INTERPRETAREA CROMATOGRAMELOR 2008

18
Interpetarea cromatogramelor In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide cu coloană indiferent dacă aceasta este de tip cu coloană deschisă sau sau de tip HPLC . Aşa cum se observă amestecul de substanţe este injectat la intrarea în coloană , prin mecanisme diverse de natură fizico – chimică are loc separarea specifică a speciilor chimice în timp acestea sosind pe rînd la celălalt capăt al coloanei unde sunt detectate obţinîndu-se o cromatogramă de tipul celei din figură. Fig. 1. Principiul separării cromatografice pe coloană şi cromatograma obţinută pentru un amestec de trei specii chimice într-un solvent Pe cromatogramă pot fi identificate trei Peak-uri: - primul peak, de înălţime mică, este cel al unei specii chimice nereţinute (neretardate) de umplutura coloanei , această specie traversează coloana cu viteza fazei mobile, 1

Transcript of INTERPRETAREA CROMATOGRAMELOR 2008

Interpetarea cromatogramelor

In figura 1 este reprezentat principiul cromatografiei lichide cu coloan indiferent dac aceasta este de tip cu coloan deschis sau sau de tip HPLC . Aa cum se observ amestecul de substane este injectat la intrarea n coloan , prin mecanisme diverse de natur fizico chimic are loc separarea specific a speciilor chimice n timp acestea sosind pe rnd la cellalt capt al coloanei unde sunt detectate obinndu-se o cromatogram de tipul celei din figur.

Fig. 1. Principiul separrii cromatografice pe coloan i cromatograma obinut pentru un amestec de trei specii chimice ntr-un solvent

Pe cromatogram pot fi identificate trei Peak-uri:

- primul peak, de nlime mic, este cel al unei specii chimice nereinute (neretardate) de umplutura coloanei , aceast specie traverseaz coloana cu viteza fazei mobile, timpul scurs de la injecie pn la traversarea coloanei de ctre aceast specie se noteaz cu t0

- al doilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza de traversare medie timpul de reinere fiind notat cu tr1

- al treilea Peak este cel al unei specii chimice cu viteza mic de traversare aceast specie avnd timpul de reinere tr2

Mrimi specifice cromatografiei

Lungimea coloanei cromatografice (L)- reprezint lungimea coloanei msurat de la sistemul de injecie pn la detector

Viteza liniar de curgere (u) estedefin it prin viteza de curgere a fazei mobile i este exprimat prin:

Timpul de traversare (timpul mort) (t0 ) este timpul parcurs de o specie chimic nereinut e (neretardate) de umplutura coloanei de la injecie pn la traversarea coloanei, aceast specie traverseaz coloana cu viteza fazei mobile. Acest timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului cromatografic atinge valoarea zero. Timpul t0 formeaz baza de plecare pentru determinarea factorului de reinereTimpul de reinere (tr)- reprezint timpul necesar ca o specie chimic s traverseze coloana cromatografic din momentul injectiei pn la sosirea la detector . Ca i la timpul mort i acest timp espe msurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecie i semnalul dat de detector atunci cnd valoarea derivatei a I a a peak-ului cromatografic atinge valoarea zero. Factorul de reinere ( factorul de capacitate ) (k). Din cromatogram din fig. 1 se observ c natura speciilor chimice poate fi interpretat prin prisma timpului de retenie tr acest timp depinde ns pe lng natura specieiei i de ali factori precum : lungimea coloanei, natura i granulaia umpluturii, etc, ca atare timpul de reinere poate fi considerat specific naturii speciilor chimice numai n condiii precis definite neavnd un caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativ este folosit factorul de reinere (k) denumit in literatur i factor de capacitate:

un factor de kapacitate de valoare mic indic o rezoluie de identificare sczut iar un factor de capacitate de valoare mare indic un timp de separare i de analiz mare cu efect negativ asupra producivitii. Din punct de vedere al ordinului de mrime factorul de capacitate trebuie s se situeze intre 1 i 10.

