12324edSuport LP Imunologie 2015-2016

7/24/2019 12324edSuport LP Imunologie 2015-2016

1/60

UMF Carol Davila Bucureti Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie

Facultatea de Medicin Dentar Anul de studii: III

2015-2016 1

SUPORT PENTRU LUCRRILE PRACTICE

DE IMUNOLOGIE

CAPITOLUL 1. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN

Imunologia este tiina biomedical ce studiaz funcia de aprare a organismuluiibolile produse prin dereglarea sistemului imun:

Alergia = rspunsul imun fa deun alergen (ex: astmul bronic)

Autoimunitatea = rspuns anti-self (ex: screloza multipl)

Rejecia grefei = rspunsul imun fa de esutul transplantat

Imunodeficiena = rspunsul imun deficitar (ex: SIDA)

Imunologia clinic urmrete:

Imunosupresia = tratamentul bolilor autoimune

Imunostimularea = intervenii imunoterapeutice (ex: vaccinuri)

Sistemul imun asigur aprarea organismului fa de:

Agresorii externi de natur biologic: bacterii, virusuri, parazii, fungi, celule strine

Propriile molecule sau celule modificate, cum sunt celulele infectate i celuleleneoplazice

Celulele sistemului imun

Celulele sistemului imun sunt distribuite difuz n tot organismul:

La porile de intrare: tegumente i mucoase bucal, respiratorie, digestiv,genital

n interstiiul organelor interne: ficat, plmni, rinichi


2/60



2015-2016 2

n sistemul circulator: snge i limf n cavitile seroase: pleur, peritoneu, pericard n sistemul nervos centralExist structuri specializate, aflate n organele limfoide, care au roluri eseniale

pentru buna funcionare a sistemului imun.

Organele limfoide sunt:

organe limfoide primare (centrale) - n care se formeaz leucocitele i sematureaz limfocitele: mduva hematogen i timusul; la adult, mduvahematogen este sursa tuturor leucocitelor din organism

organe limfoide secundare (periferice) - organele care capteaz ageniipatogeni i unde exist un mediu favorabil interaciunii ntre acetia i limfocite:ganglionii limfatici, splina, esutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucousassociated lymphoid tissue), esutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin

associated lymphoid tissue)

Principalele celulele efectoareale sistemului nnscutsunt polimorfonuclearele(n special cele neutrofile), macrofagele(MF) i celulele natural killer(NK). Macrofagelei polimorfonuclearele sunt celule fagocitare. Celulele NK au activitate mpotriva celulelorproprii infectate viral i celulelor tumorale.

Limfocitelesunt celulele eseniale pentru sistemul adaptativ.Limfocitele recunosc specific antigenele pentru c au pe suprafa receptori cu

structuri complexe. Un limfocit prezint pe membran un anumit tip de receptor carerecunoate o singur structur antigenic. Nu exist limfocite care s recunoasc mai multetipuri de antigene.

Organismul vine n contact n timpul vieii cu un numr foarte mare de antigenediferite, de ordinul milioanelor, astfel c este necesar existena unui numr foarte mare desubpopulaii limfocitare care s aib pe suprafa o varietate la fel de mare de recep tori.Practic, n organism exist zeci de milioane de subpopulaii limfocitare, care difer prinstructura receptorilor de recunoatere a antigenelor.

O subpopulaie de limfocite are pe suprafa acelai tip de receptor pentru antigen ideci recunoate acelai antigen. Aceast subpopulaie sau familie rezult dintr -o singur

celul mam i se numete clon de limfocite. O clon de limfocite cuprinde un numrfoarte mare de limfocite identice. Diferenierea clonelor se face prin reorganizareaaleatorie a genelor care codific structura proteic a receptorilor pentru antigen.

Astfel, rspunsul imun antigen specific este asigurat de: LB, LT i APC (antigenpresenting cells), iar rspunsul imun antigen nespecific de: MF, neutrofile, NK.


3/60



2015-2016 3

Celulele APCse mpart n: profesioniste a cror funcie principal este procesarea i prezentarea

antigenelor ctre LT helper: MF, celule dendritice i LB ocazionalecare, n anumite condiii, sub influena unor citokine exprim pe

suprafa MHC II: fibroblaste, celule gliale, celule pancreatice, celule epitelialetimice itiroidiene, celule endoteliale

APC sunt celule cu rol esenial n generarea RIU i RIC fa de antigeneletimodependente, care sunt cele mai frecvente n natur. APC sunt singurele celule care potrecunoate antigenele timodependente n form nativ. APC prelucreaz aceste antigene,selecteaz cele mai imunogene fragmente i le prezint limfocitelor.

Efectele sistemului imunEfectele sistemului imun sunt pozitive, prin protecie mpotriva structurilor non-

self i eliminarea selfului alterat. Efectele negative sunt date de disconfortul generat desindromul inflamator i afectarea selfului (autoimunitatea).

Inflamaiaeste o reacie nespecific de aprare a organismului, cu caracter local saugeneral, n funcie de severitatea i de ntinderea leziunilor produse de factorii patogeni.Cnd factorul patogen are o intensitate mic sau moderat, reacia inflamatorie este unproces local. Dac el are intensitate mare i produce leziuni tisulare importante , se

activeaz mecanismele de aprare din ntregul organism i apare reacia sistemicpostagresiv (RSPA).

Reacia inflamatorie se declaneaz cnd agenii patogeni au o intensitate suficientde mare pentru a produce leziuni tisulare.

Din punct de vedere morfopatologic inflamaia cuprinde fenomene alterative ireacionale. Fenomenele reacionale sunt de tip vascular-exudativ i proliferativ (dereparaie).

