1 | 20

Proiecte colaborative de cercetare aplicativa – PCCA 2013

Program: PARTENERIATE ÎN DOMENII PRIORITARE

Cod PN-II-PT-PCCA-2013-4-2154

Contract nr. 207/2014

Titlu proiect: “Dezvoltarea unui protocol de selecţie pentru chirurgia metabolică în urma evaluării

impactului acesteia asupra remisiei diabetului zaharat de tip 2 la pacienţii cu obezitate” (CREDOR -

Collaborative Romanian Efforts for Diabetes and Obesity Retrench)

Contractor: DELTA HEALTH CARE S.R.L.

Coordonator proiect: Dr. Cătălin Copăescu

Parteneri:

Partener 1 (P1) - Institutul Național de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice „Prof. Dr. N.C.Paulescu” Bucureşti; Responsabil proiect: Cristian Guja

Partener 2 (P2) - Institutul de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu” Bucureşti;Responsabil proiect: Gabriela Tanko

Partener 3 (P3) - Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila” Bucureşti; Responsabil

proiect: Daniela Lixandru

ETAPA DE RAPORTARE: Etapa 4 aferentă perioadei 01.01.2017- 30.09.2017

Denumirea etapei 4: „Elaborarea protocolului de selecție a pacienților pentru chirurgia

metabolică, alternativă de tratament a diabetului zaharat de tip 2 la pacienții cu obezitate”

REZUMATUL ETAPEI

În vederea elaborării protocolului de selecție pentru chirurgia metabolică a pacienților cu obezitate și cudiabet zaharat de tip 2 (DZ2), în etapa 4 au fost analizate statistic datele obţinute în studiul clinicCREDOR, fiind identificați o serie de (bio)markeri cu potențial predictiv pentru remisia diabetului dupăintervenţia de chirurgie metabolică (tehnica de gastrectomie longitudinală), respectiv: peptidul C, HbA1c,

HDLc, proteina C reactivă. După analiza datelor obținute de la pacienții din lotul chirurgical (preoperator

versus 6 și 12 luni după operație) au fost identificați ca predictori ai remisiei DZ2 după intervenția dechirurgie metabolică următorii parametrii clinici și biochimici: peptid C ( 5 ng/mL); durata diabetului

( 4 ani); HbA1c ( 7.5-8%); insulinoterapia preoperatorie (absența ei preoperator, sau doze scăzute);vârsta ( 45 ani); IMC preoperator (între 30-50 kg/m2); % scădere ponderală postoperator ( 25%). Pe

baza acestor parametrii a fost realizat un scor de predicție a obținerii remisiei diabetului după intervențiade gastrectomie longitudinală la pacienții cu DZ2 și obezitate, scor util în selecţia pacienților cu șanse de

remisie a diabetului după corectarea obezității prin chirurgie metabolică.

Pentru îndeplinirea obiectivului de cercetare al proiectului CREDOR, au fost realizate o serie de

experimente in vitro pe celule β pancreatice umane 1.1B4 și pe preadipocite/adipocite diferențiate

2 | 20

obținute de la pacienții din lotul cu tratament de chirurgie metabolică; din fragmentele de țesut adipos(subcutanat/visceral) prelevate în cursul intervenției laparoscopice de gastrectomie longitudinală au fost

izolate celule stem (ADSC, adipose tissue-derived stem cells - din fracția stromală vasculară), celule careau fost aduse la pasaj 4 și utilizate în experimente ca preadipocite nediferențiate și adipocite diferențiate(după incubarea 15 zile în prezența unor factori de diferențiere). Experimentele in vitro au fost realizate

fie în prezență de seruri obținute de la pacienții cu tratament convențional și de la cei tratați chirurgical la

vizitele V1, V2 și V3, fie în condiții care au mimat un stres metabolic (concentrații crescute de glucoză șiacizi grași). Aceste experimente au vizat: 1) evaluarea statusului oxidativ în celulele β-pancreatice șiadipocite incubate cu ser de la pacienții luați în studiu; 2) cuantificarea secreției de insulină stimulată deglucoză; 3) determinarea unor adipocitokine eliberate în condiții care induc un stres de reticul

endoplasmatic (SRE); 4) efectele grelinei asupra expresiei unor proteine de interes în celule 1.1B4 sau

preadipocite expuse 72 ore la condiții de stres metabolic. Rezultatele au arătat că TNF- ar putea săfurnizeze informații privind statusul inflamator al adipocitelor la persoanele care își îmbunătățesc statusul

metabolic; grelina poate diminua expresia unor proteine de stres, poate preveni activarea unor evenimente

pro-apoptotice și poate promova intracelular creșterea capacității antioxidante, iar modificarea profiluluiantioxidant (sistemic, în celulele β-pancreatice sau în adipocite) ar putea contribui la efectul metabolic

benefic al gastrectomiei longitudinale în remisia T2D.

O serie de rezultate obținute în studiul CREDOR au fost diseminate ca postere sau prezentări orale,contribuind la creșterea vizibilității proiectului CREDOR. În cadrul celei de a V-a ediții a CongresuluiUniversităţii de Medicină şi Farmacie “Carol Davila”, care a reunit la Palatul Parlamentului în perioada29-31 mai 2017, peste 4.000 de participanţi (medici și cercetători din România şi din străinătate) o

sesiune stiințifică a fost destinată proiectului CREDOR; în cadrul acesteia, reprezentanții fiecărei echipe

din proiect au prezentat în plen rezultate reprezentative ale proiectului. De asemenea, rezultate ale

proiectului CREDOR au fost prezentate la: 1) 3rd International Conference on Interdisciplinarity

Management of Diabetes Mellitus and its Complications (INTERDIAB), București, 2-4 martie 2017

(prezentare orală; lucrare publicată in extenso în volumul „Proceedings” al conferinţei, volum indexat

ISI-Thomson, pag: 323-331); 2) al 43-lea Congres Național al Societății Române de Diabet, Nutriție șiBoli Metabolice, Brașov, 24-27 mai 2017 (o prezentare orală și 2 postere); rezumatele lucrărilor au

apărut în Acta Diabetologica Romana, Vol. 43, 2017, pag 77-80, și pag 162-164; 3) 9th of the Romanian

Society for Cell Biology (RSCB) with International Participation and the 35rd RSCB Annual Scientific

Session, Iași, 7-11 iunie 2017 (1 poster); rezumat publicat în Bulletin of RSCB 2017, 45, p. 62; 4) 22nd

World Congress of International Federation for the Surgery of Obesity and Metabolic Disorders, 29

August - 2 September 2017, London, UK (1 poster premiat); abstract publicat în Obes Surg. 2017, 27

(Suppl 1):1 (factor impact 3,94); 5) 34th Annual Meeting of the European Section of the International

Society for Heart Research, July 24-27, 2017, Hamburg, Germany (1 poster); abstract publicat în J Mol

Cell Cardiol. 2017, 109, pag 4 (factor impact 5,68); 6) 53rd Annual Meeting of the European Association

for the Study of Diabetes (EASD), September 11-15, 2017, Lisbon, Portugal (1 poster); abstract publicat

în Diabetologia 2017, 60 (Suppl 1), S202 (factor impact 6,08). A fost publicat un articol în Rev Chim(Bucharest) 68: 1622-1627; ISSN 0034-7752 (factor impact 1.24), un alt articol a primit acceptul pentru

publicarea în Farmacia (factor impact 1,34), iar un al treilea a fost trimis la Obesity Surgery (factor

impact 3,94). Date privind proiectul CREDOR pot fi accesate pe site-ul www.credor.ro.

3 | 20

RAPORT ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC IN EXTENSORezultate așteptate:

1. Lista biomarkerilor identificați în ser ca fiind relevanți pentru remisia diabetului zaharat la paciențiiluați în studiu.

Analiza statistică a datelor obţinute în acest studiu a condus la următorii biomarkeri care pot fi relevanţipentru remisia diabetului zaharat de tip 2 (DZ2) după intervenţia de chirurgie metabolică (prin tehnica degastrectomie longitudinală):

a) peptid C; b) HbA1c; c) HDLc; d) proteină C reactivă; e) adiponectină2. Sinopsis-ul biomarkerilor ce vor constitui criterii de selecție a pacienților pentru includerea în

programul de remisie a diabetului folosind chirurgia metabolică.

a) Peptidul C este cel mai important indicator al funcţiei beta celulare restante. Valori mai mari ale

peptidului C indică o rezervă funcţională crescută şi măresc probabilitatea de remisie a DZ2 post

intervenţie de chirurgie metabolică.b) HbA1c este cel mai fidel indicator al controlului metabolic preoperator. Valori mari ale HbA1c

indică un dezechilibru marcant în controlul glucidic şi micșorează probabilitatea de remisie a DZ2

după intervenţia de chirurgie metabolică.c) HDLc - valori mai mici ale HDLc s-au corelat cu probabilitate mai mică de remisie a DZ postintervenţie de chirurgie metabolică.d) Proteina C reactivă este un indicator al procesului inflamator sistemic nespecific asociat cu DZ2,

care este, la rândul său, corelat cu apoptoza celulelor β pancreatice şi cu scăderea rezervei secretoriiinsulinice. Valori mari ale proteinei C reactive se corelează cu rezervă secretorie insulinică scăzută şiscăderea probabilităţii remisiei DZ post intervenţie de chirurgie metabolică.e) Adiponectina este un indicator indirect al insulinorezistenţei caracteristice DZ2, valori scăzute ale

concentrației de adiponectină indicând un grad mai mare de rezistenţă la insulină. În studiul nostru,

valori mai mici preoperator (insulinorezistenţă mai mare) s-au asociat cu o probabilitate mai mică deremisie a DZ2 post intervenţie de chirurgie metabolică.

