214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

download 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

of 61

  • date post

    26-Feb-2018
  • Category

    Documents

  • view

    214
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    1/61

    Metode moderne decontrol microbiologic

    al alimentelorSuport Curs Masterat Anul I

    Titular curs: Conf. dr. Marcel Avramiuc

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    2/61

    2

    Metodele de evaluare a populaiilor microbiene

    Metode dir ecte, care permit evaluarea concentraiei de celule sau a biomasei;

    Metode indirecte, n care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat n

    corelaie cu coninutul de biomas (turbiditatea mediului cultivat, fluorescena,

    impedana);

    Metode culturale, care necesit o perioad de incubare pentru creterea

    coloniilor i stabilirea rezultatului analizei;

    Metode automatizate, "on line", care permit analiza direct a probelor din

    fermentator, sau metode care necesit prelevarea aseptic de probe pentru analiz.

    Tehnici de diluare

    Seri i li niare, n care concentraia de microorganisme descrete n progresie

    aritmetic (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) i care sunt puin utilizate;

    Seri i logartmice (diluii decimale), n care concentraia de microorganisme

    descrete n progresie geometric (ex. 0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.).

    Pentru realizarea diluiilor decimale, ntr-un numr de eprubete sterile egal cu

    numrul de diluii necesar a se efectua, se pipeteaz aseptic 9 cm3de lichid de diluie (ser

    fiziologic steril, ap distilat steril, mediu Ringer - pentruEscherichia coli).

    Tehnici de concentrare

    Sunt utilizate n special pentru punerea n eviden a microorganismelor

    patogene;

    Metode de mbogire, care presupun inocularea probei de analiz ntr-un mediufavorabil pentru multiplicarea rapid a celulelor aflate n concentraii reduse n proba de

    analizat i, dup termostatare n condiii optime de cultivare, se verific prezena sau

    absena microorganismelor analizate, cu sau fr o determinare efectiv a concentraiei

    de celule;

    Metode de separare fizic sau fizico-chimic a celulelor prin filtrare,

    centrifugare, floculare, sedimentare, n care se determin concentrarea celulelor pe

    unitatea de volum, ceea ce asigur posibilitatea evidenierii lor ulterioare prin tehnici

    directe sau culturale;

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    3/61

    3

    Metode de separare prin interaciuni hidrofobe-hidrofile, interaciuni ale

    sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

    I. TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE DIRECT A

    NUMRULUI DE MICROORGANISME

    Estimarea electronic a numrului de microorganisme

    Aparatul de tip Coulter

    funcioneaz dup urmtorul

    principiu:

    De o parte i de alta a unuitub prevzut cu un orificiu calibrat

    sunt dispui doi electrozi de platin

    imersai ntr-un electrolit, ale cror

    borne sunt conectate la tensiune

    continu.

    Prin aspiraia provocat la

    partea superioar a tubului, celulele

    aflate n exteriorul tubului trec pe rnd prin orificiu i deplaseaz o dat cu fiecare pasaj

    un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoac o cretere tranzitorie a

    rezistenei circuitului, ceea ce genereaz un impuls electric a crui amplitudine este

    proporional cu volumul celulei.

    Impulsurile fiind de foarte scurt durat, aparatul permite numrarea unui numr

    mare de celule, una cte una, ntr-un timp foarte scurt.

    Este posibil i o clasificare a celulelor n funcie de de volumul lor.

    Aceast tehnic, dei sofisticat, este considerat extrem de interesant i se aplic

    cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realiznd simultan cu numrarea i

    dimensionarea celulelor.

    Rezultatele sunt reproductibile cnd se utilizeaz suspensii diluate de celule;

    Sarcina electric a celulelor poate influena analiza conducnd la obinerea de

    rezultate eronate;

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    4/61

    4

    Aceast tehnic nu se poate aplica n cazul culturilor ce conin n suspensie, alturi

    de celulele microorganismului cultivat, i particule solide.

    Citometrie n flux

    Permite numrarea i aprecierea strii fiziologice a celulelor, cnd detecia se

    face prin msurarea fluorescentei emise de celulele n prealabil marcate cu un colorant

    (fluorocrom).

    Dup colorare, celulele sunt antrenate printr-un orificiu ngust i trec una cte

    una prin faa unei surse luminoase.

    Fluorescenta emis de fiecare microorganism este captat printr-un

    fotomultiplicator i analizat. Rezultatele sunt traduse pe o histogram care red numrulde evenimente n funcie de intensitatea fluorescentei. Aceast histogram traduce deci

    un profil al populaiei.