Starea de disconfort a pacientului este dat de vasodilataie i cretereapermeabilitii capilare. n acest fel, histamina particip la formarea exudatului inflamator,

manifestat prin semnele clinice: tumor, rubor, calor. Hiperemia explic dou din semneleclinice de baz ale inflamaiei: roeaa zonei inflamate (rubor) i creterea temperaturiilocale (calor). Acidoza din focarul inflamator stimuleaz n exces terminaiile nervoaselibere (TNL), declannd senzaia dureroas (dolor).


4/60



2015-2016 4

Tipuri de rspuns imun

IMUNITATEA NESPECIFIC( NNSCUT)

IMUNITATEA SPECIFIC(DOBNDIT)

- Antigen independent- Fr timp de laten- Nu este antigen specific- Nu apare memoria imunologic

- Antigen dependent- Cu timp de laten- Antigen specific- Apare memoria imunologic

BARIERE FIZICE

- Piele

- Mucoasa intestinal- Mucoasa respiratorie

- Nu are

FACTORI SOLUBILI- Secreii proteice i neproteice - Ig (Ac)

CELULE

- Fagocite

- Celule NK

- Eozinofile

- LT

- LB

Celulele fagocitare

A. NEUTROFILELE

Neutrofilele provin din mduva hematogen, din celula su comun pentrumonocite i granulocite GM-CFU. Din seria granulocitar se difereniaz neutrofilele (peste90%), eozinofilele i bazofilele.

Neutrofilele triesc n snge sub 24h, chiar dac nu extravazeaz spre un focarinflamator. Aproximativ jumtate din ele se deplaseaz lent, rostogolindu-se pe endoteliulvascular.

Neutrofilele sunt celule polinucleare, cu un diametru de aproximativ 12 microni, cu

o form variabil (datorit permanentei emiteri de pseudopode). Nucleul este multilobat iprezint granulaii citoplasmatice care conin lizozim, NADPH oxidaz, lactoferin.

Neutrofilele se mai numesc polimorfonucleare neutrofile (PMN) datorit nucleuluimultilobat. Reprezint 60 - 70% din totalul leucocitelor din sngele periferic.Neutrofilele sunt primele celule care ajung intr-un focar inflamator. Sunt celule cu

rol foarte important n imunitatea innscut (nespecific).Neutrofilele strbat endoteliul capilar (diapedez) i se deplaseaz n esuturi

(chemotactism) pentru a ajunge la nivelul focarului imun.


5/60



2015-2016 5

Neutrofilele au rol important mai ales mpotriva bacteriilor cu habitat extracelular, pe care le fagociteaz.

Markerul membranar specific pentru neutrofile este CD67.

B.

MACROFAGELE

Macrofagele (MF) provin din monocite, care se gsesc n snge, n esuturi i ncavitile naturale ale organismului. Monocitele au originea n mduva hematogen, dintr -un precursor comun cu PMN, sub influena M-CSF i GM-CSF.

Monocitele ader de endoteliu datorit unor molecule de adeziune de pe suprafa.Aderarea se face numai pe anumite zone ale endoteliului, situate n vecintatea unui focarimun. Celulele APC din focarul imun, respectiv MF i celulele dendritice, elibereaz o seriede citokine IL-1, TNF-alfa i IFN-gama care stimuleaz celulele endoteliale din

vecintate.Sub aciunea unor citokine (IFN i IL-2) cu rol inductor produse de limfocite,

monocitele se difereniaz, transformndu-se morfologic i funcional n MF rezidente iapoi n MF activate. MF activate sunt capabile s ndeplineasc funcia de APC. MF tisulareau o durat de via de cteva luni, pn la civa ani.

MF sunt prezente difuz n organism, la nivelul esutului conjunctiv i n apropiereamembranei bazale a vaselor sangvine mici. Ele se afl n numr mare n zonele unde existun aflux important de antigene: plmni, ficat, splin i ganglionii limfatici.

Markerul membranar caracteristic pentru MF este CD14.

Transformarea monocitelor n MF presupune schimbri importante: Dimensiunea celulelor crete de 5-10 ori (MF au diametre de 25-50 microni). Crete numrul i dimensiunea mitocondriilor i lizozomilor, se dezvolt

aparatul Golgi.

Crete cantitatea de enzime hidrolitice (fosfataz acid, beta-glucuronidaz,catepsin, aril-sulfataz, lizozim, peroxidaz, colagenaz, elastaz, proteaze,lipaze, fosfolipaze, muramidazetc).

Devin multinucleate prin fuzionare sau prin endomitoz. Citoplasma emite numeroase pseudopode.

Funciile principale ale macrofagelor sunt: fagocitoza mecanism important de aprare nespecific;

procesarea i prezentarea antigenului rol de APC n aprarea nespecific;

secreia de citokine i de mediatori ai inflamaiei influeneaz att imunitateannscut, ct i pe cea adaptativ;


6/60



2015-2016 6

particip la procesele de reparaie tisularprin activarea fibroblatilor;

determin moarte intra i extracelular.

MF particip la rspunsul imun datorit funciei lorde APC i asigur:

Captarea Ag - MF capteaz n special Ag corpusculate: bacterii, virusuri, paraziimici, fragmente de celule self devenite antigenice; captarea este un proces

imunologic nespecific, adic se face la fel, indiferent de structura Ag. Fagocitoza Ag- pseudopodele emise de MF se unesc nglobnd Ag corpusculat ntr-

o vacuol numit fagozom.

Prelucrarea Ag - fagozomul se unete cu lizozomii din citoplasma MF; Ag nativendocitat este fragmentat de enzimele din lizozomi; din fragmentele rezultate este

ales fragmentul cel mai imunogen, care se numete epitop.