3. Protocolul de selecție pentru chirurgia metabolică a pacienților obezi cu diabet zaharat de tip 2.

În urma analizei datelor obținute de la pacienții din lotul chirurgical pe parcursul vizitelor V1 (inițial), V2

(după 6 luni) și V3 (după 1 an) au fost identificați ca predictori ai remisiei diabetului zaharat postoperațiede chirurgie metabolică următorii parametrii clinici și biochimici:

a. Peptid C - Cut-off: valori peste 5 ng/mL peptid C;

b. Durata diabetului zaharat - Cut-off: durată sub 4 ani;

c. HbA1c - Cut-off: HbA1c sub 7.5-8%;

d. Insulinoterapia preoperatorie - Cut-off: absența insulinoterapiei preoperator

e. Vârsta - Cut-off: Vârsta sub 45 ani;

f. IMC preoperator - Cut-off: IMC cuprins între 35-50 kg/m2;

g. Scăderea ponderală postoperatorie - Cut-off: % scădere ponderală peste 25%.

Pe baza parametrilor descriși mai sus a fost realizat un scor de predicție a obținerii remisiei diabetuluizaharat după intervenția de gastrectomie longitudinală la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 si obezitate.

4 | 20

Pe baza acestui scor se va face selecţia candidaţilor pentru intervenţia chirurgicală. Obținerea unui scorpeste 6 reprezintă pragul de selectare a pacienților cu obezitate și DZ2 pentru chirurgia metabolică.

Scor de predicție a remisiei diabetului zaharat după intervenția de chirurgie metabolică

Puncte acordate

0 1 2 3

Vârstă (ani) peste 40 sub 40

IMC (kg/m2) <30 30-34.9 35-39.9 >40

Peptid C (ng/ml) <2 2-3.5 3.5-5 >5

Durata DZ (ani) >8 4-8 1-3.9 <1

Activitatea 4.1: Analiza statistică a datelor obținute în studiu (activitate transferată parțial din 2016)

În cadrul activității 4.1, echipele CO, P1, P2 și P3 au continuat efectuarea analizei statistice a rezultatelor

obținute în proiect. P1 a finalizat baza de date a subiecţilor înrolați în studiul CREDOR, incluzând

rezultatele analizelor biochimice efectuate în etapa 4 a proiectului. Din 41 de pacienţi care s-au înscris în

studiul clinic și s-au prezentat la vizita V1 după randomizare (21 de pacienţi în lotul conservator şi 20 de

pacienţi în cel chirurgical) 36 de pacienţi s-au prezentat la vizita V2 (programată la 6 luni după vizitaV1), respectiv 19 pacienţi din lotul chirurgical şi 17 din lotul conservator, iar după 12 luni, la vizita V3 s-

au prezentat 34 de pacienţi, respectiv 19 pacienţi din lotul chirurgical și 15 pacienţi din lotul conservator.

Așadar, 15 pacienți din lotul conservator au beneficiat de un set complet de investigații (clinice,

biochimice), iar 17 pacienți au doar investigații parțiale. Parametrii clinici, metabolici şi hormonalideterminați la V1, V2 și V3 pentru pacienții din fiecare lot au fost evaluați comparativ (V2 vs. V1, V3 vs.

V1 și V3 vs. V2) în vederea obținerii de informații relevante privind evoluția bolii diabetice în decurs de

1 an de tratament (medical convențional sau chirurgie metabolică).

Variabilele analizate au fost testate pentru distribuţia normală/anormală cu testul Kolmogorov-

Smirnov. Diferenţele dintre variabilele analizate la momente diferite (V1, V2, V3) au fost analizate fie cutestul t (Student), pentru variabilele cu distribuţie normală, fie cu testul Wilcoxon (signed rank test)

pentru variabilele cu distribuţie anormală. În tabelele prezentate mai jos, variabilele continue cu

distribuţie normală sunt prezentate ca medie şi deviaţie standard, în timp ce variabilele care au păstrat odistribuţie anormală chiar şi după transformarea lor logaritmică sunt prezentate ca mediană şi intervalintercuartilic (interquartile range, IQR); majoritatea parametrilor analizaţi au avut o distribuţie anormalăşi deci apar în tabele ca mediana şi IQR (în paranteze).

După cum se poate remarca din Tabelul 1, pacienţii din lotul conservator au prezentat la vizita V2(după 6 luni de studiu) o scădere minoră sub aspect clinic, însă semnificativă statistic, a indicelui de masăcorporală (IMC) şi a circumferinţei abdominale (raportat la valorile determinate la vizita V1); la vizita

V3 s-a constatat că în intervalul 6-12 luni acești pacienţi au pierdut procentul de scădere ponderalăînregistrat în primele 6 luni de studiu și au înregistrat o creștere a nivelelor de colesterol, posibil pe

fondul micșorării motivaţiei pentru un stil de viaţă sănătos. Deasemenea, la vizita V2, pacienţii din lotul

5 | 20

conservator au prezentat o scădere semnificativă a tensiunii arteriale sistolice (TAS), posibil datorităschimbării schemei de tratament, ameliorare care însă s-a atenuat la vizita V3.

Tabelul 1. Analiza statistică a modificărilor parametrilor clinici şi metabolici ai pacienţilor din lotul cu

tratament conservator, la 6 luni și la 12 luni de studiuLot conservator

V1

n=21

V2

n=17p

V2 vs. V1

V3

n=15p

V3 vs. V1

A. Caracteristici clinice

Circumferința abd (cm)* 139.0 (14.0) 133.00 (10.00) 0.001302 ¹ 128.00 (13.00) 0.000714 ¹

IMC (kg/m2)* 40.50 (8.60) 39.10 (8.30) 0.0004803¹ 40.30 (7.50) 0.002851 ¹

TAS (mmHg)* 135.0 (12.0) 120.00 (10.00) 0.04345 ¹ 130.00 (19.00) 0.8504 ¹

TAD (mmHg)* 90.00 (10.00) 80.00 (20.00) 0.262 ¹ 92.00 (11.00) 0.1236 ¹

B. Analize metabolice

HbA1c (%)* 7.56 (1.87) 7.91 (2.62) 0.5791 ¹ 8.74 (2.69) 0.804 ¹

Glicemie (mg/dl)* 184.5 (99.3) 145.17 (103.63) 0.2842 ¹ 163.80 (119.97) 0.1354 ¹

Colesterol total (mg/dl)# 194.14±26.75 191.16±55.01 0.08558 ² 196.06 (±44.23) 0.03876 ²

HDL c (mg/dl)* 36.10 (8.20) 35.30 (9.50) 0.2446 ¹ 32.40 (15.45) 0.9547 ¹

Trigliceride (mg/dl)* 187.4 (123.26) 167.35 (100.68) 0.5791 ¹ 147.62 (111.41) 0.05536 ¹

LDL c (mg/dl)* 121.15 (31.6) 119.86 (42.86) 0.2247 ¹ 130.43 (50.94) 0.804 ¹

Acid uric (mg/dl)* 5.99 (1.45) 6.38 (1.54) 0.1594 ¹ 5.96 (1.92) 0.7197 ¹

C. Parametrii siguranta

Creatinina (mg/dl)* 1.02 (0.10) 1.10 (0.22) 0.9058 ¹ 1.04 (0.22) 0.164 ¹

Uree (mg/dl)* 35.25 (7.12) 33.92 (8.19) 0.7119 ¹ 37.84 (11.62) 0.5995 ¹

AST (IU/L)* 24.34 (12.45) 20.51 (14.75) 0.07968 ¹ 22.10 (9.53) 0.2293 ¹

ALT (IU/L)* 36.18 (17.38) 33.06 (24.66) 0.1743 ¹ 30.52 (12.71) 0.2293 ¹

GGT (IU/L)* 45.34 (24.00) 33.46 (13.15) 0.07968 ¹ 33.93 (8.83) 0.1876 ¹

Albumina (g/dl)* 4.59 (0.43) 4.55 (0.28) 0.3087 ¹ 4.62 (0.31) 0.3626 ¹

Proteine totale (g/dl)* 7.28 (0.74) 7.33 (0.45) 0.246 ¹ 7.29 (0.55) 0.4212 ¹

* mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

Analiza datelor de la pacienţii din lotul chirurgical este prezentată in Tabelul 2. La vizita medicală V2 (6luni postoperator), acești pacienți au prezentat nu doar o scădere ponderală însemnată (p< 0.00001), ci șiîmbunătățirea semnificativă a controlului glicemic (glicemie, HbA1c) și a profilului lipidic (HDLc,trigliceride). Ameliorările relevante clinic și semnificative statistic ale majorității parametrilor clinici şibiologici ai pacienţilor din lotul chirurgical s-au menținut și după 1 an de la intervenţia de gastrectomielongitudinală, dovedind eficacitatea chirurgiei metabolice în tratamentul DZ 2.

