LP 1.ppt

7/25/2019 LP 1.ppt

http://slidepdf.com/reader/full/lp-1ppt 1/19

DIAGNOSTICUL VIROLOGICMETODE DE CULTIVARE A

VIRUSURILOR

7/25/2019 LP 1.ppt


1. Recoltarea si pregatirea prod. patologice sau a prod.naturale

2. Alegerea culturilor de celule – in functie de sensibilitatea fata de virusulcautat/spectru cat mai larg de virusuri

3. Inocularea culturilor celulare – 2 factoriimportanti

4. Incubarea

5. Citirea si interpretarae

rezultatelor

1. Metode directe

2. Metode indirecte

Produsului patlogic: Secretii conjunctivale;Spalaturi nasofaringiene;Materii fecale, urina;Lichid de eruptii veziculare

Fragm. de tesuturi si organe: SNC, LCR, Splina, ficat, plamani, Ganglioni limfatici, sangeProduselor naturale: Alimente, Ape reziduale, sol

e! "ul em#rionat $ virusul oreionului

e! Culturi din rinichi de maimutza $ spectru larg de sensi#ilitat

Gradul de dezvoltare al culturilor celulare (varsta culturii):Confluenta monostratului;

Celule cu nucleu vizi#il, fara semne de im#atranire

%vacuole, granulatii, nucleu picnotic&Cantitatea de inocul' (,) $ ) ml

* La +,- $ +. C $ ptr sinteza componentelor virale / 01A2A31A 41RALA;

*LA 5( C $ pentru selectia virusurilor termorezistente

*6- $ 6 C $ pentru virusurile insectelor

7/25/2019 LP 1.ppt



7/25/2019 LP 1.ppt


Tipul si maniera de colectare a produselor patologice din clinica depind demetodele de laborator anticipate a se realiza!!!

Cantitatea de virus este maximă la debutul simptomatologiei.

Ideal, specimenele trebuie colectate in primele 2 zile de la aparitia simptomelor clinice,

deoarece cele mai multe virusuri sunt excretate numai in fazele timpurii ale bolii.

Exceptii:

Tip de virus Tesut Perioada de excretie

Adenovirus 8, 19, ! c"erato#$con%unctival 1& zile

'irusul urlian (lande parotide si saliva 12 zile

)icornavirusuri *ecale +aptamani#luni in particular la copii-


7/25/2019 LP 1.ppt


7 organul implicat nu este totdeauna locul de predilectie al replicării virale/x0 enterovirusurile care determin encefalite acute sunt izolate cu predilectie din materii fecale

7 gravitatea unor afectiuni nu este proportionala cu sansa de izolare/x0 neurovirulenta unor virusuri nu este proportionala cu cantitatea de virus

7/25/2019 LP 1.ppt


Virusuri patogene Produse patologice ComentariiTractul respirator

Adenovirusuri; virusuri gripale;

enterovirusuri (picornavirus);

rhinovirusuri; paramixovirusuri;

virusurile herpes simplex

Spalaturi nazale, tampon nazal;

exudat faringian, sputa

Enterovirusurile se gasesc de

asemenea iȋn fecale

Tractul gastrointestinal

Reovirus; rotavirus; adenovirus;

Norwalk virus; calicivirus

Fecale; tampon rectalProbele sunt analizate prin

microscopie electronica si ELISA;

Virusurile nu sunt cultivabile.Erupții cutanate, eczeme

Adenovirus

Enterovirus (picornavirus)

Exudat faringian, tampon rectal -

Rubella virus; virus rujeolos Urina -

Erupții veziculare Virusul Coxsakie; virusul ECHO

(Enteric Cytopathic Human Orphan);

HSV; VZV (Varicella-Zoster Virus)

Vezicule cu fluid, raclat sau

tampon, fecale (doar enterovirus)

Diagnosticul inițial al HSV și VZV

poate fi obținut din vezicule raclate

(frotiu Tzanck)

Sistemul nervos central (Meningitǎ asepticǎ, Encefalitǎ)Enterovirus (picornavirus) fecale PCR

Arbovirusuri (de ex: taogavirusuri,

buniavirusuri)rar cultivate Diagnostic serologic

Virusul rabiei tesuturi, saliva, biopsie din creier

Diagnostic prin imunofluorescenta

pentru antigenHSV; CMV; virusul urlian, virusul

rujeolosFluid cerebrospinal

PCR, izolare virala, și antigen

Tractul urinar

Adenovirus; virusul citomegalic urina CMV poate fi menținut fara un efect

vizibil

SaȃngeHIV; HTLV (Human T-cell leukemia

virus); Virusurile hepatitice B, C, D

Sange

Detectia serologica a antigenului si

anticorpilor prin (ELISA); PCR si RT-PCR

7/25/2019 LP 1.ppt


IZOLAEA IAL" I# O$L E%&IO#AT 'E ()I#)