Gradul de separare a doi componeni () - exprim gradul de separare cromatografic a dou substane i este definit ca :

Eficiena unei coloane cromatografice . Ca msur a eficenei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numrul N de talere teoretice necesare separrii fie nlimea teoretic H a talerului. Teoria talerelor se bazeaz pe conceptul c o coloan cromatografic poate fi asimilat cu o mulime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza mobil i cea staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler realizeaz singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare a unei cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu umplutur pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane cromatografice de separare crete atunci cnd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere necesar ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:

de unde rezult nlimea talerului ca fiind :

Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la traversarea coloanei cauzat de difuzie molecular longitudinal, de curgeri neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de relaia:

Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.

O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli cercettori de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii peak-ului la jumtatea nlimii lui, figura , numrul de talere teoretice rezultate fiind :

Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele dou mrimi : nlimea H a talerului i numrul N de talere ce indic ambele eficiena coloanei este preferat exprimarea prin numrul de talere deoarece este adimensional i poate fi folosit n comparaii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiia ca eficiena s fi fost stabilit cu aceeai faz mobil. Numrul de talere poate fi mrit foarte simplu prin creterea lungimii coloanei.

Rezoluia de separare Rs - reprezint msura separrii unui mai avansate sau mai puin avansate aunui component de altul , cu ct distana ntre dou peak-uri este mai mare cu atit rezoluia este mai bun, totodat crete i timpul de analiz cromatografic:

EMBED Equation.3 unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri neseparate complet.

Fig.2. Situaia unei separri incomplete a Peak-urilorDac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine

ecuaie ce arat influena termodinamic a sistemului cromatografic asupra rezoluieiei prin termenul de la numrtor i a eficienei de separare prin abaterea standard. In situaia in care:

tr2 tr1 = 4

rezoluia Rs are valoarea egal cu unu ceea ce corespunde unei separri avansatea a celor doi componeni de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistic matematic este justificat de asemnarea dintre peak-urilor cromatografice i curbe de tip Gauss valoarea lirii W fiind egal cu 4Lirea de band

Lirea de band a unei probe n cltoria ei prin coloan este influenat de patru factori:

1. difuzia radial

2. difuzia longitudinal

3. efectele transportului de mas

4. efectele exterioare

Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s soseasc pe un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime iau natere ca urmare a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n figura

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lirii benzii [VARIAN P1-25]Pentru ca o coloan s prezinte o lire de band mic este nevoie ca ea s aibe o umplutur de dimensiune ct mai mic i de diametru ct mai uniform. Difuzia radial este cu atit mai ridicat cu ct proba traverseaz mai ncet coloana. La coloane capilare fr umplutur , folosite n gazcromatografie, difuzia radial poate fi neglijat. Difuzia longitudinal se datoreaz pe diferenierea axial a vitezei de curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunat pe msura creterii timpului de staionare a probei n coloan. Spre deosebire de difuzia radial la cea axial se poate reduce efectul asupra lirii de band prin mrirea vitezei fazei mobile. Din cauza coeficientului de difuzie mai mic cu cca 103-104 Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lirii benzii VARIAN p1-26

la lichide dect la gaze difuzia longitudinal este minor n cazul cromatografiei de lichide n schimb la cromatografia de gaze ea joac un rol hotrtor. Influena efectului difuziei longitudinale asupra lirii de band este reprezentat n figura Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci cnd o molecul a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar petrece pe i n aceasta un un anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de curgere i este transportat mai departe de faza mobil. In tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i structura poroas (atunci cnd este cazul) a fazei staionare. Fenomenele de transport de mas devin cu att mai pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca atare lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus prin scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor particule cu diametru ct mai mic i neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la cromatografia de lichide) .

Fig.

Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band

Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, ii- i difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band

Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i snt cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele de transport. Suma efectelor enunate mai sus se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul de lichid iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

Fig. Lairea de band: i - la o cromatogram normal, ii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm i diametrul interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogram care se obine prin intercalarea intre detector i ieirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm i un diametru interior de 4,6 mm

Simetria Peak-urtilor. Forma peak-urilor poate fi foarte diferit , n vederea caracterizrii acestora IUPAC a elaborat o clasificare , astfel: la crestere mai accentuat a frontului Peak-ului decit a scderii acestuia denumirea este de Tailing

la cresterea mai lin a frontului peak-ului fa de scderea acestuia denumirea este de Fronting

Factorul de Tailing sau de fronting reprezint o msur a simetriei peak-ului i se determin la valoarea de 10% din nlimea peak-ului dup relaiile din figura

