „agresori”. În ”lupta” dintr-o infecţie virală, virusul este eliminat de către LT

CD8+ care recunoaşte peptide virale endogene ataşate de MHC-I. În schimb, o bacterie e

eliminată prin fagocitare de către macrofage sau neutrofile.

LT CD4+ recunoaşte peptidele bacteriene legate de MHC-II şi direcţionează răspunsul

imun către activarea macrofagelor şi producţia de anticorpi care opsonizează bacteria.

Moleculele de histocompatibilitate au așadar un rol fundamental în prezentarea

peptidului antigenic către:

·         limfocitul T helper - HLA-II sau

·         limfocitul T citotoxic - HLA-I.

În această comunicare intercelulară intră în contact 3 molecule:

·         HLA

·         peptidul antigenic

·         TCR.

Rolul moleculelor HLA clasa I

Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I

prezintă un peptid endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un

parazit cu dezvoltare intracelulară sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor

celule self tumorale sau îmbătrânite către receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T

CD8+. Se va obţine astfel un răspuns imun celular prin activarea şi multiplicarea LTc având

ca rezultat liza celulelor ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4)

Rolul moleculelor HLA clasa a II-a

164

Page 165: Micro Biologie

Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele

HLA II prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogenă, provenite din proteinele

endocitate şi degradate de APC. (Figura nr. 5)

Etape:

a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:

1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate

nespecific de monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmează

calea endocitozei;

2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii,

proteinele sunt degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;

3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic

sunt asociate, sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta

împiedică legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul

sintezei sale și permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după

terminarea sintezei;

4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la

suprafaţa APC. (Figura nr. 6)

b) Interacţiunea între APC şi limfocitul T helper:

Peptidele antigenice sunt recunoscute de către LTh prin TCR numai dacă sunt

prezentate de către APC pe MHC-II.

Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul său nu poate interacţiona cu o APC

decât dacă recunoaşte antigenele cuplate cu moleculele MHC ale

individului (restricţie allogenică).

Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacţionează cu domeniul β2constant al

HLA-II declanșând astfel primul semnal către limfocit pentru activarea sa. În urma unor

reacţii în cascadă LT va intra în mitoză, va secreta o serie de citokine şi va colabora cu LB

spre producţia de anticorpi având ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea

reacţiei este datorată asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic.

O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate în procesarea şi

încărcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 şi PSMB9 sunt subunităţi ale proteozomului

iar TAP1 şi TAP2 transportă peptidele endogene din citoplasmă în RE. BTNL2 este implicată

în susceptibilitatea la sarcoidoză

Moleculele HLA-III sunt împărţite în două categorii în funcţie de rol:

a.) cu rol în imunitate şi inflamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP

(proteina de şoc termic);

b.) cu rol enzimatic: CYP21

12. 4. Povestiri adevărate12.4.1. Polimorfismul HLA

165

Page 166: Micro Biologie

Orice celulă care prezintă un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerată

non-self, un „invadator”, iar rezultatul este acela de rejecţie a ţesutului compus din

respectivele celule. Din cauza importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre

cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR faţă de oricare alte alele autozomale.

În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă,

rinichi, celule stem hematopoietice.

Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele

donoare să fie potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a

se aloca organe fără a se lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea,

în trecut, nu a fost posibilă analizarea corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu

organe compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe 8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre

din 24 state din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă cardiacă compatibilă HLA (A,

B sau DR) sau doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat supravieţuirea ţesutului pe

o durată de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut

succes: la compatibilitate maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2

nepotriviri. Aşadar, supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnificativ

influenţată de compatibilitatea HLA.

Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor

(detectabilă prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform

căreia incompatibilitatea alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea

antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată cu rejecţia de transplant cu celule stem

hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă cronică au primit transplant de

măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B,

C) şi s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o

incompatibilitate, la cele cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la

transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza şi, astfel,

riscul rejecţiei de transplant a fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate

antigenică HLA, faţă de cei cu o incompatibilitate alelică. Riscul a fost de asemenea crescut

la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi la primitorii homozigoţi HLA în locusul de

incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la donori cu o singură incompatibilitate a

alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot fi realizate cu succes. În schimb,

incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte riscul de respingere a

ţesutului.

12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli

Studii epidemiologice au demonstrat că peste 40 de boli se întâlnesc mai frecvent la

indivizi purtători ai anumitor alele HLA I sau II decât la populaţia generală. Importanţa

acestor efecte este extrem de mare, deşi nu vor fi probabil niciodată demonstrate ca

absolute. De exemplu, între 90% şi 95% din pacienţii caucazieni cu spondilită ankilozantă

posedă HLA-B27 (1), iar 30%-50% din pacienţii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-

DQ2/DQ8 heterozigoţi. Interesant este faptul că HLA-DQ6 pare a fi responsabilă de protecţia

împotriva diabetului zaharat de tip I.

166

Page 167: Micro Biologie

Majoritatea bolilor care au legătură cu anumite gene HLA au un caracter autoimun.

Baza moleculară a acestei legături este necunoscută din cauza lipsei identificării

autoantigenului primar care reprezintă „trigger-ul”. (2) Cu toate că mecanismele prin care

genotipurile HLA controlează susceptibilitatea la aceste boli sunt încă incomplet definite, se

crede că participarea moleculelor MHC în stabilirea toleranţei imunologice şi în

recunoaşterea antigenelor stă la baza acestor fenomene.

Alelele HLA ce oferă protecţie pot media eliminarea în timus a LT potenţial patogene

responsabile de autoimunitate, în timp ce alelele HLA susceptibile pot eşua în eliminarea LT

patogene.

Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre

exemplu, subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial,

nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu

HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o incidenţă crescută de seronegativitate la

vaccinarea împotriva pojarului. (3)

Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifică faptul că

homozigoţii HLA-DR13-DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)

O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza

multiplă. (5-6)

12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC

Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc

antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de

LT foloseşte un receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe

molecule CD1. CD1 sunt asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un

situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel,

complexele CD1-glicolipide servesc drept ţintă pentru recunoaşterea de către LT ce au un

tip special de receptor: γδ TCR. Această prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule

CD1 pare să fie responsabilă de recunoaşterea independentă de MHC a mycobacteriilor. (3)

12. 7. Verificați-vă cunoştinţele1. Principala caracteristică a sistemului HLA este:

A. codominanţa

B. specificitatea

C. polimorfismul

D. histocompatibilitatea

E. imunogenicitatea.

 

2. Moleculele MHC-II se află pe:

A. majoritatea celulelor din organism

B. numai pe celulele nucleate

C. numai pe macrofage

D. toate APC

167

Page 168: Micro Biologie

E. limfocite

 

3. Colaborare intercelulară există între:

A. HLA-II şi LTc

B. HLA-I şi LTc

C. APC şi HLA-I

D. HLA-I şi LTh

E. HLA-I şi HLA-II

 

4. Moleculele HLA-II prezintă către limfocite în situsul lor:

A. imunoglobuline

B. sfingolipide

C. peptide exogene

D. TCR

E. peptide endogene

13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi 

Interacţiunile între celulele imunitare se realizează prin două mecanisme

complementare:

·         contactul celular strâns, care necesită prezenţa moleculelor de adeziune (direct);

·         prezenţa factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele două celule

aflate în contact sau, uneori, de o celulă aflată la distanţă (indirect).

Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funcţiei celulare, ca urmare a transportului

informaţiei prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celulară

sau genele nucleare.

13. 1. Moleculele de adeziuneContactul între două celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este

complex şi nu se limitează la procesele imunologice.

Legăturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacţii chimice clasice specifice,

saturabile şi reversibile.

Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face în două moduri, structural şi

funcţional.

168

Page 169: Micro Biologie

13. 1. 1. Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune

Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune se bazează pe caracteristicile chimice

ale moleculei care permit legarea sa de o anumită superfamilie sau familie de

proteine. Expresia lor pe suprafaţa celulei poate fi constitutivă sau indusă în urma activării

celulare.

Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule)

Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-

calciu-dependent şi domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol în

adeziunea intercelulară; joacă un rol important în amorsarea procesului inflamator.

·         L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa leucocitelor, în timp ce

expresia E-selectinelor pe endoteliu este indusă de către TNF-a, IL-1 şi lipopolizaharidele

bacteriene iar a P- selectinelor de către C5b, histamină şi trombină.

·         L-selectinele joacă un rol important pentru LT imature şi APC (celule dendritice)

care sunt astfel direcţionate către situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii

limfatici sau GALT.

·         P-selectinele formează împreună cu factorul Willebrand granule denumite

corpusculii Weibel-Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind

stocate în vezicule.

IntegrineleFamilia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu

structură heterodimerică (a, β). Iniţial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanţul β comun

şi lanţul a diferit, pentru ca în prezent să se cunoască faptul că lanţul a se poate asocia cu

mai multe lanţuri β (β 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitară (cel puţin un membru al

acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puţin 13 astfel de

receptori. Celulele epiteliale exprimă la rândul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus,

în urma procesului inflamator.

Integrinele intervin în legarea intercelulară şi între celulă şi substrat, prin care

contribuie la organizarea tisulară şi migrarea celulară, alături de superfamilia

imunoglobulinelor; subfamilia β2-integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la

contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (β1 şi β2-integrinele stimulează

producţia de TNF-a şi β a celulei T; β2-integrinele stimulează producţia de IL-1β a

monocitelor, la contactul cu limfocitul T).

Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specificitate diferită faţă de

substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt influenţate de procese celulare interne de fosforilare ce

induc schimbări conformaţionale, ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de

integrare a cunoştinţelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin).

Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like)

169

Page 170: Micro Biologie

Moleculele de adeziune din această clasă au o structură „imunoglobulin-like” prin

expresia extracelulară a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate în

trei subfamilii:

·         ICAM (intercellular adhesion molecule),

·         VCAM (vascular cell adhesion molecule) şi

·         PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule).

Moleculele de adeziune din această clasă intervin în legarea intercelulară, mai ales în

interacţiunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecţie (integrine) intervin

în legarea leucocitară şi prin aceasta în controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor

pe suprafaţa celulară este constitutivă sau indusă de citokine.

Caderinele

Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv

pe suprafaţa celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe

celulele adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură

integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate în patru subfamilii:

·         E-caderine (pe epitelii),

·         V-caderine (pe endoteliu),

·         P-caderine (placentare),

·         N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi).

adresine vasculare

Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor endoteliale şi intervin în „homing-

ul” limfocitar, respectiv în direcţionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici şi ţesuturile

extraganglionare.

Carbohidraţii

Reprezintă liganzii specifici pentru selectine şi nu constituie o clasă distinctă de

molecule de adeziune.

13. 1. 2. Clasificarea funcţională a moleculelor de adeziune

13. 1. 2. 1. Moleculele accesorii asociate cu TCR

·       molecula CD4

Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 2/3 din LT mature circulante, definind

subsetul de LT CD4+. Molecula CD4 este prezentă şi pe suprafaţa celulelor dendritice

cutanate şi pe monocitele/macrofagele activate. Este o moleculă de 55-67 kDa, cu o parte

extracelulară compusă din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoaşte o parte constantă

situată la nivelul domeniului β2 a moleculei HLA II.

·       molecula CD8

Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 1/3 din LT mature circulante. Defineşte

subsetul de LT cu activitate citotoxică şi unele celule NK (în proporţie mai mică) (Figura nr.

2). Molecula CD8 este homodimerică (CD8a/CD8a) sau heterodimerică (CD8a/CD8b). Rolul

său primordial este să asigure interacţiunea cu o parte monomorfă a moleculei HLA I, 170

Page 171: Micro Biologie

pentru recunoaşterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca şi molecula CD4,

este asociată cu tirozinkinaza.

NB. Pentru mai multe informații despre apoptoză, vezi capitolul Toleranţă Imunologică.

 

13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele

prezentatoare de antigen şi limfocitele T

În permanenţă, între APC şi LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelulară. Este

nevoie de prezenţa APC dar şi de o „colaborare bidirecţională” („crosstalk”) între APC şi LT

(trebuie să existe o dublă activare a celor două tipuri de celule, în sens anterograd şi

retrograd), întrucât în lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil să capteze şi cu atât mai

mult, să prelucreze Ag native T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc

un efect de „fermoar” între membrana APC şi LT, legătura având loc înainte ca TCR să vină

în contact cu epitopul (cuplul se formează chiar dacă APC prezintă un epitop pentru care LT

nu are receptori specifici).

Se descriu trei cupluri:

Cuplul B7-CD28·       Molecula B7 se exprimă pe suprafaţa majorităţii APC (celule dendritice în repaus,

macrofage activate şi LB activate). Deşi este absentă pe macrofagele şi LB în repaus, în

urma costimulării acestora, molecula B7 se exprimă pe suprafaţa lor, pentru a asigura o

cooperare celulară pozitivă.

·       Molecula CD28, care recunoaşte receptorul B7, este prezentă pe toate LT, cu

excepţia LT supresoare şi permite costimularea între APC şi LT.

·       Rezultatul este transcripţia unor factori antiapoptotici precum Bcl-x şi IL-2.

Cuplul B7-CTLA-4 (CD80)Molecula CTLA-4 nu este exprimată decât de LT CD4+ sau T CD8+, într-o proporţie mai

mică decât molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7.

Interacţiunea cu APC poate induce inhibiţie şi chiar apoptoză .

 

NB. CTLA-4 competiţionează cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimată pe

membrana APC. Datorită efectelor discrepante – activatoare/inhibitoare – se pune problema

înţelegerii modului în care LT va traduce semnalul primit.

1). Dacă APC este activat de prezenţa în mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL–2),

va prezenta un număr mai mare de molecule B7, favorizând legarea CD28, iar semnalul

transmis va fi activator (Figura nr. 4).

2). În cazul în care APC este puţin activat, va exprima pe membrana sa puţine molecule

B7. Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aşa încât

majoritatea moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va

fi inhibitor (Figura nr. 5).

Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este

modulat de factorii de mediu şi decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul

„Toleranţă Imunologică” pentru mai multe detalii).

 

171

Page 172: Micro Biologie

Cuplul CD40 şi CD40L·       Molecula CD40 se exprimă pe toate celulele prezentatoare de antigen în repaus -

celule dendritice, LB şi monocite/macrofage dar şi pe progenitorii hematopoietici şi celulele

epiteliale.

·       Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprimă decât pe LT activate CD4+ sau

CD8+ şi nu pe cele în repaus. Este de asemenea prezentă pe bazofile şi mastocite.

Sindromul hiper-IgM, X-linkat se caracterizează prin absenţa moleculei CD40L funcţionale.

·       Mecanismul prin care interacţiunea CD40-CD40L stimulează răspunsul LT pare a fi

reprezentat de intensificarea secreţiei de IL-12 şi creşterea numărului de molecule B7 de pe

membrana APC („APC licensing”), ducând la recrutarea mai multor celule prezentatoare de

antigen şi potenţarea semnalului costimulator transmis de aceste celule.

13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele

prezentatoare de antigen şi limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice şi

ţintă.

Aceşti liganzi cuprind următoarele două cupluri:

Cuplul LFA2 (CD2) şi LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated antigen)

·       Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) între LT

umane şi eritrocitele de oaie. Fenomenul se datorează prezenţei LFA3 pe eritrocitele de

oaie.

·       Molecula LFA3 (CD58) are o distribuţie largă, care cuprinde celulele endoteliale

vasculare, fibroblaştii, limfocitele şi macrofagele.

Cuplul LFA1 şi ICAM 1, 2 şi 3·       Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/β2 (CD11a/CD18). Prezenţa sa este relativ

difuză la nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB şi LT de memorie).

·       ICAM1 (CD54), ICAM2 şi ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice şi

permit activarea lor. ICAM1 se găseşte pe neutrofile în repaus, celule endoteliale,

monocito/macrofage şi LB activate.

Aceste două cupluri de adeziune permit recunoaşterea şi interacţiunea între LT CD4+ şi

APC sau între LT CD8+ şi celula ţintă, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea

constituită între LT CD4+ şi APC a fost numită „sinapsă imunologică”, subliniind transferul

informaţional implicat în recunoaşterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de către

TCR 

13. 2. Citokinele (Interleukinele)Citokinele sunt substanţe proteice, solubile, cu greutate moleculară mică, 8-70 kDa. cel

mai frecvent sunt sintetizate de către celule după activare prealabilă, acţionând ca

mediatori asupra altor celule sau asupra lor însăşi, în cantităţi foarte mici, de ordinul pico

sau nanogramelor. În momentul de faţă au fost identificate peste 100 de molecule diferite

172

Page 173: Micro Biologie

de citokine. O parte dintre citokine au în special efecte „chemotactice” şi din acest motiv au

fost numite chemokine.

Termenii de limfokine (substanţe sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind

din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gamă mult mai

largă de celule. Termenul de interleukine, care indică o acţiune între două leucocite, a

persistat şi continuă să persiste în denumirea prescurtată, de la IL-1 la IL-35.

Termenul de citokine pare să fie cel mai adecvat. În unele cazuri, denumirea provine de

la una din activităţile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor),

IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF

(granulocyte-CSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). În afara

sistemului imun şi hematopoietic au fost descoperiţi şi alţi factori de creştere: NGF (nerve

growth factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc.

Citokinele acţionează datorită prezenţei receptorilor specifici, desemnaţi prin denumirea

lor engleză: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezenţi uneori pe aceeaşi celulă care a

sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare

atotcuprinzătoare a citokinelor este foarte dificilă, din punct de vedere funcţional, pentru

motivele prezentate (şi care reprezintă un „punct” din „cutia Pandorei” la care se face

uneori referire, atunci când sunt luate în discuţie aceste structuri). Din punct de vedere

didactic (şi funcţional), vom încerca să prezentăm în continuare o grupare a celor mai

cunoscute dintre citokine.

13. 2. 1. Citokine pro-inflamatoriiÎn cadrul procesului infecţios, diferitele microorganisme care au sau dobândesc prin

variabilitate un efect de agresiune faţă de organismul gazdă, antrenează un răspuns la

nivelul endoteliului vascular; una dintre primele reacţii este reprezentată de mobilizarea

leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). În această etapă intervin şi o serie de

citokine.

·       TNF-α şi TNF-β

TNF-α este produs de monocite / macrofage dar şi de diverse alte celule (limfocite T,

limfocite B, celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacţie la

contactul cu diferite bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi.

Sursa cea mai importantă pentru TNF-α rămâne însă sistemul monocito-macrofagic. TNF-α

favorizează expresia moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular şi al

monocitelor; atrage către sediul procesului infecţios alte monocite şi leucocitele PMN. Are o

activitate anti-virală, anti-parazitară şi anti-tumorală. Stimulează lipoliza, glicoliza

musculară şi reabsorbţia osoasă prin care poate antrena apariţia caşexiei (TNF a fost numit

iniţial caşexină). Induce formarea altor mediatori ai inflamaţiei (leucotriene, PAF). Formarea

sa este la rândul său indusă de IFN, IL-1, factori de creştere sintetizaţi de monocit,

endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri, bacterii, unele componente ale

sistemului complement, leucotriene şi prostaglandine. Eliberarea TNF-α este inhibată de

glucocorticoizi, α2-macroglobuline, α2-antitripsină etc. TNF-β este sintetizat de LT activate

173

Page 174: Micro Biologie

şi celule NK şi are acţiuni identice cu TNF-α, acţionând pe acelaşi tip de receptori. În

momentul de faţă este clasificat între limfotoxine (LT-α).

·       IL-1 şi IL-6

Sunt două citokine cu rol asemănător. Sunt produse de numeroase celule: monocite,

macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite şi celule

gliale (din creier) etc.

IL-1 se găseşte sub două forme: IL-1a fixată la membrană şi IL-1β secretată.

Experimental a fost demonstrat că stimularea cu orice structură microbiană a celulelor care

în mod potenţial sintetizează IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a şi IL-1β). Ele

sunt codificate de gene diferite dar recunosc aceeaşi receptori: primul receptor IL-1R1

induce transducţia informaţiei la nivel celular, în timp ce IL-1R2 nu induce un semnal

celular. IL-1α are funcţie imunologică, activând la nivel superior LTh, care se vor divide

mitotic şi se vor diferenţia în diverse clase. IL-1β, eliberată în spaţiul extracelular şi în

sânge, exercită o puternică acţiune proinflamatorie.

Celulele care sintetizează IL-1 produc câteva ore mai târziu un antagonist al

receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca acţiunea IL-1 să fie tranzitorie. IL-1 induce

creşterea expresiei moleculelor de adeziune; activează limfocitele T şi B; creşte sinteza

proteinelor de fază acută la nivel hepatic; creşte catabolismul celulelor musculare şi al

osteoclastelor (rezorbţie osoasă); activează sistemul nervos central cu febră, anorexie şi

insomnie. Fiind şi prima interleukină numită ca atare, IL-1 a fost considerată iniţial drept o

moleculă piretogenă. Inocularea de IL-1 la subiecţi umani conduce la apariţia febrei şi

frisonului. Concentraţia de IL-1 din plasmă poate să crească şi în condiţii fiziologice (ex. în

stres nepatologic, exces de vitamină A, în timpul menstruaţiei).

IL-6 are o acţiune atât asupra sistemului imun cât şi asupra unor celule care nu aparţin

acestuia, asemănătoare cu aceea a Il-1, cu o singură diferenţă: ea acţionează mai ales pe

maturaţia terminală a LB în plasmocite şi pe diferenţierea LT citotoxice. Ca şi IL-1, produce

proteoliză endogenă, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen,

haptoglobină, α1-antitripsină, proteină C reactivă etc) şi activează sistemul nervos central

conducând la apariţia febrei, anorexiei, somnolenţei etc. IL-6 induce sinteza de

imunoglobuline; are şi rol în maturarea celulelor pe linia megakariocitară. Sinteza IL-6 este

stimulată de IL-1.

·         Limfotoxinele

Limfotoxina (LTx) a fost identificată în urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele

activate, ulterior a fost sintetizată şi caracterizată, dar s-a dovedit că nu există un singur

factor de acest tip, ci o serie de substanţe care ar putea fi grupate într-o „superfamilie”.

Iniţial LT-α, o limfotoxină solubilă, a fost definită drept factor de necroză tumorală (TNF-β).