2. Alegerea culturilor de celule – in functie de sensibilitatea fata de virusulcautat/spectru cat mai larg de virusuri

7/25/2019 LP 1.ppt


$tilizarea animalelor de laborator

7/25/2019 LP 1.ppt


Tipuri de culturi celulare

Culturi primare (de faza I) $ culturi intiate pornind de la celule, tesuturi, organe normale8tumorale preluate direct dintr*unorganism si cultivate in vitro - celulele isi pastreaza inca unele caracteristici ale tesuturilor din care provin si pot fi:

- fibroblaste

- de tip epitelial - de tip epiteloid

Culturi secundare $ iau nastere prin pasajul secundar al unei culturi primare cand celulele ating o densitate foarte mare*Celulele sunt celule diploide normale cu urmatoarele caracteristici: * asemanare morfologica si genetica cu tesutul din care provin * au nevoie de suprafata solida de aderare * au durata de viata limitata

Linii celulare stabilizate $ 9:i au originea 9n liniile celulare sta#ilizate su# aciunea unui eveniment genetic detransformare malign< spontan< sau su# aciunea unui virus oncogen! Astfel de culturi au o durat< de via< nelimitat< :ise numesc linii celulare continue :i au pierdut inhi#iia de contact!

* =nele celule sunt foarte permisive pentru multiplicarea unui anumit virus, altele, mai puin permisive, ceea ce

influeneaz< randamentul multiplic<rii virusului!* Cultura primar< este considerat< ca atare p>n< este su#cultivat<! 0up< ce a fost su#cultivat< devine cultură secundară;

Fibroblaste

HeLa %linie celularadin carcinomade col uterin&

HepG2%linie celularadin carcinom

hepatocelular&

7/25/2019 LP 1.ppt


Celulele normale au o durat< de via< limitat< 9n timp! At>t in vivo, c>t :i in vitro, ele realizeaz< unnum<r limitat de cicluri de diviziune!

0iviziunea celulelor normale in vitro este strict dependent< de urm<toarele condiii'7densitatea celular<;

7disponi#ilitatea factorilor de cre:tere;7disponi#ilitatea unei suprafee solide la care s< adere!

0ependena cre:terii de densitatea celular<, se manifest< prin fenomenul inhibiţiei de contact !

Inhibiţia de contact sau cre:terea dependent< de densitate define:te capacitatea celulei normale de arecepiona stimuli din mediul etern :i de a 9nceta diviziunea :i mi:c<rile %formarea pseudopodelor& 9ncondiii restrictive de spaiu!

in vitro, celulele normale se divid numai at>ta timp c>t dispun de spaiul necesar, adic< cresc numaip>n< la contactul cu celulele vecine, form>nd un monostrat ! C>nd monostratul este confluent,diviziunea se opre:te!

In vitro, celulele normale realizeaz< o creştere bidimensională, iar in vivo, consecina cre:terii limitatede spaiu este p<strarea riguroas< a arhitecturii esutului :i organului din care fac parte!

Liniile celulare transformate au pierdut caracterele morfologice i func!ionale ale celulelor normale de origine,iar din punct de vedere genetic sunt aneuploide %num<rul de cromosomi este mai mare sau mai mic de 6n&!Sunt foarte frecvent folosite datorit< caracterului lor permisiv pentru numeroase virusuri, liniile celulare'

7?eLa %?elen Lane $ numele pacientei&, originar< dintr*o neoplazie de col uterin;7@? %baby hamster kidney $ rinichi de pui de hamster&;7@, derivat< dintr*un carcinom mamar uman;7L, derivat< din esutul conjunctiv de :oarece!

7/25/2019 LP 1.ppt


Medii şi soluţii pentru cultivarea celulelor

Clasificare:

medii naturale, semisintetice :i sintetice!

0up< valoarea nutritiv< sunt medii de creştere :i de întreţinere %meninere&!

0up< consisten<' medii lichide :i semisolide!

Componentele fundamentale ale unui mediu:

soluţia salină tamponat< asigur< izotonia cu mediul citoplasmatic, constana valorii p? :i aportul de glucoz< %de

eemplu, soluia ?anBs&;

factorii nutritivi ' aminoacizi eseniali, derivai ai hidrolizei proteinelor, precum :i proteine din ser, plasm<, lichid ascitic;

factori stimulatori ai cre:terii din produsele de digestie proteic< :i din lichidele #iologice cu care se suplimenteaz<

mediul %ser, plasm<, lichid ascitic&;

vitamine din grupul @, furnizate de etractul de levuri care se adaug< 9n proporie de );

indicatorul de p care s< vireze culoarea 9ntr*un domeniu 9ngust' ro:u fenol are culoarea ro:ie 9n mediul alcalin :i

devine gal#en 9n mediul acid! 4aloarea p? a mediului nutritiv tre#uie s< fie c>t mai aproape de .,6! Majoritatea

culturilor de celule tolereaz< p? 9ntre ,*.,.;

antibiotice pentru stoparea multiplic<rii contaminanilor #acterieni! Denicilina %)(( =18ml mediu&, streptomicina %)((

Eg8ml mediu&, neomicina :i mFcostatinul se folosesc 9n mod curent!