Conservarea epitopilor- n MF se conserv o cantitate mic din epitopi, care sunteliberai progresiv n urmtoarele zile; conservarea are rol n ntreinerearspunsului imun mai mult timp i n generarea unui rspuns imun mai intensprintr-o stimulare mai puternic i prelungit a limfocitelor.

Prezentarea epitopilor- epitopul selectat este cuplat cu moleculele MHC II i esteexpus pe membrana MF; prin expunerea cuplului MHC II-epitop se face prezentarea

epitopului spre LTH.

Succesiunea de evenimente care determin rspunsul celulelor fagocitare n infecii:

aderarea vasculardiapedeza chemotaxia activarea fagocitoza i moartea celular

C.

CELULELE KILLER NESPECIFICE

NK (natural killer) i LAK(celule killer activate de limfokine)

K

MF activate

Eozinofilele

CELULELE NK

NK fac parte din grupul mai numeros al limfocitelor mari, numite i non -B non-T.Limfocitele non-B non-T au morfologie de LGL (large granular lymphocytes). NK au mai

mult citoplasm dect limfocitele mici.


7/60



2015-2016 7

NK au rol n imunitatea nnscut sau nespecific. Ele intervin n primele momenteale unei infecii virale i elimin o parte dintre celulele self infectate. n acest mod ele oferorganismului rgazul pentru proliferarea clonelor de LB i LT Ag-specifice, care vor eradicainfecia. De asemenea, celulele NK recunosc i distrug celulele tumorale. Recunoaterereacelulei int este imunologic nespecific.

Markerii membranari caracteristici pentru NK sunt CD56i CD16.Celulele NK activate de IL-2 i IFN-gama se transform nLAK (Limfokine ActivatedKiller).

Recunoaterea celulei int de ctre NKNK recunosc celula int nespecific, prin mai multe mecanisme: recunoaterea nespecific mediat prin IgG: NK prezint pe suprafa receptori

FcR, prin care recunosc i distrug celulele opsonizate cu IgG.

recunoaterea prin receptori de tip lectinic: pe suprafaa celulelor infectate viralapar structuri glicoproteice cu greutate molecular mare. Aceste structuri suntrecunoscute prin receptori cu structur lectinic de pe membrana NK.

recunoaterea direct prin NK-R: se presupune c pe suprafaa NK se aflreceptori NK-R care recunosc o structur prezent fiziologic pe membranatuturor celulelor somatice din organism. La celulele sntoase aceste structuriint sunt mascate de moleculele MHC I. Probabil c la celulele infectate viral saumalignizate scade expresia membranar a MHC I i se demasc ligandulmembranar pentru NK, care se ataeaz de celule i le distruge.

Distrugerea celulei int prin citotoxicitate extracelular LTC i NK realizeaz liza celulei int prin mecanisme asemntoare, prin eliberarea

unor mediatori care produc leziuni ale membranei i apoptoz. Mediatorii sunt coninui ngranulaiile vizibile n LTC activate i n NK. Cei mai importani mediatori citotoxici sunt:perforina, limfotoxina, granzimele i TNF.

CELULELE KILLER

Celulele K sunt celule nedefinite morfologic, care au receptor de tip Fc pentru IgG

(de foarte mare afinitate) i recunosc intele mpachetaten anticorpi.

Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imun. Nu exist diferene ntrerspunsul imun primar i secundar. Celulele K interacioneaz cu celula int prinintermediul receptorilor Fc. Celula tumoraltapetatcu IgG este astfel uor recunoscutde celulele K. Ele se activeaz i lizeazcelula int.


8/60



2015-2016 8

D. CELULELE DENDRITICE

Celulele dendritice sunt specializate n prezentarea antigenelor. Se caracterizeazprintr-o structur arborescent, cu un corp celular cu puin citoplasm perinuclear inumeroase prelungiri ramificate care ptrund printre celulele din jur. Aceste pseudopodeau un aspect caracteristic care a fcut s fie comparate cu dendritele neuronilor . Datoritlungimii lor, pseudopodele celulelor dendritice permit supravegherea unor spaii ntinse deesut cu ajutorul unui numr relativ mic de celule.

Celulele dendritice au rol de APC pentru c pot s capteze i s prezinte antigenele.Ele au pe suprafa principalii receptori implicai n funcia de APC: CR (receptori pentru

fragmentul C3b al complementului), FcR i pot s sintetizeze moleculele MHC II. Celuleledendritice ndeplinesc n cadrul rspunsului imun urmtoarele funcii:

capteaz antigenele de la porile de intrare transport antigenele spre organele limfoide secundare - ganglioni limfatici i

splin prezint n organele limfoide secundare antigenele spre LB i LTPe parcursul desfurrii funciei lor imunologice, clasele de celule dendritice se

transform una n alta. Se consider n prezent c o celul dendritic i schimbmorfologia n funcie de teritoriul unde se gsete. Exista 4 tipuri principale de celuledendritice:

celulele Langerhans

celule dendritice interstiiale celulele dendritice foliculare

celulele dendritice limfoide

Hematopoieza

Hematopoieza este procesul prin care iau natere celulele sangvine mature,funcionale, iniiat n viaa intrauterin i cantonat n final la nivelul mduvei osoase.Necesit celule de originei micromediul hematopoietic.

Celule hematopoietice (de origine)se mpart n 3 grupe: celule stem pluripotente(CSP), celule progenitoare hematopoietice i celule hematopoietice ale seriilor sangvine.

n luna a 5-a fetal, n dou sptmni, cavitile osoase sunt populate cu celule

stromale. Celulele hematopoietice migrate din ficat traverseaz pereii vaselor sinusoidalei formeaz parenchimul hematopoietic.

