Secţia Stiinte MedicaleAnexa 1

Raportul Centrului de Imunologie al Academiei Române pentru anul 2017

1. Membrii Secţiei – lucrări publicate în anul 2017; cea mai importantă lucrare a fiecărui membru apărută în anul 2017:

Georgiana Gabriela Petrică-Matei, Viviana Roman, Mirela Mihăilă, Camelia Mia Hotnog,

Lorelei I. Brașoveanu, Marinela Bostan. Role of p38-mitogen-activated protein kinase in

modulation of the response to therapy in FaDu human pharyngeal carcinoma cell line.

Journal of Romanian Biotechnological Letters, 2017, https://doi.org/10.26327/RBL2017.06

(IF=0,404)

2. Centrul de Imunologie a) Domenii de cercetare.

- Imunologie tumorala: Mecanisme celulare si moleculare implicate in progresia

tumorala; modularea expresiei genice/antigenice si rolului functional al moleculelor

asociate tumoral, de adeziune tumorala, implicate in angiogeneza;

- Biologie moleculara: biomarkeri asociati cancerelor umane (cancer colorectal, mamar,

ovarian, gastric, din sfera ORL, melanom, boli limfoproliferative);

- Imunoterapia cancerului: studii in vitro privind abordari imunoterapeutice in cancer;

rolul moleculelor reglatoare ale sistemului complement in rezistenta tumorilor la

1

tratament si impactul in imunoterapia tumorala; efectul modulator al micromediului

tumoral asupra tintelor terapeutice.

- Nanomedicina: studii in vitro asupra efectelelor biologice induse de nanoparticule

incarcate cu medicamente/ compusi naturali

- Biotechnologie: studii in vitro asupra efectelelor biologice induse de compusi cu ioni

metalici (ex. ruteniu, lantanide), biomateriale

- Preventia/chimiopreventia/rezistenta multipla la medicamente: efectele unor

modulatori (compusi biologic activi, citokine, medicamente, citostatice) asupra ciclului

celular, apoptozei, expresiei genice/antigenice si rolului functional al moleculelor

asociate celulelor tumorale;

- Celule stem tumorale;

- Semnalizare intra- si inter-celulara: cai de semnalizare cu rol in reglarea apoptozei si

ciclului celular, proteine fosforilate, MAP-kinaze.

b) Programe de cercetare fundamentala (proiecte de cercetare curenta ale Academiei Romane)

Program I: “MODULAREA UNOR MECANISME CELULARE SI

MOLECULARE IMPLICATE IN PROGRESIA TUMORALA SI CHIMIO-

PREVENTIE” (coordonator program: dr. Lorelei I. Brasoveanu)

1.1. Tema “ EVALUAREA EFECTULUI ANTI-TUMORAL AL UNOR COMPLECSI

METALICI IN CANCERUL DE COLON” (Director proiect Dr. Mirela Mihaila, CSIII)

1.2. Tema „MODULAREA APOPTOZEI IN CELULELE LEUCEMICE UMANE”

(Director proiect Dr. Viviana Roman, CS II)

1.3. Tema „MODULAREA GENERARII SPECIILOR REACTIVE DE OXIGEN DE UNII

COMPUSI NATURALI SI STABILIREA IMPLICARII LOR IN APOPTOZA

CELULELOR TUMORALE” (Director proiect Dr. Marinela Bostan, CSIII)

3. Resurse umane: cercetători, doctori, conducători de doctorate (vezi tabelul din anexa 2) cercetatori: 5 cercetatori stiintifici atestati

2

doctori: 4

conducatori de doctorate: 2 (1 angajat si 1 pensionar)

4. Activitate formare de tineri cercetători: doctoranzi, post-doctoranzi.

- 1 doctorand, cercetator angajat in Centrul de Imunologie, Institutul de Virusologie

„Ştefan S. Nicolau”, care si-a sustinut teza de doctorat in acest an si este in faza de

validare a tezei:

Camelia Mia Hotnog, cu teza de doctorat “Factori genetici si imunologici implicati

in progresia tumorala si angiogeneza” (coordonator: Dr. L.I. Brasoveanu) in Centrul de

Imunologie, IOD: Institutul de Virusologie „ Ştefan S. Nicolau” al Academiei Române

(SCOSAAR);

- 2 doctoranzi externi care si-au sustinut tezele de doctorat in acest an si sunt in faza de

validare a tezelor:

a) Georgiana-Gabriela Petrica-Matei, cu teza de doctorat “Studiul unor mecanisme

celulare şi moleculare implicate în transformarea, invazia şi metastazarea celulelor

tumorale în cancerele sferei ORL” (coordonator: Dr. L.I. Brasoveanu)

b) Daniela Murarasu, cu teza de doctorat “Studiul modificărilor genetice şi

epigenetice ale factorilor asociaţi cancerelor epiteliale” (coordonator: Dr. L.I.