6 | 20

Tabelul 2. Analiza statistică a modificărilor parametrilor clinici şi metabolici ai pacienţilor din lotul

supus intervenției de chirurgie metabolică, la 6 luni și la 12 luni de studiuLot chirurgical

V1 V2 p

V2 vs. V1

V3 p

V3 vs.V1n=20 n=19 n=19

A. Caracteristici clinice

Circumferinta abd (cm)* 134.0 (16.0) 105.0 (10.5) 0.0001406¹ 102.0 (10.25) 0.0001421¹

IMC (kg/m2)* 39.60 (4.90) 29.30 (2.25) 0.0001428¹ 28.70 (1.50) <0.000001¹

TAS (mmHg)* 130.00(13.75) 125.0 (30.50) 0.3256 ¹ 128.0 (31.50) 1.000¹

TAD (mmHg)* 80.00 (10.00) 82.00 (13.00) 0.03823 ¹ 86.00 (22.00) 0.02929 ¹

B. Analize metabolice

HbA1c (%)* 8.40 (1.45) 6.60 (0.75) <0.000001¹ 5.90 (0.69) 0.0001426¹

Glicemie (mg/dl)* 197.7 (107.4) 99.56 (27.48) <0.000001¹ 96.33 (29.98) <0.000001¹

Colesterol total (mg/dl)# 184.65±36.04 184.55±32.05 0.99 ² 188.75±41.84 0.7105 ²

HDL c (mg/dl)* 34.20 (8.15) 39.20 (9.90) 0.01236 ¹ 50.70 (15.65) <0.000001¹

Trigliceride (mg/dl)* 178.23 (137.50) 89.43 (48.30) <0.000001¹ 86.26 (64.14) <0.000001¹

LDL c (mg/dl)* 111.15 (34.7) 126.54 (17.5) 0.06629¹ 111.4 (61.53) 0.2935 ¹

Acid uric (mg/dl)* 5.89 (2.34) 6.51 (2.19) 0.2753 ¹ 5.59 (1.34) 0.9217 ¹

C. Parametrii de siguranțaCreatinina (mg/dl)* 1.09 (0.19) 1.00 (0.15) 0.02166 ¹ 1.02 (0.12) 0.06409 ¹

Uree (mg/dl)* 40.18 (9.31) 36.93 (11.07) 0.8596 ¹ 49.88 (14.72) <0.000001¹

AST (IU/L)* 29.60 (23.58) 16.74 (3.68) <0.000001¹ 17.38 (5.32) <0.000001¹

ALT (IU/L)* 41.38 (46.41) 15.36 (6.16) <0.000001¹ 22.80 (9.63) 0.003918¹

GGT (IU/L)* 53.91 (40.11) 28.57 (22.34) 0.002838 ¹ 30.95 (20.36) 0.002022 ¹

Albumina (g/dl)* 4.48 (0.32) 4.58 (0.23) 0.4444 ¹ 4.54 (0.30) 0.7022 ¹

Proteine totale (g/dl)* 7.27 (0.82) 7.08 (0.65) 0.7475 ¹ 7.11 (0.74) 0.5066 ¹

* mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

Rata metabolismului bazal (RMB) reprezinta necesarul zilnic de energie al unui organism aflat in

repaus pentru a-și menține active funcțiile vitale. Analiza valorilor RMB pentru pacienții luați în studiu acondus la observațiile menționate în Tabelul 3. Pacienţii din lotul conservator au prezentat la vizita V3 o

scădere statistic semnificativă, comparativ cu V1, a valorii RMB predicţíonate pe baza formulelor de

calcul.

Tabelul 3. Comparația dintre rata metabolică a pacienților CREDOR la vizita V3 vs. V1

Date calorimetrieLot conservator Lot chirurgical

V1 V3 p V1 V3 pn=21 n=15 n=20 n=19

RMB masurat (kcal/zi)* 2218 (557.50) 2073 (274.00) 0.8926¹ 2489 (471) 1732 (276) <0.000001¹

RMB estimat (kcal/zi)* 2413.4 ±276.7 2372.8±286.6 0.003198² 2392.3 ±244.0 1846.3 ±175.6 <0.000001²

Diferenta -118.7 ±412.3 -150.4 ±356.4 0.6981² 119.9±396.9 -125.0±170.5 0.009787 ²* mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

7 | 20

Un metabolism mai accelerat ajută la pierderea în greutate, în schimb metabolismul lent favorizeazăîngrășarea. În asociere cu modificarea IMC-ului, pacienţii din lotul chirurgical au prezentat modificărisemnificative atât ale RMB predicţionate, cât şi ale RMB măsurate prin calorimetrie indirectă. Pacienţiiambelor loturi au manifestat o scădere a masei grase (procentul de grăsime corporală), scădere mult mai

importantă în cazul pacienţilor din lotul chirurgical (Tabelul 4). În paralel cu scăderea IMC, pacienţii dinlotul cu tratament de chirurgie metabolică au prezentat și scăderea masei slabe, în timp ce pacienţii dinlotul conservator au prezentat, paradoxal, o creştere a masei slabe.

Tabelul 4. Comparația dintre compoziția corporală estimată prin bioimpedanțăla vizitele V1 și V3

BioimpedanțaLot conservator Lot chirurgical

V1 V3p

V1 V3p

n=21 n=15 n=20 n=19

% grăsime* 36.50 (7.80) 34.80 (7.65) 0.03087 ¹ 32.70 (9.85) 20.30 (7.60) <0.000001¹

Masa slabă (kg)* 77.40 (10.50) 81.10 (10.25) 0.01703 ¹ 86.96 (20.50) 71.50 (9.60) <0.000001¹* mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard; 1Wilcoxon signed rank test; 2paired t test

Activitatea 4.2: Analiza modificărilor metabolice la pacienții tratați convențional și la cei cuindicație pentru chirurgia metabolică (activitate transferată parţial din 2016)

Pentru îndeplinirea activităţii 4.2, P1 a continuat determinarea unor parametrii biochimici relevanți pentru

imbunătățirea controlului glicemic/metabolic. Astfel, în probele de sânge prelevate de la paciențiiCREDOR la vizitele V2 și/sau V3, P1 a determinat nivelele circulante de insulină, proinsulină, peptid C

(pentru estimarea funcției beta-pancreatice), acizi grași liberi, leptină şi adiponectină (adipocitokinerelevante pentru (dis)funcția țesutului adipos) și, respectiv, grelină și GLP-1 (Glucagon-Like Peptide-1)

(hormoni gastrointestinali implicaţi în reglarea aportului de alimente). Investigațiile de laborator au fostefectuate după următorul protocol:

- Concentrațiile serice de insulină, proinsulină și peptid C au fost determinate prin metoda

imunoenzimatică ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) folosind kituri comerciale (EIA -

2935, EIA - 1560, EIA - 1293, DRG Instruments, Germania), conform cu recomandările producătorului.

Citirea absorbanțelor (la 450 nm) s-a realizat cu cititorul de plăci ELISA: MULTISKAN Ex-Thermo

Electro Corporation (CV=2.6). Datele au fost utilizate în calculul raportului Proinsulină / Insulină.

- Pentru estimarea funcţiei beta celulare (HOMA%B - Homeostasis Model Asessment for β cellfunction) au fost utilizate valorile peptidului C şi a glicemiei a jeun conform formulei: 0,27 x peptid C a

jeun (pmol/l)/(glicemie a jeun (mmol/l)-3.5). De asemenea, pentru estimarea rezistenței la insulină a fost

calculată valoarea HOMA-IR (Homeostasis Model Asessment for Insulin Resistance) utilizând formula:

1,5+ [(glicemie a jeun (mmol/l)x peptid C a jeun (pmol/l))/2800].

- Valorile nivelelor circulante de acizilor graşi liberi pentru ambele loturi de studiu la vizitele V1, V2și V3 au fost determinate prin metoda ELISA, utilizând kitul MBS 268756 MyBioSource INC,

Biozyme. Citirea absorbanțelor (la 450 nm) s-a realizat pe cititorul de plăci ELISA automatMULTISKAN Ex-Thermo Electro Corporation.

8 | 20

- Concentrațiile hormonilor adipocitari leptină și adiponectină au fost determinate prin metoda

ELISA, folosindu-se kiturile comerciale EIA-2395 și, respectiv, EIA-4177 (DRG Instruments,

Germania), în conformitate cu indicațiile producătorului. Pentru citirea absorbanțelor (la 450 nm) s-a

folosit cititorul de plăci ELISA automat MULTISKAN Ex-Thermo Electro Corporation (CV=2.6). S-a

determinat prin calcul raportul Proinsulină / Adiponectină.

- Nivelele de grelină activă (acilată; cu rol orexigen) și de GLP-1 (hormon incretinic cu rol

anorexigen) au fost determinate cu kit-urile ELISA EIA-4710 (Human Ghrelin (active) DRG

Instruments, Germania, pentru grelina acilată) și MBS760336 (MyBioSource, INC., Biozyme pentru

GLP-1). Citirea absorbanțelor (la 450 nm) s-a realizat pe cititorul de plăci MULTISKAN Ex-Thermo

Electro Corporation. Dat fiind că grelina este extrem de instabilă în probele de ser/plasmă, probele de

sânge au necesitat o procesare preanalitică. Vacutainerele destinate recoltării probelor de sânge au

conținut aprotinină, iar imediat ce sângele a fost recoltat, vacutainerele au fost transportate la laborator pe

gheață și centrifugate la 3500 rpm, la rece, timp de 10 minute. După ce supernatantul a fost preluat în

tuburi sterile, plasma a fost acidifiată cu HCl 1N (100 µl/1000 µl plasmă cu aprotinină), tuburile au fost

re-centrifugate (la 3500 rpm, la rece, 5 minute), iar grelina a fost dozată în supernatant.