Componentele micromediului hematopoietic sunt: celulele stromale mezenchimale,

reeaua matriceal extracelulari factorii de cretere produi de celulele stromale: Factori de stimulare ai coloniilor granulo-monocitare (GM-CSF)

Factori de stimulare ai coloniilor de macrofage (M-CSF)


9/60



2015-2016 9

Factori de stimulare ai coloniilor granulocitare (G-CSF)

Eritropoietina, trombopoietina

Citokine: interleukinele

Micromediul din timus. Timusul este un organ limfoepitelial care are n cortexlimfocite, celule epiteliale, macrofage. Nidarea limfocitelor T se face prin atragerea n afaravaselor de ctre 2-microglobuline idirijarea ctre zona cu celule epiteliale.Difereniereai maturarea se fac n zona epitelial. Migrarea celulelor mature se realizeaz ctre zonamedular.

Migrarea celulelor stem. n viaa intrauterin migreaz din sacul vitelin n ficat,din ficat n mduva osoas, timus splin, ganglioni limfatici. La adult CSP se gsesc nsngele circulant i mduva osoas.

Migrarea este explicat de: intervenia CSP n sectoarele medulare intens solicitate

cutarea de noi teritorii hematopoietice

meninerea unei rezerve de CSP n snge atunci cnd mduva este lezat La natere singurul organ hematoformator devine mduva osoas.n jurul vrstei de 4 ani mduva roie din diafizele oaselor lungi dispare treptat

fiind nlocuit cu celuleadipoase. La 18 ani esut hematopoietic se gsete n vertebre,stern, coaste, oasele craniene, pelvine, partea proximal a epifizelor oaselor lungi.

esutul limfatic. esutul limfatic este strns legat de formarea mduvei osoase.Apare n plexul limfatic n sptmna a 9-a i n glandele limfatice n sptmnaa 11-a. Lanivelul splinei n perioada de declin a mielopoiezei apare limfopoieza . Timusul devineorgan limfopoietic n sptmna a 9-a. Aici vin celulele stem din ficat, splin i mduvaosoas. Dup natere, esutul limfatic rmne prezent n mduva osoas,dar devine multmai extins n ganglionii limfatici, plcile Peyer i timus.

Teorii asupra procesului de angajare a celulelor stem:1)

Teoria stochastic angajarea celular survine la ntmplare, factorii de reglareacioneaz doar n etapele tardive ale hematopoiezei.

2) Teoria micromediului inductor direcionarea celulei stem depinde de structuramicromediului medular din acel moment.

3)

Teoria umoral angajarea depinde de factori umorali care se ntrec ntre eipentru fixarea pe receptorii celulelor stem.


10/60



2015-2016 10

Modul de recoltare, prelucrare, transport i stocare a probelor de snge(dup Synevo servicii medicale de laborator)

Pregatirea pacientului1.

Recoltarea probelor se face cu pacientul n condiii bazale, naintea oricrei proceduridiagnostice sau terapeutice (ideal ntre orele 7 i 9 dimineaa, n condiii jeunpenemncate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomandca recoltarea sseefectueze dup12 ore de la ultima mas.

2. Cnd probele de snge nu sunt recoltate n condiii bazale, trebuie inut seama deefectele adiionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar i efortul fizic moderatpoate determina o cretere a c% de glucoz, acid lactic, proteine serice, CK), precum ia strii emoionale sau ritmului circadian care poate afecta anumii parametri.

3.

Pacientul stntr-o poziie comod(n poziie eznd sau n decubit dorsal).4.

Datele demografice ale pacientului trebuie s fie corect scrise pe formularul denregistrare de la punctul de recoltare a sngelui i recipientul de recoltare corectetichetat.

Recoltarea sngelui venos

Sngele este recoltat prin puncie venoas, la nivelul fosei antecubitale, cu ajutorulunui sistem vacuum: tubul este vidat n momentul imediat anterior recoltrii, eliminndu-se riscul pierderii de vid; proporia de snge recoltat-aditiv rmne constant, fapt ceconduce la rezultate corecte.

Probele de snge sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

naintea recoltrii sngelui, se desface acul prin rsucirea capacului sigilat. Senltur capacul i se expune partea filetat (1), avnd grij s nu se ndeprteze teacasteriln care se gsete acul (2). Se asambleazacul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fiacum umplute unul dupaltul, n concordancu instruciunile de mai jos:

a. Se aplicun garou pe antebraul pacientului i se neappielea din plica cotului,cu ajutorul degetului mare i al indexului minii drepte.


11/60



2015-2016 11

b.

Se inverseaz poziia minilor ct mai curnd posibil dup ce acul a penetratvena; se apasvacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul i degetelemijlocii, susinndu-l.

c.

Sngele este atras de vacuumul din vacutainer i curge n tub cu vitezproprie;se elibereazgaroul din jurul braului pacientului imediat ce sngele a aparut nvacutainer, cu ajutorul mainii stngi, susinnd n continuare holderul.

d.

Se retrage vacutainerul cu mna dreapt, apsnd uor cu degetul mare pe unadintre marginile holderului.

e. Pentru a asigura optima omogenizare a sngelui cu anticoagulantul, seefectueaz8-10 micri de inversiune a tubului.

f. Daca se recolteazmai mult de un vacutainer, se insercel de-al doilea tub i serepetpaii descrii anterior.