Brasoveanu)

- 5 doctoranzi externi aflati in faza finala a programului doctoral (3 doctoranzi -

coordonator: Dr. L.I. Brasoveanu; 2 doctoranzi - coordonator: Dr. C. Galatiuc/ CSI,

pensionata)

5. Infrastructură de cercetare nouă achiziţionată/completată în anul 2017: biblioteca de specialitate, echipamente de cercetare (cu valori peste 10 kEuro), etc.

a) Biblioteca de specialitate

- Acces la baze de date nationale si baze de date bibliografice international, prin Institutul de

Virusologie „Stefan S. Nicolau” si prin Biblioteca Centrala a Universitaţii de Medicină si

Farmacie “Carol Davila”

- Acces la 4 abonamente anuale CIB (reviste stiintifice de specialitate):

3

1) „Citometry” part A; 2) „Apoptosis”; 3) „Haematologica - The Hematology Journal”;

4) “Blood”.

6. Rezultatele cercetării desfăşurate în anul 2017 (vezi tabelul din anexa 2)

A) Brevet

1. Uivarosi V, Aramă CC, Bărbuceanu SF, Brasoveanu LI, Mihaila MA, Badea EM, Olar

RM. “Complecşi de asociere hidroxipropil-b-ciclodextrină/compuşi de ruteniu şi utilizare

terapeutică”. Brevet A00944/29.11.2016, aprobat in 2017

B) Lucrări publicate:

a. în reviste ISI din străinătate: 5 (New Journal of Chemistry, Free Radical Research,

Molecular Crystals and Liquid Crystals)

b. reviste ISI din România: 5 (Journal of Romanian Biotechnological Letters)

c. reviste BDI din România: 1 (Roumanian Archives of Microbiology and

Immunology)

d. volume conferinte internationale: 7 lucrari sub forma de rezumat

e. volume conferinte nationale: 3 lucrari sub forma de rezumat

C) Cărţi/ capitole carte publicate în străinătate/ în România - Editura Academiei

Române/alte edituri:

- Capitole publicate in strainatate (1):

1) Marinela Bostan, Georgiana Gabriela Petrică-Matei, Răzvan Hainăroşie, Nicoleta Radu,

Viviana Roman. Apoptosis and Autophagy Pathways, A New Therapy Approach in Head and Neck

Cancer. SM Group Open Access eBooks -Head and Neck Cancer | www.smgebooks.com, PP.1-9,

published date: November 03, 2017

D) Citări ale lucrărilor publicate anterior, în anul 2017: 37

4

7. Realizări excelente obţinute în anul 2017 (cca. 3 realizări), ale Secţiei şi

institutelor/centrelor coordinate:

A) Capitol carte publicata in editura din strainatate:

Marinela Bostan, Georgiana Gabriela Petrică-Matei, Răzvan Hainăroşie, Nicoleta Radu, Viviana

Roman. Apoptosis and Autophagy Pathways, A New Therapy Approach in Head and Neck Cancer.

SM Group Open Access eBooks -Head and Neck Cancer | www.smgebooks.com, pp.1-9,

Published Date: November 03, 2017

B) Lucrări ştiinţifice (publicate în reviste ISI cu factor de impact ridicat):

1. Gabriela Badea, Nicoleta Badea, Lorelei I. Brasoveanu, Mirela Mihaila, Raluca Stan, Daniela

Istrati, Teodora Balaci and Ioana Lacatusu, Naringenin improves the sunscreen performance of

vegetable nanocarriers, New J. Chem., vol. 41, pg. 480-492, 2017, articol premiat in anul 2017 de

catre ANCS / UEFISCDI 9 (IF = 3,277)

2. D. Lixandru, P. Alexandru, A. Mihai, A. Rosca, C. Ionescu-Tirgoviste, L.I. Brasoveanu, B.

Manuel-y-Keenoy, Decreased paraoxonase 2 enzymatic activity in monocyte/ macrophages cells. A

comparative in vivo and in vitro study for diabetes, Free Radical Research, 51(6), 604-615, 2017,

articol propus pentru premiere de catre ANCS / UEFISCDI, (IF=3,188)

C) Premii:

- Premiul pentru cel mai bun poster „Andrei Olinescu”, pentru lucrarea “Novel ruthenium (III)

complexes with co-solvents as potential anti-cancer agents in colon cancer therapy”, cu ocazia celei

de-a 47-a Conferinta Anuala de Imunologie cu participare internationala, Bucuresti, 4 - 6 octombrie

2017 acordat d-nei Dr. Mirela Mihaila (prim autor)

- articol premiat in anul 2017 de catre ANCS / UEFISCDI: Naringenin improves the sunscreen

performance of vegetable nanocarriers, New J. Chem., vol. 41, pg. 480-492, 2017, (IF = 3,277),

autori: Gabriela Badea, Nicoleta Badea, Lorelei I. Brasoveanu, Mirela Mihaila, Raluca Stan,

Daniela Istrati, Teodora Balaci and Ioana Lacatusu

- articol propus pentru premiere de catre ANCS / UEFISCDI: Decreased paraoxonase 2 enzymatic

activity in monocyte/ macrophages cells. A comparative in vivo and in vitro study for diabetes, Free

Radical Research, 51(6), 604-615, 2017, autori: D. Lixandru, P. Alexandru, A. Mihai, A. Rosca, C.