Tabelele 5 și 6 cuprind rezultatele dozărilor hormonale pentru pacienții din studiul CREDOR, la

V1, V2 și V3. La 6 și la 12 luni, pacienţii din lotul conservator nu au prezentat modificări statistic

semnificative, comparativ cu momentul inițial, sub aspectul indicelui HOMA-IR (indicator al gradului de

insulino-rezistenţă), a nivelelor de adiponectină, sau a raportului proinsulină/insulină (indicator indirect al

gradului de disfuncţie beta celulară) (Tabelul 5). Cu toate acestea, la 1 an acești pacienți au prezentat o

scădere semnificativă a nivelelor de proinsulină. Deasemenea, pacienţii tratați convențional au prezentat

o scădere semnificativă a nivelelor de leptină atât la V2 cât și la V3, precum și o creștere a nivelelor degrelină (semnificativă pentru prima jumătate a intervalului acestui studiu).

Tabelul 5. Comparația nivelelor hormonale dozate la V1, V2 și V3 pentru lotul conservator

Lot conservator

HormoniV1

n=21

V2

n=17

p

V2 vs. V1

V3

n=15

p

V3 vs. V1

Insulinemie (µUI/mL)* 22.12 (23.41) 17.43 (12.71) 0.07141 ¹ 14.13 (31.83) 0.2078 ¹

HOMA-IR (CP)* 8.12 (14.02) 7.35 (5.70) 0.06383 ¹ 6.32 (11.93) 0.1688 ¹

HOMA-β (CP DM)* 90.68 (52.24) 86.76 (131.14) 0.3529 ¹ 67.54 (146.79) 0.7615 ¹

Proinsulina (pmol/L)* 6.42 (19.76) 4.84 (6.60) 0.2435 ¹ 3.06 (5.31) 0.00116 ¹

Proinsulină/insulina* 0.44 (0.59) 0.21 (0.73) 0.1202 ¹ 0.19 (0.15) 0.0946¹

Peptid C (ng/ml)* 9.82 (2.53) 7.66 (2.10) 9.82 (2.53) 14.13 (31.83) 0.2078 ¹

Leptina (ng/ml)* 15.50 (7.66) 10.16 (12.78) 0.005569 ¹ 8.62 (7.45) 0.00262 ¹

Adiponectina (µg/ml)* 4.82 (9.28) 3.98 (6.50) 0.06641 ¹ 3.52 (2.61) 0.0832 ¹

GLP-1 (ng/ml)* 47.13 (4.85) 50.54 (9.11) 0.5171 ¹ -

Grelina (pg/ml)* 100.47 (47.2) 136.75 (62.89) 0.02016 ¹ 140.48 (115.6) 0.0946 ¹*mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

9 | 20

În ceea ce privește concentrația de GLP-1, a existat un trend ascendent în primele 6 luni, însă diferențadintre nivelele de GLP-1 la momentul V2 vs. V1 nu s-a dovedit statistic semnificativă. Determinarea

GLP-1 în probele prelevate la vizita V3 de la toți pacienții din studiu nu a mai putut fi realizată întrucâtkitul ELISA pentru dozarea GLP-1 a fost necorespunzător, respectiv calibratorii și reactivii și-au pierdut

stabilitatea ȋnainte de expirarea termenului de valabilitate al kitului; în ciuda demersurilor repetate făcutela firma producătoare, kitul nu a mai putut fi înlocuit.

Pacienţii din lotul chirurgical au prezentat o diminuare statistic semnificativă a HOMA-IR, a

nivelelor de peptid C și a raportului proinsulină / insulină, ceea ce indică îmbunătățirea controlului

glicemic la acești pacienți (Tabelul 6). În plus, la 6 și la 12 luni postoperator, pacienții au prezentat

reducerea semnificativă a nivelelor circulante de leptină și grelină, ceea ce a contribuit probabil la

scăderea substanțială a IMC-ului lor. În plus, pacienţii din lotul chirurgical au prezentat o creşteresemnificativă a nivelului de adiponectină, cu un efect pozitiv în ameliorarea insulino-rezistenţei, precumşi o reducere a nivelului de GLP-1 (în primele 6 luni), explicaţia pentru acest fapt urmând a fi stabilită.

Tabelul 6. Comparația nivelelor hormonale dozate la V1, V2 și V3 pentru lotul tratat chirurgical

HormoniLot chirurgical

V1 V2 p

V2 vs. V1

V3 p

V3 vs. V1n=20 n=19 n=19

Insulinemie (µUI/mL)* 18.92 (24.35) 6.67 (5.68) <0.000001¹ 5.08 (4.17) < 0.000001¹

HOMA-IR (CP)* 8.44 (10.56) 1.68 (1.70) <0.000001¹ 1.19 (0.80) < 0.000001¹

HOMA-β (CP DM)* 60.16 (84.72) 72.03 (97.63) 0.04937 ¹ 61.25 (49.27) 0.5412 ¹

Proinsulina (pmol/L)* 5.86 (6.59) 0.87 (0.71) <0.000001¹ 0.70 (0.87) < 0.000001¹

Proinsulină/insulina* 0.32 (0.29) 0.12 (0.12) <0.000001¹ 0.12 (0.18) < 0.000001¹

Peptid C (ng/ml)* 9.72 (1.33) 7.39 (2.09) 0.002022 ¹ 4.19 (1.70) < 0.000001¹

Leptina (ng/ml)* 8.45 (6.39) 2.62 (1.29) <0.000001¹ 2.65 (0.79) <0.000001¹

Adiponectina (µg/ml)* 2.09 (1.09) 3.63 (5.58) <0.000001¹ 7.53 (7.42) <0.000001¹

GLP-1 (ng/ml)* 47.40 (12.17) 16.12 (17.61) <0.000001¹ -

Grelina (pg/ml)* 117.40 (42.9) 94.42 (15.72) 0.001038 ¹ 84.82 (32.86) 0.000526 ¹*mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviații standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

Activitatea 4.3: Evaluarea statusului oxidant / antioxidant ȋn circulația periferică a pacienților cuobezitate și diabet de tip 2 (activitate transferată parţial din anul 2016)

Pentru îndeplinirea activităţii 4.3, în probele de sânge prelevate de la pacienții CREDOR la vizitele V1,

V2 și V3, P1 a determinat markerii pro-inflamatori circulanți TNF-α, IL-6, proteina C reactivă (high-

sensitivity C-reactive Protein, hsCRP) și homocisteina, utilizând kiturile ELISA disponibile comercial

EIA-4641, EIA-4640, EIA-3954 (DRG Instruments, Germania) și MBS260128 MyBioSource INC

(Biozyme), precum și aparatul MULTISKAN pentru citirea absorbanțelor (la 450 nm). Tabelele 7 și 8prezintă comparativ modificarea markerilor proinflamatori menționați, la 6 luni (V2) și la 12 luni (V3).Pentru lotul chirurgical, la 6 luni postoperator, atât IL-6 cât şi TNF-α au prezentat valori în creştere, cu otendinţă de stabilizare, sau uşoară diminuare după 12 luni. În această privință, datele din literatură sunt

10 | 20

controversate, unele studii raportând scăderi ale acestor markeri, iar altele creşteri. Pentru lotulconservator, evoluţia a fost asemănătoare, cu o creştere la V2 şi stabilizare la V3.

Tabelul 7. Comparația nivelelor markerilor proinflamatori la 6 luni de tratament

Markeri

proinflamatori

Lot conservator Lot chirurgical

V1 V2 p V1 V2 pn=21 n=17 n=20 n=19IL-6* 5.79 (13.41) 15.91 (9.58) 0.02557 3.34 (6.26) 12.62 (20.70) 0.003918

TNFα* 0.73 (1.12) 4.04 (3.10) 0.006968 0.65 (0.90) 2.52 (3.51) 0.002838

Homocisteină* 1.94 (0.95) 1.75 (0.74) 0.2633 ¹ 1.96 (0.88) 1.77 (0.44) 0.1447 ¹

hsCRP* 6.34 (6.21) 9.13 (7.34) 0.03479 ¹ 9.47 (4.85) 3.43 (8.95) 0.005329 ¹*mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviatii standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

Tabelul 8. Comparația nivelelor de markeri proinflamatori după 12 luni de tratament

Lot conservator Lot chirurgical

Markeri

proinflamatori

V1

n=21

V3

n=15p

V1

n=20

V3

n=19p

IL-6* 5.79 (13.41) 11.51 (9.04) 0.08325 3.34 (6.26) 11.51 (11.47) 0.0004

TNFα* 0.73 (1.12) 3.27 (3.56) 0.00116 0.65 (0.90) 2.90 (3.33) 0.003342

Homocisteină* 1.94 (0.95) 1.94 (1.53) 0.0637 ¹ 1.96 (0.88) 2.36 (0.71) 0.1447 ¹

hsCRP* 6.34 (6.21) 12.33 (9.35) 0.0946 ¹ 9.47 (4.85) 1.31 (2.48) 0.0006447 ¹*mediane și IQR (în paranteze); # medii±deviatii standard;1 Wilcoxon signed rank test; 2 paired t test

În ceea ce priveşte evoluţia hsCRP, intervenţia de gastrectomie longitudinală a dus la scăderea

semnificativă a inflamaţiei subclinice, în asociere cu scăderea ponderală; reducerea este semnificativă la6 luni şi continuă la 12 luni postoperator. Pentru lotul conservator, la 6 luni apare o uşoară creştere, care

se accentuează la 12 luni, ceea ce denotă eşecul intervenţiei medical-nutriţionale în obţinerea/menţinereascăderii ponderale și a îmbunătățirii controlului glicemic.