12/60



2015-2016 12

Indiferent de sistemul de recoltare folosit, se respecturmtoarele manevre:- se utilizeaz mnui sterile, de unic folosin pentru fiecare pacient cruia i se

recolteazprobe;- se evitpuncionarea n zonele n care existleziuni cutanate;- se dezinfecteaz zona aleas pentru puncionare cu ajutorul unui tampon steril

mbibat n soluie apoas de izopropanol 70%, prin micri circulare, din interior spreexterior, pentru a ndeprta contaminanii;

- duptamponare, se las s se usuce zona nainte de a trece la puncionare (daczona este umed, poate fi indushemoliza probei);

- la sfritul puncionrii, se aplicimediat un tampon compresiv pentru a asigurahemostaza i a evita formarea hematomului (durata recomandat a compresiei este de 5mininute);

- la sfrit se acoperzona cu un pansament steril;

- acul de puncie nu va fi reintrodus n teac(pentru a evita neparea), ndoit sautiat, ci va fi depus ntr-un container de plastic rezistent la reziduuri neptoare sautietoare.

Aditivi utilizai

Pentru a mpiedica procesul de coagulare a sngelui integral, unele vacutainereconin substane anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA,citrat de dextroz), fie prin inhibarea trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudin).

Pentru a nu exista nicio confuzie n identificarea tubului de recoltare, capacelevacutainerelor sunt colorate diferit, n funcie de aditivul folosit. Codurile de culoare pentrusubstanele anticoagulante sunt descrise n ISO/DIS 6710:

1. Capac mov/roz - folosete ca anticoagulant EDTA i are utilitate n hematologie,biologie molecular, unele teste imunochimice (ex. ACTH).

2.

Capac bleu/verde - conine Citrat 9+1 i se folosete pentru analiza coagulrii.3.

Capac negru/mov - conine Citrat 4+1 i se folosete pentru VSH.4. Capac verde/portocaliu - conine Heparinat i se utilizeaz plasmpentru testele

de biochimie.

5.

Capac rou/incolor - este un tub fr anticoagulant. Serul este folosit pentru

testele de chimie, imunologie i serologie.

Unele vacutainere destinate obinerii serului conin un activator de coagulare (careaccelereazformarea cheagului) i un gel separator, care permite meninerea serului dupcentrifugare n tuburile primare, n cursul fazei preanalitice (transport ctre laborator),analitice i postanalitice (stocarea probelor n laborator).


13/60



2015-2016 13

Ordinea recoltrii tuburilor

n cazul n care este nevoie sse obinmai multe probe dintr-o singurflebotomie(puncie venoas), se recomandsse respecte urmtoarea ordine de recoltare a tuburilor:

1.

recipientele pentru hemocultur;2.

tuburile fraditivi;3.

tuburile ce conin citrat;4.

tuburile ce conin heparin;5.

tuburile ce conin EDTA.

Volumul optim de prob

Una din erorile cel mai des ntlnite este trimiterea la laborator a unei cantitiinsuficiente de prob. Pentru a v asigura c exist un volum adecvat de prob, serecolteazntotdeauna snge ntr-o cantitate de 2 ori i jumtate mai mare dect volumul

necesar efecturii unui anumit test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sauplasmnecesar procesului analitic).

n acelai timp, trebuie s se evite recoltarea excesiv de snge, n special lavrstnici, copii mici, pacieni internai n seciile de terapie intensiv.

n cazurile frecvente, n care pacienilor le sunt indicate mai multe teste, se ine contde urmtoarele volume de snge recomandate n cazul folosirii analizoarelor automateactuale:

- 4-5 mL snge pentru efectuarea unui profil de investigaii biochimice uzuale;- 1 mL snge pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Obinerea sngelui pentru imunofenotipri

Urmrete determinarea populaiilor i subpopulaiilor celulare

Se recolteaz 2-3 mL snge venos ntr-o eprubet steril, pe anticoagulant (heparin)

Sngele se prelucreaz n maxim 6 ore de la recoltare

Metodafolosit-citometrie n flux.Valori de referini comunicarea rezultatelor

Buletinul final va conine intervalele de referin pentru subseturile limfocitareadecvate vrstei pacientului mpreuncu o interpretare a rezultatelor obinute.

Trebuie cunoscut faptul c numrul absolut al populaiilor limfocitare esteinfluenat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatur i mediulnconjurtor. Studiile legate de variaiile circadiane au demonstrat o cretere progresivanumrului de celule CD4+ n cursul zilei, n timp ce limfocitele CD8+ i limfocitele B CD19+cresc doar n prima parte a zilei, fra se modifica n cursul dup-amiezei.


14/60



2015-2016 14

Din acest motiv, atunci cnd se efectueaz o monitorizare seriat a populaiilorlimfocitare se recomandca probele de snge sse recolteze n acelai moment al zilei.

Obinerea sngelui pentru determinarea activitii funcionale a Ly, Mo, Gran

Se recolteaz venos snge venos pe anticoagulant (heparin)

Se prelucreaz n maxim 4 ore

Determinarea activitii funcionale a leucocitelor este indicat n urmrireainfeciei HIV, cu monitorizarea serial a numrului de celule T CD4+ pentru evaluareaprogresiei bolii, stabilirea indicaiei de terapie antiretrovirali de tratament profilactic alinfeciilor oportuniste, precum i evaluarea rspunsului la terapie. Este foarte importantdeterminarea ct mai precisa numrului absolut de celule CD4+, acest lucru realizndu-seprin utilizarea unui numr cunoscut de microsfere (TruCount beads) la care se adaug un

volum cunoscut de prob.

Obinerea sngelui pentru tipizarea HLA(MHC)

Complexul HLA este plasat pe braul scurt al cromozomului autozom 6.

Se recolteaz 8,5mL snge venos periferic n vacutainer ce conine citrat de dextroz(ACD). Sngele se prelucreaz n maxim 4 ore de la recoltare.