Ionescu-Tirgoviste, L.I. Brasoveanu, B. Manuel-y-Keenoy (IF=3,188)

5

D) Alte realizări pe care le consideraţi excelente (dacă este cazul):

- participare retea COST, Action CA16113: “CliniMARK: “Good biomarker practice” to

increase the number of clinically validated biomarkers”. Membri echipa management si

echipa implementare: dr. Viviana Roman, dr. Marinela Bostan

- participare realizare proiect director strain, in calitate de membru in echipa de management

al proiectului “Stabilirea Profilului Molecular al Neoplasmelor Mieloproliferative și al

Leucemiei Acute Mieloide pentru Designul unor Strategii de Diagnostic Precoce, Prognostic

și Tratament“, POC Axa 1, Acțiunea: A1.1.4. Atragerea de personal cu competențe avansate

din străinătate pentru consolidarea capacității de CD (dr. Lorelei I. Brasoveanu –

Responsabil cu asigurarea calității) si dr. Viviana Roman, membru in echipa de

implementare a proiectului (Responsabil activități de imunologie și studiul inflamației);

membri comisii evaluare licitatii desfasurate in cadrul proiectului. Proiect derulat in Institutul

de Virusologie “Stefan S. Nicolau”

- coordonare 3 teze de doctorat sustinute in 2017 (Dr. Lorelei I. Brasoveanu)

9. Cooperări ştiinţifice naţionale şi internationale, inclusiv în cadrul proiectelor (cu menţionarea numărul proiectului şi a partenerilor)

A. COOPERARI STIINTIFICE NATIONALE IN PROIECTE DE CERCETARE:

- Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alex. Trestioreanu”;

- UMF “Carol Davila” Bucuresti

- Universitatea Bucuresti, Facultatea de Biologie

- Universitatea Bucuresti, Facultatea de Chimie

- Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti

- Spitalul Clinic Universitar “Sfantul Ioan”

- INCDI “Victor Babes”

- INCDI “I. Cantacuzino”

- ICECHIM

6

- Spitalul Clinic Panduri

a) retea COST, Action CA16113: “CliniMARK: “Good biomarker practice” to increase the

number of clinically validated biomarkers”. Membri echipa management si echipa

implementare: dr. Viviana Roman, dr. Marinela Bostan

B. COOPERĂRI ŞTIINŢIFICE INTERNAŢIONALE:

1. Institutul Curie, U-365, Paris, Franta (Prof. Jean-Pierre Kolb)

2. Centro di Riferimento Oncologico Aviano, Italia (Dr. Luca Signorelli; dr. Sandra Coral)

3. Spitalul Universitar din Siena, Italia (Dr. Michele Maio, dr. Ester Fonsatti)

4. Cellular Technology, Cleaveland, SUA (Dr. Ioana Moldovan)

5. Universitatea din Pittsburgh (Dr. Iulia Popescu)

10. ALTE ACTIVITATI: - Dr. Lorelei I. Brasoveanu, Dr. Viviana Roman - evaluatori in 2017 ai unor articole reviste

internationale (Journal of Immunochemistry and Immunoassays), nationale (Romanian

Biotechnological Letters, Roumanian Archives of Microbiology and Immunology)

- Participarea la programe/ workshopuri de perfectionare:

1) Bio-Rad webinar cu tema: “Ask me Anything. Your qPCR questions answered!” (15

noiembrie 2017, Institutul de Virusologie “Stefan S. Nicolau”) (cercetatorii CIB)

2) Sesiune de prezentare si discutii “ Produse bioactive, innovative, derivate din ciuperci

comestibile” – Proiect POC P_40_406, sectiunea G “Noi tehnologii si produse pentru

sanatate” – ICCF Bucuresti, 2 noiembrie 2017 (Dr. Viviana Roman, dr. Marinela Bostan)

3) Workshop “Empower Flow-Cytometry Lab’s Workflow and Reliability”, organizatori:

Beckman-Coulter si Medist Life Science, co-organizatori Asociatia de Citometrie si

Facultatea de Biologie – Platforma de Cercetare si Biologie Sistemica (PCBS)

4) Curs de Medicina Integrativa: “Microbiomul uman si nutritia clinica?”, Biblioteca

Academiei Romane, 8 decembrie 2017 (dr. Marinela Bostan, dr. Viviana Roman, dr. Lorelei

I. Brasoveanu)

7

11. GREUTATI INTAMPINATE IN ACTIVITATEA DE CERCETARE:Lipsa finantarii activitatilor de cercetare realizate in cadrul proiectelor de cercetare

fundamental/ curenta (fonduri pentru reactivi si materiale consumabile);

12. CONCLUZII ŞI PROPUNERI:

- In vederea realizarii in conditii optime a obiectivelor propuse in cadrul planului de

cercetare curenta al Academiei Romane, precum si a contractelor de cercetare finantate

de Ministerul Cercetarii, solicitam efectuarea de catre Academia Romana a demersurilor

necesare suplimentarii posturilor in cercetare din Institutul de Virusologie „Stefan S.

Nicolau”, respectiv Centrul de Imunologie. In acest moment exista o mare lipsa de

personal cu studii superioare, in special cercetatori tineri, dar si de personal calificat cu

studii medii.

- Propunem de asemenea: deschiderea finanţărilor pentru Granturile Academiei Romane in

anul 2018; alocarea de fonduri pentru contractele de cercetare curenta.

- Alocarea de fonduri pentru efectuarea unui studiu de rezistenta a cladirii in care

functioneaza Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”, respectiv Centrul de

Imunologie, avand in vedere vechimea de peste 50 de ani a acesteia.

