Trecerea moleculelor hidrofile prin membrana bacteriilor gram negative.pdf
Coloraţia Gram
2
LUCRARE DE LABORATOR – COLORAŢIA GRAM A fost introdusă în practica microbiologică de Gram. Se utilizează acţiunea a doi coloranţi: fucsină bazică şi violetul de genţiană, este o coloraţie diferenţială- diferenţiază toate bacteriile în două grupe: Gram pozitive şi Gram negative, care se bazează pe diferenţele structural biochimice şi biologice, dar în special pe structura diferită a peretelui celular. Este o coloraţie cu valoare taxonomică, descrierea începând cu caracterul Gram. Materiale necesare: lame, lamele, cultură bacteriană, ansă bacteriologică, spirtieră, apă, soluţie de violet de genţiană 1%, soluţie Lugol, alcool, soluţie de fucsină bazică 1% sau safranină, pipette, microscop, aparat de fotografiat, hârtie de filtru DESCRIEREA ETAPELOR DE LUCRU Pentru efectuarea unui preparat fixat cu bacterii care urmează a fi examinate, trebuie parcurse următoarele etape: etalonarea celulelor pe suprafaţa unei lame de microscop, fixarea frotiului şi apoi colorarea. Preparatul astfel obţinut este cunoscut sub denumirea de frotiu. 1. Pe o lamă de microscop se pune, cu bucla ansei, o picătură de apă fiziologică. În bucla ansei se recoltează o cantitate mică din suspensie sau dintr-o colonie bacteriană şi apoi se dispersează omogen în picătura de apă fiziologică. Frotiul este fixat la flacără. 2. Se colorează cu soluţie de violet de genţiană 1% care se menţine pe lamă 1-2 minute, apoi colorantul se scurge şi preparatul se spală cu apă. Toate bacteriile se colorează în violet. 3. Mordansarea cu soluţie Lugol (1:2:300 iod, iodură de potasiu, apă distilată). Soluţia se menţine pe lamă 2-3 minute. Preparatele nu se spală. În timpul acestei operaţii iodul formează cu violetul de genţiană un complex iodat cu greutate moleculară mare care la unele bacterii este stabil, la altele este instabil. 4. Decolorarea cu alcool se menţine 5- 7 secunde pe lamă, apoi se face o spălare abundentă cu apă pentru a opri acţiunea decolorantului. 5. Recolorarea cu soluţie de fucsină bazică 1% sau safranină, 1/10. se menţine pe lamă un minut. Preparatul se spală cu apă, și se uscă. 6. Se examinează la microscop. Celulele la care complexul este instabil se decolorează şi vor fi recolorate cu fucsină în roşu, celelalte rămân colorate în violet.
-
Upload
nelu-castravet -
Category
Documents
-
view
217 -
download
0
description
..
Transcript of Coloraţia Gram
LUCRARE DE LABORATOR COLORAIA GRAM
A fost introdus n practica microbiologic de Gram. Se utilizeaz aciunea a doi colorani: fucsin bazic i violetul de genian, este o coloraie diferenial- difereniaz toate bacteriile n dou grupe: Gram pozitive i Gram negative, care se bazeaz pe diferenele structural biochimice i biologice, dar n special pe structura diferit a peretelui celular. Este o coloraie cu valoare taxonomic, descrierea ncepnd cu caracterul Gram.
Materiale necesare: lame, lamele, cultur bacterian, ans bacteriologic, spirtier, ap, soluie de violet de genian 1%, soluie Lugol, alcool, soluie de fucsin bazic 1% sau safranin, pipette, microscop, aparat de fotografiat, hrtie de filtruDESCRIEREA ETAPELOR DE LUCRU
Pentru efectuarea unui preparat fixat cu bacterii care urmeaz a fi examinate, trebuie parcurse urmtoarele etape: etalonarea celulelor pe suprafaa unei lame de microscop, fixarea frotiului i apoi colorarea. Preparatul astfel obinut este cunoscut sub denumirea de frotiu.
1. Pe o lam de microscop se pune, cu bucla ansei, o pictur de ap fiziologic. n bucla ansei se recolteaz o cantitate mic din suspensie sau dintr-o colonie bacterian i apoi se disperseaz omogen n pictura de ap fiziologic. Frotiul este fixat la flacr.
2. Se coloreaz cu soluie de violet de genian 1% care se menine pe lam 1-2 minute, apoi colorantul se scurge i preparatul se spal cu ap. Toate bacteriile se coloreaz n violet.
3. Mordansarea cu soluie Lugol (1:2:300 iod, iodur de potasiu, ap distilat). Soluia se menine pe lam 2-3 minute. Preparatele nu se spal. n timpul acestei operaii iodul formeaz cu violetul de genian un complex iodat cu greutate molecular mare care la unele bacterii este stabil, la altele este instabil.
4. Decolorarea cu alcool se menine 5- 7 secunde pe lam, apoi se face o splare abundent cu ap pentru a opri aciunea decolorantului.
5. Recolorarea cu soluie de fucsin bazic 1% sau safranin, 1/10. se menine pe lam un minut. Preparatul se spal cu ap, i se usc.
6. Se examineaz la microscop. Celulele la care complexul este instabil se decoloreaz i vor fi recolorate cu fucsin n rou, celelalte rmn colorate n violet.
7. Fotografiaz preparatul la obiectivul 10x i 40 x i anexeaz imaginile obinute n caiet, efectund analiza acestora.
Interpretarea observaiilor. Dac preparatul este dintr-un amestec de germeni- unele bacterii vor fi colorate violet- Gram +, altele n rou/ oranj- Gram .
Principiul coloraiei Gram. Coloranii bazici au mare afinitate i reacioneaz cu componentele acide din citoplasma bacteriilor, iar dup tratarea cu soluia Lugol se formeaz un complex iodat stabil. La Gram pozitive i instabil la Gram negative care trebuie colorate apoi cu un colorant de contrast pentru evideniere. Ipoteza acceptat este c un rol esenial n colorare l are peretele celular. Coloraia Gram depinde foarte mult de vrsta culturii bacteriene. Numai culturile tinere permit o coloraie i o interpretare corect. Pe msur ce mbtrnesc i schimb comportamentul- bacteriile Gram pozitiv se coloreaz ca i cele Gram negativ.
Bacterii Gram pozitive. Bacilii sporulai- Bacillus subtilis, Bacillus aureus, specii ale genurilor Staphylococcus, Streptococcus, bacteriile lactice- Lactobacillus. Bacterii Gram negative. Escherichia coli, Proteus, Salmonella, gonococul- Neisseria, se comport la fel toate celulele eucariote, cu excepia drojdiilor.
