Curs 8. Proteine cu rol în transportul sau stocarea oxigenului

Se cunosc trei clase de proteine care transportă sau stochează oxigenul: familia hemoglobină (Hb) - mioglobină (Mb), hemocianinele (Hc) şi hemeritrinele (Hr). Hemoglobinele şi hemeritrinele au în componenţă fier iar hemocianinele cupru. (Prefixul hem este legat de sânge. Prefixul deoxi se referă la speciile fără oxigen iar oxi la cele care au oxigenul coordinat. Prefixul met se utilizează pentru formele oxidate inactive ale transportorului de oxigen.)

Hemoglobina şi mioglobina

Hemoglobinele se întâlnesc la toate vertebratele (cu excepţia unor peşti din zona antarctică), au fost izolate şi din unele bacterii, leguminoase (nodulii care fixează azotul), nevertebrate (inclusiv unele larve ale insectelor), moluşte (melci) şi de la aproape toţi viermii din familia anelidelor. Corpul uman adult conţine aproximativ 4 g de fier şi din această cantitate în jur de 3 g se găsesc sub formă de hemoglobina, cantitate care este menţinută prin absorbţia unei cantităţi puţin mai mari de 1 mg pe zi. Eritrocitul uman conţine 200-300 milioane de molecule Hb şi are o viaţă de aproximativ 120 zile, după care este eliminat din circulaţie, iar hemoglobina este catabolizată în splină, ficat şi măduvă. Fierul eliberat este înglobat în feritină, proteina este catabolizată în aminoacizi iar ligandul porfirinic în pigmenţi biliari.

Structura moleculară a Hb şi Mb

Mioglobina (Mb) şi hemoglobina (Hb) au fost printre primele proteine caracterizate structural (Perutz, premiul Nobel 1966) şi ambele conţin ca centru prostetic combinaţia complexă a fierului cu protoporfirina IX (hemul b). Pentru ambele funcţia depinde de fixarea reversibilă a dioxigenului dar rolul lor biologic este diferit, Mb stochează oxigenul în celule în timp ce Hb transportă oxigenul în plasma sanguină. Diferenţa dintre Mb şi Hb este aceea că în timp ce Mb este o specie monomeră, Hb este un tetramer. Protoporfirina IX este încapsulată într-un „buzunar” format din resturi de amino acizi care conţin grupări hidrofobe în proteina numită globină. Aceste grupări blochează accesul moleculelor voluminoase la atomul de fier şi previn formarea speciilor dinucleare cu punţi Fe3+-O2-Fe3+ care apar prin oxidarea hemului în absenţa proteinei. Ionul Fe(II) formează încă o legătura coordinativă cu azotul imidazolic al unui rest de histidină proximal din globină. Pe o parte a hemului, opusă

1

faţă de histidina proximală, un alt rest de histidină cunoscut ca distal controlează accesul O2, CO, CN¯, S2O3

2¯sau NO în buzunarul de legare al ligandului.

CO2HCO2H

NN

N NFe

His

CO2HCO2H

NN

N NFe

His

OO

O2

Hemoglobina Oxihemoglobina

Mioglobina, prezentă în ţesutul muscular, cu o greutate moleculară de aproximativ 17.000 Da este alcătuită din hemul b şi un lanţ polipeptidic format din 153 resturi de aminoacizi fără grupări disulfură sau tiol, numit şi lanţ m. Acest lanţ polipeptidic are un grad mare de ordonare şi anume 2/3 se găseşte sub formă de -helix (fig. 1).

(a) (b)

Figura 1. Reprezentarea schematică a mioglobinei (a) şi hemoglobinei (b)

Hemoglobina este o unitate tetrameră cu o masă de 64.450 Da formată din patru unităţi hem şi câte două lanţuri peptidice şi dispuse tetraedric. Lanţurile conţin resturile a 141 aminoacizi în timp ce lanţurile au în componenţă resturi de la 146 aminoacizi. Studiile de difracţie cu raze X efectuate pe deoxi-Hb şi deoxi-Mb au indicat faptul că sunt semnificative modificările care apar în interacţiile -NH3

+....OCO¯- din interiorul şi dintre lanţurile polipeptidice numite punţi saline. Există opt asemenea punţi care se rup prin coordinarea dioxigenului la fier.

2

În deoxi-Hb a şasea poziţie de coordinare a Fe(II) este orientată în interiorul proteinei şi blocată steric de o grupare salină. Prin coordinarea O2

de către prima unitate hem are loc ruperea punţii saline care este asociată cu o modificare conformaţională a lantului proteic care afectează următoarea unitate proteică, expune a şasea poziţie de coordinare a ionului de fier din acestă unitate, şi aşa mai departe. Acest fenomen se numeşte cooperativitate între unităţile hemului, adică după ce o unitate a fixat dioxigenul celelalte fixează mult mai rapid.Forma oxi a Hb este cunoscută ca starea R (relaxată) în timp ce forma deoxi ca starea T (tensionată). Perutz a sugerat un mecanism care explică cooperarea celor patru grupări heminice în Hb fundamentat pe ideea că o interacţie între o moleculă de oxigen şi o grupare hem poate afecta poziţia lanţului proteic ataşat la el, care la rândul ei afectează celălat lanţ proteic prin legături de hidrogen, şi aşa mai departe. “Cheia” mecanismului indicat de Perutz este modificarea stării de spin a ionului de fier in forma oxi-Hb compatativ cu deoxi-Hb.În hemul deoxigenat ionul de Fe(II) are configuraţie de tip spin maxim (t2g

4eg2), raza Fe(II) cu este de 0,78 Å iar lungimea legăturii Fe-N trebuie să

fie ca urmare pentru hem de 2,18 Å. În interiorul protoporfirinei IX există un spaţiu pentru o lungime a legăturii de 2,00 şi ca urmare fierul se găseşte cu aproximativ 0,8 Å deasupra planului macrociclului.