Nivelul de homocisteină nu s-a modificat semnificativ pentru nici unul dintre cele 2 loturi,

sugerând că acest biomarker nu ar fi relevant în selecția pacienţilor pentru chirurgia bariatrică.P3 a determinat glutationul neproteic eritrocitar (GSH), enzimele antioxidante eritrocitare

superoxide dismutaza (SOD), glutation peroxidaza (GPx), catalaza (CAT), precum şi activitateaarilesterazică şi lactonazică a paraoxonazei1 (PON1) pe probele neprelucrate în 2016, conform metodelor

descrise în etapa a 2-a. Rezultatele sunt prezentate sub formă de medie±eroarea standard a mediei (SEM)

comparativ pentru lotul conservator şi chirurgical în Tabelul 9. Enzimele GPx și CAT au crescutsemnificativ statistic la 6 luni în ambele grupuri, diferența menținându-se semnificativă şi la 12 luni. Prin

utilizarea unui model de regresie condiționată univariată am evidențiat faptul că pacienții cu evoluțienefavorabilă pentru remisia diabetului (HbA1c> 6%) au avut valori mai mari (la momentul inițial și după12 luni) ale IMC și peptid C, precum și valori mai scăzute (valoarea inițială și după 12 luni) pentru HDLși adiponectina (ca factori antiinflamatori).

11 | 20

Tabelul 9. Nivelele de antioxidanți determinate în eritrocite obținute de la pacienții cu tratamentconservator sau chirurgical la vizitele V1, V2 și V3

Parametrii

V1 V2 V3

LotConservator(n=21)

LotChirurgical(n=20)

LotConservator(n=17)

LotChirurgical(n=19)

LotConservator(n=15)

LotChirurgical(n=19)

GSH (μg/g Hb) 0.27±0.01 0.26±0.01 0.28±0.01 0.03±0.0 0.27±0.01 0.28±0.01

GPx (U/g Hb) 8.33±0.49 6.26±0.5 14.18±0.96** 8.80±0.1* 6.16±0.6*$$ 8.32±0.12$

SOD (U/g Hb) 605.02±14.6 626.47±14.1 665.58±35.9 586.16±40.5 465.52±38.7*$$ 515.41±28.05

CAT (k/g Hb) 9.28±0.46 9.96±0.56 14.77±1.8* 15.50±1.48* 13.80±0.8* 19.95±1.22$

PON1dh(µmol/ml/min)

2.15±0.04 2.34±0.06 2.26±0.09 2.31±0.05 2.04±0.06 2.45±0.08

PON1phe(µmol/ml/min)

73.54±2.5 73.94±2.8 75.94±1.7 73.94±2.8 74.34±2.2 71.92±1.88

* şi ** reprezintă p< 0.05 şi respectiv p<0.001 comparând inițial şi 6 sau 12 luni pentru fiecare grup; $ şi $$ reprezintăp< 0.05 şi p<0.001 comparând 6 şi 12 luni între loturi (conservator şi chirurgical)

Rezultatele noastre sugerează că fluctuațiile greutății urmate de modificarea profilului antioxidant arputea juca un rol important în efectul metabolic benefic al gastrectomiei longitudinale în remisia T2D.

Activitatea 4.4: Identificarea unor biomarkeri relevanți în evoluția diabetului post-tratament

(convențional/chirurgie metabolică) la pacienții obezi cu diabet de tip 2 (activitate transferată parțial

din 2016)

Analiza datelor pacienților incluși în studiu la vizitele V1, V2 și V3 a condus la identificarea următorilorparametrii ca fiind asociați cu probabilitate mai mare de a obține ameliorarea sau remisia diabetului în

urma intervenției de chirurgie metabolică (gastrectomie longitudinală):

a) Nivelul controlului glicemic - exprimat prin valoarea glicemiei a jeun și a HbA1c. Valoripreoperatorii ale HbA1c sub 8% s-au asociat cu o probabilitate mai mare de remisie a DZ2 (HbA1c <

6%); în cazul pacienților cu valori HbA1c > 8%, procentul celor cu ameliorarea/remisia diabetului a fost

mai mic, însă și acești pacienți au prezentat după 6 și 12 luni îmbunătățiri semnificative statistic ale

markerilor metabolismului glucidic (HbA1c, glicemie, insulinemie, HOMA-IR, HOMA-%B, peptid C).

b) Prezența tratamentului insulinic / Doza de insulină - Dacă preoperator 6/19 pacienți din lotul

chirurgical necesitau tratament injectabil cu insulină, după un an postoperator numai un pacient mai avea

nevoie de insulină, însă în doze mult reduse. Faptul că 5/6 pacienți nu au mai necesitat tratament

injectabil (încă înaintea vizitei de 6 luni) indică o creștere consistentă a calității vieții acestor paciențidupă intervenția de chirurgice metabolică.

c) Factorii hormonali - nivelele preoperatorii ale factorilor hormonali studiați nu s-au asociat

semnificativ cu rezultate diferite în îmbunătățirea metabolismului glucidic și nu pot fi considerați factori

predictivi pentru remisia DZ2.

d) Funcția beta-celulară: un predictor important pentru ameliorarea DZ2 l-a reprezentat funcția betacelulară preoperatorie (estimată prin HOMA-%B). Pacienții care au prezentat preoperator o functie beta-

celulară bună și valori ale HbA1c sub 8%, respectiv peptid C peste 5ng/ml, au obținut mai rapid valori ale

markerilor metabolismului glucidic apropiate de cele normale.

12 | 20

De asemenea, diferențele în ameliorarea metabolismului glucidic constatate între pacienții cu vârstecuprinse între 38-50 de ani versus cei între 50-63 de ani, indică faptul că vârsta reprezintă un factor de

care depinde evoluția diabetului după intervenția de chirurgie metabolică. Așadar, la pacienții sub 50 deani, gastrectomia longitudinală s-a dovedit mai eficientă în îmbunătățirea controlului glicemic. Valoarea

circumferinței abdominale (obezitatea abdominală) este importantă în sensul că valori ale acesteia mai

mari de 130 cm se asociează cu o probabilitate mai mare de a obține controlul glicemic îmbunătățit.Din analiza statistică a parametrilor clinici și biochimici modificați în intervalul de follow-up (6 și

12 luni) P1 a identificat următorii (bio)markeri/parametri asociați cu o probabilitate mai mare de a obțineo scădere ponderală în urma intervenției medical nutriționale de modificare a stilului de viață:a) Nivelul de control metabolic - exprimat prin valoarea glicemiei a jeun și a HbA1c. Valori mai mici

ale acestor parametri, exprimând o aderență mai bună la recomandările terapeutice, atât în ceea ce

privește stilul de viață cât și terapia medicamentoasă, se corelează cu o probabilitate mai mare de a obținescăderea ponderală și un control glicemic îmbunătățit.b) Obezitatea abdominală – exprimată prin valoarea circumferinței abdominale. Valori mai mari ale

acesteia, se asociează cu o probabilitate mai mare de a obține scăderea ponderalăc) Vârsta -Vârsta mai mică (probabil asociat cu o rată a metabolismului bazal mai mare, probabilitatemai mare de aderență la program de exerciții fizice) se asociază cu o probabilitate mai mare de a pierde în

greutate.

d) Prezența tratamentuliu insulinic / Doza de insulină- Doza mai mare de insulină a fost corelată cu oprobabilitate mai mică de a obține scăderea ponderală, fenomen explicat de efectula anabolic al insulinei

și secundar probabil, prin comportamentul defensiv de creștere a aportului alimentar în vedrea reduceriiriscului apariției unor episoade de hipoglicemie (fenomen caracteristic tratamentului cu insulină)e) Factori hormonali - Nivel mai mare de grelină și mai mic de leptină a fost asociat unei probabilitățimai mici de apariție a scăderii ponderale.

În ceea ce privește probabilitatea de a obține ameliorarea diabetului zaharat după tratamentulconvențional, principalul predictor a fost funcția beta celulară (reflectată prin nivelul controluluimetabolic la baseline - HbA1c, nivelul de peptid C, prezența insulinoterapiei și doza de insulină).

Activitatea 4.5: Evaluarea expresiei genice si proteice a unor molecule implicate in metabolismul

acizilor grași în adipocite și celule β pancreatice (activitate transferată total din 2016)P3 a realizat experimentele de expresie genică prin real-time PCR pentru toate probele recoltate la Vl, V2

şi V3 pentru lotul conservator şi cel chirurgical. Pentru aceste probe izolarea ARN şi reverstranscriereala ADNc a fost realizată în etapa a 3-a, probele fiind stocate la -80ºC pentru realizarea experimentelor de

expresie genică din această etapă. Produsul reacției de reverstranscriere a fost amplificat utilizand primeri

prefabricați TaqMan pentru PON2 (ID:Hs00165563_m1) (Applied Biosystems, TaqMan GeneExpression Assays, concentrație finală primeri 900mM).