Analiza calitativ

Analiza cantitativMetoda normrii suprafeei (nlimii)

La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv inlimea unui peak este proportional cu concentraia componentului reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraia procentual a unui component trebuie avut n vedere nlimea total sau suprafaa total a tuturor componentelor din amestec care este considerat ca avnd o compoziie de 100% . Concentraia fiecrui component din amestec se determin pe urm prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se accept urmtoarele:

1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele i c fiecare component apare sub forma unui peak individual bine definit. Aceast presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe componente pot parsi n acelai timp coloana fiind identificate ca o singur specie, sau unele specii pot fi reinute total pe coloan i iar altele eventual nici nu snt detectate

2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se adeverete

bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se procedeaz la calibrarea sensibilitii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise n continuare.

Metoda standardului extern

La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care conine specia (speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime al concentraiei componentei (componentelor) urmrite este bine ca la standardul extern concentraia s fie n acelai domeniu. Faza mobil astfel preparat se trimite prin cromatograf i se traseaz o cromatogram , operaia se repet pentru proba de analizat. Din cromatograma standard se determin pentru peak- ul urmrit, figura, un factor de rspuns r ca fiind raportul dintre concentraia componentei [Ai] urmrite i nlimea h sau suprafaa S a peak-ului, :

b

Fig. Mrimi caracteristice ale peak-ului luate n calcul la

determinarea concentraiei prin metoda standardului externn continuare concentraia oricrei componente din prob se determin prin nmulirea factorului de rspuns r cu nlimea h sau cu suprafaa S peak-ului. De fapt prin calcularea acestui factor de rspuns r se simplific determinarea concentraiei prin regula de trei simple, factorul de rspuns regsindu-se de fiecare dat n aceast regul sub forma unei constante, la calcularea concentraiei diferitelor componente din amestec. Acest mod de determinare a concentraiei unei componente presupune o dependen liniar ntre nlimea respectiv suprafaa peak-ului i concentraie. Atunci cnd aceast dependen este cunoscut sau bnuit ca fiind neliniar se efectueaz mai multe cromatograme etalon cu concentraii cunoscute care includ n domeniu valoarea concentra iei necunoscute , figura i cu valorile obinute se traseaz o curb de

Fig. nlimea i forma peak-urilor la calibrarea multipl cu concentraii cresctoare a componentului urmritFig. Curba de etalonare a componentului urmrit oarecare

etalonare n coordonate h(S) i concentraie. Pe aceast curb de etalonare se extrapoleaz valorile nlimii sau suprafeei peak-ului urmrit pentru detrminarea concentraiei speciei pe care o reprezint acesta. Imprecizia acestei metode este legat de erorile de dozare ale probei de analizat avnd n vedere i volumele mici ce se dozeaz.

Metoda standardului intern

La folosirea acestei metode se obin cele mai mari precizii deoarece snt evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecie. Tehnica se bazeaz pe adugarea atit la proba standard ct i la proba urmrit o cantitate bine stabilit dintr-un standard intern. Raportul dintre suprafeele peak-urilor sau a nlimii probei i suprafaa peak-ului standardului intern reprezint parametrul analitic urmrit respectiv factorul de rspuns r :

factor care se poate exprima , atunci cnd se ine cont de corespondena dintre suprafaa S a peak-ului i concentraia c , i ca fiind [LINDSAY]:

unde: c - concentraia componentei care intereseaz

S - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului

cs - concentraia standardului intern

Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardukui intern

In aceste condiii concentraia componentei urmrite cu are expresia:

unde: cu - concentraia componentei analizateSu - suprafaa (respectiv nlimea) peak-ului componentei analizatecs - concentraia standardului intern

Ss - suprafaa (respectiv inlimea) peak-ului standardului intern

PAGE 14

_1272654517.unknown

_1272655441.unknown

_1298178338.unknown

_1298141341.unknown

_1272655177.unknown

_1272654896.unknown

_1271783782.unknown

_1272614124.unknown

_1272647645.unknown

_1271942818.unknown

_1272614105.unknown

_1272006761.unknown

_1271942781.unknown

_1269325249.unknown

_1269333197.unknown

_1269325047.unknown