Catedra de medicina celulara si moleculara

Obiectul biologiei celulare

Microscopie opticaMicroscopie optica

Obiectul biologiei celulare

Biologia celulara = stiinta fundamentala Biologia celulara = stiinta fundamentala care se ocupa cu studiul celulei ca unitate care se ocupa cu studiul celulei ca unitate structurala si functionala a oricarui structurala si functionala a oricarui organism viuorganism viu

Microscopia optica

Microscopul optic = dMicroscopul optic = dispozitiv cu ajutorul ispozitiv cu ajutorul căruia se pot examina structuri cu căruia se pot examina structuri cu dimensiuni mult sub puterea de rezolutie a dimensiuni mult sub puterea de rezolutie a ochiului umanochiului uman

Microscopul optic

O c u la ru l

S u rsa lu m in a

C o n d en sa to rM asa

M acro s i m ic ro v iz a

Componentele microscopului optic

1.    SURSĂ DE LUMINA1.    SURSĂ DE LUMINA 2.    CONDENSOR2.    CONDENSOR 3.    DIAFRAGMĂ3.    DIAFRAGMĂ 4.    MASA4.    MASA 5.   5.   DISPOZITIV DE DISPOZITIV DE

DEPLASARE A LAMEIDEPLASARE A LAMEI

6.    REVOLVER6.    REVOLVER 7.    OBIECTIVE7.    OBIECTIVE 8.    SISTEM DE PRISME8.    SISTEM DE PRISME 9.    OCULAR9.    OCULAR

10. MACROVIZA10. MACROVIZA

11 11 MICROVIZAMICROVIZA

Modul de formare a imaginii la MO

Obiectivul formeaza o Obiectivul formeaza o imagine marita , reala si imagine marita , reala si rasturnata a obiectuluirasturnata a obiectului

Ocularul- are ca obiect Ocularul- are ca obiect imaginea data de obiectiv imaginea data de obiectiv si va forma imaginea si va forma imaginea finala mult marita , finala mult marita , rasturnata si virtuala , la rasturnata si virtuala , la infinit deci nu necesita infinit deci nu necesita efort de acomodareefort de acomodare

Performantele microscopului optic

Puterea de marirePuterea de marire Puterea de rezolutiePuterea de rezolutie

Puterea de marire

Puterea de marire = produsul dintre puterea Puterea de marire = produsul dintre puterea de marire a obiectivului si cea a ocularuluide marire a obiectivului si cea a ocularului

Puterea de marire maxima x1500 oriPuterea de marire maxima x1500 ori Puterea de mărire Puterea de mărire

- ×4, ×10- ×4, ×10

- ×20, ×40 – diagnostic histologic- ×20, ×40 – diagnostic histologic

- ×60, ×100 – diagnostic citologic- ×60, ×100 – diagnostic citologic

Puterea de rezolutie a microscopului optic ==Cea mai mică distanţă dintre două puncte la care Cea mai mică distanţă dintre două puncte la care

acestea pot fi percepute distinctacestea pot fi percepute distinct De ea depinde claritatea şi bogăţia în detalii a De ea depinde claritatea şi bogăţia în detalii a

imaginiiimaginii Depinde de lentila obiectivuluiDepinde de lentila obiectivului FORMULA LUI ABBÉ :FORMULA LUI ABBÉ : d=d=/ n sin/ n sinαα = lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 µm)= lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 µm) n= indicele de refractie al mediului dintre preparat si obiectivn= indicele de refractie al mediului dintre preparat si obiectiv = ½ din apertura unghiulara a obiectivului= ½ din apertura unghiulara a obiectivului

Puterea de rezolutie a microscopului optic

Limitarile puterii de rezolutie a Limitarile puterii de rezolutie a microscopului optic in practicamicroscopului optic in practica

este o constanta naturala ce nu poate fi este o constanta naturala ce nu poate fi influentata (0,55)influentata (0,55)

Mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei Mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei aer (n = 1)aer (n = 1)

Puterea de rezolutie

Obiectivul cu imersie – Obiectivul cu imersie – intre obiectiv si intre obiectiv si preparat se interpune o picatura de lichid cu preparat se interpune o picatura de lichid cu un indice de refractie supraunitar, cum este un indice de refractie supraunitar, cum este uleiul de cedru (uleiul de cedru (n=1,51)n=1,51)

Apertura unghiulara maxima teoretica este Apertura unghiulara maxima teoretica este 180 , deci 180 , deci =90, limita teoretica maxima a =90, limita teoretica maxima a sin sin =1=1

Rezolutia maxima a microscopului optic= Rezolutia maxima a microscopului optic= 0,20,2

Preparate fixate si colorate

Studiul celulelor vii, necolorate

1.MICROSCOP CU 1.MICROSCOP CU CÂMP ÎNTUNECATCÂMP ÎNTUNECAT

2. M. CU CONTRAST 2. M. CU CONTRAST DE FAZĂDE FAZĂ

33. M. CU . M. CU INTERFERENŢĂINTERFERENŢĂ

4. M. TIP NOMARSKI4. M. TIP NOMARSKI 5. MICROSCOPUL 5. MICROSCOPUL

RANVERSATRANVERSAT

Studiul celulelor vii, necolorate

1.MICROSCOP CU 1.MICROSCOP CU CÂMP ÎNTUNECATCÂMP ÎNTUNECAT

PRINCIPIU – PRINCIPIU – exista un exista un diafragm in condensor diafragm in condensor care selecteazacare selecteaza doar doar lumina laterala, iar lumina laterala, iar imaginea finala este imaginea finala este formata de catre razele formata de catre razele reflectate de reflectate de componentele din componentele din preparat preparat