Dintre numeroşii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menţionăm LT-α şi LT-β, sintetizate

în special de LT şi LB activate, dar şi de către celulele NK sau celule LAK (lymphokine

activated killer cells). Au rol în etapele de iniţiere a inflamaţiei şi se pare că au un rol în

realizarea unei protecţii faţă de agresiunea microbiană.

·         IFN-g

174

Page 175: Micro Biologie

Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN-γ amintim activarea macrofagelor (acest

interferon este probabil cea mai importantă substanţă care produce „trecerea”

macrofagelor de la o stare „în aşteptare” la starea activă, bactericidă) şi astfel intervine în

fazele iniţiale ale inflamaţiei dar şi în diferenţierea clonelor de limfocite care reacţionează

faţă de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate în

următoarele subpuncte.

·         IL-10

Acţionează atât asupra celulelor hematopoietice cât şi asupra altor celule. Dacă iniţial s-

a considerat că are efecte pro-inflamatorii, în momentul de faţă se cunoaşte faptul că, prin

efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o

interleukină cu efect anti-inflamator. A fost numită şi „factor de inhibare al macrofagelor”.

·         IL-11

Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor,

keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11

stimulează sinteza unor reactanţi de fază acută, la fel ca şi IL-6. Totuşi, efectul esenţial al

IL-11 se adresează creşterii trombocitare. Are şi efecte anti-inflamatorii la nivelul

adipocitelor şi osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizată utilizarea IL-11 în tratamentul

asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariţia unei trombocitopenii severe la

pacienţii care primesc medicaţie citotoxică, anti-tumorală.

·         IL-12

Cunoscută drept o substanţă care induce sinteza de IFN-γ, IL-12 are şi alte efecte de

stimulare a răspunsului inflamator al gazdei, în urma unui proces infecţios. Sursa cea mai

importantă de IL-12 este reprezentată de celulele dendritice.

·         IL-16

Iniţial a fost considerată o chemokină pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita

astfel de activităţi şi faţă de alte celule implicate în procesul infecţios şi în inflamaţie. Sursa

principală de IL-16 este reprezentată de LT CD8+.

·         IL-17 (A, B, C, F)

Au efecte proinflamatorii şi de stimulare a hematopoiezei.

·         IL-18

A fost considerată drept o moleculă care induce sinteza de IFN-γ. Ulterior s-a dovedit că

singură, nu duce la o stimulare eficientă, dar în asociere cu IL-12, efectul de stimulare al

sintezei de IFN-γ demonstrează sinergism. IL-18 este sintetizată în special de macrofagele

activate şi de către celulele dendritice, dar există şi alte celule producătoare de IL-18

(monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte

în procesul infecţios declanşat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), paraziţi

(ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale şi

intervine în patogenia unor boli în care există inflamaţie cronică sau în boli autoimune.

·         IL-22

Este o citokină înrudită cu IL-10, dar cu puternice proprietăţi pro-inflamatorii. Într-un

studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un răspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de

la debutul infecţiei cu Klebsiella pneumoniae. Răspunsul indus în celule cultivate în

175

Page 176: Micro Biologie

prezența aceastei citokine, este de exprimare a moleculelor defensive în celulele epiteliale

traheale. Unul din efectele induse de această citokină este exprimarea moleculei lipocalin-

2, cu rol în sechestrarea fierului. Într-un model de infecţie colonică s-a demonstrat că lipsa

IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale şi diseminare bacteriană.

·         IL-23

Are efecte asemănătoare cu IL-12, exercitate în combinaţie cu IL-12. Este sintetizată

mai ales de celulele dendritice.

·         HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1)

Iniţial a fost caracterizată ca o proteină non-histonică cu rol în arhitectura cromozomilor.

S-a demonstrat că această citokină cu totul particulară are rol pro-inflamator, fiind eliberată

din celulele necrotice (şi doar în mică măsură de cele apoptotice), jucând rol de DAMP

(Damage Associated Molecular Pattern) dar şi secretată activ de macrofage stimulate.

Receptorul membranar specific, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-

products) mediază efectele sale.

Această proteină are un rol patogenic important în sepsis şi medierea efectelor de fază

târzie  ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, că mortalitatea în

sepsis a fost redusă prin administrarea pasivă de anticorpi anti-HMGB1.

13. 2. 2. Citokine cu acţiune anti-virală şi anti-proliferativă

În această categorie sunt cuprinse mai multe interleukine.

·         Spre exemplu interferonul a şi β. IFN-a este produs de monocite şi celulele

hematopoietice iar IFN-β este produs de alte celule de tipul fibroblaştilor şi al celulelor

endoteliale. Cele două citokine prezintă acţiune anti-virală şi anti-proliferativă; stimulează

celulele NK; cresc expresia moleculelor MHC I; activează producţia de IL-2 de către

monocite/macrofage şi celule dendritice; induc sinteza de IFN-g, cu acţiune anti-virală şi

anti-proliferativă.

·         IL-2, cu efect autocrin şi paracrin, a fost prima interleukină utilizată în terapia

cancerului (administrarea pe cale intravenoasă a fost asociată, din nefericire, cu efecte

toxice severe; datorită acestor efecte, dar şi descoperirii unor efecte similare prin

administrarea altor molecule în alte situaţii clinice, în momentul de faţă a intrat între

noţiunile medicale clasice şi definirea „sindromului de toxicitate al citokinelor”). Mai recent,

se încearcă administrarea IL-2 la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA, în speranţa că efectele

proliferative asupra LT CD4+ vor îmbunătăţi istoria naturală a bolii. O analiză recentă a

datelor din două mari studii clinice a arătat un efect neutru al terapiei. (1)

·         Prin potenţarea activităţii citotoxice a LT şi a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea

utilitate clinică în inhibarea procesului infecţios determinat de virusuri dar şi în diferite

forme de neoplazii.

·         IL-18 are sau induce efecte împotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal,

virusului herpes simplex etc dar are şi efecte anti-tumorale.

176

Page 177: Micro Biologie

13. 2. 3. Citokine activatoare ale răspunsului imun celular

Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de provenienţă limfocitele Th1. În

această categorie sunt incluse următoarele citokine.

·         IL-2 este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 şi Th1 (cu rol în RIP de tip

celular) activate şi într-o mai mică măsură de celulele NK şi de celulele dendritice. Şi LT Th2

(cu rol în RIP de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acţionează asupra diferitelor celule cu rol

în imunitate [asupra limfocitelor T acţionează printr-un mecanism autocrin, antrenând

proliferarea şi activarea spre subsetul Th1 dar şi Th2; transformă celulele Nk în celule LAK

(lymphokine activated killer cells); antrenează proliferarea limfocitelor B]. Acţionează

sinergic cu IL-12 şi IFN-γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a fost prima

dintre interleukine care a fost caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu

133 aminoacizi, o greutate moleculară de 15,5 kDa; gena care codifică sinteza de IL-2 se

găseşte pe cromozomul 4.

·         IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină

este reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu

producerea speciilor reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra

microorganismelor intracelulare. Prin acţiunea sa anti-Th2, reduce răspunsul imun umoral.

IFN-γ controlează funcţii imune implicate în apărarea antibacteriană, antivirală şi

antiparazitară.

13. 2. 4. Citokine activatoare ale răspunsului imun umoral

Aceste citokine sintetizate de ex. de către limfocitele Th2 şi unele mastocite, orientează

răspunsul imun umoral spre diferitele clase şi subclase de imunoglobuline.

·         IL-4 acţionează în etapa iniţială a răspunsului imun umoral, permiţând trecerea

LB din stadiul G0 la stadiul G1. Stimulează producerea şi maturarea intramedulară a LB.

Acţiunea sa este întărită de IL-1. De asemenea, stimulează producerea de IgG, specifică RIU

secundar şi blochează producerea de IgM, specifică RIU primar. Mecanismul are loc la nivel

de genom şi se numeşte izotipic switch (comutare izotipică) (Figura nr. 8). Citokina este

totodată un factor de creştere pentru bazofile şi mastocite. Are de asemenea rol în

hematopoieză. Acţionează sinergic cu IL-3 în cursul diferenţierii mastocitelor şi limfocitelor.

Dacă există o sinteză crescută peste normal a IL-4 de către LT Th2, se înregistrează o

creştere semnificativă a sintezei de IgE iar din punct de vedere clinic apariţia manifestărilor

hipersensibilităţi de tip umoral (tip I).

·         IL-5 stimulează RIU la nivelul mucoaselor. Intră în acţiune mai târziu, alături de

IL-2, permiţând multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de creştere pentru leucocitele

polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare şi asupra bazofilelor. La fel ca şi IL-

4 şi IL-5, are rol hematopoietic. Stimulează sinteza de Ig A de către limfocitele B. Datorită

177

Page 178: Micro Biologie

efectelor menţionate, un tratament novator al afecţiunilor datorate hipersensibilităţii de tip

I ar putea să se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- „alergice” care să aibă drept ţintă

molecula IL-5).

·         Printre numeroasele sale activităţi, IL-6 este o citokină proinflamatorie, cu

acţiune tardivă în procesul de maturaţie a imunoblastelor în plasmocite.

·         IL-10 induce diferenţierea iniţială a liniei de celule B. IL-10 inhibă citokinele

proinflamatorii şi sinteza de IFN-g, comportându-se ca o citokină reglatorie negativă pe

subsetul Th1. Are de asemenea şi rol stimulator, în cazul maturării mastocitelor, în cazul

apărării antivirale şi antitumorale, precum şi rol chemoatractant pentru limfocitele T

(CD8+).

·         IL-13 este produsă de LT Th2 activate (dar există şi clone de LT Th1, Th0 sau LT

CD8+ care pot sintetiza această moleculă). IL-13 inhibă sinteza citokinelor proinflamatorii

şi, ca şi IL-4, stimulează sinteza IgE.

13. 2. 5. ChemokineAceste molecule de adeziune cuprind  aproximativ 50 de  membri divizaţi în mai multe

familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost

standardizată în raport cu structura chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de

cisteină. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte

pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaugă litera R şi un număr, în timp ce

liganzii conţin litera L şi un număr. Ele prezintă o activitate chemotactică faţă de limfocite,

monocite, eozinofile etc.

Neutrofilele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinofilele,

bazofilele şi monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri

există în permanenţă pe suprafaţa celulelor normale circulante şi pot fi detectate prin

metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul

circulator, în timp ce unii liganzi (CX3CL1, CXCL16) conţin o porţiune transmembranară,

permiţând ancorarea celulelor de endoteliul vascular în condiţii de flux fiziologic. Prin

intermediul acestor receptori, celulele menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la

celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este

reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că

studiile arată tot mai des rolul chemokinele în procese patologice, precum ateroscleroză,

scleroza multiplă etc.

13. 2. 6. HematopoietineHematopoieza este controlată de către un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se

menţine un compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate

liniile sanguine. Sistemul necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui

spaţiu hematopoietic medular graţie echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul

de proliferare şi diferenţiere a celulelor stem intervin numeroase citokine:

178

Page 179: Micro Biologie

·       SCF (stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei

osoase. SCF este produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana

citoplasmatică.

·       IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu

greutatea moleculară 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate

în urma stimulării antigenice dar şi al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codifică

pentru sinteza IL-3 se află pe cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi

diferenţierea celulelor stem spre diferitele linii.

·       IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 şi IL-15:

- IL-4 stimulează diferenţierea şi creşterea bazofilelor şi mastocitelor;- IL-5 are acelaşi rol faţă de eozinofile;- IL-7 este un factor de creştere produs de celulele stromale medulare şi timice care induce proliferarea L pre T şi pre B;- IL-10 favorizează dezvoltarea megacariocitelor;- IL-11 este un factor de creştere pentru linia trombocitară, dar are şi efect pro-inflamator;- Il-15 permite diferenţierea celulelor stem spre NK.

Factorii de creştere ai liniilor hematopoietice: factorii de creştere stimulează

celulele hematopoietice deja diferenţiate, respectiv progenitorii, permiţând creşterea şi

evoluţia lor spre stadiile ulterioare, până la maturizare. Se cunosc GM-CSF (granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor) pentru linia monoblastică şi mieloblastică, G-CSF

(granulocyte CSF) pentru linia mieloblastică, M-CSF (macrophage GSF) pentru linia

monoblastică, alături de interleukinele menţionate anterior, în special IL-3.

13. 3. Mesagerii secunziStimularea celulară debutează prin interacţiunea unui număr mare de receptori

membranari celulari. Alături de moleculele de adeziune şi receptorii de citokine, mai trebuie

amintiţi receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) şi receptorii pentru

complement (CR). Aceştia au o importanţă sporită în recunoaşterea patogenilor şi

reprezintă startul procesului de procesare antigenică în cadrul răspunsului imun înăscut.

Transducţia semnalului primit necesită intervenţia mesagerilor secunzi, care transmit

informaţia printr-o reacţie în cascadă, până la nivelul membranei celulare, al organitelor

intracitoplasmatice sau al nucleului. În acest ultim caz, este vorba de o acţiune asupra unor

gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificări

transcripţionale).

Întregul mecanism este complex şi necesită interacţiunea între partea

intracitoplasmatică a receptorilor membranari şi mesagerii secunzi. În unele cazuri,

molecula receptor membranar care primeşte semnalul extracelular comunică direct cu

mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). În alte

cazuri, molecula receptor cu o parte intracelulară limitată la câţiva aminoacizi, este

asociată la alte molecule, fomând adevărate domenii de amplificare a semnalului

(molecular scaffolds). Partea intracelulară astfel dezvoltată poartă motivul de interacţiune

cu mesagerul secund. În acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR,

179

Page 180: Micro Biologie

moleculele Iga şi Igβ ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru

interleukine. (Figurile nr. 9-10)

Recrutarea leucocitelor circulante – Molecule de adeziune şi Citokine

Primii mediatori ai inflamaţiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar

ca rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal – epinefrină, activarea mastocitelor rezidente

– histamină, sau ca urmare a activării cascadei coagulării – trombină). Aceşti  mediatori

sunt responsabili de modificările reologice specifice inflamaţiei şi de recrutarea leucocitară

prin activarea celulelor endotelialiale adiacente.

Consecinţele sunt permeabilizarea patului vascular şi expunerea pe versantul circulator

a moleculelor de adeziune. P- şi E-selectinele sunt primele expuse, având rol în

marginalizarea leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe

leucocite joacă rol de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele două selectine, ducând la contactul

celulelor cu endoteliul, cu rol în încetinirea leucocitelor – rolling leucocitar (adeziunea este

insuficient de puternică pentru a constitui o legătură fermă).

Citokinele (IL–1 şi TNF–a) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor

immunoglobin–like (ICAM-1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaţa

leucocitelor (LFA-1 şi Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leagă

receptori specifici de pe membrana leucocitară (IL-8R). Ca urmare a semnalizării

intracelulare determinată de citokine, se induc schimbări conformaţionale în structura

integrinelor (semnalizare „inside-out”). Integrinele trec astfel de la stadiul conformaţional

cu afinitate redusă la cel cu afinitate crescută pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de

a stabili o adeziunea fermă a leucocitelor la endoteliu. Urmează reorganizarea scheletului

celular şi diapedeza leucocitară mediată tot de integrine (semnalizare „outside-in”).

Integrinele mediază şi ataşarea leucocitară la componentele matricei extracelulare,

conducând la exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite înaintarea

leucocitelor spre focarul de inflamaţie. Procesul de dirijare a migrării leucocitare se bazează

pe emiterea de prelungiri membranare în direcţia dictată de gradientul de concentraţie a

mediatorilor chemotactici.

13. 4. Povestire adevăratăPovestirea adevărată este preluată din literaură şi subliniază mai multe principii care

merită însuşite încă din anul al 2-lea de studenție. Introducerea în practica medicală

curentă a unui nou medicament reprezintă concomitent un maraton (întrucât durează în jur

de 15 ani) cât şi un concurs (între companii farmaceutice, echipe de cercetare). Există însă

un proces riguros de testare ce trebuie urmat cu strictețe. Studiile sunt coordonate astfel

180

Page 181: Micro Biologie

încât se efectuează studii de siguranţă şi de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale

de laborator, iar abia în final pe oameni (voluntari). De multe ori însă, rezultatele foarte

promiţătoare ale studiilor preclinice sunt ”dărâmate” de ineficienţa noilor substanţe în

clinică. Aceste date conflictuale trebuie foarte bine investigate şi trebuie efectuat un bilanţ

riguros care să aibă drept scop binele pacienţilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine

documentate şi supervizate.

Prima etapă a studiilor clinice, o reprezintă validarea siguranţei de administrare la tineri

voluntari sănătoşi.

Asemănător terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor

T, investigaţiile preclinice au arătat un potenţial beneficiu în folosirea anticorpilor

direcţionaţi anti-CD28, cu acţiune de superagonişti şi rol de a activa şi expansiona numărul

de limfocite T in vivo, independent de stimularea receptorului TCR. În modelul murin, s-a

demonstrat că un anticorp cu aceeaşi specificitate a expansionat preferenţial sectorul

CD4+CD25+, de limfocite reglatoare, având un profil bun de siguranţă.

Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sănătoşi. În

decursul a 90 de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce

au fost atribuite unei descărcări masive de citokine (furtună citokinică/ ”cytokine storm”).

Fenomene asemănătoare au fost identificate într-un număr impresionant de patologii,

existând în continuare destul de multe necunoscute. Toţi pacienţii au prezentat răspuns

inflamator sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scădere a tensiunii sistolice cu cel

puţin 20 mmHg şi tahicardie compensatorie. Majoritatea pacienţi au dezvoltat o suferinţă

pulmonară  însoțită de permeabilizare vasculară şi infiltrare a spaţiilor alveolare cu lichid,

ducând la suferinţă severă. Toţi pacienţii au necesitat tratament suportiv cu intubaţie,

tratament de stabilizare hemodinamică şi dializă, iar tratamentul „specific”,

imunomodulator, a constat în administrarea de anticorpi anti-IL2 şi corticoterapie.

Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele şi citokinele circulante. S-a

constatat o creștere dramatică a TNF-α la o oră de la infuzia anticorpului cât şi a IL-2, IL-4,

IL-10 şi IFN-γ în decurs de 4 ore. Pacienţii cu evoluţia cea mai gravă au avut nivele ridicate

de citokine circulante pentru o durată mai lungă de timp.

 Toţi voluntarii au supravieţuit sindromului de răspuns inflamator sistemic (Systemic

Inflammatory Response Syndrome -SIRS). Analiza acestor reacții precum şi publicarea

rezultatelor a contribuit la o mai buna înţelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai

mult, urmărirea acestor fenomene, ca evoluţie naturală şi sub tratament a contribuit la

înţelegerea tratamentului. Merită admirat faptul că o poveste „de eşec” pentru o moleculă

candidat a fost publicată şi a contribuit, în felul acesta, la „viitorul succes” în domeniu.

13. 5. Verificaţi-vă cunoştinţeleLa întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.

1.      Rolling-ul leucocitar este mediat de interacțiunea:

  a.       Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine

  b.      Selectine – Antigen Lewis X

181

Page 182: Micro Biologie

  c.       Integrine – Receptori de integrine

  d.      Integrine – Fibrină

2.      Inducerea comutării izotipice IgM – IgG este realizată de:

  a.       TNF alfa

  b.      IL-1

  c.       IL-4

  d.      HMGB-1

3.      Descrieţi cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice.

4.      Enumerati rolurile Interferonului Gamma.

5.      Au efect imunoinhibitor (răspuns multiplu):

  a.       TLR

  b.      IL-4

  c.       IL-10

  d.      CTLA-4

  e.       IL-13

14. Imunoglobulinele Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în

plasmă, lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina

specific cu antigenul inductor al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu

aceeaşi structură dar fără activitate de anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în

macroglobulinemia Waldenström's a fost identificată proteina patologică Bence-Jones

(poate fi identificată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză anormală de lanţuri

uşoare; a fost descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) îl

înlocuieşte pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi

anticorpii migrează electroforetic în regiunea „gama”.

Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au şi alte

roluri.

Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor”

bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri

(inclusiv împotriva structurilor proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor,

pot exista anticorpi diferiţi faţă de structuri diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă

de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae).

Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:

- recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;

- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor

avea rolul de antigene pentru respectivul individ;

- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;

182

Page 183: Micro Biologie

- pot activa sistemul complement etc.

S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr-o parte de

moleculă umană şi alta animală; fiind de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri

antigenice şi nu vor mai fi „respinşi”.

14. 1. Structura generalăStructura de bază a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde două lanţuri grele identice şi

două lanţuri uşoare identice, legate între ele prin punţi disulfurice: două punţi între cele

două lanţuri grele (în cazul IgG1) şi o singură punte între fiecare lanţ greu şi uşor.

Această schemă structurală a fost identificată în urma mai multor experimente

(reducere şi alchilare, acţiunea papainei, acţiunea pepsinei). Pepsina poate de ex. să

degradeze enzimatic o moleculă de imunoglobulină, acţionând la nivelul aminoacidului

Leucină din structura lanţurilor grele. Duce astfel la apariţia unui fragment cu greutate

moleculară destul de mare format la rândul său din 2 fragmente Fab unite [acest fragment

poartă numele de F(ab)2].

Fragmentele unei Ig sunt următoarele:

- Fab: prima jumătate a lanţului greu şi întregul lanţ uşor, legate între ele printr-o punte

disulfurică, obţinute sub acţiunea papainei, prin scindarea înaintea regiunii balama, cu un

singur situs de legare;

- F(ab’) 2: cele două fragmente Fab şi regiunea balama, care rezultă după acţiunea

pepsinei, constituie un fragment superior celor două fragmente Fab şi conţine două situsuri

de legare;

- Fc: jumătăţile terminale ale celor două lanţuri grele unite prin punţi disulfurice la

nivelul regiunii balama;

- pFc’: cuprinde fragmentele peptidice rezultate după acţiunea pepsinei, cu întregul

domeniu CH3 situat după aminoacidul 333 al lanţului greu;

- Fd: corespunde primei părţi a lanţului greu după acţiunea papainei, cu formarea

fragmentului Fab, şi după reacţia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanţul uşor;

- Fv: corespunde părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor (VH+VL).