Activitatea antioxidantă a particulei de HDL se datorează prezenţei în cantitate crescută a enzimei

paraoxonaza 1 (PON1). Un alt membru al familiei genei paraoxonazei, PON2, a fost identificat ca având

localizare intracelulară. PON2 poate să scadă stresul oxidativ intracelular şi să prevină oxidarea LDL;

expuse unor condiții pro-oxidante, celulele care supraexprimă PON2 prezintă un stres oxidativ scăzut.Rezultatele noastre au arătat că creşterea mRNA pentru PON2, posibil ca un mecanism compensator, cu

13 | 20

valori mai mari la V1 comparativ cu V3 (p<0.05 pentru lotul conservator şi p<0.001 pentru lotu l

chirurgical) (manuscris în pregatire).

Activitatea 4.6: Cuantificarea secretiei de insulina stimulata de glucoza in conditiile SRE (activitate

transferată parțial din 2016)Pentru cuantificarea secreției de insulină stimulată de glucoză de cățre celulele β-pancreatice au fost

optimizate experimentele atât la nivelul lizării celulelor, separării probelor prin electroforeza (cantitate deproteină, timp de migrare, tampon de migrare), concentraţiei de anticorp folosit, cantitate de proteină catşi pentru determinarea de insulină prin tehnica ELISA. Prin folosirea liniilor celulare β-pancreatice ca

model experimental pentru studiul diabetului zaharat, am arătat că acumularea intracelulară de insulină afost mai mică la concentrații ale glucozei mai mari și acest lucru a fost asociat cu modificarea atât a

PON2 cât şi a secreției de insulină. Efectul a fost amplificat prin adăugarea de acid oleic în combinaţie cuconcentraţia mare de glucoză.Activitatea 4.7: Determinarea citokinelor eliberate de adipocite în condițiile SRE (activitate transferatăparțial din 2016)În timpul intervenției de gastrectomie longitudinală, pacienților din studiul CREDOR le-au fost prelevate

fragmente de țesut adipos subcutanat și visceral, care au fost procesate de P2 în vederea obținerii de

celule stem (ADSC, adipose tissue-derived stem cells). Celulele ADSC din fracția stromală vasculară dețesut adipos au fost aduse la pasaj 4, după care au fost diferențiate în adipocite. Mediul de diferențiere

folosit a fost DMEMs/Ham’s F12 1:1 (fără FBS), cu penicilina (100 U/ml), streptomicină (100g/ml) șineomicină (50g/ml), suplimentat cu 15mM HEPES, 15mM NaHCO3, 17µM acid pantotenic, 33 µM

biotina și 2mM glutamină, la care s-a adăugat pentru primele 2 zile 1M insulină, 0.1M dexametazonă,0.5 mM IBMX, 0.2 nM T3, 10µg/ml transferină și 1M roziglitazonă. Mediul utilizat pentru continuareadiferențierii este cel descris mai sus din care s-a omis IBMX.

În condițiile descrise, 70% dintre celule sunt capabile săse diferențieze în adipocite (Figura 1). În paralel au fost

menținute în cultură celule nediferențiate, respectiv înmediu standard DMEMs/Ham’s F12, suplimentat cu

penicilină (100 U/ml), streptomicină (100g/ml),

neomicină (50g/ml) și fără FBS, iar aceste celule au

reprezentat grupul control. La finalul diferențierii (15zile), celulele au fost incubate timp de 72 h în mediu

DMEMs/Ham’s F12 la care s-a adăugat fie ser autologobținut de la pacienții supuși intervenției de chirurgiemetabolică, fie tunicamicina (1µg/ml), un inductor al

stresului de reticulul endoplasmatic (SRE). După 72 h,

Figura 1 ADSC de la un pacient CREDOR,

diferențiate și incubate 72 h cu ser autolog.

Contrast de faza (mărire 40x)

mediul condiționat a fost recoltat, centrifugat la 2500 rpm, la 40C, timp de 10 min, alicotat și păstrat la- 800 C pentru determinarea unor citokine eliberate extracelular de ADSC. Adipokinele secretate în

mediul de cultură de către ADSC diferențiate au fost determinate spectrofotometric cu următoarele kituri:RD-DY398B-05 Human Leptin DuoSet ELISA, RD-DY1065 Human Adiponectin/Acp30 DuoSet

14 | 20

ELISA, RD-DY210-05 Human TNF-alpha DuoSet ELISA , RD-DY206-05 Human IL-6 DuoSet ELISA,

si RD-DY217B-05 Human IL-10 DuoSet ELISA.

Figura 2. Sinopsis-ul unor adipocitokine secretate în prezență de ser recoltat de la pacienți din lotulchirurgical, preoperator (V1) și la 1 an postoperator (V3)

Rezultatele obținute au arătat următoarele: ADSC din țesut adipos subcutanat, diferențiate și incubate timp de 72h cu mediu conținând 10% ser

autolog recoltat de la pacienți CREDOR la vizita V3, eliberează leptina, TNF- și IL-6 în cantități maimici comparativ cu celulele incubate cu ser recoltat de la același pacient la vizita V1. Nivelele de

adiponectina și IL-10 măsurate în mediul condiționat în cele două situații experimentale nu se modificăsemnificativ.

ADSC obținute din țesut adipos visceral, diferențiate și incubate timp de 72h cu mediu conținând 10%ser autolog recoltat la vizita V3, secretă TNF- în concentrații crescute și IL-10 în concentrații scăzute,comparativ cu celulele incubate cu ser recoltat de la același pacient la vizita V1. Nivelele de leptină,

adiponectină și IL-6 din mediul conditionat nu se modifică semnificativ în condițiile stimulării ADSCviscerale cu ser recoltat la vizita V3 versus V1.

ADSC obținute din țesut adipos visceral, diferențiate și incubate timp de 72h cu mediu conținând1µg/ml tunicamicina (inductor de SRE) secretă în mediu nivele crescute de TNF-, comparabile cu cele

măsurate în condițiile incubării ADSC cu ser recoltat la vizita V3. Leptina, adiponectina și IL-6 secretate

de ADSC viscerale in mediul de cultura in prezenta tunicamicinei se află în concentrații mult mai micicomparativ cu cele măsurate la V1 si V3.

Aceste rezultate au evidențiat faptul că adipocitele din regiunea subcutanată de la persoanele care

prezintă scădere ponderală și control glicemic îmbunătățit răspund la modificările sistemice prin

eliberarea în mediul extracelular de TNF-, leptină și IL-6 în concentrații mai mici, fără modificări

semnificative ale concentrațiilor de adiponectină și IL-10. Adipocitele obținute din țesut adipos visceraleliberează extracelular nivele mai mari de TNF-, fără modificări majore în profilul celorlalteadipocitokine. Pe de altă parte, dozările în ser ale adiponectinei și ale markerilor pro-inflamatori (leptina,

IL-6 si TNF-) efectuate în cadrul unei alte activități din acest proiect au condus la rezultatecontradictorii: în cazul pacienților cu obezitate și DZ2 care au prezentat scădere ponderală șiîmbunătățirea statusului metabolic, concentrațiile de leptină au scăzut, cele de adiponectină au crescut, iarconcentrațiile de IL-6 și TNF- au crescut în mod contrar și neașteptat. Este posibil ca TNF- să

15 | 20

furnizeze informații privind statusul inflamator în adipocitele persoanelor care înregistrează o scădereponderală și o îmbunătățire a statusul metabolic, deci să constituie un biomarker. Totuși, având în vedere

numărul mic de pacienți incluși în acest studiu, este posibil ca rezultatele obținute să nu fie semnificative.

Pentru un sinopsis al adipocitokinelor secretate în circulație după pierderea în greutate și remisia DZ2

este nevoie de un studiu cu un număr semnificativ mai mare de subiecți. Caracterizarea mediului

condiționat de adipocitele din țesut adipos subcutanat și visceral provenite de la același pacient, dupăincubarea cu ser autolog recoltat înainte și după pierderea ponderală, poate furniza informații asupra

proceselor biologice din aceste celule, cu rol esențial în metabolismul glucidic și lipidic.

Activitatea 4.8: Evaluarea statusului oxidativ în celulele β-pancreatice și adipocite incubate cu ser

de la pacienții luați în studiu (activitate transferată parțial din 2016)P3 a efectuat experimentele pentru descifrarea mecanismelor oxidative și a capacității de apărare acelulelor ȋmpotriva efectelor speciilor reactive de oxigen generate ȋn procesele asociate SRE. Activitățilerealizate ȋn cadrul acestei activități au inclus: 1) identificarea surselor generatoare de ROS; 2)

determinarea statusului oxidativ şi antioxidativ total; 3) studiul NADPH oxidazei şi a enzimeiantioxidante PON2: exprimare genică și determinarea activității enzimatice; 4) determinarea activitățiienzimatice a SOD și GPX. Pentru determinarea nivelelor de expresie genică au fost utilizați primeriprefabricați TaqMan pentru următoarele gene: gp91phox (ID:Hs001661163_m1), p67phox(ID:

Hs00166416_m1), p22phox (ID:Hs0016470_m1) și p47phox(ID: Hs00165362_m1).

Pentru evaluarea statusului oxidativ în celulele β-pancreatice PANC-1 în cocultură cu adipocite de

la pacienții din studiul CREDOR, P3 a determinat concentrația totală de oxidanți şi antioxidanți (kitImanox TAS/TAC, KC5200 şi kit Perox TOS/TOC, KC 5100; conform instrucțiunilor producătorului) şiconcentrațiile de insulină şi proinsulină în mediul condiționat şi lizate celulare (metoda ELISA).