2. M. CU CONTRAST DE FAZĂ2. M. CU CONTRAST DE FAZĂ PRINCIPIUPRINCIPIU -  lumina care trece prin medii cu indici de -  lumina care trece prin medii cu indici de

refracţie diferiţi îşi modifică direcţia şi refracţie diferiţi îşi modifică direcţia şi vitezaviteza

-   microscopul transformă aceste diferenţe -   microscopul transformă aceste diferenţe în diferenţe de intensitate luminoasăîn diferenţe de intensitate luminoasă

33. M. CU INTERFERENŢĂ. M. CU INTERFERENŢĂ PRINCIPIUPRINCIPIU - mai foloseşte încă o rază de lumină care - mai foloseşte încă o rază de lumină care

nu traversează ţesutul analizat ,dar interferă nu traversează ţesutul analizat ,dar interferă cu raza provenita de la sursa de luminacu raza provenita de la sursa de lumina

- ofera informaţii despre densitatea - ofera informaţii despre densitatea obiectului analizeiobiectului analizei

4. M. TIP NOMARSKI4. M. TIP NOMARSKI Un tip modificat al Un tip modificat al

microscopului cu microscopului cu contrast de faza, contrast de faza, oferind imagini aparent oferind imagini aparent tridimensionaletridimensionale

  ....

5. 5. MICROSCOPUL RANVERSATMICROSCOPUL RANVERSAT - pentru examinarea celulelor din flacoane - pentru examinarea celulelor din flacoane

sau placi Petrisau placi Petri - obiective sub masuta - obiective sub masuta - sursa de lumina deasupra- sursa de lumina deasupra

MICROSCOPUL CU

FLUORESCENŢĂ LUMINISCENTA = LUMINISCENTA = proprietatea unor substante de proprietatea unor substante de

a emite lumina atunci cand sunt stimulate luminos a emite lumina atunci cand sunt stimulate luminos =FOTOLUMINISCENTA=FOTOLUMINISCENTA

FLUORESCENTA – proprietatea unei substante FLUORESCENTA – proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioase de a emite radiatii lumioase doar in timpuldoar in timpul stimulariistimularii

FOSFORESCENTA –FOSFORESCENTA –proprietatea unei substante proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioase de a emite radiatii lumioase si dupa incetarea si dupa incetarea stimulariistimularii

MICROSCOPUL CU

FLORESCENŢĂ TERMOFLUORESCENTA = TERMOFLUORESCENTA = proprietatea unor proprietatea unor

substante de a emite lumina atunci cand sunt substante de a emite lumina atunci cand sunt stimulate termic.stimulate termic.

MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

Aplicatii practice:Aplicatii practice:

1.1.AUTOFLUORESCENŢAAUTOFLUORESCENŢA

capacitatea tesuturilor vii capacitatea tesuturilor vii de a absorbi radiatii de a absorbi radiatii luminoase cu o anumita luminoase cu o anumita lungime de unda si de a o lungime de unda si de a o emite ulterior alte radiatii, emite ulterior alte radiatii, cu o alta lungime de unda, cu o alta lungime de unda, mai maremai mare

2.    2.    FLUORESCENTA SECUNDARAFLUORESCENTA SECUNDARA – după – după marcare cu compuşi fluorescenţi :marcare cu compuşi fluorescenţi :

a.     Acridin orange – ADN-verde/ ARN-rosua.     Acridin orange – ADN-verde/ ARN-rosu

b.     Quinacrina – cromozomi = bandareb.     Quinacrina – cromozomi = bandare

Marcarea fluorescenta a ADN

MICROSCOPUL CU FLORESCENŢĂ

3.IMUNOFLUORESCENŢA : punerea în 3.IMUNOFLUORESCENŢA : punerea în evidenţă a diferiţilor antigeni cu ajutorul evidenţă a diferiţilor antigeni cu ajutorul unor anticorpi specifici marcaţi cu un unor anticorpi specifici marcaţi cu un compus fluorescent IZOTIOCIANAT DE compus fluorescent IZOTIOCIANAT DE

FLUORESCEINA (FITC)FLUORESCEINA (FITC)

-2 tipuri: directa si indirecta-2 tipuri: directa si indirecta

Imunofluorescenta directa

=Ag + Ac specific =Ag + Ac specific marcatmarcat

Imunofluorescenta indirecta

Ag + Ac specific + Ac sec. marcatAg + Ac specific + Ac sec. marcat

- are o sensibilitate mai mare ca metoda a—- are o sensibilitate mai mare ca metoda a—se foloseste in cazul in care antigenele se se foloseste in cazul in care antigenele se gasesc in cantitate mica in tesutgasesc in cantitate mica in tesut

Imunofluorescenta indirecta

4.SONDE FLUORESCENTE , 4.SONDE FLUORESCENTE , molecule care detecteaza concentratia IC a molecule care detecteaza concentratia IC a ionilor , a rad. liberi , a variatiilor de pH IC ionilor , a rad. liberi , a variatiilor de pH IC si isi modifica proprietatile in functie de si isi modifica proprietatile in functie de valorilor acestora.valorilor acestora.