Pentru Ig, noţiunea de domeniu se regăseşte la lanţurile grele în 4 exemplare (IgG, IgA,

IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) şi la lanţurile uşoare în 2 exemplare. Terminologia utilizată

este următoarea:

·       Lanţurile grele:

- VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comună tuturor claselor şi

subclaselor cu aceeaşi specificitate.

- CH 1, CH 2, CH 3 şi CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care

conţine diferenţele pentru fiecare clasă şi subclasă; de exemplu pentru IgG1 există

fragmentele Cg11 , Cg12 şi Cg13 şi pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4.

·       Lanţurile uşoare:

- VL pentru fragmentul uşor variabil (variable light), diferit pentru lanţurile kappa şi

lambda: Vk şi Vl.

183

Page 184: Micro Biologie

- CL pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru

Cl funcţionale.

Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu

determinantul antigenic (epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ)

vine în contact direct cu epitopul şi se numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului

combinativ se numeşte idiotip.

14. 2. Structura particulară a fiecărei clase sau subclase de Ig

IgG

IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser şi are o

distribuţie aproximativ egală în vase şi ţesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu

termorezistenţă mai mare), cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000

(excepţie făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3 domenii constante pentru lanţul greu şi un

procentaj de hidraţi de carbon de 2-3 %. Concentraţia sanguină a IgG este de ordinul 11 g/l,

din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% şi IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul

complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viaţă

intra uterină). Apare în RI secundar.

IgM

Sunt anticorpi aglutinanţi şi reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac

IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producţia lor fiind stimulată de către IL-4, care nu

activează mecanismul de switch izotipic.

IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafaţa LB. Are structură monomerică

şi se termină prin aminoacizii 556-597, cuprinzând în mod particular o parte

intramembranară hidrofobă şi 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare moleculă de IgMm

este asociată cu 2 lanţuri Iga şi 2 lanţuri Igβ. Ansamblul formează BCR (B cell receptor),

comparabil cu TCR-ul limfocitului T.

IgM serică (IgMs) cuprinde un lanţ greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii

constante Cm1 - Cm4 şi un procent ridicat de hidraţi de carbon (12 %). Molecula însăşi este

un pentamer cu un prim inel al punţii disulfurice la sfârşitul lui Cm3, un al doilea la

terminarea lui Cm4 şi un lanţ J (joining chain). Masa moleculară este foarte mare (circa

970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraţia serică este de 1,2 g / l.

Reprezintă circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative

dintre care numai 5 sunt funcţionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu

poate trece prin bariera hemato-placentară. Apare în RI primar.

IgA

IgA serică. Sub forma IgA1 (80%) şi IgA2 (20%), ea se găseşte ca monomer (GM

160.000, 7 S) sau ca dimer sau trimer, ultimele două forme cu lanţul J de joncţiune. IgA2

are o structură originală. Lanţurile uşoare unite între ele printr-o punte disulfurică nu sunt

legate printr-o legătură covalentă cu lanţurile grele. Concentraţia sanguină a IgA este de

2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-184

Page 185: Micro Biologie

placentară. Nu participă la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are

activitate bactericidă mai mare decât IgG şi decât IgM.

IgA exocrină sau secretorie cuprinde două subclase IgA1 şi IgA2. Masa moleculară

este de 400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde două unităţi de

IgA reunite printr-un lanţ J. Acest ansamblu este înconjurat de unitatea secretorie

sintetizată de celulele epiteliale ale tubului digestiv.

Au rol important în apărarea la nivelul mucoaselor (digestivă, respiratorie etc) şi în

reglarea ”compoziţiei” florei microbiene de la suprafaţa acestora. Este important ca nou-

născutul să primească de la mamă colostrul şi apoi să fie alimentat pe cale naturală pentru

a primi IgA (sinteza proprie începe după circa 1 lună de la naştere).

IgD

Are un nivel seric scăzut iar rolul său încă nu este pe deplin cunoscut. IgD se află, mai

ales, la suprafaţa limfocitului B în asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor

activ de diferenţiere celulară şi memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu

poate traversa bariera hemato-placentară. Concentraţia de IgD creşte în ser de la naştere şi

până la vârsta de 15 ani. Creşte în serul femeilor însărcinate.

IgE

Deşi concentraţia lor serică este infimă (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile şi mastocite le

conferă un rol important în inflamaţie şi hipersensibilitatea de tip imediat. posedă, ca şi

IgM, un al patrulea domeniu constant, care îi conferă o masă moleculară de 190.000 D şi un

coeficient de sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixează pe receptor prin intermediul

domeniilorCe2 şi Ce3,într-o poziţie aproape orizontală.

Lanţurile uşoare

Acestea sunt în proporţie de 2/3 lanţuri kappa şi 1/3 lanţuri lambda, excepţie făcând IgD

la care lanţurile lambda sunt majoritare.

14. 3. Determinanţii antigenici ai imunoglobulinelor

Imunoglobulinele inoculate la o specie diferită vor avea rol de antigene şi în această

„calitate” prezintă 3 tipuri diferite de determinanţi sau markeri antigenici.

Izotipia

Determinanţii izotipici sunt prezenţi la toţi indivizii aceleiaşi specii. Ei iau naştere în

cursul diferenţierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obţinuţi prin injectarea Ig umane

policlonale sau monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la

subiecţii cu deficit de IgA după transfuzia de sânge şi stau la originea şocului cu

hipotensiune arterială. Ei pot fi consideraţi anticorpi anti-izotip.

Allotipia

Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumită specie, bazate pe

deosebirea a 1-3 aminoacizi, corespund variaţiei apărute în cadrul respectivei specii. În

mod natural (în lipsa unei injectări prealabile de sânge sau plasmă), se pot găsi anticorpi

185

Page 186: Micro Biologie

anti-allotipici la subiecţii care nu au allotipurile corespunzătoare, la 1% din subiecţii normali

şi la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrită reumatoidă.

Diferitele sisteme cunoscute se notează folosind litera clasei de Ig şi litera K pentru

kappa, urmate eventual de numărul subclasei şi în final litera m pentru marker (ex.

sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km).

IdiotipiaÎn definiţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care

a produs anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o

primă etapă a imunizat un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de

anticorpi numiţi Ab1 împotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu

acest imunoser şi s-au obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau

anti-idiotip Ab1. Aceşti anticorpi nu recunosc decât serul primului animal imunizat şi nu

serul dinaintea imunizării sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeaşi Salmonella. Un

anticorp Ab2 poate recunoaşte mai mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând anticorpii

cu aceeaşi specificitate anti-Salmonella.

Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti-

idiotip Ab2, aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă

reacţia antigen-Ab1 şi Ab2-β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt

numiţi „imagine internă“ a epitopului de plecare E1, ceea ce înseamnă ce au o structură

imunologică asemănătoare, recunoscută de Ab1. Determinanţii antigenici idiotipici se

găsesc la nivelul părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi uneori sunt constituiţi

din cele două lanţuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor

imunoglobulinelor.

14. 4. Proprietăţi fizico-chimice14. 4. 1. Ig policlonale

Termenul de clonă a fost împrumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele

care derivă dintr-o bacterie sunt identice între ele şi cu prima bacterie. În imunologie,

aceasta desemnează toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate

imunologică).

Un răspuns imun „obişnuit” corespunde unui răspuns policlonal cu imunoglobuline:

·         de diferite clase şi subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.;

·         cu două allotipuri, dacă subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3);

·         cu lanţuri uşoare kappa şi lambda;

·         cu diferite specificităţi faţă de antigen, în recunoaşterea diverşilor determinanţi

antigenici iar pentru fiecare determinant antigenic, prezenţa unor epitopi diferiţi;

·         cu diferite afinităţi.

Ansamblul sintezei determină o hipergamaglobulinemie difuză datorată heterogenităţii

Ig prezente, corespunzătoare numărului de clone limfocitare diferite, şi se traduce prin

molecule cu încărcătură electrică diferită.

14. 4. 2. Ig monoclonale au următoarele caracteristici:

186

Page 187: Micro Biologie

·         o singură şi subclasă de Ig, de exemplu IgA2;

·         un singur lanţ uşor, de exemplu lambda;

·         un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2;

·         o specificitate unică, ce recunoaşte un anumit epitop;

·         afinitate unică.

Acest aspect poate rezulta din proliferarea benignă (imunoglobulină monoclonală

benignă) sau malignă (mielom multiplu, boală Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig

secretate de clonă au o structură chimică identică, cu mobilitate electroforetică unică,

astfel încât electroforetic proteinele prezintă un vârf cu bază îngustă, iar

imunoelectroforetic se caracterizează prin apariţia celei de-a doua curburi a arcului normal,

având următoarele 3 caracteristici: linie groasă, curbă foarte marcată, poziţie mai apropiată

de imunoserul revelator.

14. 5. Ontogenia imunoglobulinelor

Fătul este capabil să sintetizeze, din a zecea săptămână, cantităţi foarte mici de IgM şi

cantităţi importante din a 12-a săptămână. IgG materne nu traversează bariera placentară

decât după a 20-a săptămână.

în absenţa unei infecţii congenitale (toxoplasmoză, sifilis etc), în sângele nou născutului

se găseşte o cantitate de IgM fetală care nu depăşeşte 10% din valoarea adultului. Nivelul

IgG la nou-născut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ,

de la mamă la făt.

După scăderea nivelului IgG materne (care pot persista până în lunile 3-6 de viaţă şi

chiar până la 18 luni) se observă o sinteză activă a diferitelor clase: IgM are nivel normal la

1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA şi IgE au un nivel normal la 14 ani.

14. 6. FuncţiiProprietăţile fragmentului Fab

Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu

intervenţia egală a domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor.

Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fiecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura

primară, dar apropiaţi în structura cuaternară, contribuie la formarea acestuia.

Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile.

Proprietăţile fragmentului Fc

Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fixat antigenul sau a fost

alterat de căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea

complementului şi recunoaşterea factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea

reactivităţii este următoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4.

Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig.

IgG (cu excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile.

187

Page 188: Micro Biologie

Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai

uşor. Aşa cum am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de

cea maternă, ceea ce indică prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu

traversează placenta, Ig din aceste clase găsite la nou-născut fiind de origine fetală.

Cunoaşterea acestor aspecte este foarte utilă pentru evidenţierea unei afectări intrauterine

sau a unui simplu transfer de Ig materne. În caz de suspiciune de toxoplasmoză

congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti-toxoplasma în serul nou-născutului (au

existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a sarcinii în cazul în care la mamă au fost

identificaţi anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG).

Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un

receptor ascuns în stare nativă pentru C1q, care va fi activat în timpul fixării anticorpului pe

antigen. Acest receptor se află în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o

singură moleculă de IgM pentamerică este suficientă pentru activarea complementului,

datorită celor două situsuri apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin eficace

decât IgM, pentru activarea complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate

una de cealaltă. Calea alternă poate fi activată de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b.

Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule

membranare specifice pentru fiecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor

purtătoare. Se disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixează un monomer de Ig şi

sunt activaţi când antigenul se leagă de anticorp formând o punte între doi receptori cu

slabă afinitate Fc R II şi Fc R III, care nu pot fixa decât complexe antigen-anticorp

multivalente, formate în prealabil.

Celulele purtătoare de receptori pentru Ig sunt:

·         macrofagele, monocitele şi neutrofilele au următorii receptori: Fc g RI, Fc g RII,

Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor

acoperite cu anticorpi IgG;

·         celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxicităţi faţă de

celula ţintă sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependentă (ADCC) (antibody

dependent cellular cytotoxicity). În acest mod celulele NK se pot fixa pe celula ţintă şi o pot

liza;

·         bazofilele circulante şi mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI şi Fc e RII),

inductoare ale hipersensibilităţii imediate;

·         eozinofilele şi plachetele au receptori de slabă afinitate Fc e RII. Plachetele au şi

receptori Fc g care le conferă o activitate antiparazitară;

·         limfocitele au diverşi receptori de slabă afinitate.

Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimerică

sintetizată pe plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează

citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale

glandelor exocrine.

14. 7. Povestiri adevărate188

Page 189: Micro Biologie

Apariţia unor infecţii respiratorii severe la persoane cu deficit de IgA

Cele 2 cazuri prezentate demonstrează importanţa existenţei unor valori normale a

imunoglobulinelor, discutându-se ca şi exemplu concret situaţia IgA. În ambele cazuri,

deficitul imun congenital a fost diagnosticat tardiv, la 2 ani şi jumătate şi respectiv la 5 ani,

cu ocazia unor infecţii respiratorii joase. În nici unul dintre cazuri nu a fost posibilă stabilirea

etiologiei, pentru că s-au administrat antibiotice şi chimioterapice înainte de a se recolta

produse patologice pentru începerea diagnosticului bacteriologic, direct.

Primul caz

Un copil de sex masculin, în vârstă de 5 ani, se internează într-o clinică de pediatrie,

datorită faptului că în cursul internării într-un spital de nivel inferior nu s-a obţinut

vindecarea pneumoniei de care suferea.

Motivele internării au fost: stare generală alterată, lipsa evoluţiei favorabile în cursul

internării precedente.

Istoricul bolii a arătat că este vorba de un copil care a făcut în fiecare an mai multe

infecţii respiratorii joase (3-5 / an, în fiecare an) şi mult mai numeroase infecţii acute ale

căilor respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat în finalul anului precedent, cu

simptome respiratorii pentru care părinţii au administrat paracetamol şi picături cu un

decongestiv nazal. După 2 săptămâni, datorită intensificării semnelor respiratorii, medicul

de familie recomandă internarea în cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind

pneumonie cu pleurezie. În spital s-a administrat o asociere de ceftriaxonă cu gentamicină,

dar semnele respiratorii s-au menţinut, apărând în plus semne de insuficienţă respiratorie;

în aceste condiţii copilul se transferă în clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de

gardă relevă o stare generală foarte alterată, dificultăţi în respiraţie, respiraţii frecvente,

tiraj intercostal, lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stâng, submatitate la

percuţie şi raluri crepitante însoţite de frecătură pleurală la auscultaţie în treimea medie a

hemitoracelui stâng. În clinica de pediatrie s-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi lichid

pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au

fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativă. Valorile celorlalte analize de

laborator au fost următoarele: VSH = 85 mm/oră, număr de leucocite = 28.000/mm3 (dintre

care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactivă=9,8 mg/dL. Dozarea

imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de 242

mg/dL pentru Ig M, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a

complementului a fost dozabilă, în cantitate de circa 10 ori mai mare decât valorile

normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari.

Diagnosticul de pneumonie stângă cu pleurezie, probabil de etiologie bacteriană, în

condiţiile unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de

medicamente antibacteriene (ceftriaxonă, amikacină şi teicoplanină) alături de

dezobstruante, menţinerea permeabilităţii căilor respiratorii şi administrare de oxigen. S-au

administrat de asemenea imunoglobuline pe care intravenoasă.

Datorită faptului că în ciuda unei evoluţii favorabile din punct de vedere clinic, semnele

fizice de la nivel pulmonar s-au menţinut iar temperatura nu a coborât sub 38,1ºC, s-a

administrat suplimentar un medicament antifungic evoluţia fiind favorabilă. Tratamentul a

189

Page 190: Micro Biologie

fost continuat timp de 3 săptămâni, după care copilul a fost externat cu recomandarea de a

reveni la control clinic, radiologic şi bio-umoral. La controlul efectuat s-a constatat că

deficitul de IgA nu a fost corectat şi s-a menţinut şi după vindecarea pacientului, fiind

probabil o cauză a patologiei şi nu un rezultat al acesteia.

Al doilea caz

Un copil de sex feminin, se internează la vârsta de 2 ani şi 6 luni într-o clinică de

pediatrie, prin transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorită evoluţiei nefavorabile a unei

pneumonii. S-a născut prematur, după 8 luni de gestaţie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7.

A fost îngrijită în maternitate până la vârsta de 2 luni şi jumătate. Până la vârsta de 2 ani şi

jumătate a făcut repetate infecţii acute ale căilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4

episoade / an).

Motivele internării au fost: febră, tuse şi dispnee.

Din discuţia cu părinţii s-a aflat că tusea şi febra au apărut cu 10 zile anterior internării;

ulterior copilul a început să respire din ce în ce mai dificil. A primit în ambulatoriu ampicilină

(pe cale orală), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru că evoluţia a fost nefavorabilă, mama a

fost sfătuită să se prezinte pentru internare, la spital.

S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evidenţiat: febră (38,3°C),

paloare, număr ridicat de respiraţii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale în

timpul inspirului) şi sindrom de matitate în treimea inferioară a hemitoracelui drept (la

inspecţie, auscultator şi la percuţie). La examenul radiologic s-a văzut opacifierea

neomogenă a jumătăţii inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte

investigaţii se amintesc: VSH= 120 mm/oră, leucocitoză (12.400 / mm3) cu neutrofilie

(75%), hipoxemie (cu scăderea presiunii de oxigen). Imediat după internare s-a administrat

ceftriaxonă, apoi amoxicilină-acid clavulanic în asociere cu ciprofloxacină, fără ca evoluţia

să fie pozitivă. În aceste condiţii, s-a recomandat transferul într-o clinică de pediatrie, de

nivel superior.

Diagnosticul la internare în clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreaptă, sepsis

bacterian.

Examenul clinic la internare a revelat o stare generală profund alterată, prezenţa unui

facies suferind, foarte palid, hipertermie (39ºC), deficit al stării de nutriţie (greutate = 10,7

kg), cianoză peri-oro-nazală accentuată la plâns şi alte eforturi, polipnee (80 respiraţii /

minut), bătăi ale aripioarelor nazale, matitate cu absenţa murmurului vezicular în două

treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat

la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonară efectuată la

internare a evidenţiat opacifierea omogenă a hemitoracelui drept.

Celelalte investigaţii de laborator au avut următoarele valori: VSH = 75 mm/h,

hemoglobină = 8,2 g/dL, leucocitoză (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600

neutrofile/mm3, 63%), modificări ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie

dreaptă importantă, insuficienţă respiratorie acută, insuficienţă cardiacă, anemie, hipotrofie

ponderală. S-a realizat puncţia pleurală (atât pentru a elimina această cauză de presiune

mecanică asupra arborelui cardiovascular cât şi pentru punerea diagnosticului etiologic şi

stabilirea sensibilităţii la antibiotice a agentului sau agenţilor etiologici). S-a recoltat şi

190

Page 191: Micro Biologie

sânge pentru hemoculturi, înainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau

chimioterapice. Lichidul pleural era „sub presiune”; s-au extras cu uşurinţă peste 375

mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost trimise imediat către laboratorul de

bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus în evidenţă rare PMN (2-5 / câmp) şi rari coci

Gram-pozitivi, aşezaţi unul câte unul sau în diplo. Coloraţia Ziehl-Nielsen nu a pus în

evidenţă bacili acid-alcoolo rezistenţi. Atât culturile din lichidul pleural cât şi cele

hemoculturi au rămas sterile. Prin reacţii antigen-anticorp s-a încercat punerea în evidenţă

a prezenţei antigenelor capsulare în lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae,

meningococ), dar reacţiile au fost negative.

Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o

valoare de 160 mg/dL pentru IgM, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3

a complementului a fost dozabilă, în cantitate mai mare decât valorile normale.

În condiţiile obţinerii acestor date clinice, paraclinice şi de laborator, s-au administrat

antibiotice în asociere [iniţial o combinaţie între un glicopeptid şi o cefalosporină de

generaţia a III-a (pentru 2 săptămâni), apoi o combinaţie între vancomicină şi amikacină

(pentru încă 2 săptămâni)], în afară de drenajul lichidului pleural (sub control clinic şi

paraclinic), administrare de oxigen, administrare de lichide, electroliţi şi substanţe nutritive

intravenos. Avându-se în vedere rezultatul dozării imunoglobulinelor, s-au administrat şi

imunoglobuline intravenos. Lent, evoluţia din punct de vedere clinic a fost favorabilă. Pe

partea dreaptă, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost

spitalizat pentru o lună, iar înainte de externare valorile bio-umorale au fost următoarele:

VSH =12 mm/oră, număr de leucocite= 6.500/ mm3 (fără neutrofilie), hemoglobină =

10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL.

Discuţii

Cu excepţia vârstei, au existat o serie de asemănări între cele două cazuri. Ambii copii

au avut în antecedente episoade de IACRS şi IACRI, mai multe / an, în fiecare an, fără

diagnostic etiologic, pentru care au primit tratament la domiciliu, de regulă incluzând

antibiotice sau chimioterapice. Episodul infecţios discutat, datorită evoluţiei grave, a

condus la recomandarea de internare şi în fiecare dintre cele două cazuri internarea a fost

realizată, succesiv, la două nivele spitaliceşti. În ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior,

copii au primit tratament antibiotic înainte de recoltarea produselor pentru punerea unui

diagnostic etiologic. În aceste condiţii nu a fost posibilă nici stabilirea sensibilităţii

microorganismelor implicate şi tratamentul anti-infecţios a fost condus „empiric”, ceea ce

ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului.

În primul caz nu s-a putut emite nici o ipoteză privind etiologia (alta decât „bacteriană”)

iar în al doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis

suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococică.

Tratamentele conduse în ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de părinţi (în baza

„amintirii” unor recomandări medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care să ridice

suspiciunea privind o „cauză de bază” care să explice un număr de infecţii respiratorii,

repetate, mai numeroase decât în mod obişnuit, ne fac să realizăm motivele pentru care

191

Page 192: Micro Biologie

deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate că în ambele cazuri a existat un

deficit absolut în sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar).

Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei

funcţionări a sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor

deficienţe, iar pe de altă parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui

realizat numai după diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice, singura variantă corectă, care poate veni în sprijinul pacienţilor pe care

trebuie să îi îngrijim.

15. Sistemul complementComplementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente,

reprezintă unul dintre principalii constituenţi ai apărării naturale, ai imunităţii umorale şi

respectiv un element important al reacţiei imune survenite ca urmare a formării

complexelor antigen-anticorp (are rol esenţial în răspunsul inflamator). Sistemul

complement (C') reprezintă o componentă normală a serului.