Experimentele de cocultură celule β - preadipocite/adipocite au fost realizate astfel:

1) prin adăugarea peste celulele β-pancreatice PANC-1 atașate a preadipocitelor (CSV)/adipocitelor la4, 10 şi 20 de zile de la diferențiere (mediu condiționat). Cu o zi înainte de experiment, celulele PANC1

au fost desprinse și cultivate în plăci de 6 godeuri (2x104 celule/mL). După 24 de ore, mediul de cultură afost îndepărtat, celulele au fost spălate cu PBS, după care a fost adaugat mediul de la

preadipocite/adipocite diferenţiate (4, 10, 20 zile). Celulele au fost menţinute în cultură încă 24 sau 48 deore, apoi mediul a fost recoltat și celulele lizate pentru determinările de insulină şi proinsulină sau

expresie genică;2) prin folosirea unui insert ce conţine o membrană de policarbonat cudimensiunea porilor de 0.4µm. Celulele β-pancreatice PANC-1 au fost cultivate

în stratul de jos in timp ce adipocitele au fost diferenţiate timp de 7 şi 20 de zile

în insert (Figura 3). În insert celulele au fost menţinute 24 sau 48 h, apoi a fost

recoltat mediul şi celulele lizate pentru determinarea de insulină şi proinsulină(tehnica ELISA) și expresie genică (Real-time PCR).

Rezultatele reprezentative sunt prezentate ca medie şi deviația standard înFigura 4.

Figura 3. Modelul

experimental de co-cultura

PANC-1-adipocite

16 | 20

Figura 4. Determinarea de insulină şi proinsulină (mediu şi lizate celulare) în celulele PANC-1 co-

incubate (mediu condiționat) cu preadipocite/adipocite diferențiate (ziua 4, 10 şi 20) (n=4)

Activitatea 4.9: Identificarea mecanismelor intracelulare modulate de grelină/deacilgrelină în condițiide stres metabolic în adipocite și celule β-pancreatice (activitate transferată parțial din 2016)Diminuarea senzației de foame la pacienții obezi după intervenția de gastrectomie longitudinală esteatribuită adesea reducerii nivelelor circulante de grelină (datorită îndepărtării celulelor producătoarede grelină din stomac). Forma acilată a grelinei activează receptorul GHSR (growth hormonesecretagogue receptor) implicat în modularea apetitului și în controlul homeostaziei energetice;forma ne(des)acilată nu este ligand pentru GHSR. Unele studii preclinice arată că grelina induce

obezitate abdominală via retenția de lipide mediată de GHSR, în timp ce altele dovedesc că acesthormon limitează acumularea de grăsime și îmbunătățește statusul redox la nivel hepatic. În ipotezacă grelina are un rol în atenuarea stresului de reticul endoplasmatic (SRE) și în inhibarea apoptozeiinduse de SRE, P2 a efectuat o serie de experimente în care a urmărit efectele grelinei (acilată/des-

acilată) asupra expresiei unor markeri de SRE în celule β pancreatice 1.1B4 expuse timp de 72 ore la

condiții de stres metabolic. Celulele 1.1B4 au fost incubate în prezența sau absența de acil grelină(100 ng/μl - concentrație similară celei determinate la pacienții din studiu), sau des-acil grelină (100ng/μl), în condiții care mimează hiperglicemia și nivelele crescute de acizi grași saturați, respectivconcentrații mari de glucoză (25 mM) și acid palmitic (250 μM), comparativ cu condiția normală (5mM glucoză, normoglicemia). Drept control pozitiv pentru inducerea SRE am folosit tunicamicină (10μg/ml), iar pentru inhibarea receptorului la grelină am utilizat JMV3002. Rezultatele au arătat că grelina aprevenit supraexprimarea proteinelor markeri ai SRE GRP78/BiP și CHOP (C/EBP homologous protein)și a reversat diminuarea activării kinazei Akt (p-Akt), sugerând că ambele forme de grelină pot preveniactivarea unor evenimente pro-apoptotice. Inhibarea efectului anti-apoptotic al acil grelinei cu JMV a

indicat că atenuarea SRE de către grelina acilată implică o cale de semnalizare intracelulară dependentăde GHSR. De asemenea, preadipocite diferențiate au fost expuse 72 ore la condițiile menționate mai susși s-a observat că des-grelina stimulează exprimarea unor gene care codifică proteine implicate înstocarea de lipide, precum lipoprotein lipaza (LPL) și diminuează expresia unor proteine de stres, precum

XBP1 și CHOP. Experimentele în care a fost urmărit efectul grelinei asupra secreției de insulinăstimulate de glucoză (GSIS) în celulele β pancreatice au fost neconcludente, kitul folosit pentru detecțiainsulinei nefiind suficient de sensibil. În colaborare cu P2, P3 a evaluat efectele modulatoare ale

grelinei/DAG asupra moleculelor din căile de semnalizare activate de stresul oxidativ ȋn cele doua tipuri

17 | 20

celulare. Experimentele efectuate au urmărit raportul GSH/GSSG (kit PROMEGA conform

instrucțiunilor producătorului); apoptoza celulară (kit PROMEGA conform instrucțiunilorproducătorului), determinarea expresiei unor proteine (Akt, fosfo-Akt, catalază, subunități ale NADPHoxidazei) posibil implicate în semnalizarea intracelulară stimulată de grelină (acilată/desacetilată),precum şi studiul enzimei antioxidante PON2 (expresie genică şi activitate enzimatică lactonazică).Grelina circulantă se poate asocia cu HDL-colesterol (HDLc), iar paraoxonaza este un component

lipofilic antioxidant al HDLc. În studiile în care a fost investigată capacitatea antioxidantă a grelinei,incubarea celulelor cu grelină a determinat o creștere a nivelelor proteice a enzimei antioxidante catalazăși a raportului GSH/GSSG, posibil pe o cale de semnalizare dependentă de SIRT1, moleculă cu rolantiapoptotic. Rezultatele vor fi incluse într-un articol în colaborare P2 şi P3 (manuscris în pregătire).

Activitatea 4.10: Stabilirea criteriilor și redactarea protocolului de selecție a pacientilor cu

potential de remisie a diabetului ce pot beneficia de intervenția chirurgicală de gastrectomielongitudinală (activitate transferată parțial din 2016)În vederea realizării activității 4.10, CO, P1, P2 şi P3 au stabilit un protocol de selecție a persoanelor cu

obezitate și diabet de tip 2 care ar putea beneficia de chirurgia metabolică pentru tratamentul diabetului și

a complicațiilor cardiovasculare asociate. În urma analizei datelor înregistrate la vizitele de follow-up

(V2, V3) ale pacienților din lotul chirurgical, au fost identificați următorii markeri clinici și biochimici(biomarkeri) care pot conduce la identificarea pacienților cu șanse mari de a-și imbunătăți metabolismul

glucidic în urma tratamentului chirurgical de gastrectomie longitudinală:

a. Peptid C - indicator al funcției beta celulare (component al formulei de evaluare HOMA-%B).

Nivele mai mari de peptid C constituie un predictor important al remisiei diabetului după intevenția de

gastrectomie longitudinală. O valoare a peptid C mai mare de 5 ng/ml este asociată cu un procent de

remisie de 80% postoperator.

Cut-off Peptid C peste 5 ng/mL

b. Durata diabetului zaharat – O durata mai lungă a DZ se asociază nu doar cu un risc crescut de

instalare a unor complicații cronice, care cresc la rândul lor riscul de evoluție postoperatorie nefavorabilă,dar și cu scăderea progresivă a funcției beta celulare. O durata a diabetului de peste 5 ani se asociează curemisie a DZ de numai 12.5%. In schimb, durata sub 4 ani este asociată cu remisie de peste 50%.

Cut-off – Durată DZ2 ; sub 4 anic. HbA1c – valori mai mari ale hemogloginei glicozilate se asociază probabil o funcție beta celularăscăzută, posibil ireversibil.

Cut-off HbA1c Sub 8%

d. Insulinoterapia preoperatorie – este indirect tot o măsură a funcției beta celulare. Pacienții care nunecesita insulină preoperator au o probabilitate mai mare de remisie a diabetului.

Cut-off – Insulinoterapie; Absența insulinoterapiei la baselinee. Vârsta – pacienții mai tineri au probabilitate mai mare de remisie a DZ2 postoperator. Probabil

indirect, prin intermediul funcției beta celulare. În general, creșterea vârstei cu 10 ani scade cu 20%probabilitatea de remisie.

Cut-off Vârstă sub 50 ani

18 | 20

f. BMI preoperator – pacientii cu IMC-ul intre 30-40kg/mp au avut o probabilitate mai mare de

remisie a DZ2 in urma tratamentului chirurgical, fata de cei cu BMI-ul peste 40kg/mp.

Cut-off BMI între 30-40 kg/m2

Pe baza parametrilor descriși mai sus, s-a realizat un scor de predicție a obținerii remisiei diabetuluizaharat după intervenția de gastrectomie longitudinală la pacienții cu obezitate și DZ2, alegând parametri

clinici simpli, precum peptidul C - indicatorul cel mai fidel al rezervei funcționale beta celularepancreatice. Pe baza acestui scor se poate face selecţia candidaţilor pentru intervenţia chirurgicală,

respectiv un scor peste 6 poate fi considerat un prag de selecție a pacienților pentru chirurgia metabolică.