- Alocarea de fonduri pentru efectuarea de reparatii ale cladirii in care functioneaza

Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”, respectiv Centrul de Imunologie, precum si

a instalatiilor electrice si sanitare, avand in vedere vechimea de peste 50 de ani a

acestora.

Coordonator Centrul de Imunologie,

Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, CSI

8

PROIECTE DE CERCETARE

FINANŢATE DE CATRE ACADEMIA ROMÂNĂ

La realizarea planului de cercetare propus pentru 2017 de catre Centrul de Imunologie

Bucuresti a participat in cadrul programului si temelor propuse tot personalul angajat, atat cei cu

studii superioare (cercetatori stiintifici grad I, II si III), cat si personalul cu studii medii. Rezultatele

obtinute prin efectuarea studiilor din cadrul programului major de cercetare curenta al Centrului de

Imunologie, reprezentat prin trei teme, precum si prin proiectele cu finantare suplimentara sau

colaborarile stiintifice cu alte institutii, au fost valorificate prin comunicari la manifestari stiintifice

nationale si internationale, precum si prin publicatii in reviste de specialitate.

Programul “STUDIUL UNOR MECANISME CELULARE SI

MOLECULARE IMPLICATE IN PROGRESIA TUMORALA SI

CHIMIO-PREVENTIE”

TEMA I: “EVALUAREA EFECTULUI ANTI-TUMORAL AL UNOR COMPLECSI

METALICI IN CANCERUL DE COLON” (Director proiect Dr. Mirela Mihaila, CSIII)

Obiectivul general al proiectului: Studiul isi propune investigarea la nivel celular si molecular, pe

linii celulare tumorale umane de colon standardizate a unor complecsi metalici (cu ioni de ruteniu

sau lantanide) in vederea evaluarii potentialului lor terapeutic. Proiectul isi propune testarea in vitro

a efectului biologic al acestor compusi metalici asupra proliferarii tumorale, apoptozei si progresiei

prin fazele ciclului celular, comparativ cu citostatice clasice ce contin ioni metalici (cisplatin,

oxaliplatin).

Faza I: Activitatea biologica prin modularea apoptozei si fazelor ciclului celular in linii

celulare tumorale de colon.

Faza II: Modularea expresiei moleculelor asociate apoptozei celulelor tumorale de colon de

catre compusii metalici.

9

Cancerul colorectal este al treilea dintre cele mai comune tipuri de cancere umane din lume si

implica o serie de evenimente complexe cum ar fi modificarile genetice, progresia aberanta de

modificari ale ciclului celular, inducerea angiogenezei, inhibarea apoptozei si modificarea adeziunii

celulare. Utilizarea clinica a cisplatinului si a analogilor acestuia poate fi limitata de rezistenta

tumorii la medicamente si efectele adverse, prin urmare compusii de ruteniu (RuIII), ar putea fi luati

in considerare ca medicamente alternative. Metalele sunt componente celulare esentiale pentru

organismele vii si in conditii normale sunt strict reglementate. Complexele sintetizate au devenit

probe atractive ca potentiali agenti anticancerigeni, dar absorbtia, toxicitatea si rezistenta la metalo-

droguri, trebuie studiate inainte de utilizarea clinica. Studiile sunt orientate spre gasirea unor agenti

antitumorali non-chimioterapeutici pe baza de metale tranzitionale, mai activi si mai putin toxici.

Faza I: Activitatea biologica prin modularea apoptozei si fazelor ciclului celular in linii

celulare tumorale de colon.

Activitatile fazei I s-au axat pe evaluarea efectului biologic al tratamentelor liniei celulare de

adenocarcinom de colon LoVo cu compusi de ruteniu (Ru-enro, Ru-cipro, Ru-enoxa, Ru-pip).

Astfel, s-a urmarit evaluarea proliferarii prin analiza fazelor ciclului celular si a evenimentelor

apoptotice, utilizand cisplatinul drept substanta de referinta.

Efectele tratamentului cu Cis-Pt sau cu compusii cu ruteniu asupra procesului apoptotic s-au

determinat prin tehnica dublei marcari cu anexina V si iodura de propidiu (PI), utilizand Apoptosis

Kit (Becton Dickinson) urmata de achizitia datelor si analiza prin citometrie in flux, utilizand

citometrul in flux FACSCantoII si Diva 6.1 software.

Evaluarea potentialului apoptotic

Substanta Apoptoza

timpurie (%)

Apoptoza tarzie /

secundara (%)

Apoptoza

totala (%)

NT 6.89 9.11 16

Cis-Pt (10 uM) 9.83 17.38 27.21

Cis-Pt (50 uM) 15.22 22.31 37.53

Ru-enro (10 uM) 63.28 1.95 65.23

Ru-enro (50 uM) 83.52 3.94 87.46

Ru-cipro (10 uM) 65.90 3.37 69.27

Ru-cipro (50 uM) 71.99 4.88 76.87

Ru-enoxa (10 uM) 75.00 3.59 78.59

10

Ru-enoxa (50 uM) 69.64 5.51 75.15

Ru-pip (10 uM) 58.24 12.57 70.81

Ru-pip (50 uM) 69.50 2.55 72.05

In urma tratamentelor cu compusi de ruteniu (Ru-enro, Ru-cipro, Ru-enoxa, Ru-pip) la cele doua

concentratii (10 uM / 50 uM), se observa o crestere semnificativa a apoptozei totale, comparativ cu

celulele tratate cu Cis-Pt (27.21% / 37.53%).