Sistemul complement are o serie de funcţii importante: apărarea nespecifică împotriva

infecţiei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine, favorizarea prin opsonizare a

fagocitozei, chemotactism pentru PMN şi sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune şi

a celulelor apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă şi la creşterea permeabilităţii

capilarelor, stimularea contractilităţii musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări,

sistemul complement are efecte benefice; totuşi sunt de menţionat şi unele efecte negative

(ex. participă la reacţiile anafilactice, este implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică

etc).

Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice.

Componentele sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale

etc. Substanţele activatoare reprezintă 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l);

componenta C3 este componenta care se găseşte în cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l).

(Tabelul nr. 1)

Sistemul C' se poate activa pe trei căi, respectiv calea clasică, calea lectinică şi calea

alternă.

Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de formarea complexelor

imune (Ag-Ac), dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C

reactivă cuplată cu anumiţi liganzi (Figura nr. 1).

Calea lectinică poate fi activată de lectina care leagă manoza de pe suprafaţa

bacteriilor (MBL, Mannan-Binding Lectin), dar şi de alte proteine asemănătoare.

·         Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imună şi prezintă cel

puţin două situsuri identice de legare specifică a unor structuri glucidice;

192

Page 193: Micro Biologie

·         MBL este o proteină din clasa colectinelor, având domenii lectinice prin care se

ataşază glucidelor şi un domeniu colagen-like. MBL se găseşte în cantitate mică în serul

indivizilor sănătoşi, însă în cazul infecţiilor acute, concentraţia acesteia creşte semnificativ.

S-a constatat că persoanele care au deficit de MBL dezvoltă în copilărie mult mai multe

infecţii decât copiii normali, lucru ce atestă importanţa apărării organismului prin activarea

complementului pe calea lectinică la vârste la care sistemul imun nu s-a constituit în

totalitate din punct de vedere funcţional.

Interacţiunea acestora formează un complex asemănător celui format în primele

subetape ale căii clasice (C1qrs) şi activează calea clasică fără a necesita prezenţa

complexelor antigen-anticorp.

·         Pe lângă MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri

antigenice, să declanşeze activarea complementului pe calea lectinică. Aceste proteine

sunt ficolina-1, ficolina-2 şi ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compuşi acetilaţi prezenţi pe

suprafaţa microorganismelor. Dintre MBL şi ficoline, cea mai abundentă în plasmă şi cea

care intervine cel mai adesea în declanşarea căii lectinice, este ficolina-3, numită şi

antigenul Hakata sau β-2 macroglicoproteina termolabilă. (1)

Calea alternă poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri, paraziţi, venin de viperă,

produşi de coagulare, celule tumorale etc.

Calea clasică şi calea alternă (alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale

efectoare comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr.

3). În fiecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum

şi receptorii pentru complement. Aceste elemente se găsesc fie în plasmă fie la nivelul

peretelui celulelor autologe sau omologe.

În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare

componentă studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră,

de la C1 la C9, care este eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită

subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 există C1q, C1r şi respectiv C1s).

Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt

fragmentate, aceste fragmente fiind desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale

(exemplu C3a şi C3b). În general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a,

fragment înglobat într-un complex proteolitic şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi

se fixează la nivelul structurii ţintă, în timp ce componenta a este mai mică, este solubilă şi

posedă o activitate anafilactoidă sau chimiotactică.

Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate în cursul cascadei de activare a

complementului, care prezintă receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile,

trombocite şi au efect proinflamator. Cea mai puternică dintre anafilatoxine este C5a.

Acţiunile anafilatoxinelor sunt de tipul:

·         contracţie a musculaturii netede,

·         creştere a permeabilităţii vasculare,

·         degranulare bazofilică şi mastocitară,

·         chemotactismul şi activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea

enzimelor litice şi a radicalilor liberi.

193

Page 194: Micro Biologie

Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c şi C3d).

Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele

sistemului complement sunt prezentate în tabelul nr. 1.

15. 1. Calea clasicăActivarea sistemului complement

Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanşa activarea lor este

necesar un stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către

complexele antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4)

sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunzând subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3.

Complementul poate fi activat de o singură moleculă de IgM sau de către două molecule de

IgG apropiate una de alta. Activarea este posibilă şi în cazul unor molecule de IgG agregate.

În mod asemănător, calea clasică poate fi activată şi de către unele microorganisme

sau diferite substanţe chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria

spp.), retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparină-protamină etc.

În cursul activării intervin următoarele proteine:

C1. În sângele circulant există un complex plurimolecular ce conţine o moleculă de C1q

(moleculă ce aparţine familiei colectinelor, precum MBL), două molecule de C1r şi două

molecule de C1s, situate în jurul ionilor de calciu şi asociate inhibitorului C1, denumit C1inh.

La persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activează cronic în mod

spontan, provocând episoade severe şi recurente de edem – edem angioneurotic.

Compusul C1q, cu o greutate moleculară de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet

de 6 lalele. Fiecare „floare” este la rândul său compusă din 3 lanţuri de proteine alipite şi

terminate în mod globular. Fixarea C1q prin mai puţin de două părţi globulare periferice pe

fragmentele Fc ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din

complexul plurimolecular. Acest fenomen antrenează pe de altă parte autoactivarea

moleculelor C1r şi C1s. Componenta C1s are o activitate serinesterazică, prin care poate să

cliveze următoarele 2 componente: C4 şi C2.

C4 este fragmentat în C4a, moleculă mică, cu activitate anafilactoidă şi respectiv C4b,

de dimensiuni mai mari, care se leagă printr-o legătură covalentă fie de fragmentul Fab al

anticorpului fie la nivelul peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (străine, proprii

modificate, infectate etc). Ansamblul formează complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b.

C2. Aceeaşi esterază (C1s) împreună cu fragmentul C4b, clivează o moleculă de C2 în

C2b (o moleculă mică, cu activitate de tip kinină) şi în C2a (molecula de dimensiune mai

mare, care se leagă de structura ţintă). Ansamblul necesită prezenţa Mg2+şi formează C3

convertaza căii clasice sau C4b2a. În acest moment, anticorpii şi respectiv componenta C1

pot să se detaşeze de structura ţintă, iar procesul poate continua.

C3 este clivată în C3a şi C3b de către C4b2a. C3a este o moleculă mai mică şi are, în

mod primordial, o activitate anafilactoidă şi chimiotactică, în timp ce subcomponenta C3b

se fixează pe structura ţintă datorită unei punţi realizate între un radical tioester şi o

grupare (-OH) sau (-NH2) de pe suprafaţa celulară acceptoare. Pe de altă parte, C3b poate fi

inactivat de factorul I (rezultând C3bi), iar apoi clivat într-o moleculă mare C3c (liberă) şi o

194

Page 195: Micro Biologie

moleculă C3dg restantă pe structura ţintă, care poate apoi să se transforme în C3d. C3b

format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasică. (Figura nr. 1)

Calea clasică de activare a complementului poate fi amplificată foarte mult. Fiecare

complex antigen-anticorp leagă o moleculă de C1, iar C1s în stare activă clivează până la

100 molecule de C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataşază complexelor

antigen-anticorp. C3 convertaza căii clasice clivează mii de molecule de C3. Aceste lucru

dovedeşte imensa capacitate de amplificare a acestui lanţ de reacţii biochimice.

15. 2. Calea alternă şi calea de amplificare

Calea alternă constituie una dintre primele linii de apărare a organismului față de un

agent patogen, înaintea constituirii răspunsului imun.

Această cale poate fi activată de către diferite microorganisme, de componente ale

acestora, de numeroase substanţe neimune, spre exemplu:

·         bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative,

virusuri (dar şi celule infectate sau transformate de către virusuri), fungi (ex. Candida

albicans), paraziţi (ex. Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi),

·         endotoxine bacteriene,

·         alte substanţe (insulină, hemoglobină, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri,

unele substanțe de contrast utilizate în radiologie, venin de viperă sau veninul altor şerpi

etc.).

Calea alternă poate fi activată de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.

Printre componentele căii alterne se numără:

C3. În plasmă, prin proteoliza spontană a C3, sunt formate în permanenţă mici cantităţi

de C3b. Moleculele de C3b se fixează de suprafeţele acceptoare, în particular de peretele

microorganismelor sau de celulele infectate şi alterate. Câteva bacterii, a căror structură

este bogată în acid sialic, pot evita acţiunea sistemului complement. La rândul său, C3b

acţionează asupra factorului B.

Factorul B. Element al căii de amplificare, factorul B este clivat în Ba şi Bb. Complexul

C3bBb, format în prezenţa ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativă, care

clivează noile molecule de C3 în C3b. Acest clivaj accelerat de C3, dă naştere C5-

convertazei (C3bBb)n.

Factorul D, factor prezent sub formă activă în ser înainte de activarea C’, clivează

factorul B, ceea ce facilitează formarea complexului C3bBb.

Ansamblul factorilor activatori ai căii clasice şi alternative realizează o buclă de

amplificare, care permite transformarea numeroaselor molecule de C3 în C3b astfel încât

C3b să acopere (opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)

15. 3. Calea finală comună

195

Page 196: Micro Biologie

Calea finală comună mai este numită şi calea efectoare sau calea litică. Activarea

începe de la C5-convertaza căii clasice (C4b2a-C3b)n şi respectiv de la (C3bBb)n în cadrul

căii alternative.

Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al

membranei (Membrane Attack Complex), MAC):

C5. Convertazele-C5 pentru calea clasică şi respectiv pentru calea alternă clivează C5

în C5a, molecula mică, liberă şi C5b, molecula mare care se fixează pe structura ţintă. Atât

C5a, cât şi molecula care rezultă în urma transformării sale în C5-dezarginină, acţionează la

nivelul receptorului C5a-R al mastocitelor şi bazofilelor.

C6, C7, C8. C5b antrenează legătura dintre C6 şi C7, formând un complex C5b67 notat

prescurtat C5b7. Complexele C5b7 se leagă de o moleculă de C8 care se implantează în

membrană apoi mai multe molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m.

C9. Această proteină are două proprietăţi: 1. de a se insera la nivel membranar, graţie

unei feţe hidrofobe; 2. de a polimeriza, formând astfel peretele unei soluţii de continuitate

de circa 10 nm în diametru la nivelul membranelor celulelor ţintă (limfocitul T utilizează o

substanţă numită perforină, cu efect asemănător cu cel produs de C9). Formarea sau

fixarea complexului C5b9 în cantităţi sublitice la suprafaţa celulelor antrenează sinteza şi

eliberarea mediatorilor inflamaţiei (leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3)

Există o serie de mecanisme de reglare a activităţii sistemului complement, acestea

fiind mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat în cursul cascadei de

activare, având capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2)

În general, aceste proteine inhibă formarea C3 convertazei sau promovează disocierea

ei (când aceasta deja s-a format).Decay Accelerating Factor (DAF) – „Factorul de accelerare

a disocierii C3 convertazei” este o proteină care poate dezactiva C3 convertaza căii clasice,

dar are şi rolul de a inhiba formarea ei, nepermiţând elementelor C2a şi C4b să

interacţioneze. Împreună cu CR1 (complement receptor 1), DAF competiţionează cu factorul

B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei căii alterne. Acest

complex DAF-CR1 poate să disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza căii

alterne.

Factorul H are acţiune similară.

Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte şi Factorul I, o protează din plasmă

care clivează C3b în mai multe situsuri, inactivându-l. Iniţial rezultă C3bi, apoi C3c şi C3dg

(fragment ce rămâne ataşat membranei celulare).

Properdina (factorul P), în contrast cu toţi compuşii enumeraţi anterior, intervine în

reglarea sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei căii alterne. Deficienţele

de properdină au fost asociate cu creşterea susceptibilităţii faţă de infecţiile provocate

de Neisseria spp.

15. 4. Receptorii pentru complement (CR)

Cei mai importanţi receptori recunosc C3b sau derivaţii săi C3bi şi C3d.196

Page 197: Micro Biologie

CR1 (CD35) sau receptorul pentru C3b

CR1 sau receptorul pentru C3b şi C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile,

eozinofile, monocite şi macrofage, limfocite B şi T4 precum şi la nivelul podocitelor

glomerulare. Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul

globulelor roşii spre macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de altă parte, fenomenul

de aderenţă imună realizat prin intermediul macrofagelor de particulele încărcate cu C3b,

permite fagocitoza complexelor şi eliminarea lor. Dacă sunt prezenţi şi anticorpii, această

acţiune este decuplată, graţie acţiunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menţionat

că CR1, prezent pe celulele dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului

situat în cadrul complexului imun acoperit de componente ale complementului.

CR1 acţionează drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin

în reglarea acţiunii complementului. (2)

Variaţiile expresiei genetice a CR1 se corelează direct cu apariţia lupsului eritematos şi

formelor severe de malarie. În prezent este speculat scopul terapeutic pe care îl are CR1

solubil. (3)

CR2 (CD21) sau receptorul pentru C3d

Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare

dendritice şi pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antrenează stimularea şi proliferarea

limfocitelor B prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite

prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel

faringian şi respectiv infectarea ulterioară a limfocitelor de către virusul Epstein-Barr se

realizează prin intermediul acestui receptor.

CR2 este implicat direct în inducerea răspunsului imun umoral primar.

CR3 (CD11b/CD18) sau receptorul pentru C3bi

CR3 sau receptorul C3bi se găseşte pe monocite, macrofage, neutrofile şi pe celulele

foliculare dendritice. El permite fenomenele de aderenţă imună precum şi fagocitoza

particulelor acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody

dependent cell-mediated cytotoxicity).

CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice.

Are un rol important în stabilirea adeziunii dintre leucocite şi endoteliu, fiind presuspus

faptul că CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula

endotelială. (4)

CR3aR, C4a, C5a, C1q, HR

Există, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) şi C5a

(C5aR) la nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor şi trombocitelor.

Aceşti receptori activaţi antrenează fenomene inflamatorii, activând aceste celule şi

permiţând eliberarea substanţelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul

pentru C1q (C1qR) precum şi receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza

particulelor opsonizate.

197

Page 198: Micro Biologie

15. 5. Rolul biologic al sistemului complement

Sistemul complement prezintă numeroase activităţi biologice:

15. 5. 1. În inflamaţie sunt implicaţi diferiţi compuşi solubili de talie mică. C3a şi C4a

au o masă moleculară apropiată de 10.000 Da şi sunt numite anafilatoxine. Ele pot să se

fixeze pe bazofile şi pe mastocite atrăgând eliberarea de histamină precum şi vasodilataţie,

unul dintre primele elemente ale răspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabilă să

crească permeabilitatea vasculară. C5a posedă o activitate chimiotactică pozitivă faţă de

neutrofile şi conduce la agregarea polinuclearelor, în urma activării complementului.

Complexul C5b7 fixat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea acţiune

chimiotactică pentru polinucleare.

15. 5. 2. În apărarea anti-infecţioasă. Agenţii infecţioşi extracelulari pot fi acoperiţi de

componente ale sistemului complement fie în urma activării directe (calea alternativă

activând direct C3), fie prin intermediul anticorpilor care fixează complementul. În final,

complexele de atac ale membranei (componentele C5-C9) lizează diferite microorganisme:

bacterii, virusuri sau paraziţi. Aceasta reprezintă o activitate citolitică directă a

complementului cu sau fără prezenţa anticorpilor.

Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot fi acoperiţi de C3b sau C3bi care

sunt recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare

esenţiale: neutrofile şi macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele.

Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului:

ex. prezenţa unei capsule care împiedică activarea căii alternative (S. pneumoniae,

Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substanţe care fixează C3b sau antrenează o

rezistenţă la inserţia complexului de atac al membranei.

15. 5. 3. În metabolismul complexelor imune. Curăţarea (clearance-ul) complexelor

imune este facilitată în mare măsură de către sistemul complement. Simpla fixare a

complementului inhibă formarea complexelor imune de talie mare (calea clasică) şi le

solubilizează. Totuşi complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi

pot fi transportate până la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are

proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Această proprietate stă la baza

diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante.

15. 5. 4. În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d

sau C3dg (CR2).

15. 5. 5. În inducerea secreţiei de citokine de către monocite şi macrofage prin

intermediul receptorilor C3. (5)

Sistemul C' poate acţiona în sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurcă,

cobai se poate folosi în reacţii de diagnostic în microbiologia medicală, sistemul indicator

provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) şi din această cauză a fost şi este încă

folosit în foarte multe situaţii. Trebuie însă reţinut faptul că sistemul C' se degradează rapid

198

Page 199: Micro Biologie

la temperaturi mai mari de 56ºC şi din această cauză reactivii care conţin C' trebuie

menţinuţi la rece (0ºC) inclusiv pe timpul transportului.

15. 6. Povestiri adevărate15. 6. 1. Infecție gravă cu SGB în cazul deficitului de complement

Streptococii de grup B (Streptococcus agalactiae) reprezintă o cauză frecventă a

infecţiilor grave la nou-născuţi şi copiii mici. Prognosticul cel mai nefavorabil îl au sepsisul şi

infecţiile localizate la nivelul sistemului nervos central. În special în sepsis, dar şi în cazul

meningitelor, evoluţia poate fi către şoc şi insuficienţă multiplă de organ (eliberarea

sistemică a TNF-α, de către monocite şi macrofage este corelată cu gravitatea şi riscul

evoluţiei către deces). Gravitatea infecţiilor este însă dependentă şi de imaturitatea

mecanismelor de apărare la vârste mici. Se poate constata o insuficientă producţie de PMN

neutrofile, o activitate mai scăzută a sistemului complement, un procent mai însemnat de

limfocite T „naive”.

Deşi sinteza elementelor care formează sistemul complement începe relativ repede, în

perioada fetală (între săptămânile 6 - 14 de viaţă intrauterină), concentraţia acestora la

naştere nu depăşeşte jumătate din cea de la adult.

Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezintă o etapă

esenţială în cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement

reprezintă „punctul de convergenţă” între calea clasică şi calea alternativă (alternă). C3

favorizează fagocitoza prin structuri care se ataşează suprafeţei bacteriene şi sunt

recunoscute de anumiţi receptori. Pe suprafaţa neutrofilelor sunt expuşi receptorii CR1

(CD35) - care se leagă de componenta C3b. Neutrofilele prezintă şi receptori CR3.

Comparativ cu configuraţia receptorilor la adult, neutrofilele nou-născuţilor sunt deficitare

în exprimarea CR3.

Un studiu recent a demonstrat că blocarea (la adult) receptorilor CR3 împiedică buna

desfăşurare a proceselor de opsonizare şi fagocitoză. Acelaşi studiu a emis ipoteza că

depozitarea unor anumiţi compuşi de clivare ai C3 pe suprafaţa streptococului de grup B ar

fi un factor important în apărarea gazdei împotriva agravării infecţiei.

Alte experimente au arătat că la şoriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF-α indusă de

streptococ este semnificativ redusă. În concluzie, calea alternă a complementului şi factorul

C3 ar putea reprezenta cheia eliberării de TNF-α. Abilitatea streptococului de grup B de a

activa sistemul complement a fost demonstrată în vitro.

Deşi se ştie că nou-născuţii prezintă concentraţii relativ mici ale complementului, în

mod aparent calea alternă este suficient de activă încât să amplifice eliberarea de TNF-α în

cazul infecţiilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au

certificat creşterea marcată a eliberării TNF-α de către monocitele nou-născuţilor.

Având în vedere că eliberarea de TNF-α ca răspuns la infecţiile grave cu streptococ de

grup B pare să aibă o strânsă legătură cu fiziopatologia acestor infecţii, se consideră că

terapia adjuvantă imunomodulatoare administrată cu scopul de a reduce activitatea pro-

199

Page 200: Micro Biologie

inflamatorie a streptococului ar putea fi eficientă. O astfel de terapie ar include şi

modularea căii alterne a complementului.

15. 6. 2. Consecințe ale deficitului de properdină

Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul

imunităţii nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu

deficienţe ale acestor compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de

hipersensibilitate.

Un subiect îndelung studiat îl reprezintă deficitul de properdină şi predispoziţia

persoanelor care posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria.

Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului,

singura care reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii

alterne. Concentraţia serică fiziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, fiind un amestec

de monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri în raport de 1:2:1.

În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în

asociere cu o infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această

problemă, s-a ajuns la concluzia că există 3 tipuri diferite de deficit de properdină

(observate clinic la indivizi diferiţi). Primul tip se caracterizează prin absenţa proteinei în

plasmă. Cel de-al doilea se manifestă printr-un titru foarte scăzut al properdinei, iar cel de-

al treile tip presupune o concentraţie serică normală, dar o variantă nefuncţională a

proteinei.

Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte dificil de făcut. Pe lângă

testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al

pacientului şi al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de

properdină este rar întâlnit, însă prezent în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în

cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o altă populaţie. Formele de deficit

de properdină sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoaşte deja, în toate trei

tipurile bolii, care sunt mutaţiile ce survin şi unde sunt acestea localizate.

Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în

toate tipurile deficitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii

sunt W-135 şi Y, mai puţin serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a

dezvoltat metode mai eficiente de apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu deficit

de properdină au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecţie meningocociă

decât restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală, şansele cele mai mari de a

face infecţie cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdină,

vârful riscului dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de

cazuri este de până la 75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt

ce atestă că probabil apărarea umorală devine mai eficientă la aceste persoane.

Pacienţii cu deficit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent

antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul

generând anticorpi anticapsulari ce devin eficienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea

bună este că nu la toţi pacienţii la care este detectat deficitul de properdină se dezvoltă

infecţii meningococice. Acest lucru a sugerat că există şi alţi factori adiţionali care

200

Page 201: Micro Biologie

favorizează predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la o parte dintre

indivizii cu deficit de properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă

aminoacidică de pe lanţul g al moleculei de IgG2 specifică fiecărui individ). Se speculează

că această combinaţie: deficit de properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei

relevant care explică de ce indivizii afectaţi prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii

de infecţii meningococice.

15. 7. Verificați-vă cunoștințeleUrmatoarele întrebări au un singur răspuns corect.