    Adesea markerii colorani utilizai pot oferi diferite tipuri de rspunsuri:

    Dac colorantul este un marker de viabilitate, din histogram se deduce numrul

    de celule viabile i stareafiziologic a populaiei.

    Dac histograma cuprinde net dou picuri este posibil numrarea separat amicroorganismelor dintr-o cultur mixt (de exemplu, streptococi i lactobacili).

    Dac markerul este un anticorp se pot numra specific anumite microorganisme

    dintr-o populaie heterogen.

    Principiul de funcionare al citometrului n flux:a, bexemple de sisteme de deteciec

    diagram de repartiie a dimensiunilor

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    5/61

    5

    Tehnica de microscopie n fluorescen i imunofluorescen

    Tehnica de microscopie n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru

    diferenierea celulelor vii de cele moarte.

    Prin suspensionarea celulelor de drojdie n soluie diluat de albastru de metilen

    cu citrat n preparat microscopic se vor putea diferenia celulele vii (incolore) de cele

    moarte (colorate n albastru).

    n mod similar, pot fi difereniate bacteriile vii de cele moarte dup colorare cu

    acridin oranj.

    Tehnica de microscopie n imunofluorescenpermite detectarea unei categorii

    particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.

    Tehnica DEFTDirect Epifluorescent Filter Technique

    Cupleaz filtrarea prin membrane cu colorarea vital a celulelor. Se aplic n

    cazul analizei microbiologice a produselor lichide (bere, vin, lapte).

    Numrarea se realizeaz prin studiu microscopic, dup filtrarea produsului prin

    membran (sau diluarea sa) i colorarea vital a celulelor.

    Procedeul este rapid (10-20 min) i sensibil. Limita de detecie este de 104

    microorganisme/cm3, utiliznd volume de probe de 100 cm3.

    Numrarea se poate realiza cu un microscop optic obinuit dup colorare cu

    albastru de metilen, albastru Loeffler sau amestec fucsin-albastru de metilen.

    Rezultate mai bune se obin cnd numrarea se realizeaz cu un microscop cu

    fluorescent sub lumin UV. n acest caz se utilizeaz colorani fluoresceni

    (fluoresceina, primulina, auramina, acridin oranj, galben de acridin, acriflavina) cepermit studiul la grosismente mici cu evidenierea celulelor vii i a celor moarte.

    II. TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A

    NUMRULUI DE MICROORGANISME

    A.metode de cul ti vare pe medii dense(metoda cultural Koch);

    B. metode de cultivare n medii lichide (metoda titrului - metoda tuburilormultiple; metoda diluiilor limit).

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    6/61

    6

    Dezavantaje: volum mare de munc, sunt necesare ustensile sterile i medii de

    cultur adecvate, iar rezultatul analizei se obine dup un timp de termostatare necesar

    dezvoltrii i multiplicrii celulelor, difereniat n funcie de natura microorganismelor (n

    general: 3-5 zile/25...28C -pentru fungi; 2 zile/37C - pentru bacterii aerobe mezofile).

    A. Numrarea microorganismelor prin cultivare pe medii dense

    Const n inocularea unui volum cunoscut din suspensia de celule pe medii de

    cultur solidificate, n plci Petri i, dup o perioad de cultivare n condiii optime, se

    numr coloniile formate.

    Rezultatul se exprim n:

    numr de microorganisme [N/cm3sau g] - n cazul microorganismelor care prezint

    celule individuale, neasociate;

    uniti formatoare de colonii (ufc) [ufc/cm3sau g]n cazul microorganismelor la

    care celulele formeaz asociaii (lanuri, pachete, pseudomiceliu).

    Tehnici de cultivare i numrare a microorganismelor: a - prin

    filtrare; b - prin diluare (sau inoculare n volume mari)

  • 7/25/2019 214716732 Curs Metode Moderne de Control Microbiologic Al Alimentelor 1

    7/61

    7

    A. 1. Tehnica clasic de numrare prin cultivare pe medii dense,

    n plci Petri

    Metodologia de analiz presupune adoptarea a dou modaliti de inoculare a

    celulelor n/pe mediul de cultur solidificat, n plci Petri, i anume:

    a. inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se

    transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se

    repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidificat

    i temperat la 40...45C. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri

    orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii

    optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia.

    Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ

    anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul

    microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup

    nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un