Fe2+

sp. max.

ciclu porfirinic

sp. min.Fe

2+

OO

2,82 Å

1,97 Å

Deoxi Hb Oxi Hb

Când oxigenul completează a şasea poziţie de coordinaţie configuraţia devine de tip spin minim (t2g

6) iar raza Fe(II) spin minim este cu 0,17 Å mai mică decât a Fe(II) spin maxim. Lungimea legăturii Fe-N va fi prin urmare aproximativ 2,00 Å, ca urmare Fe(II) spin minim se va potrivi cu “golul” porfirinei şi coordinarea O2 va determina deplasarea fierului în planul macrociclului. Gruparea imidazolică a restului histidinic ataşat la Fe(II) trebuie să îl urmeze şi astfel structura terţiară a lanţului proteic din care face parte va fi şi ea drastic alterată, predispunând celălalt hem să

3

reacţioneze. Raportul constantelor succesive de fixarea a O2 de către cele patru unităţi hem este 1:4:24:9. Cînd molecula de hemoglobină complet saturată ajunge la ţesut are loc procesul invers. Pe măsură ce fiecare moleculă de oxigen părăseşte HbO2, aceasta se rearanjează cu creşterea tendinţei de a împinge în afară moleculele de oxigen rămase.

Fixarea dioxigenului. Curbele de oxigenare

Natura legăturii Fe-O2 nu este încâ lămurită. Este în general acceptat că O2 se coordinează monodentat şi legătura Fe-O2 are un caracter considerabil de dublă legătură dar există controverse legate de orientarea O2 faţă de planul hemului şi de transferul de electroni de la Fe(II) la O2.Studii cu raze X pe MbO2 au indicat un unghi de 120º între axa moleculei de oxigen şi planul hemului în timp ce în spectrul IR al HbO2 apare o banda care se poate atribui vibraţiei de valenţă (O-O) pentru superoxid. Ca urmare, una dintre ipoteze ia în considerare existenţa pentru HbO2 a Fe3+ cu configuraţie de tip spin minim şi a anionului O2

¯. Diamagnetismul speciei se explică prin cuplarea electronilor Fe3+ cu cel al O2

¯.

Figura 2. Curbele de saturare cu oxigen pentru mioglobină şi hemoglobină

Oxigenarea reversibilă a Hb şi Mb prezintă următoarele caracteristici (fig. 2):- mioglobina are o afinitate de ~10 ori mai mare pentru oxigen comparativ cu hemoglobina; acest lucru este justificat de funcţia sa de stocare a oxigenului în ţesutul muscular unde concentraţia acestuia este mică;

Mb + O2 → MbO2

4

- constanta de echilibru pentru complexarea Mb cu O2 este dată de o expresie simplă de forma:

Forma hiperbolică pentru oxigenarea mioglobinei este tipică pentru atingerea nivelului de saturaţie chiar la o concentraţie scăzută a oxigenului.

Hb + O2 → HbO2

- constanta de echilibru pentru formarea HbO2 este oarecum mai complicată fiind dată de o expresie de forma:

Exponentul n (constanta Hill) are pentru hemoglobină valoarea de 2,8 şi rezultă din faptul că o singură moleculă de Hb poate accepta patru molecule de O2, iar fixarea lor nu este independentă. Curba de oxigenare are o formă sigmoidă care este un indiciu al cooperativităţii.Legarea oxigenului la hem este dependentă de pH. Sângele încărcat cu CO2 are un pH acid datorită hidratării acestuia, reacţie catalizată de anhidraza carbonică:

CO2 + 2H2O → HCO3¯ + H3O+

Protonul se poate lega în diverse zone ale globinei dar HCO3¯se leagă la

gruparea aminică din poziţia α a lanţului de globină cu formarea anionului carbamat. Legarea acestora scade capacitatea de legare a oxigenului care este pus în libertate în celulă. Hemoglobina cu protonul şi HCO3

¯ ataşate la aceasta ajunge la plămâni şi ca urmare a concentraţiei mici de CO2 în capilarele pulmonare aceştia sunt eliberaţi, are loc procesul de deshidratare sub acţiunea anhidrazei carbonice şi CO2 este eliberat. Eliberarea acestor ioni creşte afinitate Hb pentru O2 care este fixat la nivelul plămânilor. Acest control al Hb pentru legarea şi eliberarea O2 prin modificarea pH-ului este cunoscut sub denumirea de efect Bohr.

5