1. C3 convertaza:

A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anafilactoidă

B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi

funcţie

C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b

D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack

Complex)

E. nici un răspuns nu este corect.

2. Afirmaţia adevărată este:

A. sistemul complement este una dintre componentele implicate în apărarea nespecifică

B. nu există nici o bacterie care să poată scăpa de acţiunea sistemului complement,

întrucât toate bacteriile reprezintă structuri non-self care generează un răspuns imun

C. calea clasică de activare a complementului presupune interacţiunea componentei C1q cu

paratopii (Fab) anticorpilor din complexele antigen-anticorp

D. componentele sistemului complement se găsesc permanent în ser în stare activă,

pregătite pentru a interveni ori de câte ori apare un agent patogen

E. răspunsurile de la punctele A și C sunt adevărate.

3. Receptorii pentru complement:

A. sunt proteine circulante în ser care se pot combina cu structurile complementului pentru

a fi transportate către splină

B. se găsesc pe toate celulele din organism

C. sunt proteine prezente în membrana celulelor imunitare care intervin în multiple roluri

ale sistemului complement (cum ar fi transportul eritrocitelor senescente către splină sau

ficat)

D. sunt doar de două tipuri şi prin intermediul lor, moleculele de C3b pot opsoniza celula

ţintă

E. nici un răspuns nu este corect.

201

Page 202: Micro Biologie

4. Calea comună de activare a sistemului complement:

A. are ca rezultat formarea C3 convertazei

B. poate fi inhibată de către properdină

C. este amplificată sub acţiunea DAF (Decay Accelerating Factor)

D. debutează prin scindarea componentei C5 sub acţiunea C5 convertazei

E. toate răspunsurile sunt corecte.

5. Care dintre componente activează cel mai uşor calea clasică?

A. complexele antigen-anticorp

B. bacteriile care au un conţinut bogat în manoză la nivelul peretelui celular

C. bacteriile încapsulate

D. celulele tumorale

E. sunt corecte răspunsurile A și D.

16. AntigeneleAntigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun.

Alţi autori consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun

(imunogenicitate) şi să fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul

imun (RI) tinde să neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat.

Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt definite drept substanţe imunogene.

Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot

declanşa activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene

numai dacă se combină cu macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen

incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic

rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o haptenă. Pot apărea reacţii de

hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură şi numai în

condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică

de codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel

RI.

Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat

activ, imediat.

Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt

imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva

microorganismelor sunt diferite dar pot fi deduse în funcţie de structura şi caracterele de

patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstrează

202

Page 203: Micro Biologie

faptul că între capitole diferite există legături importante, iar noțiunile citite și

înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile, ulterior.

Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip

micobacterian și spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate

fără invazivitate și invazivitate fără toxicitate). (Figura nr. 1)

Recunoaşterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun,

preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de

peptide antigenice diferite şi nu sunt specifice unui antigen în mod particular.

Moleculele simple precum apa, sărurile minerale şi ureea sau comune majorităţii

speciilor (ca acizii graşi, creatinina, mono- şi dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de

altă parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariţia

hipersensibilității, sau medicamentele, pot deveni antigene după ce se asociază cu diferite

macromolecule.

16. 1. Clasificarea antigenelor16. 1. 1. În relaţie cu subiectul în care are loc RI

Heteroantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat,

provenite de la o altă specie. Imunizarea este cu atât mai uşor de obţinut cu cât între specii

diferenţele sunt mai mari şi îndepărtarea filogenetică este mai importantă. Termenul izotip

indică un caracter comun tuturor indivizilor unei specii, şi, în acelaşi timp, corespunde

unuixenoantigen pentru celelalte specii.

Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt

obţinuţi prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip.

Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la

animalul imunizat sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune. În mod normal, un

individ nu declanşează un răspuns imun împotriva structurilor proprii. Un răspuns autoimun

se poate obţine prin imunizarea animalului cu substanţe proprii împreună cu adjuvanţi sau

prin injectarea unor substanţe self uşor alterate.

Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau

anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat.

16. 1. 2. În relaţie cu tipul de răspuns imun

Antigenele timodependente

Răspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal

timectomizat în timpul vieţii intrauterine sau la naştere, la şoarecele nud, timectomizat sau

203

Page 204: Micro Biologie

la un subiect cu maladia di George, caracterizată prin absenţa congenitală a timusului.

Antigenele timodependente sunt în general de natură proteică dar pot fi şi de natură

glucidică. Ele induc un răspuns primar iniţial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un

răspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obţinerea sa, sunt necesare 3 celule

(o celulă prezentatoare de antigen, un limfocit T helper şi un limfocit B) sau 2 celule (atunci

când LB joacă şi rolul de APC).

Antigenele timoindependente

Producerea de anticorpi faţă de antigenele timoindependente nu necesită prezenţa LT.

Antigenele sunt în general glucide cu determinanţi antigenici repetitivi, cu o metabolizare şi

o rată de degradare lentă.Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care

au aceeaşi structură glucidică repetitivă dispusă de-a lungul peretelui celular. flagelina,

antigen proteic cu determinanţi antigenici repetitivi, face parte din antigenele

timoindependente.

16. 1. 3. În funcţie de repartiţia antigenelor în natură

Existenţa anticorpilor „naturali” şi a celor apăruţi în urma unui răspuns imun face

necesară divizarea antigenelor în două categorii:

Antigene ubicuitare: Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg răspândite în

natură. Prezenţa lor în bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare în primele luni de

viaţă. Răspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A şi anti-B sunt

din clasa IgM, uşor adsorbabili de substanţele A sau B salivare. Aceşti anticorpi, consideraţi

alloanticorpi în cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi.

Antigene restrânse: Unele antigene sunt limitate la o singură specie şi la un singur tip

celular (un exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii apăruţi în urma răspunsului

imun nu apar decât după contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, după o

transfuzie sau după pasajul hematiilor fetale în sângele femeii gravide.

16. 1. 4. În funcţie de natura chimică

Polizaharidele ca şi partea glucidică a glicoproteinelor sunt în general antigene.

Exemplele cele mai cunoscute sunt antigenele care definesc grupele sanguine (la acestea,

specificitatea este dată de diferitele zaharuri) şi antigenele clasice ale diferitelor

microorganisme.

Antigenele lipidice îşi datorează antigenicitatea cuplării cu părţi glucidice sau proteice,

aşa cum este cardiolipina, extrasă din mitocondrii, faţă de care apare reacţia imună în

sifilis.

204

Page 205: Micro Biologie

Atunci când au o greutate moleculară mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau

proteinele devin antigene şi imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina

(greutate moleculară 1.000, cu doar 9 aminoacizi).

Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene şi imunogene.

Lipidele cuplate cu zaharuri formează lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de

ex. în peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio

spp., Brucella spp. etc).

Obţinerea de anticorpi anti-acizi nucleici după imunizarea unui animal este dificilă. În

unele afecţiuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observă diferite tipuri

de anticorpi anti-acizi nucleici.

Compuşii sintetici cu structura cea mai variată pot fi antigene dacă greutatea lor

moleculară este suficient de mare sau dacă sunt legaţi de proteine purtătoare („carrier”).

Compuşii sintetici au importanţă în determinarea imunogenicităţii şi specificităţii

antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de

reacţia „alergică” din patologia umană (ex. hipersensibilitatea de tip I faţă de beta-

lactamine).

Superantigenele sunt molecule care se leagă în exteriorul moleculelor MHC II şi de o

secvenţă peptidică din familia TCR; aceste molecule, fără a fi recunoscute specific,

acţionează pe numeroase clone celulare T cu structură comună. Această proprietate a fost

observată la enterotoxinele stafilococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consideră

că superantigenele pot avea un rol în inducerea bolilor autoimune.

16. 1. 5. În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac

În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac formaţi în cadrul acestui

RI, antigenele pot fi:

- Ag complete (majoritatea) care pot declanşa RI şi pot reacţiona cu Ac apăruţi;

- Ag incomplete care nu pot declanşa RI dar pot reacţiona (in vitro) cu Ac; sunt de ex.

epitopi izolaţi, nelegaţi de grupări purtătoare (pot fi haptene).

16. 1. 6. În funcţie de specia microorganismului implicat

Antigenele bacteriene includ substanţe legate de corpul celular (proteina M a

streptococului beta-hemolitic de grup A, polizaharidul A de la stafilococul auriu, antigenul O

al bacteriilor Gram-negative, antigenul Vi de la Salmonella typhi, antigenele K şi de tip K de

la bacteriile capsulate, antigenele H ale bacteriilor ciliate) sau eliberate sub formă de

exotoxine sau enzime extracelulare (bacil difteric sau streptococ beta-hemolitic de grup A

205

Page 206: Micro Biologie

dacă sunt lizogenizaţi, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella

shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi și capitolele 2 și 9)

Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din învelişul extern (ex.

hemaglutinine) sau constituie proteine şi glicoproteine structurale.

Antigenele parazitare au un caracter complex şi un aspect mozaicat, datorat de ex.

marii diversităţi a ciclurilor biologice parazitare. La o singură specie parazitară pot fi

evidenţiate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum).

Antigenele parazitare pot fi somatice şi metabolice.

16. 2. Proprietăţile antigenelor16. 2. 1. Specificitatea imunologică

Specificitatea unui antigen este proprietatea de a fi recunoscut prin RI pe care l-a

declanşat şi nu prin RI declanşat de alte antigene, diferite. Toate tehnicile imunologice se

bazează pe această proprietate fundamentală.

Reacţia încrucişată

Deşi specificitatea reacţiei imune este regula, există totuşi şi excepţii, reacţiile

încrucişate, atunci când 2 antigene de origine diferită reacţionează cu acelaşi anticorp

(datorită unei asemănări structurale).

Epitopul este o parte bine definită din structura antigenului, care intră în contact cu

situsul de combinare al anticorpului. Structura corespondentă sau receptorul de antigen al

imunoglobulinei se numeşte paratop.

Determinantul antigenic este un „punct cald” al antigenului, recunoscut în cadrul

diferitelor răspunsuri imune. El corespunde mai multor epitopi centraţi pe acelaşi loc. Într-

un Ag, determinanţii antigenici sunt situaţi frecvent la extremităţi sau în unghiurile

moleculei. Un Ag prezintă în general mai mulţi determinanţi antigenici, fie sub forma

aceleiaşi structuri glucidice repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite,

recunoscute de către sistemul imun.

Numărul determinanţilor antigenici care pot fi recunoscuţi de către sistemul imun

constituie repertoriul imun. Pe baza cunoştinţelor asupra structurii părţii variabile a

imunoglobulinelor, genomul uman codifică pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de

anticorpi diferiţi. În plus, mutaţiile frecvente în linia B aduc posibilităţi suplimentare, lărgind

repertoriul imun. Acelaşi Ac poate recunoaşte mai mulţi determinanţi antigenici diferiţi, cu

afinităţi variabile.

Pe de altă parte, o moleculă de antigen are mai mulţi epitopi (10-20), valenţa

antigenului fiind dată tocmai de numărul acestora (de ex. dacă există 16 epitopi, valenţa

este 16 şi ar putea fixa 8 molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu câte 2 situsuri

combinative). Fiecare epitop este recunoscut şi declanşează un RI şi sinteza de anticorpi

care îl recunosc doar pe el.

206

Page 207: Micro Biologie

16. 2. 2. ImunogenicitateaImunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau

celular.

O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artificială), incapabilă să inducă singură

un răspuns imun dar care poate fi recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul

a fost introdus de Landsteiner în 1930. Haptena are specificitate dar nu are

imunogenicitate. Termenul de haptenă nu este sinonim cu cel de determinant antigenic:

haptena poate fi mai mică, egală sau mai mare ca epitopul.

Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare

cu haptena face ca aceasta să devină imunogenă.

16. 2. 3. AlergenicitateaUnele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să

provoace o reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene

cunoscute sunt polenul, veninul de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau

produse de origine animală.

16. 2. 4. Asocierea cu factorii adjuvanţi

Un adjuvant poate creşte intensitatea răspunsului imun faţă de un antigen la care

acesta este asociat. Adjuvanţii pot fi utili atunci când antigenele sunt eliminate rapid şi nu

există timpul necesar pentru stimularea RI. Pentru ca Ag să persiste cât mai mult, ele sunt

asociate cu aceste substanţe numite generic adjuvanţi (ex. hidroxid de aluminiu,

saponină, adjuvant Freund etc).

16. 2. 5. Răspunsul la mitogenePe lângă răspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie

globală, stimulând diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observă frecvent în cursul infecţiilor

sau inoculării de lipopolizaharide enterobacteriene.

16. 2. 6. Alte efecte ”datorate” antigenelor

Pot apărea şi alte modificări în organismul gazdă, care ţin de răspunsul imun.

Persistenţa activării macrofagelor într-un focar poate determina formarea granuloamelor.

Acestea sunt formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii și

antigene fagocitate sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite și ”celule

epitelioide” (formate din fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferică de celule T,

207

Page 208: Micro Biologie

neutrofile și celule dendritice printre fibrele de colagen. Ȋn cazul tuberculozei (TB) centrul

granulomului este reprezentat de cazeum. În cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu

SIDA sau cu alte stări de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi

afectat, infecţia nu trece în stadiu latent ci rămâne activă. Un alt argument poate fi

reprezentat de următoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocanți ai TNF (de

exemplu, ca tratament simptomatic în artrita reumatoidă) reactivează rapid tuberculoza.

Răspunsul organismului la agresiunea bacteriană se poate solda și cu alte afectări și

chiar distrugeri la nivel tisular, şoc toxico-septic sau reacții de tip Schwartzman. Şocul

toxico septic este provocat de o producere excesivă de citokine în cursul sepsisului, în

special în infecțiile cu germeni Gram negativi și respectiv cu eliminare importantă de LPZ.

Apar febră înaltă, colaps circulator, CID (coagulare intravasculară diseminată), necroză

hemoragică și eventual afectare multiplă de organ (MOF -multiple organ failure). În mod

paradoxal, pacienţii care îşi revin după acest tip de şoc pot dezvolta ”paralizie imună”, fiind

susceptibili unei infecţii secundare.

Reacția Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate să apară experimental atunci

cȃnd, injectând subcutanat o doză mică de endotoxină, rezultă inflamaţie uşoară; ulterior,

la injectarea intravenoasă după 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamată devine

hemoragică în cȃteva ore. Această reacție poate apărea după infecții cu bacterii Gram

negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc.

O a doua injectare după încă 24 de ore de la prima injectare intravenoasă a

endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator şi necroză bilaterală a cortexului

renal. Mai pot apărea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului

digestiv, tromboze și CID. La nivel microscopic apar modificări endoteliale, depozite de

fibrină, acumulare de neutrofile și degranularea acestora. Titrul interferonului se corelează

cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se corelează cu manifestările sistemice. Aceasta

reacţie Schwartzman ar putea să se afle la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita

meningococică sau a şocului septico-toxic.

Organismul uman reușește, de obicei, să mențină o balanţă și nu apar agresiuni (auto-

agresiuni) evidente în cursul infecțiilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare

sunt IL-10 si TGFβ. Există și bacterii care profită tocmai de această balanţă a organismului.

Hemaglutinina şi adenilat ciclaza (factori de virulenţă ai B. pertussis) favorizează secreţia

de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistenţa bacteriene în organism prin inhibarea

TH1. O perturbare a acestei balanţe o poate determina omul prin tratament antibiotic

(auto-administrat sau nu) soldat cu distrugerea masivă a bacteriilor. Poate rezulta un

răspuns inflamator sever cu distrugeri tisulare.

16. 3. Factorii de care depinde imunogenitatea

1. Structura chimică trebuie să fie cât mai diferită (provenind de la o specie cât mai

îndepărtată) faţă de structurile proprii [noţiunea de „structură străină” este de fapt o

noţiune chimică; modificarea unui singur aminoacid din structura primară a unei molecule 208

Page 209: Micro Biologie

proteice va fi „sesizată” ca atare şi va duce la un RI, ca şi cum ar fi vorba de o structură

„nouă” (diferită, străină, modificată)]; cu cât structura chimică antigenică provine de la o

specie mai îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai puternic;

2. Structura trebuie să aibă un grad de „rigiditate” (să se menţină ca atare);

3. Structura trebuie să persiste suficient de mult în organism (în cazul în care respectiva

structură este rapid epurată, nu va duce la apariţia unui RI); în acest sens pot fi date ca

exemplu anumite structuri antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor

îmbolnăviri (vaccinuri), dar care nu persistă suficient de mult în organismul gazdă, motiv

pentru care au fost asociate cu substanţe adjuvante (sărurile de aluminiu au fost folosite în

calitate de adjuvanţi pentru prima dată în 1950, în vaccinul Salk; diferite substanţe

adjuvante sunt utilizate în vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus

influenzae tip b etc);

4. Greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da);

antigenele cu moleculă mică pot stimula răspunsul imun după cuplarea cu o „proteină

carrier”;

5. Structura chimică trebuie să fie cât mai complexă (cele mai imunogene sunt

proteinele iar cele mai puţin imunogene sunt lipidele şi acizii nucleici);

6. Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrării antigenului etc. sunt

alţi factori de care depinde imunogenitatea.

Toţi aceşti factori sunt valabili „în contextul CMH al gazdei” care urmează să

reacţioneze faţă de respectivul antigen.

16. 4. Povestiri adevărate16.4.1. Antigene ... reacții ... apărare ...

Dar care ar fiutilitatea clasificării antigenelor? Diferite categorii de antigene vor ”dirija”

diferit răspunsul imun şi vor încearca să îl ”păcălească”, fiecare in stil propriu.

Prima linie de apărare a organismului este reprezentată de piele şi mucoase, de acizii

graşi secretaţi la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de mişcările cililor

traheali, de fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot

limita invazia bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine.

A doua linie de apărare este reprezentată de răspunsul imun înnăscut (innate), fără

intervenţia LT sau LB. Acțiunea este îndreptată împotriva aşa-ziselor Ag microbiene

comune, reunite sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) şi

cuprinde molecule ce în literatura anglo-saxonă sunt grupate sub denumirea de „patern

recognition molecules” (ex: colectine, ficoline, TLR-Toll like receptor, receptorul manozei,

proteinele NOD, proteina A din surfactantul pulmonar, complementul, PCR - proteina C

reactivă). Spre exemplu, LPZ-ul bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai

importanți reprezentanți ai PAMPs. LPZ se cuplează cu TLR4, activȃnd astfel raspunsul

imun, cu stimularea secreției de TNF alfa, Il-1, creşterea adezivităţii celulare, secreţia de

peptide şi amine vasoactive și scăderea consecutivă a tensiunii arteriale. Bacteriile Gram

pozitive posedă acid lipotechoic şi peptidoglicani (polizaharidele nu au suficient potenţial

209

Page 210: Micro Biologie

imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. Ȋn recunoaşterea

lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor şi spirochetelor intervin LBP și TLR4. TLR4

se mai numește şi CD14. 

Cum se prezintă aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la

suprafaţa celulelor organismului (in special de la nivelul porţilor de intrare) și sunt

îndreptate împotriva patogenilor extracelulari. Dar există și molecule pentru patogenii care

au pătruns în celulă, care se află nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor

(TLR 9) sau solubili în citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori şi Salmonella

spp. generează PAMPs intracelulare. (Film nr. 1)

 

http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0

 

16.4.2. Răspuns imun nespecific ... specific ...

 Răspunsul nespecific presupune:

-activarea complementului pe calea alternativă (bacteriile Gram negative sunt

succeptibile la liza iniţiată de complexul C5b-9)

-eliberarea de citokine proinflamatorii, care cresc proprietăţiile adezive ale sistemului

endotelial (C5a, eliberat în cadrul formării complexului litic, funcţionează pe post de

chemoatractant pentru neutrofile şi mastocite), şi leucotriene care vor crește

permeabilitatea. Macrofagele eliberează TNF și Il-1, care împreună cu chemokinele CCL2,

CCL3 şi CXCL8 direcţionează recrutarea de populaţii leucocitare. TNF, IL-1 și IL-6 iniţiază

răspunsul inflamator acut și cresc producţia de componente ale complementului. PCR

opsonizează bacteriile favorizând fagocitoza acestora. IL-12 și IL-18 stimulează NK sa

produca IFN gama, care va activa macrofagele)

-generează semnale care influențează si răspunsul imun specific (Celulele dendritice

joacă un rol crucial în activarea LT. Activarea acestora în periferie induce migrarea lor la

nivelul nodulilor limfatici, unde creşte exprimarea MHC, a moleculelor co-stimulatoare:

CD40, CD80, CD86 şi a citokinelor ce induc diferenţierea LT. Contactul PAMPs-TLR creşte

producţia locală de IFN gama, IL-12 și IL-18 care vor stimula diferenţierea LT, în special a

TH1)

 

Răspunsul specific se bazează pe activitatea LB şi a LT. Are loc un proces complex de

interacţii celulare cu rol de amplificare a semnalizării iniţiale și de evitare a răspunsului

imun la un semnal fals. LB au în principal rolul de a secreta Ac și de a păstra o memorie a

agresiunilor infecţioase. Anticorpii pot fi suficienţi numai dacă patogenitatea este indusă de

o singură toxină sau moleculă de adeziune iar Ac produşi sunt directionaţi împotriva acestei

molecule cu rol patogen. Anticorpii opsonizanţi sunt importanţi pentru rezistenţa împotriva

bacteriilor extracelulare.

Bacterile patogene pot eluda răspunsul în anticorpi, aşa cum se petrece în

cazul Neisseria gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta în mod repetat cu acest

microorganism, însă în sȃngele său să nu se găsească dovezi ale imunităţii protective. (Film

nr. 2)

210

Page 211: Micro Biologie

 

http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM

 

16.4.3. Dar alte modalități de eludare a răspunsului imun?

 Antigenul O, avȃnd un lanţ polizaharidic lung, poate fixa complementul la distanţă de

bistratul lipidic, astfel încât acesta nu işi poate exercita acțiunea litică. E. coli, Salmonella

spp. și Pseudomonas aeruginosa fixează complementul dar îl ”taie” rapid de pe suprafaţa

celulară. Alte microorganisme exploatează mecanismele fiziologice ale organismului gazdă

pentru a ”păcăli” sistemul imun.