Pentru analiza fazelor ciclului celular, celulele au fost tratate cu RNaza bovina, urmata de iodura de

propidiu (PI), achizitia datelor si analiza prin citometrie in flux, folosind programul MODFIT.

Efectele tratamentului cu Cis-Pt sau cu compusii cu ruteniu asupra progresiei ADN fazele ciclului

celular s-au determinat prin tehnica marcarii cu iodura de propidiu (PI), urmata de analiza prin

citometrie in flux.

Distributia procentuala a nucleilor celulelor LoVo in fazele ciclului celular

Substanta Go/G1 (%) S (%) G2/M (%)

NT 22.74 57.99 19.26

Cis-Pt (10 uM) 18.30 60.38 21.32

Cis-Pt (50 uM) 20.24 63.75 16.01

Ru-enro (10 uM) 23.62 56.73 19.66

Ru-enro (50 uM) 28.91 51.05 20.04

Ru-cipro (10 uM) 22.23 62.69 15.08

Ru-cipro (50 uM) 23.35 59.09 17.56

Ru-enoxa (10 uM) 23.51 64.55 11.94

Ru-enoxa (50 uM) 24.19 60.22 15.59

Ru-pip (10 uM) 10.81 46.96 42.23

Ru-pip (50 uM) 1.80 58.32 39.88

Datele obtinute efectuate pe celule tumorale LoVo tratate cu complexe de Ru(III), au aratat o

proliferare a celulelor diminuata, niveluri crescute de apoptoza si procente scazute de nuclei in faza

S a ciclului celular.

11

Faza II: Modularea expresiei moleculelor asociate apoptozei celulelor tumorale de colon de

catre compusii metalici

Avand in vedere ca tratamentele cu compusi de Ruteniu (III) sau Cisplatin efectuate, influenteaza

procesul apoptotic, nivelul apoptozei poate fi corelat si cu expresia genica a moleculelor implicate,

cum ar fi p53 (molecula pro-apoptotica) sau Bcl-2 (molecula anti-apoptotica), prin RT-PCR efectuat

in sistem TaqMan.

Analizele statistice au aratat corelatii semnificative intre expresia genica a moleculelor pro-

apoptotice p53, anti-apoptotice Bcl-2 si nivelele de apoptoza in celulele tratate cu compusii noi de

Ru(III). Bazandu-se pe interfata dintre biologia moleculara si chimia bio-anorganica, complecsii de

Ru(III) ar putea fi utilizati in viitor ca agenti anticancerigeni in cazul tumorilor rezistente la

tratamentul cu Cisplatin.

Personal implicat: Dr. Mirela Mihaila (director proiect), drd. Mia Camelia Hotnog dr. Lorelei Irina

Brasoveanu, dr. Marinela Bostan, dr. Viviana Roman, asist. Elena Nicolae, lab. Aneta Doncea

(colaboratori interni)

Diseminare:

1. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Viviana Roman, Marinela Bostan, Valentina Uivarosi, Lorelei I.

Brasoveanu, “Novel ruthenium (III) complexes with co-solvents as potential anti-cancer agents in

colon cancer therapy”, Vol rez. pg. 82-83 (romana), 156-157 (engleza), A 47-a Conferinta Anuala

de Imunologie (cu participare internationala), Bucuresti, 4 - 6 octombrie 2017.

12

2. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Marinela Bostan, Valentina Uivarosi, Lorelei I. Brasoveanu,

“Biological activity of novel ruthenium (III) complexes with co-solvents”, Vol rez. pg. 103-106, Al

XI-lea Congres National de Citometrie (cu participare internationala), Bucuresti, 19 - 21 octombrie

2017.

3. Mirela Mihaila, Camelia Hotnog, Viviana Roman, Marinela Bostan, Valentina Uivarosi, Lorelei I.

Brasoveanu, “Evaluation of anti-tumor activity of ruthenium (III) complexes with co-solvents

through modern techniques”, Conferinta Institutului Regional de Oncologie Iasi (cu participare

internationala), Iasi, 23 - 26 noiembrie 2017.

TEMA II: „MODULAREA APOPTOZEI IN CELULELE LEUCEMICE UMANE”

(Director proiect Dr. Viviana Roman, CS II)

Obiectivul general al proiectului: Urmarirea succesiunii de evenimente ce au loc in urma

declansarii fenomenului de apoptoza in celulele leucemice umane.

Faza I: Receptori de suprafata si proteine implicate in apoptoza.

Faza II: Corelatii intre expresia receptorilor de suprafata si proteine implicate in fenomenul de

apoptoza.

Faza I: Receptori de suprafata si proteine implicate in apoptoza.

Rezistenta la chimioterapie este o problema majora si, in acelasi timp, un factor limitant al

tratamentului neoplazic. Initial, tumorile raspund la tratament, dar apoi unele devin rezistente la

medicamente, fie dupa prima doza de tratament, fie dupa prima recadere, pana cand, inevitabil,

concentratia citostaticelor nu mai poate fi suportata de pacient. In ambele cazuri, tratamentul poate

ajunge sa fie mai destabilizant decat boala in sine. Din acest motiv, incercarile curente de a

imbunatati supravietuirea pacientilor cu cancer vor trebui sa includa strategii care sa tinteasca in

mod specific rezistenta celulelor tumorale.