Kit-urile specifice permit tipizarea de rezoluie nalt a alelelor ntr-un singur test.Metoda SSP (Sequence Specific Primers) se bazeaz pe tehnologia PCR care foloseteprimeri specifici pentru tipizarea ADN din esuturi.

Fiecare kit de primeri specifici constntr-un panel de primeri, fiecare coninnd opereche specificde primeri (specifici pentru o alelsau un grup de alele) ct i o perechede primeri de control specifici pentru secvenele non-alelice prezente n toate probele.

Acest control acioneaz ca un control PCR intern pentru a verifica eficienaamplificrii PCR.

HLA= Human Leukocyte Antigen = antigene de histocompatibilitate = MHC= Major

Histocompatibility Complex = complexul major de histocompatibilitate


15/60



2015-2016 15

MHC este format din molecule solubile sau aflate pe diferite suprafee celulare, curoluri importante n funcionarea normal a sistemului imun.

Complexul major de histocompatibilitate este implicat n imunitatea adaptativ(specific) avnd un rol esenial n discriminarea ntre self i nonself. De asemenea,intervine i n imunitatea nespecific. Complexul major de histocompatibilitate mai estecunoscut sub numele de sistemul HLA (human leukocyte antigen).

Exist 2 clase principale:

Moleculele MHC I sunt glicoproteine aflate pe suprafaa aproape tuturorcelulelor nucleate i a trombocitelor. Au rolul de a prezenta antigenele peptidiceinterne limfocitelor T citotoxice. Neuronii i spermatozoizii nu prezintmolecule MHC I pe membrane. Limfocitele au pe suprafa numeroase moleculeale complexului major de histocompatibilitate de tip I - pn la 105

receptori/celul. Moleculele MHC II se gsesc pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen

(n special macrofage, monocite, celule dendritice i limfocite B). Au rolul de aprezenta antigenele procesate de ctre aceste celule limfocitelor T helper.Numrul moleculelor MHC II aflate pe suprafaa monocitelor i macrofagelorneactivate este redus. Stimularea antigenic determin creterea semnificativ aexpresiei acestor receptori pe membran.

Funciile MHC I i MHC II

Moleculele MHC I i MHC II au un rol esenial n recunoaterea antigenului de ctrelimfocitele T. Aceste limfocite sunt implicate n generarea att a raspunsului imun umoralct i a celui celular. Spre deosebire de limfocitele B, limfocitele T nu pot recunoate dec tacele antigene prezentate n combinaii cu moleculele MHC (mecanism de restricie MHC).

Limfocitele T helper recunosc doar antigene exogene prezentate mpreuna cu MHCII, iar limfocitele T citotoxice recunosc antigene endogene prezentate mpreun cu MHC I.

Moleculele MHC se asociaz cu fragmente peptidice care au fost procesate anteriorn diferite compartimente ale celulei:

MHC I se leag de peptide derivate din antigene endogene, care au fostprocesate n citoplasma celulei: proteine normale celulare, tumorale, virale,proteine care provin din bacterii cu habitat intracelular.

MHC II formeaz complexe cu peptidele rezultate n urma procesriiantigenelor exogene, care au fost internalizate prin fagocitoz de ctre celulespecializate (mai ales macrofage i celule dendritice).


16/60



2015-2016 16

Toate celulele care prezint pe suprafa receptori MHC I pot prezenta antigeneendogene limfocitelor T citotoxice. Aceast prezentare determinactivarea limfocitelor Tcitotoxice, cu declanarea raspunsului imun celular, care are drept finalitate eliminareaacestor celule neoplazice sau infectate cu germeni intracelulari. Astfel, celulele care prezint

antigene prin intermediul MHC I catre LT citotoxice sunt de fapt celule int pentru acestea

din urm.

Antigenele exogene pot fi procesate i prezentate limfocitelor T helper doar de ctrecelule specializate care au pe suprafa molecule MHC II (celule prezentatoare de antigen).

Obinerea serului- Se recolteaz 8-10mL snge venos ntr-o eprubet de centrifug- Se introduce proba la 370C timp de 15 min, pn la completa coagulare- Se decanteaz serul ntr-o alt eprubet de centrifug

-Serul rezultat se centrifugheaz 5 min la 3000 rpm

- Serul poate fi pstrat timp de 1-2 ani la -200C

Utilizarea antibioticelor (Ab) i antimicoticelor (Am) n mediul de cultur

Antibiograma presupune testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs patologic fa de diverse antibiotice. Astfel se caracterizeaz capacitateaacestora de a opri dezvoltarea microbian i ofer informaii pentru selectarea celui saucelor mai active antibiotice fade microorganismul testat.

Antibiograma se face dupstabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea n culturpur i prin identificarea agentului patogen. Tratamentul se realizeaz n funcie derezultatele date de antibiogram, alegnd antibioticul cel mai eficace, adic fa de carebacteria izolatare cea mai mare sensibilitate.

Principiul antibiogramei const n capacitatea Ab de a mpiedica multiplicareabacterian, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele Ab au n anumite concentraii iproprietatea de a omorbacteriile: efect bactericid.

Metode folosite pentru testarea sensibilitii in vitrola antibioticeMetoda difuzimetricKirby Bauer (clasic): aceasta se efectueazpe medii solide,

n plci Petri, pe care s-a nsmnat n pnz cultura bacterian; apoi pe suprafaamediului se dispun discuri cu antibiotice astfel cn jurul acestora se va realiza un gradientde concentraie prin difuziunea local a antibioticului (n imediata vecintate a disculuiobinndu-se o c% mai mare de antibiotic care descrete pe msura ndeprtrii de acesta).