Dezavantajul adaosului anti#ioticelor 9n mediile nutritive %9n special penicilina :i streptomicina& const< 9n apariia formelor L sau 9n seleciatulpinilor rezistente, am#ele la fel de riscante pentru cultivarea continu< a celulelor! 0e aceea, periodic se recomand< la fiecare al patruleapasaj, s< se adauge o soluie de neomicin<!

7/25/2019 LP 1.ppt


STUDIUL RELATIEI

VIRUS - CELULAGAZDA IN CULTURICELULARE

7/25/2019 LP 1.ppt


CULTURI CELULARE

Izolarea siinoculareavirusurilor

Evidentierea efectuluiviral citoatic indusasura celulelor din

cultura

1. Recoltarea si pregatirea prod. patologice sau a prod.naturale2. Alegerea culturilor de celule – in functie de sensibilitateafata de virusul cautat/spectru cat mai larg de virusuri

3. Inocularea culturilorcelulare

4. Incubarea

5. Citirea si interpretaraerezultatelor

Metodedirecte

Metodeindirecte

7/25/2019 LP 1.ppt


1. METODE DIRECTE PERMIT EVIDENTIEREA PREZENTEI VIRUSULUI

!"DI#ICARI !"R#"L"GICEALE

SU$STRATULUI

Vira%ul rosuluifenol

Culturile de celuleneinfectate

determina virajulculorii ca urmare aacumularii in mediu

a acidului lactic siC" 6 Multiplicarea virala

#locarea virajuluiculorii modificarea

meta#olismuluicelular

Efectul citoatic & EC'"odificari#alterari morfologice si structurale

induse de prezenta $irusului in celule

0e tip degenarativ

Cu formare de incluzii

Hfect de tip proliferativ sau transformant

FORMAREA

PLAJELOR DE

LIZA SUBAGARA

7/25/2019 LP 1.ppt


*cu formare de sincitii / mase citoplasmatice, multinucleate, cu aglomerari mari de nuclei, rezultate prin ruperea mem#raneicelulare, fuzunea citoplamelor si agregarea nucleilor

* efect citocid / citolitic / distrugerea si dezagregarea celulelor I particulel virale sunt eliminate la eterior

* Hfect mit / o#servarea sincitiilor, a puntilor celulare si a plajelor de liza

%e tip degenerati$

&fect de tip proliferati$ sau transformant

Cu formare de incluzii

* 4irusul ra#ic produce incluzii citoplasmatice acidofile %ce contin macromolecule codificante ale informatiei genetice virale&/ corpusculi 'abesegri

*Caracteristice virusurilor cu genom ARN8A0N care au capacitatea de a transforma in vitro celulel normale si de a induce

in vivo tumori eperimentale

*2ransformarile sunt de ordin morfologic, meta#olic, antigenic

*2ransformarile se traduc prin * intensificarea ratei meta#olice

* multiplicare rapida

* schim#ari ale aranjamentului celular in culturi

FORMAREA PLAJELOR DE LIZA SUB AGARA - BACTERIOFAGI

*in mediu agar semisol1d $ S=SDHNS1H 41RALA J S=SDHNS1H @AC2HR1ANA $ turnare in placi Detri in strat su#tire;

*Darticulele virale infectante raman localizate $ multiplicare virala pe o zana limitata $ aparitia plajelor de liza

7/25/2019 LP 1.ppt


4irusul herpetic * sincitii 4irusul poliomielitic $ efect citocid

4irusul ra#ic * incluzii

7/25/2019 LP 1.ppt


2. METODE INDIRECTE DE APRECIERE A REPLICARII VIRALE

ITERFERENTA

TESTE BIOCHIMICE

HEMADSORBTIA

/ actiunea antagonista a doua virusuri dintre care, unul do#andeste capacitatea de a eclude cel de al 11*lea virus infectant!

/ metoda folosita la izolarea unor virusuri care nu isi manifesta prezenta prin nici o modificare morfo*fiziologica a celulelor pe

care sunt active;

/ determina modificari cantitative ale unor meta#oliti celulari sau ai mediului de cultivare , ca urmare a multiplicarii virale

/ pentru detectarea prezentei virusurilor care la izolare sau cultivare nu se prima prin HCD vizi#il

/ se #azeaza pe capacitatea celulelor infectate cu virus de a adsor#i pe suprafata hematiile dintr*o suspensie adaugata inflaconul de cultivare $ fenomen vizi#il microscopic!

H! 4irusul gripal $ aglutinarea hematiilor

7/25/2019 LP 1.ppt


Observarea efectului citopatic la microscopul optic:liz celularvacuolizare

sinci iiț

aparitia corpilor de incluzie

Hfect citopatic produs de virusulherpes simple ) %marire +3&

Hfect citopatic produs de virusulherpes simple ) %marire )-(3&

7/25/2019 LP 1.ppt


3/4A5+67IA

LP 1.ppt

Documents

Transcript of LP 1.ppt