Scor predicție a remisiei diabetului zaharat după intervenția chirurgicalăPuncte acordate

0 1 2 3

Vârstă (ani) peste 40 sub 40

BMI (kg/m2) <30 30-34.9 35-39.9 >40

Peptid C (ng/ml) <2 2-3.5 3.5-5 >5

Durata DZ (ani) >8 4-8 1-3.9 <1

Activitatea 4.11: Diseminarea rezultatelor - protocolul de selecție pentru chirurgia metabolică a

pacienților cu obezitate și diabet zaharat de tip 2 (activitate transferată parțial din 2016)În cadrul celei de a V-a ediții a Congresului Universităţii de Medicină şi Farmacie “Carol Davila”,

care a reunit la Palatul Parlamentului, în perioada 29-31 mai, peste 4.000 de participanţi, personalități alemedicinei şi cercetării ştiinţifice medicale din România şi din străinătate, studenţi, medici rezidenţi,medici de familie, medici specialişti, proiectul CREDOR a beneficiat de o sesiune specială. Sesiuneaintitulată Aspecte clinico-moleculare în afecțiuni asociate obezității, care a cuprins prezentările celor 4parteneri din proiect, a contribuit la creșterea vizibilității proiectului CREDOR. Reprezentanți ai CO, P1,P2 și P3 au susținut următoarele prezentări orale:1) Smeu B. Reversing type 2 diabetes after laparoscopic sleeve gastrectomy/Remisia diabetuluizaharat de tip 2 după operația laparoscopică de gastrectomie longitudinală. Congresul Universității deMedicină şi Farmacie „Carol Davila”, 29-31 mai, 2017, Bucureşti, Romania.

2) Ștefan DS. Resting metabolic rate and adipokines profile 12 months after lifestyle intervention inobese type 2 diabetes patients/Rata metabolismului bazal şi evoluția adipokinelor la 12 luni dupăschimbarea stilului de viață la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 şi obezitate. Congresul Universitățiide Medicină şi Farmacie „Carol Davila”, 29-31 mai, 2017, Bucureşti3) Constantin A, Dumitrescu M, Nemecz M, Picu A, Smeu B, Guja C, Tanko G. Improved glycemiccontrol diminishes the endoplasmic reticulum stress in pancreatic β-cells/Imbunătățirea controluluiglicemic atenuează stresul reticulului endoplasmic în celulele β pancreatice. Congresul Universității deMedicină şi Farmacie „Carol Davila”, 29-31 mai, 2017, Bucureşti4) Lixandru D. Oxidative stress in obese type 2 diabetes patients after weight loss/Stresul oxidativ lapacienții cu diabet zaharat de tip 2 şi obezitate după pierderea în greutate. Congresul Universității deMedicină şi Farmacie „Carol Davila”, 29-31 mai, 2017, Bucureşti

19 | 20

De asemenea, în 2017, o parte din rezultatele proiectului CREDOR obținute au fost diseminate demembrii echipelor CO, P1, P2 si P3 la o serie de manifestări naționale/internaționale, ca prezentări orale,postere, sau lucrări publicate in extenso.

Prezentări orale /postere /lucrări publicate in extenso la manifestări naționale/internaționale

1) Ştefan DS, Lixandru D, Bajko D, Petcu L, Picu A, Pantea I, Smeu B, Copăescu C, Ionescu-

Tîrgovişte C, Guja C. The evolution of resting metabolic rate and body composition after 6 and 12months of lifestyle changes in obese type 2 diabetes patients. 3rd International Conference on

Interdisciplinarity Management of Diabetes Mellitus and its Complications (INTERDIAB 2017),

Bucharest, March 2-4, 2017. Lucrarea a fost publicată in extenso în volumul Proceedings al conferinţei,indexat ISI-Thomson, Book Series: International Conference on Interdisciplinary Management of

Diabetes Mellitus and its Complications, Pages: 323-331; Published: 2017; Edited by: Serafinceanu C,

Negoita O, Elian V. Prezentare orală2) Ștefan DS, Bajko D, Petcu L, Picu A, Mihai A, Lixandru D, Smeu B, Copăescu C, Ionescu-

Tîrgoviște C, Guja C. Comparison of insulin resistance and beta cell function markers one year aftersleeve gastrectomy versus conservatory treatment in obese type 2 diabetes subjects; CREDOR studyresults.Al 43-lea Congres Național al Societății Române de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice, Brașov,

24-27 mai 2017. Rezumatul acestei lucrări a fost publicat în Acta Diabetologica Romana vol. 43, pag 77-

80, 2017; ISSN 2068-8245. Prezentare orală3) Bajko D, Ștefan DS, Petcu L, Picu A, Mihai A, Lixandru D, Smeu B, Copăescu C, Ionescu-

Tîrgoviște C, Guja C. Metabolic control and anthropometric data one year after sleeve gastrectomyversus conservatory treatment in obese patients with type 2 diabetes; CREDOR study results. Al 43-lea

Congres Național al Societății Române de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice, Brașov, 24-27 mai, 2017.

Rezumatul lucrării publicat în Acta Diabetologica Romana vol. 43/2017, ISSN 2068-8245. Poster

4) Lixandru D, Ilie M, Ștefan DS, Bajko D, Petcu L, Picu A, Smeu B, Copăescu C, Ionescu-TîrgovișteC, Guja C. Relationship between hormonal, inflammatory markers and type 2 diabetes remissionfollowing sleeve gastrectomy. Al 43-lea Congres Național al Societății Române de Diabet, Nutriție și

Boli Metabolice, Brașov, 24-27 mai, 2017. Rezumatul lucrării a fost publicat în Acta Diabetologica

Romana vol. 43, pag 162-164, 2017; ISSN 2068-82452017. Poster

5) Constantin A, Dumitrescu M, Nemecz M, AlexandruN, GeorgescuA,Guja C, Smeu B, Tanko G,

Maya Simionescu. Endoplasmic reticulum stress markers and autophagy in human β-cells exposed tosera from obese type 2 diabetic patients. 22nd World Congress of International Federation for the Surgery

of Obesity and Metabolic Disorders, 29 August - 2 September, 2017, London, UK. Abstract publicat în

Obes Surg (2017), 27 (Suppl 1):1; https://doi.org/10.1007/s11695-017-2774-7 (factor impact: 3,947).

Poster premiat

6) Nemecz M, Constantin A, Dumitrescu M, Petcu L, Picu A, Tanko G, Simionescu M. Endoplasmicreticulum stress pathways are activated in pancreatic β-cells by sera from obese type 2 diabeticpatients. 9th National Congress of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB) with International

Participation, and the 35rd RSCB Annual scientific Session, Iasi, Romania, June 7-11, 2017. Rezumatul

lucrării a fost publicat în Bulletin of RSCB 2017, 45, p. 62. Poster

7) Tanko G, Dumitrescu M, Constantin A, Nemecz M, Dragan E, Popov D, Georgescu A, Simionescu

M. Structural and molecular changes associated with experimental hypertension-induced

20 | 20

compensatory left ventricular hypertrophy. 34th Annual Meeting of the European Section of the

International Society for Heart Research, July 24-27, 2017, Hamburg, Germany. Abstract publicat în

Journal of Molecular and Cellular Cardiology 109, pag 4, 2017 (factor impact: 5,68). Poster

8) Nemecz M, Constantin A, Dumitrescu M, Alexandru N, Picu A,Smeu B, Tanko G, Simionescu M.

Beta cells exposed to sera from obese diabetic patients undergoing improved glycemic control exhibitenhanced survival and diminished formation of reactive oxygen species. 53rd Annual Meeting of the

European Association for the Study of Diabetes (EASD), September 11-15, 2017, Lisbon, Portugal.

Abstract publicat în Diabetologia S202 (2017) 60 (Suppl 1):S1–S608 (factor impact: 6,08). Poster

Articole publicate/acceptate/în evaluare în reviste indexate ISI-THOMSON cu factor de impact

1. Ştefan DS, Mihai A, Bajko D, Lixandru D, Petcu L, Picu A, Smeu B, Copăescu C, Ionescu-

Tîrgovişte C, Guja C. (2017) Comparison of Sleeve Gastrectomy and Conservatory Treatment Effect onBiochemical and Hormonal Profile of Obese Type 2 Diabetes Subjects: CREDOR RandomizedControlled Study Results. Rev Chim (Bucharest) 68: 1622-1627; ISSN 0034-7752 (factor impact 1.24)

2. Liviu Iosif, Daniela Lixandru, Laura Gaman, Mihaela Ilie, Bogdan Smeu, Diana Simona Ştefan,Laura Petcu, Ariana Picu, Alina Constantin, Constantin Ionescu-Tîrgovişte, Cristian Guja, CătălinCopăescu, Irina Stoian. Oxidative stress profile and type 2 diabetes remission following 6 months ofsleeve gastrectomy versus conservatory treatment. Articol acceptat pentru publicare în revista Farmacia

(factor de impact 1.348)

De asemenea, lucrarea știintifică Endoplasmic reticulum stress markers in 1.1B4 beta cellsexposed to sera from obese type 2 diabetic patients before and after 6-month conventional medicaltreatment or sleeve gastrectomy, autori: Constantin A, Nemecz M, Dumitrescu M, Picu A, Smeu B, Guja

C, Alexandru N, Georgescu A, Tanko G, a fost trimisă spre publicare la Obesity Surgery (factor impact

3,947); încă 4 articole se află în pregătire.