17/60



2015-2016 17

Se utilizeaz penicilina G (bacterii G+), streptomicina sulfat (bacterii G+/-),gentamicina(mycoplasme, bacterii G+/-), amphotericina B(fungi).

Metoda cu antibiotic ncorporat n mediu semisolid (modern): permitedeterminarea sensibilitii microbiene la un set de ageni antibacterieni/ antifungici,ncorporate ntr-un mediu semisolid. Este alctuit din 16 perechi de godeuri, din care 2/4nu conin antibiotice/antifungice i sunt martori de cretere.Celelalte perechi de godeuriconin diferite antibiotice n cte dou concentraii (c = concentraie mai mica i C =concentraie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpin testat ca fiind sensibil,intermediar sau rezistent. Din tulpina de testat este preparat o suspensie care estetransferat n mediul de cultur cu care este inoculat galeria. Rezultatele se citesc vizual

sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37C.

Interpretarea rezultatelor: Rezistena la un anumit antibiotic este evideniat prin virajul culorii spre rou

n godeurile unde microbiiau crescut fr a fi deloc inhibai. Rezistena intermediar la antibiotic este evideniat prin culoarea portocalie

din godeurile respective, unde microorganismele au fost inhibate doar la

concentraia crescut a antibioticului. n godeurile n care microorganismele nu au crescut deloc, nici la concentraia

sczut, nici la cea crescut a antibioticelor, culoarea vireaz spre glaben i aratsensibilitatea microbului fa de Ab respectiv.

Tehnici de biologie molecularReacia de amplificare enzimatic PCRReacia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metod de amplificare enzimatic

in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologiePCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinelemediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industriaalimentar, epidemiologie etc.Tehnica PCR imit replicarea ADN in vivo.

Variante tehnice i aplicaii ale tehnologiei PCR

diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaiin gene importante n anumite boli

diagnosticul unor boli infecioase: permite detectarea particulelor infecioasebacteriene i virale aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultivdificil in vitro, pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare i pentru


18/60



2015-2016 18

patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umanipozitivi nainte de seroconversie

studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne(detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene ndiverse procese maligne)

studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a uneicantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic

biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permitesecvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr anecesita n prealabil clonarea acestora

studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recupe-rarea i analizaunor secvene ADN din fosile

medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivelmolecular o serie ntreag de probe biologice

Materiale necesare

Tuburi PCR de 0,2/0,5 mL

Vrfuri pentru pipete automate

Materialele trebuie s fie noi i sterile

Tehnica de lucru

Se realizeaz prin combinarea unei probe de ADN cu primeri oligonucleotidici,deoxiribonucleotidtrifosfai (dNTP) i o ADN-polimeraz termosensibil (Taq-polimeraza),

ntr-un tampon corespunztor.Prin nclzirea i rcirea repetat a amestecului (30-40 cicluri), se obine nivelul deamplificare dorit.

Treptele de temperatur ale unei racii PCR standard

Denaturarea iniialPentru ca o reacie PCR s se desfoare eficient, este foarte important ca moleculele

ADN matri s fie denaturate iniial complet. Acest lucru poate fi realizat prinnclzirea iniial a amestecului de reacie 2 min la 94-95oC.

Treapta de denaturare din cadrul fiecrui cicluDe obicei, este suficient o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie

adaptat funciede termocycler i de tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n tuburide 500 L sunt necesari timpi mai lungi dect dac se lucreaz n tuburi de 200 L).

Ataarea primerilorn marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a primerilor trebuie

determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint unul dinfactorii critici pentru asigurarea unei nalte specificiti a reaciei PCR. Dac


19/60



2015-2016 19

temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar dactemperatura este prea sczut, atunci crete probabilitateaatarilor nespecifice.

Polimerizarea propriu-zisTaq-ADN polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72 oC. n fiecare ciclu, o

perioad depolimerizare de 45 sec este suficient pentru amplificarea unor fragmentede pn la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul secalculeaz n multiplii de 45 sec, urmat de ajustri pentru diverse matrie. Pentru aobine o cantitate ct mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare,astfel:

pentru primele 10 cicluri se folosete un timp constant de polimerizare (de ex.45 sec pentru 1 kbp)

pentru urmtoarele 20 de cicluri se crete timpul de polimerizare cu 2 -5 sec perciclu (de ex. 50 sec pentru ciclul 11, 55 sec pentru ciclul 12 etc.).

O asemenea mrire progresiv a timpului de polimerizare oferenzimei mai mult

timp pentru polimerizare, pentru c pe msur ce reacia PCR avanseaz, n amestecul dereacie se gsete din ce n ce mai mult matri i din ce n ce mai puin enzim activ(randamentul enzimei scade datorit expunerii prelungite la temperaturi nalte).

Numrul de ciclurintr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate

n mai puin de 40 cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n electroforez ngel de agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de cicluri, se pot acumula produide reacie nespecifici.

Polimerizarea (extensia) finaln multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se in 5-15 min

la 72oC pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum irenaturarea moleculelor monocatenare.

PCR n mutageneza situs-specific

Pornind de la faptul ca primerii folosii ntr-o reacie PCR sunt inclui n produselePCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie ntreag de variante tehnice ale acestei reacii.Astfel, nexperimentele de mutagenez situs-specific, modificrile dorite pot fi introdusen ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inserii sau de deleii.n toate acestecazuri se utilizeaz o tehnologie PCR n care reacia de amplificare este mprit n 2

reacii PCR separate n care sunt amplificate cele 2 secvene ADN aflate de o parte ide altaa situsului de modificat. n aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri constituite dintr-un primer extern (pentru captul moleculei ADN iniiale) i un primer intern (primeriiinterni sunt complementari situsului de modificat i conin n secven modificarea dorit).Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultai conin deja modificarea dorit,precum i o zon decomplementaritate inter-ampliconi.