Calea apoptotica poate fi initiata in doua moduri : prin receptorii familiei TNF (“tumor

necrosis factor”) sau prin calea mitocondriei, ambele cai conducand la activarea cascadei caspazelor,

in final caspazele efectoare determinand fragmentarea ADN si moartea celulara. Stimularea

receptorilor din superfamilia TNF (ex: CD95/APO-1/Fas, TRAIL/Apo-2l/TNF-related apoptosis

inducing ligand) are ca rezultat activarea caspazei 8, care, in mod direct, activeaza caspazele

efectoare. Calea mitocondriala este initiata de o serie de proteine capabile sa induca direct

13

programul apoptotic de moarte celulara. In mod normal, acesti factori se gasesc in spatiul

intermembranar mitocondrial. Ca raspuns la diversi stimuli apoptotici aceste proteine (citocromul c,

APAF -1 (apoptotic actvator factor-1), Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of

caspases)) sunt eliberate in citosol si/sau translocate spre nucleu (AIF, apoptosis-inducing factor).

Dereglarea mecanismului normal de moarte celulara ofera celulelor tumorale un avantaj prin

faptul ca pot sa-si mareasca numarul si astfel sa strice balanta homeostatica. Prin faptul ca sunt

exprimati pe suprafata membranei celulare, activarea receptorilor din familia TNF poate determina

un mecanism specific de inducere a apoptozei in diverse celule tumorale. Reglarea apoptozei prin

receptorii TRAIL este, in parte controlata de nivelurile de expresie ale receptorilor TRAIL-R1/DR4,

TRAIL-R2/DR5 si de cele ale receptorilor “capcana” (decoy receptors) TRAIL-R3/TRID si TRAIL-

R4/TRUNDD. In privinta nivelurilor de expresie a receptorilor TRAIL in celulele tumorale,

literatura de specialitate este foarte contradictorie. Se considera insa in mare, ca nivelurile de

expresie DR4 si DR5 sunt similare in tesuturile normale si in cele tumorale, iar in multe din cazuri

expresia receptorului TRAIL-R3/TRID este corelata cu rezistenta la apoptoza mediata de TRAIL

In Faza I a acestei teme a avut loc determinarea nivelurilor de expresie a receptorilor TRAIL pe o

serie de linii celulare tumorale.

Determinarea expresiei receptorilor TRAIL pe limfocitele din singele periferic recoltat de la

pacienti cu leucemii s-a facut prin imunofluorescenta indirecta cu anticorpi specifici anti-TRAIL

R1-R4, urmata de citometria in flux. Valorile nivelurilor de expresie a receptorilor TRAIL au fost

exprimate atat prin procente(%) de celule pozitive cat si prin media intensitatii fluorescentei (MIF).

Prin analiza in citometrie in flux a limfocitelor, nivelurile expresiei receptorilor TRAIL sunt

aproape identice intre primii trei receptori si foarte asemanatoare cu valorile obtinute pentru

controlul de izotip. In schimb, valoarea pentru TRAIL-R4 este marita, fiind in concordanta cu

literatura de specialitate cu privire la expresia acestui receptor pe supafata celulelor normale si la

rolul sau de receptor “capcana” fata de actiunea proapoptotica a TRAIL.

Faza II: Corelatii intre expresia receptorilor de suprafata si proteine implicate in fenomenul de

apoptoza.

In apoptoza indusa pe calea receptorilor familiei TNF de pe suprafata celulelor tumorale, asa

cum este TRAIL/Apo-2L, declansarea apoptozei are loc prin legarea la receptorii transmembranari

DR4 (TRAIL-R1) sau DR5 (TRAIL-R2). Oligomerizarea celor doi receptori conduce la recrutarea

adaptorului FADD (Fas-associated death domain), activarea caspazei 8 si formarea complexului

14

DISC (death-induced signaling complex). La acest nivel procesul poate fi inhibat de catre cFLIP

(FLICE inhibitory protein) care competitioneaza cu FADD pentru situsul de legare a caspazei 8,

care o data stimulata poate hidroliza diferite caspaze efectoare (caspazele 3, 6 si 7) ce devin active.

Acestea pot sa hidrolizeze la randul lor alte substrate, cum ar fi ICAD (inhibitorul proteinei

CAD,caspaze-activated DN-ase) pe care-l elibereaza din complexul inactiv, permitandu-i sa migreze

la nucleu si sa produca fragmentarea internucleozomala a ADN.

Mitocondria joaca un rol important in cadrul evenimentelor ce urmeaza declansarii

fenomenului de apoptoza si anume eliberarea factorilor proapoptotici citocrom c, Smac sau a celor

proteine proapoptotice din familia Bcl-2 (Bax, Bak, Bid). Activarea apoptozei prin calea extrinseca

(ex: TRAIL) poate conduce, direct sau indirect, la modularea expresiei unora din aceste proteine

care controleaza permeabilitatea membranei mitocondriale sau eliberarea proteinelor proapoptotice

mitocondriale pe parcursul fenomenului de apoptoza. In afara membrilor familiei Bcl-2,

activitatea caspazica este reglata si de familia de proteine IAP (inhibitor of apoptosis proteins,

XIAP, c-IAP1, c-IAP2, survivin), caracterizate de unul sau mai multe domenii BIR (baculovirus

IAP repeats) care determina inhibarea familiei caspazelor.