Cȃnd C3b s-a ataşat de o membrană celulară poate interacţiona cu factorul B, care va

amplifica activarea complementului sau poate interacţiona cu factorii H şi I, care vor inhiba

complementul. Prezenţa acidului sialic favorizează interacţia complementului cu factorii H şi

I iar celulele organismului uman reprezintă un mediu bogat în acid sialic. Prin acest mod se

apără Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar şi streptococii beta hemolitici de grup B.

Proteina M a steptococcilor de grup A funcţionează ca un acceptor al factorului H (să nu

uităm că acești streptococi posedă şi o genă ce codifică sinteza unei C5a proteaze).

16.4.4. Leucocite ... macrofage ... fagocitoză ...

Totuşi, împotriva majorităţii bacteriilor este neapărat nevoie de intervenţia fagocitelor.

Fagocitele elimină cea mai mare parte a bacteriilor prin chemotaxie, adeziune, internalizare

şi apoptoză. Activarea optimă a macrofagelor este dependentă de TH1 (CD4+).

Macrofagul este principala celulă prezentatoare de antigen, dar are şi rolul de a secreta

citokine, enzime, molecule ale complementului, are efect procoagulant, produce specii

reactive de oxigen şi NO care sunt foarte toxice, şi endocitează bacterii şi fungi. Rolul său în

ansamblu este de a iniţia, propaga, preveni, supresa şi finaliza răspunsul imun. Macrofagele

se dezvoltă din monocitele circulante (ca şi celulele dendritice mieloide şi osteoclastele) şi

pot exista sub formă ciculantă sau sub formă tisulară. Citokinele eliberate de TH1

stimulează inflamaţia şi activitatea antimicrobiană a macrofagelor, în timp ce citokinele

eliberate de TH2 induc o prezentare antigenică eficientă către LB. TGF beta, corticosteroizii

şi IL-10 induc un fenotip antiinflamator. Macrofagele internalizează patogenii, utilizȃnd o

varietate de receptori (receptorul pentru LPZ, TLR, beta-glucanR, manoseR, receptorii

pentru complement CR1, CR3, CR4). (Film nr. 3)

http://www.youtube.com/watch?v=CHrk0ofcLDo

 Ataşarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin

intermediul TLR, manose receptor (MR),scavenger receptors și dectin-1b sau indirect, după

opsonizarea bacteriei cu Ac, fibronectină, vitronectină sau complement, prin intermediul

CR1, CR3, CR4, MBL, integrine, FcγRI, FcγRII, FcγRIII.

Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) oferă o oarecare protecţie, însă

necesită intervenţia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase în focarul

inflamator de componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de

chemokine şi citokine sintetizate de macrofagele din ţesutul respectiv și de unele celulele

epiteliale. Streptococcus pyogenesva determina leziuni acute şi atragerea la nivelul

focarului infecţios în special a neutrofilelor, în timp ce Mycobacterium

211

Page 212: Micro Biologie

tuberculosis determină leziuni cronice şi va atrage macrofage, LT şi celule multinucleate

derivate din macrofage.

După cum știți, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru

microorganism, dar şi pentru celulele organismului gazdă). O specie reactivă de oxigen se

formează în principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substanţă are adăugat un

electron, care o va face instabilă şi care va determina un şir de reacţii în lanţ în organism.

Studii recente pe neutrofile au demonstrat că speciile reactive de oxigen sunt bactericide şi

indirect (prin inducerea unui flux de K în fagozomi)activează producerea de proteaze.

NO se formează din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate fi indusă de IFNγ și

TNFα, NO fiind tot o specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului

superoxid.

Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile,

de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor

se inseră între lipidele membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va

duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus

aureus,Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina

G şi azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important

pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele îngreunȃnd accesul

microorganismelor la acest element. Ȋnsă, organismul gazdă are nevoie crescută de fier de

vreme ce este co-enzimă pentru generarea NO şi pentru lanţul respirator. E foarte

important de reţinut că neutrofilul are o viaţă scurtă dar este foarte agresiv cu bacteriile, în

timp ce macrofagul are o viață mai lungă, însă neactivat, este un ... prieten al

bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFNγ, iar acesta este

produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+).

Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria

monocytogenes, Shigella spp. şiBurkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug

membrana fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului

fago-lizozom.

 M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele

epiteliale, care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C.

neoformans au un înveliş protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii.

Stafilococii posedă catalază, care scade stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un

glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în general, eliberează

lipoarabinoman, care scade eficienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei

infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi

exercită corespunzător funcţia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza

celulei gazdă.

După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC.

Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fie legat de o

moleculă MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate

pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la

nivelul APC prin fagocitoză sau endocitoză, aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe 212

Page 213: Micro Biologie

MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP,

HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o moleculă asemănătoare MHC I care prezintă antigene lipidice

(M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4)

http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY

16.4.5. Intervenția LT ...

LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă.

S-a demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din

partea LTc şi consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cuM. tuberculosis.

Tendinţele actuale sunt de a găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-

a mai observat că pe lȃngă dependenţa activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi

o dependență de activitatea litică a fagozomilor.

TCR (fie ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ.

Aceste 2 tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2

specii de receptori vor avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi

a timocitelor, iar TCR γδ la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De

aceea s-a ridicat ipoteza conform căreia LT în care predomină TCR γδ să nu aibă neaparat

nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ recunosc fosfoliganzi derivaţi

din M. tuberculosis care le determină activarea).

 Superantigenele activează direct LT, fără a mai fi nevoie de prezentarea lor de către un

APC pe un MHC. Stafilococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol

adaptativ. S-ar putea ca motivul să fie o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea

producerii de anticorpi. Certa e însă toxicitatea determinată de eliberarea masivă de

citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparţinȃnd stafilococcilor este un exemplu

de superantigen. Și proteina M a Streptococcus pyogenes formeză un complex cu

fibrinogenul, complex care se leagă de integrinele de pe neutrofile, determinȃnd eliberarea

în cantităţi mari a mediatorilor inflamatori. Dacă un antigen convenţional activează 0,01-

0,1% LT, superantigenele activează 5-30% din populaţia LT.

16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ...

Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în

2010 relevă o incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care

8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul

de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi,

precum fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1)

HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si

bacteriilor şi au fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei

acestora în condiţii de temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces

infecţios). HSP au rol în asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în

transportul altor molecule. Ȋn timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi

împotriva HSP, atȃt a celor autohtone, cȃt şi a celor bacteriene. HSP activează sistemul

imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 şi anumiţi TLR. Datorită asemănării structurale

între cele 2 tipuri de HSP se presupune că aceste proteine ar avea un rol important în

generarea bolilor autoimune.

213

Page 214: Micro Biologie

Tot timpul ne aflăm sub influenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc

procese fiziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie

ne protejează de germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale.

Dar există şi ”teoria igieniei”, neconfirmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor

microorganismelor, conform căreia şi infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii

patogene este de folos. ”Alergiile” (stările de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale

intestinului subțire şi bolile autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de

igienă, vaccinuri și antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modalități clasice de

apărare împotriva infecțiilor, ci de a afla cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fiecare ”armă” şi

de a cunoaște cȃt mai bine adversarul împotriva căruia o folosim.

16.4.7. Şoc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ?

Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat

şi o durere surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui.

Ȋn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit

amoxicilină. S-a prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i

s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu

amoxicilină şi s-a recomandat prednison.

Este corectă atitudinea dermatologului?

Argumentaţi.

La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate,

dezorientare și durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să fi avut sȃngerări (melenă,

hemoptizie, hemoroizi). Examen și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min,

T:39,7°C, SO2=93%.

La examenul fizic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar,

fără exsudate sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufluri

supraadăugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În

tabel sunt listate determinările biochimice şi hematologice anormale (comparativ, valorile

normale). (Tabelul nr. 1)

Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu

explorările paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult

respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3)

La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică;

febra se menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei

datorită insuficienţei respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină,

exsudat faringian şi se face o puncție lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază

tratament cu clindamicină, vancomicină și meropenem iar pacienta este transferată în

serviciul de ATI.

Comentarii explicative

Ȋn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune

stabilirea diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii:

1)      Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge,

fluid cerebro-spinal, pleural, peritoneal)

214

Page 215: Micro Biologie

2)      Hipotensiune

3)      2 sau mai multe dintre următoarele:

·         Insuficienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod

normal la pacienţii cu boală renală)

·         Coagulopatie

·         Enzime hepatice crescute

·         ARDS (adult respiratory distress syndrome)

·         Rash maculo-eritematos

·         Necroză de ţesut moale.

Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la

2% 1995-2001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că

favorizează TSS. Un articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS

folosiseră anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic.

Diferenţierea între TSS stafilococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție

stafilococică pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insuficienţa

conjunctivală, mialgie severă. Pacienţii cu infecție streptococă pot prezenta necroză de

ţesut moale (celulită, fasciită, abces, miozită), simptomatologie influenza-like, varicelă în

antecedente în cazul celor nevaccinaţi.

Ȋn cazul TSS stafilococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri.

Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt

responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea

determinării Ac anti TSST-1 este de 90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M

nu există teste fiabile. Se poate folosi în schimb titrarea ASLO în dinamică.

Ȋn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi:

·         cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea

TA şi a PVC

·         antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-

lactamine pentru streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru stafilococ;

clindamicina s-a introdus pentru că are un efect mai îndelungat după administrare,

facilitează fagocitoza bacteriei, inhibă liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutivă

suplimentară de citokine în circulaţie).

·         terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate

intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF.

Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul

Ac anti TSST-1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe

antibiotice orale, funcţia renală şi WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografii

toracice zilnice, care au confirmat şi rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externată după 14

zile de spitalizare.

Diagnosticul final: Şoc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.

16. 5. Verificați-vă cunoștințele215

Page 216: Micro Biologie

La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.

1. Care dintre următoarele microorganisme au toxicitate dar nu şi invazivitate?

a) Klebsiella pneumoniae şi Vibrio cholerae

b) Corynebacterium diphteriae şi Vibrio cholerae

c) Escherichia coli şi Salmonella typhi

d) Corynebacterium diphteriae şi Mycobacterium tuberculosis

 

2. Care este răspunsul corect?

a) Administrarea îndelungată de antibiotice nu afectează flora intestinală.

b) Administrarea de antibiotice fără realizarea şi respectarea antibiogramei, fără a ţine

cont de CMI şi CMB nu determină fenomenul de rezistenţă la antibiotice.

c) Cȃnd flora normală este distrusă pot apărea infecţii cu Candida spp. sau Clostridium

difficile.

d) Este mai corect să administrăm probiotice (de exemplu lactobacilii) şi o doză foarte

mare de antibiotic în cazul unei infecţii localizate, decȃt să drenăm chirurgical respectivul

abces sau flegmon.

 

3. Ce este un granulom?

a) o marcă a RIC împotriva bacteriilor intracelulare

b) un tip de modificare anatomo-patologică acută

c) o marcă a RIU împotriva bacteriilor extracelulare

d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare.

 

4. Găsiţi afirmaţia greşită

a)Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot

declanşa activarea limfocitelor

b) Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat

activ, imediat.

c) Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T

sau anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat

d) Autoantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat,

provenite de la o altă specie.

 

5.Iată 3 afirmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai

îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fie cât

mai simplă” și (3) „greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-

5.000 Da)”. Alegeţi varianta corectă dintre urmatoarele:

a) (1) și (3) sunt false

b) (1) și (2) sunt adevărate

c)   doar (3) este adevărată

d) doar (2) este falsă

216

Page 217: Micro Biologie

17. Răspunsul imun umoral şi celular17. 1. Definiţia şi caracteristicile răspunsului imun

Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea

unui Ag, și anume:

·         activarea limfocitelor,

·         eliberarea a diverse molecule,

·         multiplicarea celulelor specifice,

·         producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag şi

să participe la

·         eliminarea acestuia (direct sau indirect).

După acest prim contact (ca şi în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce

limfocitele T şi B de memorie, capabile să reacţioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia

unei reintroduceri ulterioare a aceluiaşi antigen.

Aşa cum a fost menţionat anterior, principala caracteristică a imunităţii

este specificitatea. Pentru a sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este

de a discuta despre „potrivirea dintre cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac. Acest

exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet în comparaţie cu realitatea. O

altă modalitate de a sugera specificitatea răspunsului imun ar fi „potrivirea dintre mâna

aşezată în faţa oglinzii şi imaginea din oglindă”.

Probabil, o modalitate şi mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din

INCDMI ”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că

Ag este reprezentat de o pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând,

un cuvânt ci chiar o singură literă într-un cuvânt de pe o anumită pagină, această

schimbare ar fi sesizată de sistemul imun iar Ac produşi se vor „potrivi” cu această pagină

în care a fost schimbată o singură literă. Totuşi, aşa cum am menţionat la punctul 16. 2. 1.,

există şi reacţii încrucişate.

O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a

discerne între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc

definiţia de antigen (vezi şi MHC/CMH).

Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat

de către celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se

dezvoltă un răspuns imun celular specific prin LT citotoxice şi unul umoral specific prin

anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri

217

Page 218: Micro Biologie

de răspuns. În cazul antigenelor timoindependente, răspunsul imun este umoral. În

continuare vor fi prezentate în mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun umoral şi

celular.

17. 2. Răspunsul imun de tip umoral

Răspunsul imun umoral (RIU) constă în producerea de Ac specifici şi este transferabil

pentru o perioadă de timp (3-6 săptămâni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umorală

intervine în distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea

toxinelor.

Natura antigenelor faţă de care se dezvoltă un răspuns imun umoral include poliozide,

proteine, substanţe sintetice, rareori lipide şi acizi nucleici sau anticorpi (în cazul proceselor

autoimune). Unele antigene („alergenii”) determină un RI cu anticorpi de tip IgE.

Introducerea antigenului pe cale subcutană, intramuscular sau intravenos determină un

RIU cu producerea de IgM și/sau IgG iar administrarea pe cale orală determină un răspuns

preferenţial cu IgA.

După o primă administrare intravenoasă, la un subiect care nu a mai venit în contact

cu respectivul antigen, Ag molecular parcurge următoarele etape succesive:

1. descreşterea cantitativă rapidă, datorată difuziei în spaţiile extravasculare;

2. dispariţia lentă, datorată catabolismului propriu al antigenului;

3. descreşterea rapidă după 8-10 zile, ca urmare a eliminării formaţiunilor imune

(complexele imune) rapid fagocitate.

În cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub formă

de agregate, eliminarea este mult mai rapidă, prin procesul de fagocitoză (care antrenează

o imunizare mai precoce).

În cazul utilizării căii subcutanate, antigenul rămâne, în parte, la locul de inoculare.

Adăugarea unui adjuvant menţine antigenul în acest loc şi favorizează o stimulare

imunologică de durată (eventual şi formarea unui granulom inflamator). În următoarele ore,

antigenul migrează în sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunzători anatomic,

apoi în zona medulară şi în final (24 de ore) ajunge în regiunea corticală, la periferia

foliculilor primari. În interiorul organelor limfoide, antigenul se regăseşte în celulele

fagocitare. În prezenţa anticorpilor preformaţi şi a sistemului C', unele antigene se

localizează la suprafaţa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul

cu antigenul antrenează importante modificări histologice ale organelor limfoide: centri

germinativi se dezvoltă în foliculi şi persistă mai multe săptămâni; în paralel apar atât

imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de memorie; după 3-4 zile se pot detecta

limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi serici.17. 2. 1. Răspunsul imun primar (RIP)

218

Page 219: Micro Biologie

Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de

acesta. Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag.

După primul contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:

·       Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor

Ag către LB (în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului,

calea de administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;

·       Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3

zile; în timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de

stagnare (câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;

·       Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.

De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la

stimulul antigenic primar.

Natura anticorpilor:

·         examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt

de tip IgM (cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce

nivelul IgM scade);

·         în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;

·         în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.17. 2. 2. Răspunsul imun secundar (RIS)Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după

contacte ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:

·         poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;

·         latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere

logaritmică;

·         anticorpii sunt de tip IgG;

·         titrul Ac produşi este mult mai înalt;

·         persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat,

luni de zile).

Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu

memorie. După eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie,

reacţia imună la al doilea contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria

imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifică.

Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:

·         face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi

·         permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).

Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem

şi motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.17. 2. 3. Succesiunea de evenimente în producerea anticorpilorDupă pătrunderea antigenului şi recunoaşterea acestuia ca non-self urmează

fagocitarea şi prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt

reprezentate în principal de celulele dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B.

219

Page 220: Micro Biologie

APC, prin IgM şi IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoaşterea

epitopilor antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de

limfocite B, estimat la 107 posibilităţi; mutaţia somatică conduce la posibilităţi mult mai

mari de diversificare).

Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea şi etapele

următoare ale RIU necesită prezenţa limfocitelor Th CD4+ (cu intervenţia TCR, APC cu

expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 şi moleculele de aderenţă).

După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive),

care  ulterior vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp

se vor diferenția în LTh0 și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de

citokinele produse (vezi și 11.3.1.).

Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-

5 şi IL-6, care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB.

Acest „switch” se realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural,

dar cu aceeași specificitate pentru antigen.

Limfocitele B pot fi activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de origine

polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între

receptorii de suprafaţă şi determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În

lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără

„comutarea” spre IgG.

Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre

stadiul G1 (celula sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de

contactul cu antigenul.

IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 şi G1 şi

creşte expresia moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23,

CD34 şi CD40.

Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din

stadiul G1 în fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5.

Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite;

secreţia de IL-6 ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea

izotipică spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline.

Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu

ajutorul unor molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați

mesageri (”hormoni”) ai imunității.17. 2. 4. Teoria selecţiei clonaleTeoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet.

Această teorie afirmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de

clone de limfocite, fiecare dintre aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri

antigenice (unui anume epitop); în cadrul aceleaşi teorii, Burnet a făcut estimarea că în

lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiţi. Clona, aşa cum se

cunoaşte, este o populaţie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale

unei singure celule „mamă”.

220

Page 221: Micro Biologie

Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură

imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice

(pentru fiecare antigen diferit există un receptor diferit).

Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie”

pe acelea care au receptori complementari (configuraţie spaţială etc) şi astfel determină

proliferarea şi diferenţierea lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au

aceeaşi specificitate pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat.

Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”)

sunt reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la

maturitate. În lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.

17. 3. Răspunsul imun de tip celular

Imunitatea celulară presupune în special dezvoltarea unui răspuns imun faţă de celulele

infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelulară

(mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), paraziţi intracelulari, allogrefe, celule

tumorale.

Un microorganism cu dezvoltare intracelulară penetrează în diverse celule şi în

particular în macrofage (aflate în stare de repaus şi neactivate) şi se poate divide fără ca

acest proces să inducă o reacţie imună celulară naturală şi specifică. Macrofagul care a fost

infectat cu un microorganism secretă o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a şi

TNF-β) care la rândul lor vor acţiona după cum urmează (Figura nr. 2):

·         TNF-a va activa macrofagul infectat;

·         TNF-a, TNF-β vor activa macrofagele neinfectate încă;

·         TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK.

Această primă fază va pune în mişcare celulele imunităţii celulare specifice şi astfel

limfocitele Th0 vor fi activate şi se vor diferenţia în Th1, datorită IL-12, secretată de

macrofage şi a IFN-g, secretat de celulele NK activate.

Antigenele proteice sunt transformate de către APC în peptide de 12-20 aminoacizi.

Acest tip de antigene induce o dublă imunizare celulară şi umorală. Nu a fost încă

demonstrat, complet, RIC faţă de antigenele ne-proteice.17. 3. 1. Etapele răspunsului imun celularImunitatea celulară intervine în mai multe etape succesive.

Răspunsul celular presupune ca antigenul prezentat limfocitelor să fie degradat în

peptide şi asociat cu molecule MHC II. Dintre APC menţionăm celulele dendritice (cele mai

bune prezentatoare de antigen), celulele Langherhans, macrofagele şi limfocitele B

(eficiente numai după stimulare).

Recunoaşterea peptidelor antigenice de către LT helper şi activarea

lor necesită contactul direct între APC şi limfocitele Th, interacţiunea fiind trimoleculară:

TCR, peptide antigenice şi MHC clasa II. moleculele CD4 şi moleculele de adeziune

consolidează această interacţiune. Toate aceste contacte duc la activarea şi multiplicarea 221

Page 222: Micro Biologie

limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizează IL-2 şi lanţul a cu rol de

receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o acţiune autocrină şi exocrină; multiplicarea

limfocitelor T antigen-specifice duce la formarea de clone celulare specifice antigenului.

Generarea limfocitelor T citotoxice

LT CD8+ sunt selecţionate după specificitatea lor faţă de antigen şi activate de

diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil.

Recrutarea altor celule pentru cooperare

Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule

care nu sunt specifice antigenului:

¨             IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de

către CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT

CD8+ şi a celulelor NK;

¨             IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de

celulele NK, activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK

şi le activează funcţia citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu

virusuri (acţiune antivirală).

17. 4. Povestire adevărată17.4.1. Tratamentul în imunosupresie

În stabilirea şi aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodată

uitat rolul răspunsului imun (nici în plus şi nici în minus). De exemplu, pacientului

imunodeprimat trebuie să-i administrezi antibiotice bactericide și nu bacteriostatice.

Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse

motive se restaurează imunitatea, poate face reacţii cu impact fatal asupra evoluţiei. O

infecţie cronică cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor în diverse situaţii, nu

ridică probleme deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creşterea răspunsului imun,

„găseşte” pacientul într-o situaţie în care viremia este „înaltă”. Reacţia imună, recent

restaurată, poate induce leziuni hepatice severe, hepatită fibrozantă colestatică cu

mortalitate uneori până la 90%. Un alt exemplu ar fi pacientul cu infecţie HIV, aflat la

debutul unui tratament antiretroviral. Acesta, datorită aceluiaşi proces de restaurare imună,

poate să dezvolte afecţiuni nemanifeste până atunci, numite sindrom

de reconstrucţie imună, cu mortalitate foarte mare. Aşadar, este necesară o atenţie

deosebită atât în ceea ce priveşte imunodepresia cât şi în cazul revenirii imunităţii.

17.4.2. Stresul și răspunsul imun

Stresul este cunoscut ca având efect inhibitor al răspunsului imun, crescând astfel

susceptibilitatea la infecții și cancer.