In aceasta etapa s-a determinat prin diverse tehnici efectul tratarii celulelor leucemice cu

TRAIL si eliberarea unor proteine pro sau antiapoptotice. Studiul cinetic a aratat ca exista o crestere

semnificativa a nivelurilor de expresie a citocromului c si a proteinei Smac functie de timpul de

incubare; in cazul survivin si Bcl-2 se constata insa o diminuare a nivelului de expresie dependenta

de timp.

Din cercetarile facute pana acum si avand in vedere si marele beneficiu de a nu fi toxic, se

pare ca utilizarea TRAIL in terapia cancerului, atat singur sau in diverse combinatii

chimioterapeutice, pare a fi o cale lipsita de riscuri ced ar putea deveni o noua abordare de

reintroducere a mortii celulare programate in acele celule tumorale in care acest fenomen a suferit

dereglari majore.

Personal implicat: Dr. Viviana Roman (Director proiect), Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, Dr.

Marinela Bostan, Drd. Camelia Hotnog, Dr. Mirela Mihaila, asist. Elena Nicolae, lab. Doncea Aneta

(colaboratori interni)

15

TEMA III: „MODULAREA GENERARII SPECIILOR REACTIVE DE OXIGEN DE UNII

COMPUSI NATURALI SI STABILIREA IMPLICARII LOR IN APOPTOZA CELULELOR

TUMORALE” (Director proiect Dr. Marinela Bostan, CSIII)

Obiectivul general al proiectului: Stabilirea modului in care procesele de generare a speciilor

reactive de oxigen ar putea influenta mecanismele implicate in modularea procesului de apoptoza in

celulele tumorale. Se vor utiliza metode moderne de citometrie de flux, chemiluminescenta si

spectrofotometrie. Rezultatele obținute ar putea asigura suportul dezvoltării unor noi direcții

terapeutice în scopul creșterii ratei de supraviețuire a bolnavilor de cancer.

Faza I: Studiul citotoxicitatii induse de compuși naturali asupra viabilitatii si a

proceselor de proliferare in culturi celulare tumorale.

Faza II: Analiza eliberarii speciilor reactive de oxigen indusa de unii compusi naturali si

analiza implicarii lor in procesul de apoptoza in celulele tumorale.

Faza I: Studiul citotoxicitatii induse de compuși naturali asupra viabilitatii si a

proceselor de proliferare in culturi celulare tumorale.

Studiul s-a realizat pe liniile celulare tumorale ORL FaDu si PE/CA-PJ49, precum și pe o

linie celulara martor de celule endoteliale imortalizate, HUVEC. Celulele au fost tratate cu cisplatin

si/sau resveratrol sau curcumina pentru diferite perioade de timp, iar rezultatele obtinute prin analiza

spectrofotometrica a aratat ca tratamentul cu CisPt a determinat o scădere a indicelui de proliferare

(IP) în funcție de doza, dar și de timp. Valoarea IP obținut în cazul celulelor PE/CA-PJ49 este mai

mică decât valoarea IP a celulelor FaDu, ceea ce demonstrează un raspuns ușor diferit al celor doua

tipuri de linii celulare tumorale. În cazul tratamentului cu resveratrol RSV (50uM) s-a inregistrat o

scădere a indicelui de proliferare (IP) în ambele linii celulare tumorale, fara insa a fi afectat

semnificativ IP inregistrat la celulele liniei martor HUVEC. De asemenea, analiza comparativă a IP

a aratat că tratamentul cu RSV influenteaza procesul de proliferare mai puțin decât tratamentul cu

CisPt în toate liniile utilizate. Aplicarea tratamentului concomitent CisPt + RSV a condus la o

scădere mai accentuată a IP în cazul liniilor tumorale atât la 24h după tratament, dar mai ales la 48h.

Aceste date arată că RSV poate potența efectul indus de CisPt, ceea ce determina o scadere

semnificativa a procesului proliferativ al celulelor tumorale .

In incercarea de a crește eficienta tratamentului cu CisPt si de a reduce efectele secundare

care apar ca urmare a tratamentului cu cisplatin la pacientii cu cancer al sferei ORL culturile celulare

16

au fost tratate cu un alt compus natural, curcumina (CRM) in concentratii diferite si pentru perioade

diferite de timp. Analiza datelor obtinute a permis alegerea concentratiei de lucru – 15uM, si

evaluarea modului in care CRM influențează procesul de proliferare al celulelor tumorale sau a

celulelor liniei martor HUVEC. În cazul tratamentului concomitent CisPt si/sau CRM se observă că

la celulele FaDu procesul de proliferare este mult redus, în timp ce proliferarea celulelor tumorale

PE/CA-PJ49 este mai putin afectata. Analizate comparativ datele obținute au condus la concluzia ca

RSV și CRM în concentrațiile alese au capacitatea de a inhiba procesul proliferativ și pot potența

efectul indus de tratamentul cu CisPt în celulele tumorale. De asemenea, se observă că RSV

influențează mai mult capacitatea proliferativă a celulelor din linia PE/CA-PJ49 decât pe cea a

celulelor tumorale FaDu, în timp ce CRM inhibă mai ales proliferarea celulelor FaDu. Efectele

induse de tratamentul cu RSV sau CRM asupra celulelor liniei martor HUVEC determină o reducere

a IP, dar mult mai mică decât în cazul liniilor tumorale.

Datele obtinute au condus la urmatoarele concluzii:

- CisPt a determinat o scădere a procesului de proliferare în funcție de doza dar și de timp atât în

cazul liniilor celulare tumorale FaDu si PE/CA-PJ49. Valorile obținute arată că celulele liniei

PE/CA-PJ49 răspund mai bine la tratamentul cu CisPt.

- RSV reduce capacitatea proliferativă a celulelor din linia PE/CA-PJ49 mai mult decât pe cea a

celulelor tumorale FaDu, în timp ce CRM inhibă mai ales proliferarea celulelor FaDu.

- Tratamentul combinat CisPt și/sau RSV,CRM a condus la o scădere accentuată a procesului de

proliferare în liniile tumorale atât la 24 h după tratament dar mai ales la 48 h. Aceste date arată că

RSV si CRM pot potența efectul indus de CisPt asupra procesului proliferativ al celulelor tumorale.

Faza II: Analiza eliberarii speciilor reactive de oxigen indusa de unii compusi naturali si

analiza implicarii lor in procesul de apoptoza in celulele tumorale.

Ca urmare a metabolismului celular normal sunt produse speciile reactive de oxigen (SRO), care au

un rol dual, deoarece acestea pot sa exercite un efect dăunătoar sau benefic pentru sistemelor vii.

SRO la concentrații scăzute sau moderate induc efecte benefice, cum ar fi apărarea împotriva

agenților infecțioși și activarea unui număr de sisteme de semnalizare celulară sau inducerea unui

răspuns mitogenic, in timp ce la concentratii mari asociate cu o deficiență a productiei de

antioxidanți pe cale enzimatica și/sau neenzimatica apare efectul nociv al radicalilor liberi care

cauzează daune biologice si care este cunoscut sub denumirea de stres oxidativ. SRO produse in

exces pot deteriora lipidele celulare, proteinele , sau acizii nucleici conducand la inhibarea funcțiilor

17

celulare normale. Din acest motiv, se considera ca stresul oxidativ este implicat în aparitia si

evolutia cancerului.

Cu ajutorul metodei chemiluminescentei amplificate cu luminol am analizat procesul de generare a

SRO atât în cazul liniilor celulare tumorale FaDu si PE/CA-PJ49, cat si in celulele martor HUVEC

tratate cu cisplatin in prezenta sau absenta unor compusi naturali (RSV si CRM). Datele obtinute

arata ca tratamentul cu CisPt induce generarea SRO atat in celulele tumorale, cat si in celulele

martor. RSV sau CRM aplicate in mod singular determina o eliberare a SRO mai ales in celulele

tumorale FaDu si PE/CA-PJ49 si influenteaza mai putin celulele martor HUVEC.

Aplicarea concomitenta a tratamentului cu CisPt + RSV sau CisPt + CRM a amplificat procesul de

generare al SRO in ambele linii tumorale FaDu si PE/CA-PJ49 si a indus o usoara crestere a

eliberarii SRO de catre celulele martor HUVEC. Analiza comparativa a efectului indus de cei doi

compusi naturali asupra generarii SRO de catre celulele tumorale au aratat ca CRM amplifica de 5x

eliberarea SRO in celulele tumorale FaDu si de 9x in celulele tumorale PE/CA-PJ49.

In paralele s-a analizat procesul apoptotic indus de tratamentul cu CisPt + RSV sau CisPt + CRM in

liniile celulare tumorale si s-a observat ca atat RSV, dar mai ales CRM au capacitatea de a creste

semnificativ numarul celulelor care intra in apoptoza, amplificand efectul indus de tratamentul

singular cu CisPt in liniile tumorale. In concluzie, compusii naturali luati in studiu determina o

activare a eliberarii SRO care se coreleaza cu cresterea apoptozei in celulele tumorale analizate, ceea

ce incurajeaza utilizarea acestor compusi ca posibili adjuvanti in terapia anti tumorala.

Personal implicat: Dr. Marinela Bostan (Director proiect), Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, Dr.

Viviana Roman, Dr. Mirela Mihaila, Drd. Camelia Hotnog, As. Nicolae Elena, lab. Aneta Doncea,

(colaboratori interni)

Diseminarea rezultatelor:

Georgiana Gabriela Petrică-Matei, Viviana Roman, Mirela Mihăilă, Camelia Mia Hotnog, Lorelei I.

Brașoveanu, Marinela Bostan. Role of p38-mitogen-activated protein kinase in modulation of the

response to therapy in FaDu human pharyngeal carcinoma cell line. Romanian Biotechnological

Letters Journal, 2017, https://doi.org/10.26327/RBL2017.06 (IF=0,404).

Coordonator Centrul de Imunologie,

Dr. Lorelei Irina Brasoveanu, CSI

18