Paradoxal, stresul este învinuit pentru exacerbarea astmului și a bolilor inflamatorii și

autoimune, deși astfel de boli ar trebui să fie ameliorate de un anumit grad de

imunosupresie. Mai mult, răspunsul de tip „fight-or-flight” este unul dintre mecanismele

naturale de apărare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal

promovează supraviețuirea, și de aceea este puțin probabil ca acest răspuns la stres să

222

Page 223: Micro Biologie

suprime funcția imună, în momentul în care este esențială pentru supraviețuire. Fără acest

răspuns un tigru nu poate prinde o căprioară, în timp ce căprioara nu ar avea nici o șansă

de supraviețuire. Aceste observații sugerează că stresul poate suprima funcția imună în

anumite condiții și o poate întări în altele. Așadar, efectele stresului pot fi atât benefice cât

și dăunătoare.

Studiile au demonstrat că o serie de factori influențează direcția efectelor stresului:

1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat în timpul activării

imune stimulează atât imunitatatea înnăscută cât și pe cea adaptativa; stresul cronic

suprimă răspunsul imun scăzând numărul celulelor și/sau potențând mecanismele

imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI și prin

promovarea răspunsului proinflamator.

2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în

timpul stresului acut determină imunostimulare;

3. concentrația fiziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura

endogenă vs. sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fiziologică au

efect imunostimulant, în timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și

hormonii sintetici au efect imunosupresor.

4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a

răspunsului imun: imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii

incipiente ale activării imune, iar imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI.

Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în

organism, funcția imună fiind semnificativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în

timpul stresului acut.

Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul

plasmatic al cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură.

Rezultatele arată o creștere semnificativă în numărul celulelor imune înainte de săritură,

urmată de o scădere dramatică la 1 oră după, modificări concomitente cu creșterea

catecolaminelor, respectiv creșterea cortizolului plasmatic. (2)

Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate

ușoară, sau efort fizic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee

(splină, plămâni) și intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul

induce trecerea leucocitelor din sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract

gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici).

Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fiziopatologic persistența RI după

încetarea acțiunii agentului stresor sau activarea repetată.

Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres

pregătind sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție).

17.4.3. Interacțiunea somn – răspuns imun

Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea

consecințelor a fost dificilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifice acesteia, lipsesc.

S-a constatat însă că peste 64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe

223

Page 224: Micro Biologie

cognitive marcate, dar numai câteva semne fiziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile

de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie.

Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu

este foarte clară. Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru

cronic energetic, deteriorarea graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun,

accelerarea catabolismului,  malnutriție putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza

morții șobolanilor deprivați de somn (3 săptămâni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ

anaerobe, prin multiplicare excesivă (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Corynebacterium

jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul

unei stări hipermetabolice și inflamatorie sistemice având ca rezultat sepsisul fără a se

putea pune în evidență un focar septic.

Semnele care certifică prezența unui status de imunosupresie includ absența abceselor

în ciuda colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de

microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.

17. 5. Tipuri de imunitateImunitatea poate fi moştenită (trăsătură de specie, se transmite ereditar) şi dobândită.

Imunitatea poate fi dobândită activ, după contactul cu un anumit antigen (ex.

bacterian). Evenimentul imunologic poate apărea după o infecţie (natural) sau după

administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunităţii dobândite activ este faptul că,

de regulă, protecţia este de durată. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul că

instalarea răspunsului imun are loc lent, mai ales în cazul RIP.

Imunitatea poate fi dobândită şi pasiv, preluând anticorpi produşi de către o altă gazdă.

Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxină difterică / tetanică / botulinică

(artificial) pune la dispoziţia gazdei infectate, imediat, o cantitate importantă de antitoxină,

în vederea neutralizării cât mai rapid a toxinei implicate patogenic. În mod natural, fătul şi

nou născutul beneficiază de protecţie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA

prin colostru, lapte) proveniţi de la mamă. Avantajul imunităţii dobândite pasiv este

rapiditatea, în timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru

care este oferită protecţia iar pe de altă parte, de riscurile unei hipersensibilizări, atunci

când sunt utilizaţi anticorpi provenind de la o altă specie (ex. în cazul administrării de ser

recoltat de la cal hiperimunizat).

Există şi posibilitatea dobândirii unei imunităţi activ - pasiv, atunci când se

administrează concomitent (dar în locuri diferite) ser imun şi un vaccin (ex. în suspiciunea

infecţiei cu Clostridium tetani).

Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent,

imunitatea înnăscută oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar

imunitatea dobândită intervenind mai târziu, pentru a elimina infecția. Însă,interacțiunea

dintre cele 2 tipuri de imunitate este evidentă: imunitatea adaptativă profită de

224

Page 225: Micro Biologie

abilitatea imunității înnăscute de a distinge între agenții patogeni, microbii benefici și

factorii de mediu.

Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în strânsă colaborare (un adevărat

exemplu pentru studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar).

Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente,

celulele NK au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în

plus, au fost identificate celule NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative:

timus și ganglionii limfatici. (4)

17. 6. Definiţia vaccinurilorPornind de la observaţiile şi experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a

fundamentat ştiinţific vaccinurile alcătuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la

punct metodele de neutralizare a toxinelor şi a identificat utilizarea lor ca „anatoxine”.

Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau

inactivate sau 2. cuprinde fracţiuni din microorganisme (subunităţi), în vederea stimulării

mecanismelor de răspuns imun, de regulă pentru prevenirea apariţiei unor infecţii.

Vaccinarea este definită drept o metodă profilactică, care urmăreşte creşterea

rezistenţei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activă, cu stimularea răspunsului

umoral sau celular, după caz. De fapt, vaccinările incluse în programele naţionale de

vaccinare (conform recomandărilor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, OMS) reprezintă

metodele profilactice cu cel mai bun raport între cost şi eficienţă, în comparație cu orice

altă metodă cunoscută.

Strategiile de vaccinare au în vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al

gazdei respective (imunocompetentă sau imunodeprimată).

Unele vaccinuri se pot administra şi în timpul unei izbucniri epidemice („outbreak”) sau

a unei epidemii, pentru prevenirea apariţiei de cazuri noi şi scurtarea duratei epidemiei.

Există şi posibilitatea administrării unor vaccinuri în scop curativ, gazda fiind deja

infectată în momentul inoculării (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatită cronică, cu HBV).

17. 7. Clasificarea vaccinurilorÎn funcţie de infecţia care se doreşte a fi prevenită, vaccinurile pot fi bacteriene sau

virale.

În funcţie de modul de preparare există:

·           Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluzând, după caz, corpi vii

atenuaţi sau distruşi (inactivaţi) prin acţiunea unor factori fizici (ex. căldură) sau chimici

(ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conţine bacterii vii atenuate, stimulează RIC şi se

administrează pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A

includ virusuri omorâte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conţin virusuri

vii, atenuate şi stimulează RIU şi răspunsul imun la poarta de intrare.

·           Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetică, au un grad superior

de siguranţă (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular).

225

Page 226: Micro Biologie

·           Vaccinurile care conţin anatoxine bacteriene, purificate şi adsorbite pe

suport mineral (DTP conţine anatoxină tetanică şi difterică plus corpi de Bordetella

pertussis omorâţi, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA).

În funcţie de numărul componentelor antigenice există:

·         Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B,

pertussis acelular, BCG etc),

·         Vaccinuri asociate, care conţin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-

rubeolos etc).

      Date privind schema de vaccinare aflată în uz în ţara noastră la acest moment,

precum şi câteva informaţii privind substanţele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt

prezentate în anexa nr. 4.

17. 8. Povestire adevăratăIanuarie 1993 ... un articol semnalează faptul că difteria, o boală practic eliminată în

Europa de Vest, capătă proporţiile unei epidemii, în Rusia.

Situaţia a fost de asemenea periculoasă în Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri

au fost raportate în primele zece luni ale anului 1992. Ameninţarea extinderii în alte state,

foste membre URSS, a fost reală. Eforturile uriaşe de a vaccina atât copiii cât şi adulţii au

făcut, până la urmă, posibil controlul epidemiei. Totuşi, în perioada 1990-1998, peste

150.000 de cazuri de difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS,

înregistrându-se şi un foarte mare număr de decese.

Dar care a fost motivul şi de ce a apărut o epidemie de difterie după 1990 ?

Incidenţa difteriei în Rusia era foarte mare în prima jumătate a secolului 20; peste

750.000 de cazuri au fost raportate doar în Rusia în anii ’50 (imunizarea împotriva difteriei

a început în anumite zone ale Uniunii Sovietice în 1920, însă abia în 1958 a fost statuată

imunizarea universală a copiilor, în toată Uniunea Sovietică). Este adevărat că în 1977, au

început să fie din nou raportate cazuri de difterie, în URSS, atingând o valoare maximă în

1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dată, majoritatea cazurilor au apărut la adulţi.

Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea adversă faţă de imunizare.

Multe dintre bolile prevenite de vaccin aveau o incidenţă scăzută şi în acest context a

apărut o „mişcare anti-imunizare” în presă, în contextul unei perioade (1985-1990) de

profundă neîncredere în guvern. După 1990, părinţii nu mai erau de acord să permită

imunizarea copiilor cu vaccinuri produse în Rusia fiind făcuţi să creadă că acestea le fac rău

şi îi îmbolnăvesc. Chiar şi membri ai comunităţii medicale au avut „ieşiri în presă” în care

au exprimat părerea că aceste vaccinuri dăunează.

În plus, o parte din părinţi considerau că amânarea (nerespectarea schemelor de

vaccinare, neprezentarea la medic atunci când erau invitaţi să o facă) sau evitarea

vaccinării copiilor sunt o nou-descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată

cu dizolvarea URSS.

Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în

legătură cu vaccinul produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au

226

Page 227: Micro Biologie

demonstrat că vaccinul era eficient [este totuşi posibil ca vaccinul să fi fost transportat în

condiţii improprii şi astfel să fi avut, în mod real, o eficacitate mai mică (presupunere care

nu a fost demonstrată)].

Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele

modificări, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen,

creşterea intervalului între vaccinări, renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală)

iar preocuparea pentru sănătatea publică a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la

copii a scăzut în anii ’80, la mai puţin de 70% (mult sub recomandările OMS).

Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai

multor copii dar şi a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost

aprobată abia în 1993. S-au făcut vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu

pentru vaccinarea şomerilor. Pentru a creşte rata imunizării la copii s-a diminuat lista

contraindicaţiilor şi a început să se folosească schema completă de vaccinare. În octombrie

1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea în clasa I. În 1995 - 1996, epidemia a

început să fie controlată. Dar care au fost pierderile umane şi materiale, reale, probabil că

nu vom cunoaşte, vreodată.

În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale

intervenţiei negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei

de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate

publică în secolul 20.

18. Reacţiile de hipersensibilitate18. 1. Definiţie, clasificare

Reacţia imună este un răspuns normal fiziologic faţă de microorganisme sau celule

tumorale.

Totuşi, RI poate îmbrăca şi aspecte patologice, de tipul hipersensibilităţii (HS) sau

al autoimunităţii. Primele observaţii privitoare la reacţiile de hipersensibilitate au fost

făcute de Charles Richet în urmă cu un secol, observaţii care vor acoperi tipul I din

clasificarea Gell şi Coombs de mai tȃrziu.  Pornind de la diferite tipuri de reacţii observate,

Gell şi Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de hipersensibilitate de tip I-

IV. În 1974, Roitt adaugă hipersensibilitatea de tip V, stimulantă (pornind de la anticorpii

stimulanţi ai funcţiei tiroidei, prezenţi în hipertiroidia primitivă, boala Basedow).

În mod clasic, HS reprezintă o stare de reactivitate crescută a organismului, pe baza

unui mecanism imunologic, indusă de expunerea (repetată) la anumite structuri

antigenice (sau haptene).  Cuvȃntul alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet;

desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate.

HS este specifică şi include

·         un contact sensibilizant,

·         o perioadă de latenţă şi

227

Page 228: Micro Biologie

·         un nou contact, contactul declanşator, cu acelaşi antigen care a fost implicat în

contactul sensibilizant.

HS se poate clasifica în funcţie de tipul de răspuns imun în:

·         HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB şi anticorpii)

            -HS de tip I (anafilactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului

anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic,

urticariei, eczemei atopice etc;

            -HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi,

complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement

independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex. în patogenia reumatismului articular

acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, reacţii

posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);

            -HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în

reacţia Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita

extramembranară, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita

şi periarterita poststreptococică etc.

·         HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT şi

citokinele), spre exemplu în

-HS tuberculinică sau

-HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină,

tricofitină etc şi

-HS în multe dintre infecţiile virale.

18. 2. Hipersensibilitatea de tip I (anafilactică)

Reacţia imună anafilactică se poate instala rapid (în mai puţin de 15-30 minute) după

un nou contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. În această reacţie

intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite de „reagine” (în principal IgE), care

eliberează mediatori chimici (histamina fiind cel mai important şi cel mai cunoscut dintre

aceştia).

Anafilaxia este un fenomen general, obţinut ca răspuns la antigene variate: toxine,

proteine, medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina şi

substanţele de contrast folosite în imagistică pot determina şoc anafilactoid, cu aceleaşi

manifestări ca în şocul anafilactic, însă fără participarea IgE.

Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe

receptorii specifici exprimaţi la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor.

Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt

implicate IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12).

Th2 (Figura nr. 1) are o acţiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât asupra LB  cât şi

asupra celulei secretoare.

228

Page 229: Micro Biologie

Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează

de aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate

foarte apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4

devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea

juca Il-10.

Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datorează structurii

diferite. IgE prezintă faţă de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită

şi zone de recunoaştere pentru ambele tipuri de receptori: FcεRI (afinitate înaltă) şi FcεRII

(afinitate joasă).

 

IgE au un timp de viaţă mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar

concentraţia acestora este foarte scăzută în serul individului normal.

Ataşarea IgE de mastocite şi bazofile (ca dimeri cuplaţi cu alergenul) duce la creşterea

duratei de viaţă a IgE de la mai puțin de 2 zile la 10 zile.

IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că placenta nu conține FcεR. Ȋn

sângele fetal se pot găsi IgE în cantităţi sub 1UI/ml prin ataşare de FcγRI de pe macrofagele

fetale. FcγRI pot semnaliza pentru degranulare şi după cuplarea cu alte molecule (ex.

lectine, Ac anti lanțt α FcγRI).

Bazofilele şi mastocitele se caracterizează prin prezenţa unor granule

metacromatice, roşii după coloraţia cu albastru alcyan, datorită histaminei şi heparinei.

Mediatorii mastocitari sunt reprezentaţi de histamină, leucotriene, prostaglandine,

factorul activator plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) şi

neutrofile (NCF) şi o serie de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-

a, TGF-β1, IFN-g). La suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor sunt exprimaţi diverşi receptori,

dintre care cei mai importanţi sunt FceRI, FceRII (CD23) şi C3aR şi C5aR (CD88).

Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniţializează semnalizarea spre interiorul

celulei, ducând la activarea celulară.

Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun şi

necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare

constă dintr-o serie de reacţii biochimice în trepte, cu participarea fosfolipidelor

membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducând la creşterea influxului de

Ca2+ extracelular alături de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a

iniţia eliberarea mediatorilor preformaţi şi sinteza de novoa mediatorilor lipidici.

Exemplificăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:

·         bronhoconstricţie prin acţiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede

traheo-bronşice,

·         vasodilataţie arterio-capilară prin contracţia fibrelor musculare netede din

peretele venulelor postcapilare,

·         creşterea permeabilităţii capilare,

·         creşterea motilităţii intestinale şi

·         reacţie urticariană la nivel cutanat.

 

229

Page 230: Micro Biologie

Mastocitele eliberează histamină şi LTD4, care vor determina edem, hipersecreţie de

mucus şi bronhoconstricţie, cu scăderea FEV1, însă eliberează şi IL-5, TNFα, care vor atrage

eozinofile, limfocite, neutrofile şi macrofage.

Aceste celule inflamatorii vor determina modificări cronice la nivelul plămȃnului:

hiperplazie a celulelor secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei

bazale şi hiperplazie musculară netedă. Aceste modificări vor determina o hiperreactivitate

bronşică, dar de data aceasta, nespecifică (hiperreactivitate bronşică la aer rece, efort).

Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se corelează cu valoarea NO

expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un număr crescut de eozinofile şi cu

valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) în sputa indusă. Aceste teste nu au valoare

diagnostică, însa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severităţii astmului.

Faptul că mastocitele intervin în ambele faze, imediată şi tardivă, o demonstrează

efectul benefic pe care îl are cromoglicatul (stabilizator de membrană, se opune

degranulării) în tratamentul astmului bronșic. Corticosteroizii acţionează numai pe

răspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea între implicarea mastocitelor şi LT în

inflamaţia cronică datorită faptului că inhibă ambele celule.

 

Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I,

sunt de reţinut:

- şocul anafilactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm;

în lipsa tratamentului poate evolua către deces. Principalele antigene care pot declanşa

şocul anafilactic sunt înţepăturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor

medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) şi

- edemul Quincke care cuprinde faţa, gura şi uneori faringele şi laringele, ducând la

asfixie şi deces.

Dintre manifestările clinice localizate ar fi de amintit:

- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept

principali agenţi declanşatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci

(conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv febra de fân, traheita spasmodică şi astmul

alergic);

- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) şi

- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă,

peşte, fructe, ţelină etc).

18. 3. Povestiri adevărate 18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever?

 18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreția IgG4/IgE?

 18. 3. 3. Testarea HS de tip I

18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever?

230

Page 231: Micro Biologie

O tânără de 19 ani ajunge la camera de urgenţă din cauza unui atac acut de dispnee, respiraţii şuierătoare (wheezing), înroşire (erupţie eritematoasă) generalizată la nivelul tegumentelor şi vărsături. Era cunoscută ca suferindă de astm bronşic, ţinut sub control cu tratament medicamentos. Din antecedentele din copilărie, avea notat în carnetul de sănătate o reacţie „alergică” (dermatită atopică şi urticarie) după ingerarea de unt de arahide.

După spusele colegilor care au însoţit-o la spital, înainte de a-i apărea simptomele, a mâncat o ciocolată de la un tonomat din cămin. Pe ambalaj nu apăreau notate alunele ca ingredient.

Totuşi ...

Iată câteva elemente privind „alergiile” la diferite alimente

Reacţiile de hipersensibilitate apărute după ingestia anumitor alimente afectează aproximativ 6-8% dintre copiii mai mici de 4 ani şi aproape 2% din populaţia SUA cu vârsta mai mare de 10 ani. „Alergia” la produsele alimentare reprezintă una dintre cele mai importante cauze pentru reacţiile anafilactice tratate în departamentele de urgenţă din SUA şi din multe state occidentale. În fiecare an sunt raportate circa 30.000 reacţii anafilactice, 2.000 de spitalizări şi 200 de decese din cauza reacţiilor de sensibilitate la diferite produse alimentare. Reacţiile în urma consumului de arahide şi alune de pădure conduc la un procent important de reacţii anafilactice fatale sau foarte grave. În SUA, de unde putem obţine date statistice privind această situaţie, 3 milioane de oameni suferă astfel de „alergii”. Deşi există numeroase programe de informare (tot în SUA) cu privire la „alergiile alimentare”, majoritatea pacienţilor nu ştiu cum să acţioneze şi cum să se salveze în cazul unei reacţii anafilactice.

Cum s-ar putea pune diagnosticul?

La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de astm, trebuie să ridice întotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indusă de produse alimentare poate fi confundată de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza şi examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului.

Tratamentul alergiei la alune

În primul rând şi cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită şi măsurile includ educarea pacienţilor şi a familiilor acestora cu privire la modul în care să evite ingestia accidentală de alune, cum să recunoască primele semne şi simptome ale unei reacţii „alergice” şi cum să reacţioneze în primele stadii ale unei reacţii anafilactice.

Spre deosebire de imunoterapia tradiţională (pentru reacţiile de HS la înţepături de insecte etc) în cazul HS la alune sunt investigate metode de tratament „neconvenţionale” precum injectarea lunară de anticorpi anti-IgE (care, prin scăderea nivelelor de IgE, pot preveni activarea răspunsului la alergenul proteic din alune) sau obţinerea prin inginerie genetică a unor proteine de

231

Page 232: Micro Biologie

alune recombinante (prin substituirea unor aminoacizi „critici” se poate preveni activarea reacţiilor mediate de IgE).

Tratamentul reacţiei anafilactice

Pacienţii care au HS de tip I la alune trebuie să primească urgent adrenalină (injectată intramuscular), antagonişti ai receptorilor histaminici H1 şi H2 (administraţi oral, intramuscular sau intravenos), oxigen, albuterol (pe cale inhalatorie) şi corticosteroizi (injectabil). Datorită faptului că pot apărea reacţii bifazice (definite ca o agravare simptomelor, ce necesită o nouă terapie după tratarea iniţială a reacţiei anafilactice) şi deoarece circa90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia anafilactică iniţială, pacienţii trebuie ţinuţi sub observaţie cel puţin 4 ore înainte de a fi externaţi din camera de  urgenţă.

Se recomandă continuarea tratamentului timp de 3 zile (prednison şi antihistaminice), cu toate că nu a fost demonstrat că această recomandare ar reduce riscul simptomelor recurente.

18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreția IgG4/IgE?

Pentru a bloca interacţiunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a încercat terapeutic, cu rezultate bune in vitro (administrare inhalatorie), dar nu și  in vivo (probabil datorită contracarării acțiunii acestora prin intervenția altor citokine implicate în sinteza de IgE).

Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.

Copii care trăiesc în casă cu o pisică e posibil să nu dezvolte hipersensibilitate la alergenii aceasteia, prin modificarea raspunsului Th2

        

va crește sinteza de IgG4 şi

        

va scădea sinteza de IgE.

Cercetătorii încearcă să găsească un mod de a induce Th2 să sintetizeze numai a IgG4, cu blocarea producției de IgE, cu scopul de a induce toleranţa la venin de insecte, proteine diferite, alergeni alimentari, păr de animale etc. Merită menționat faptul că imunizările antitetanos şi antidifterie nu induc producerea de IgE, în timp ce imunizările repetate antipertussis cu adjuvant

232

Page 233: Micro Biologie

Freund incomplet induc o sinteză crescută de IgE (e foarte interesant faptul că există variaţii mari în funcţie de tulpina utilizată pentru fabricarea vaccinului).

Câteva exemple de alergeni

O descriere orientativă a alergenilor implicați în HS de tip I ar fi cea de proteine hidrosolubile cu greutate moleculară între 10 şi 40kDa, chiar dacă structura, provenienţa şi calea pe care o urmează aceste proteine poate fi extrem de diferită. Cloning a descoperit o anumită secvență de aminoacizi omoloagă pentru o parte din alergeni și diferite enzime. Pentru polen sau părul de pisică nu există nici omologia structurală cu enzimele şi nici capacitatea enzimatică, deci nu aceştia sunt factorii esenţiali. Pentru acarieni, în schimb, s-a dovedit o strȃnsă corelaţie între activitatea proteazică şi imunogenitate (Der p 1 taie CD23 sau CD25 de pe limfocite, intensificȃnd răspunsul imun; de asemenea, distruge joncţiunile dintre celulele epiteliale, ceea ce le facilitează acarienilor pătrunderea în organism).

18. 3. 3. Testarea HS de tip I

Testele cutanate, prick-test, reprezintă metoda cel mai des utilizată în diagnosticul HS de tip I.

Se introduc cȃte 0,1μl din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testează 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), şi unul negativ (soluție salină fiziologică). Modificările cutanate apar în 5-15 min şi durează 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de răspuns:

        

maculă, determinată de descărcarea de histamină, cu prurit şi edem şi

        

papulă, cu aspect eritematos şi dimensiuni mai mari şi care are ca mecanism reflexul

de axon.

(Figurile nr. 5 și 6)

 

Altă tehnică ar include dozarea IgE, însă testul este mai puţin sensibil decȃt testele cutanate.

Un test cutanat pozitiv nu inseamnă neapărat că persoana prezintă HS de tip I, ci că există o mare probabilitate să fie aşa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru) este urmat şi de un răspuns tardiv, caracterizat prin eritem şi induratie. Răspunsul tardiv apare la 2-3 ore după injectarea intradermica a antigenului, ţine pȃnă la 24 ore şi este sugestiv pentru inflamaţie cronică la nivelul foselor nazale, plămȃnului, pielii, datorându-se:

233

Page 234: Micro Biologie

        

efectelor directe ale prostaglandinelor, leucotrienelor şi citokinelor eliberate de

mastocite,  

        

infiltrării cu limfocite, eozinofile, bazofile şi neutrofile şi

        

produşilor de secreţie ai acestor 4 tipuri de celule.

Răspunsul tardiv se întȃlneşte în cazul administrării de tuberculină, candidină şi tricofitină.

 

Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din zona respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-test: injecţii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua probe repetate fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare.

(Figurile nr. 7 și 8)

 Un test patch pozitiv înseamnă prezenţa eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de vezicule pline cu lichid între cheratinocite) la nivel macroscopic şi prezenţa unui infiltrat celular dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate în MBP-major basic protein, bazofile, limfocite). S-a reuşit clonarea de LT specifice împotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczemă (produsă în mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil şi din pielea persoanelor alergice dar care nu dezvoltă eczemă, ceea ce sugerează nu doar rolul de helper, ci chiar pe cel de celulă efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare că rolul LT ca efector în HSI nu se limitează doar la nivel cutanat, dar şi la nivelul mucoasei nazale şi conjunctivei în rinita alergică şi a epiteliului bronşic în astm.

(Figura nr. 9)

Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu răspuns rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4-8 ore, constȃnd în eliberare de mediatori de novo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate pune în evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot identifica toate modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere de colagen, subţierea peretelui bronşiolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronşică. Pentru demonstrarea hiperreactivităţii bronşice nespecifice se fac teste de provocare cu histamină,

234

Page 235: Micro Biologie

metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci epitelilul, ori stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din celulele locale (histamină din mastocite).

Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic, titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid. Examenul CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime din astmatici.

Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la cel de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament.

Imunoterapia sau hiposensibilizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni, a fost încercată în 1911 de Noon şi Freeman. Acum se foloseşte împotriva reacțiilor față de veninul de albine, viespi şi pentru tratamentul rinitei alergice. Doza iniţială este de 1-10ng şi creşte progresiv cu cȃte 10μg alergen/doză.

O formă mai nouă de imunoterapie e cea folosind, nu structura naturală a alergenilor, ci un fragment conținȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a alergenului. De asemenea, se pot sintetiza forme recombinate genetic, cu o capacitate de legare de IgE scăzută.  Însă şi acestea ar putea provoca şoc anafilactic aşa că administrarea lor se va face după luarea tuturor precauţilor necesare. 

Sunt în studiu şi vaccinuri ADN, cu introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vectorîin celulele gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia. Experimente s-au facut pe şoareci, unde expresia tisulară de CpG a facut să crească activitatea TH1 şi să scadă cea  a TH2.

Anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi se ataşează de Fab a IgE circulanţi, şi astfel îi îndepărtează din circulaţie. Ȋnsă, pot şi scădea producţia de IgE prin ataşarea de receptorii situaţi pe LB, care nu vor mai semnaliza pentru producerea de reagine (Ac anti-IgE). Şi-au dovedit eficacitatea în cazul astmului alergic şi al rinitei alergice, şi urmează să se stabilească dacă au efect benefic în cazul alergiei alimentare, dermatitei atopice sau alergiei la medicamente.

 

18. 4. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

Întrebarea 1

1). Anafilaxia apare după un contact nou cu un antigen la care organismul nu era

sensibilizat.

2). Ȋn HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai

numesc şi reagine.

235

Page 236: Micro Biologie

3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de

novo.

Dintre cele 3 afirmaţii de mai sus, care este adevărată/care sunt adevărate?

A) 2

B) toate

C) nici una

D) (1) si (3)

 

Ȋntrebarea 2

Alegeți afirmațiile care sunt amândouă corecte și se află în relație de cauză-efect.

a). Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun

pentru că necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc).

b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe

receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice

c). Şocul anafilactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm

pentru că în lipsa tratamentului poate evolua către deces

d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la

nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun.

 

Intrebarea 3

Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I

a). prick-test

b). dozarea IgE

c). patch test

d). dozarea IgG

 

Intrebarea 4

Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I

a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de

cȃteva luni

b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a

alergenului caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE

c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele

gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia

d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi

 

Intrebarea 5

Pentru a găsi afirmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată

a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne

recente de astm, nu ar trebui să ridice niciodată suspiciunea anafilaxiei.

b). Cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită

236

Page 237: Micro Biologie

c). Ȋn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii  receptorilor histaminici H1 şi H2,

oxigenul, albuterolul şi corticosteroizii

d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la

reacţia anafilactică iniţială, pacienţii pot fi externaţi din camera de urgenţă înainte de

atingerea a 4 ore de la prezentare.

18. 5. Hipersensibilitatea de tip II (citotoxică)

Reacţia imună citotoxică reprezintă unul dintre mecanismele importante de apărare a

organismului gazdă faţă de microorganisme. Rolul acestei reacţii este multiplu: distrugerea

bacteriilor extracelulare şi intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar şi

distrugerea unor paraziţi sau fungi. Pentru îndeplinirea acestor funcţii sunt utilizate

mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea

specifică completează imunitatea naturală, adăugând aderenţa celulelor fagocitare şi a

celulelor NK la antigene prin intermediul anticorpilor şi complementului. Un rol aparte în

imunitatea specifică îl deţin limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.

HS de tip citotoxic apare după cuplarea anticorpilor cu antigene fixate pe membrana

celulară. Spre deosebire de hipersensibilitatea de tip I, Ac implicaţi în acest tip de răspuns

imun sunt IgG sau IgM. Ei sunt ataşaţi celulelor gazdei sau se găsesc în matricea

extracelulară (în HS III, Ac sunt în ser, cu formarea de complexe circulante care se vor

depune nespecific în ţesuturi). (Figura nr. 10)

Se cunoaște faptul că un neutrofil recunoaşte și fagocitează fagocita bacteria

opsonizată cu Ac, formează fagolizozomi urmând distrugerea produsului

fagocitat.Receptorii pentru complement sunt necesari pentru că bacteria poate fi

opsonizată şi de fragmente ale sistemului complement. A fost demonstrat experimental (pe

șoareci) că rolul esenţial nu revine C3R, ci FcR. Ȋn loturile cu deficit de sinteză a lanţului γ al

FcR, HS de tip II nu apare, în timp ce la şoarecii cu deficit al componentelor sistemului

complement, nu s-a constatat nici o diferenţă faţă de lotul de control. Ȋn cazul HS de tip

II, în locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoză a enzimelor lizozomale asupra

celulei/matricei tapetate cu Ac.

După formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se

generează complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odată cu liza

celulei gazdă are loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor şi

leucotrienelor.

Alături de neutrofile participăşi macrofagele, trombocitele, celulele K, eozinofilele

datorită prezenţei FcR pe membrana lor. Macrofagele, eozinofilele şi neutrofilele au un

răspuns mai puternic datorită prezenţei şi a C3R pe membrana celulară. Amplitudinea

fenomenelor la nivel celular depind de cantitatea de Ac dar şi de rezistenţa celulelor ţintă la

liză. De exemplu, în cazul eritrocitelor este suficient un singur MAC, în timp ce pentru

celulele nucleate există o capacitate mai mare de a se reechilibra ionic precum şi

mecanisme de apărare anti-complement.237

Page 238: Micro Biologie

Liza mediată de C' este implicată în anemiile hemolitice, reacţiile postransfuzionale

în incompatibilitatea ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de

atragerea fagocitelor şi eliberarea locală a enzimelor litice.

 Organismul uman posedă în mod normal în sȃnge anticorpi față de Ag sistemului ABO

pe care nu le deține. În aceste condiții, Ac nu se vor întȃlni niciodată cu fără o intervenţie

din afară. Ȋn cazul unei transfuzii cu sȃnge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de

febră, hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior și posterior), datorită

hemolizei intravasculare.

Este de menționat că o femeie însărcinată poate păstra sarcina în cazul unui făt cu o

altă grupă de sȃngepentru că Ac formaţi împotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM

(pentameri) care nu vor trece bariera fetoplacentară.

 Sistemul Rh, însă, poate provoca sindromul hemolitic al nou-născutului. Mama,

sensibilizată împotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece

bariera feto-placentară. Manifestările sindromului hemolitic al nou-născutului constau în

hepatosplenomegalie, icter şi peteșii apărute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh

incompatibil cu mama sa, nu va suferi, însă, următorii, da. Situaţia caracteristică este:

mama, Rh- iar fătul, Rh+. Ac anti Rh+ rămân ”in amonte” de placentă. Pornind de la aceste

constatări s-a imaginat un tratament care şi-a dovedit eficienţa. Se administrează mamei

imediat post- partum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne.

Alte sisteme sangvine implicate în reacţiile posttransfuzionale, în afară de sistemele

ABO şi Rh, sunt MN, Duffy şi Kell. Formarea de IgG vor induce o reacţie hemolitică mai puţin

accentuată. Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului şi

splinei, şi nu vor da o hemoliză intravasculară sistemică. Ȋnsă poate apărea şi în acest caz

necroza acută tubulară datorită eliberării masive a componentelor eritocitare.

 Pot apărea reacţii postransfuzionale îndreptate şi împotriva altor componente celulare

sangvine, însă consecinţele nu sunt la fel de pregnante ca în cazul eritrocitelor.

Reacţiile de respingere de grefă se manifestă la nivelul ţesuturilor vascularizate direct

(un exemplu de țesut care nu suferă reacţii de respingere este corneea). Cele mai severe

manifestări se datorează tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor,

recrutare de neutrofile şi trombocite. Ȋnsă frecvente sunt şi manifestările datorate

incompatibilităţii MHC.

 Alte exemple:

- anemia hemolitică după ataşarea de proteinele de suprafaţă a hematiilor a unor

medicamente (penicilină, fenacetină, chinidină etc) şi iniţierea producerii şi cuplării unor

anticorpi de tip IgG.  HS de tip II la medicamente se poate produce în 3 modalități diferite:

·         prin ataşarea medicamentului la membranna celulară cu producerea ulterioară

de Ac (cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor),

·         prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se

ataşează pe membrana celulară şi

·         prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11)

238

Page 239: Micro Biologie

- trombocitopenia şi tendinţa la hemoragie după administrarea de chinină, care se

ataşează de trombocite şi stimulează producerea de autoanticorpi;

- apariţia unui sindrom asemănător lupusului eritematos după administrarea de

hidralazină care stimulează producerea de autoanticorpi anti-ADN;

- anemia hemolitică după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, datorită stimulării

producerii de anticorpi care se fixează pe hematii;

- cardita reumatismală din reumatismul articular acut (anticorpii faţă de streptococul

beta-hemolitic de grup A reacţionând încrucişat cu ţesutul cardiac);

- sindromul Goodpasture (după apariţia de Ac care se fixează pe membrana

glomerulară renală sau la nivel pulmonar, se activează C', rezultând leziuni grave ale

membranelor celulare).

Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginării unor

tratamente ce folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor

receptor 2) în terapia cancerului de sȃn; Infliximab (Ac anti-TNF) în boala Crohn; Rituximab

(Ac anti-CD20) în limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimună, artrită reumatoidă

şi lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) în leucemii şi pentru inducerea

imunosupresiei la pacienţii ce suferă un transplant de celule stem.

18. 6. Povestire adevărată (Cardita reumatismală, entitate a hipersensibilităţii tip II ce nu trebuie subestimată)

În urmă cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatică) reprezenta

un subiect foarte frecvent dezbătut în publicaţiile ştiinţifice, mai mult chiar decât infarctul

miocardic acut, de ex. Atunci existau atât de mulţi copii cu această boală, încât spitale

întregi erau dedicate tratamentului RAA.

În prezent, majoritatea medicilor din ţările dezvoltate nu au mai văzut cazuri de RAA

(profilaxia primară şi secundară a atacului reumatismal realizându-se în mod

corespunzător); experienţa în ţările occidentale este astăzi limitată la constatarea prezenţei

leziunile de valvă mitrală la pacienţi care au fost afectaţi de RAA în tinereţe.

În ţările dezvoltate, populaţia cumulată este mai mică de 20% din populaţia globului;

pentru restul populaţiei (peste 80%), RAA şi cardita reumatismală continuă să reprezinte o

problemă importantă. Se estimează că la nivel mondial există 15,6 milioane de persoane cu

RAA, în fiecare an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt

provocate fie de RAA fie de diferitele complicaţii ale RAA. Este posibil ca numărul real de

cazuri să fie mai mare.

239

Page 240: Micro Biologie

O consecinţă negativă a scăderii interesului faţă de RAA în ţările dezvoltate este

reducerea cercetării în acest domeniu şi singurele progrese din ultima jumătate de secol au

fost realizate în domeniul tratamentului medical şi chirurgical al RAA.

Principala modalitate de control al RAA rămâne tratamentul corect al faringitelor cu

streptococ β-hemolitic de grup A şi administrarea de injecţii cu penicilină retard (varianta

„depozit” cu intervalul cel mai lung între 2 administrări poate fi administrată la 3-4

săptămâni), de-a lungul unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA

pentru a preveni episoadele recurente (profilaxie secundară). Ambele strategii au fost

publicate încă din anii 50, în SUA. În prezent se încearcă şi obţinerea unui vaccin, pentru

profilaxie primară (se estimează că în 10-20 ani va putea fi obţinut un vaccin sigur şi

eficient).

În lipsa unor cercetări realizate în ţările dezvoltate, se încearcă obţinerea unor date în

statele în care RAA are o frecvenţă crescută. Spre exemplu, studii realizate în Mozambic,

Cambodgia, Franţa şi Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei în detectarea

pacienţilor cu boală cardiacă reumatică (copii cu vârstă şcolară), detectându-se astfel cu

90% mai multe cazuri decât prin metoda clasică, de diagnostic clinic. S-a descoperit că 2-

3% dintre copii cu vârstă şcolară din Cambodgia şi Mozambic sufereau de boală cardiacă

reumatică, majoritatea nefiind diagnosticaţi în cursul acestui studiu. Aceste date confirmă

faptul că RAA şi cardita reumatismală au o suficient de mare importanţă pentru a atrage

atenţia publicului internaţional şi a comunităţilor de cercetare.

18. 6. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

 

Ȋntrebarea 1

Printre rolurile hipersensibilităţii de tip II se numără:

a). distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare

b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri

c). distrugerea unor paraziţi sau fungi

d). toate cele de mai sus

 

Ȋntrebarea 2

Care dintre următoarele afirmaţii este incorectă?

a). Ȋn HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.

b). Ȋn HS de tip II sunt utilizate atȃt mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN,

macrofage, celule NK) cȃt și ale imunităţii specifice.

c). Imunitatea specifică presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma

ulterior complexe imune circulante.

d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavȃnd

posibilitatea de a se depune la nivelul ţesuturilor.

240

Page 241: Micro Biologie

18. 7. Hipersensibilitatea de tip III (prin complexe imune circulante)

 Fenomene experimentale

 Patologia umană

HS de tip III se poate datora:

- unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită stafilococică);

- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită);

- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier,

antigene aviare în cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).

Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive

eliberate în cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are

ca efect creşterea permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi

expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor şi formarea de

microtrombi.

Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală

continuă să genereze C3a şi C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol

protectiv, determină ulterior creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare.

Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi exocitează conţinutul în loc să endociteze complexele

imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazală vasculară). Enzimele inhibitoare

serice împiedică enzimele lizozomale să acţioneze la nivel sistemic, însă nu şi local, de

aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru

C3b, importanţi pentru preluarea complexelor imune şi transportul lor către splina şi ficat,

unde vor fi fagocitate. Ȋn HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade eficienţa.

Complementul menţine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasică şi resolubilizează

complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul depleţiei de

componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) în patologia HS de tip

III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de

ficat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o perioadă mai lungă de

timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza

producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III.

Depunerea complexelor imune

 Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive)

reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare.

Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de

prezenţa turbulenţelor. Ȋn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare

decȃt în restul capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în 241

Page 242: Micro Biologie

zonele de filtru vascular (plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau

altul poate fi dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a

Ac.

Fenomene experimentale

Reacţia Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus şi Nicholas Breton, după

injectarea subcutanată de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime

după aproximativ 6 ore. Boala serică acută, descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată

din nou în anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon).

Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depozitează în ţesuturi, apare conceptul de

antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul respectiv sau este fixat

secundar, se iniţiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente:

·         activarea complementului şi a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a şi C5a;

·         afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale şi

·         afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.

Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om.

Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de

la altă specie, asociat cu un adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru

obţinerea de anticorpi circulanţi IgG precipitanţi, reacţia Arthus poate fi obţinută prin

injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la

6 ore şi dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat, peteşii şi uneori purpură

necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la fixarea de igG

şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular.

Boala serului

a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecţioase erau tratate

prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicaţiile

acestei terapii sub termenul de boală serică (febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită

la unii bolnavi după 8-12 zile de la prima injecţie.

Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina

bovină (BSA), în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia

bolii serice acute (experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile.

BSA marcată radioactiv, scade, iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi

după 24 de ore, lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza complexelor imune

(corespunde prezenţei concomitente de BSA şi a anticorpilor anti-BSA); este boala serică cu

glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii

anti-BSA liberi nu sunt decelabili decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea complexelor

imune corespunde acestei perioade, ca şi scăderea complementului seric. Manifestările

patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-BSA liberi şi nici complexelor imune circulante.

Ca şi în reacţia Arthus, leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de

un aflux de neutrofile. La animalul fără complement apare o simplă albuminurie fără

glomerulonefrită); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau

conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescuţi; manifestările clinice, în special

glomerulonefrita, regresează rapid).

242

Page 243: Micro Biologie

b) Boala serică cronică. Este dificil de reprodus la animal. Totuşi administrarea

repetată a antigenului (din 2 în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice

extramembranare proliferante.

Patologia umană

Principalele afecţiuni umane sunt:

·         bolile comparabile cu reacţia Arthus (în care antigenul induce o reacţie locală prin

difuziunea anticorpilor IgG precipitanţi); un exemplu este boala plămânului de fermier

[după contactul în timpul zilei cu fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la

începutul nopţii (după 6 ore) o stare de asfixie care dispare în următoarele ore];

·          manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaţiilor, pielii şi uneori a

creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative.

Afecţiunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă,

glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice etc. În 2/3 din cazurile de anemie

hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se formează anticorpi IgM anti-medicament. În

aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră, frison, mialgii cu dureri lombare şi

uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.

18. 8. Povestiri adevărateVasculită necrozantă aparută în cadrul

glomerulonefritei difuze postinfecţioasăVor fi prezentate două cazuri de glomerulonefrită şi evoluţia lor clinică şi

anatomopatologică. Biopsiile efectuate au evidenţiat aspectul de glomerulonefrită difuză

acută postinfecţioasă, asociată cu necroză fibrinoidă şi infiltrat inflamator leucocitar în

peretele arteriolelor şi arterelor interlobulare. Au fost observate proliferări celulare. În

ambele cazuri a apărut insuficienţa renală acută (IRA) severă (în cazul celui de al doilea,

evoluţia a fost nefastă, spre deces).

Primul caz

Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat în spitalul din oraşul de reşedinţă.

Motivele internării au fost reprezentate de inapetenţă, edem facial, diaree, vomă şi

hematurie macroscopică, constatate în ultimele 2 zile. La internare s-a constatat că

pacientul era febril (38°C) şi prezenta hipertensiune arterială (TA = 220/120 mmHg).

După o săptămână, în timpul internării, a apărut oligurie şi a fost trimis la un spital de

un nivel superior. A evoluat spre anurie şi a necesitat dializă peritoneală.

După 4 săptămâni de la internare, anuria a continuat să persiste, asociindu-se cu

episoade de vomă; TA a putut fi controlată medicamentos.

A fost transferat la spital de nivel superior.

Examenul clinic la internare a arătat o stare generală relativ bună, edem prezent în

pătrimea distală la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, înălţime =