20/60



2015-2016 20

Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor2 produse PCR, denaturarea termic a moleculelor urmat de renaturarea acestora ncondiii de stringen. Se adaug primeri exteriori i se realizeaz o noua reacie PCR, alcrei rezultat va fireprezentat de molecule ADN identice cu matria iniial, coninnd nsi modificarea dorit.

Spre deosebire de tehnicile clasice de mutagenez, i chiar de experimentele demutagenez cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit orezoluie i o acuratee multmai mare n obinerea de molecule ADN modificate. n mareamajoritate a cazurilor, aplicaiile practice vizeaz analiza corelaiilor dintre secvena denucleotide a unor molecule ADN i realizarea anumitor funcii.

Prelucrarea rezultatelor

Probele obinute se analizeaz prin electroforez n gel de agaroz 1%

Dup migrare, gelul se examineaz la UV

ARN-ul, n mod normal, migreaz n faa ADN-ului

CAPITOLUL 2. RELAIA AG-AC I MECANISME DE RSPUNS IMUN

Imunoglobulinele sunt glicoproteine specializate n recunoaterea moleculelor non-self. Se gsesc sub dou forme, circulant i de membran:

Forma circulant este reprezentat de moleculele de anticorpi, care se gsesc n

plasm, lichidul interstiial i secreii. Anticorpii sunt sintetizai de plasmocite, celulecare provin din LB activate n urma contactului cu antigenul.

Forma membranar este reprezentat de monomeri de imunoglobuline, fixai pe

suprafaa LB. Aceste molecule intr n alctuirea receptorilor pentru antigen ailimfocitelor B (B-cell receptors - BCR). Au rol de de activare a LB.

Imunoglobulinele solubile sunt proteine care migreaz pe electroforez n principaln fraciunea gamaglobulinelor. Imunoglobulinele nu migreaz exclusiv n fraciunea .Exist clase importante de imunoglobuline care se regsesc n fraciunile i aleelectroforezei.

Cele mai multe antigene cu care organismul vine n contact au o structur complex.n general, pentru un anumit antigen, sistemul imun va genera mai multe tipuri deanticorpi, care vor recunoate diferii epitopi. Fiecare anticorp recunoate specific unanumit epitop, de care se leag cu o poriune care are structur complementar cu aepitopului. Aceast poriune se numete paratop, situs de legare sau situs combinativ.


21/60



2015-2016 21

Funciile anticorpilor

Anticorpii au un rol esenial n ndeprtarea antigenelor solubile i n distrugereaantigenelor corpusculate. Nu toate clasele de anticorpi prezint aceleai proprietifuncionale.

n cele mai multe cazuri, simpla legare a anticorpilor de antigene nu determindistrugerea bacteriilor sau ndeprtarea antigenelor moleculare. Legarea anticorpului deantigen se realizeaz prin intermediul fragmentului Fab, n timp ce fragmentul Fc esteresponsabil de funciile biologice. Acest fragment are capacitatea de a activa moleculeefectoare ale sistemului imun i de a fi recunoscut de ctre celule imunocompetente.

Funciile principale ale anticorpilor sunt:

opsonizarea favorizeaz fagocitoza Ag de ctre MF i PMN. Aceste celuleprezint pe suprafaa receptori pentru fragmentul Fc, numii FcR. Aceti receptori permit legarea complexelor antigen/anticorp pe suprafaa MF ineutrofilelor. Legarea mai multor complexe imune pe suprafaa fagocitelordetermin iniierea unui semnal de transducie intracelular care are dreptrezultat fagocitoza acestora. Fagocitoza este un proces complex, prin care

agentul patogen este internalizat i devine inta unor mecanisme de distrugerecare determin liza patogenului.

activarea complementului pe calea clasic este o proprietate pe care oposed moleculele de IgM i cele mai multe subclase de IgG.

citotoxicitatea mediat celular dependent de anticorpi (ADCC) permitedistrugerea celulelor proprii ale organismului care au fost infectate viral sau cu

bacterii intracelulare. Celulele infectate viral produc proteine virale care servescreplicrii virusului. Unele dintre aceste molecule sunt expuse pe suprafaacelulei respective. Moleculele virale sunt recunoscute ca non-self, ceea ce

declaneazun rspuns imun umoral, cu producerea de anticorpi care se fixeazpe aceste molecule de suprafa. Celulele natural killer (NK), care au un rolimportant n rspunsul imun celular, prezint receptori pentru fragmentul Fc.Astfel, anticorpii direcioneaz celulele NK spre celulele infectate viral, cu lizaacestora din urm.

Structura anticorpilor

Similar altor molecule proteice, imunoglobulinele au o organizare spaialcomplex, caracterizat prin structur primar, secundar, teriar i cuaternar. Toateimunoglobulinele au o structur asemntoare, reprezentat de o unitate tetracatenar.Planul de organizare al domeniilor imunoglobulinelor se regsete n multe alte proteine,


22/60



2015-2016 22

de exemplu la unii receptori de suprafa. Proteinele care conin cel puin un domeniuimunoglobulinic constituie superfamilia imunoglobulinelor.

Toate tipurile de anticorpi au structur comun, fiind alctuii din 4 lanuripeptidice: dou lanuri identice uoare (L) i dou lanuri identice grele (H).

Fiecare lan uor este legat de un lan greu printr-o punte disulfidic i prin diferitealte legturi noncovalente. Astfel se formeaz un heterodimer H - L. Heterodimerii suntlegai ntre ei de asemenea prin puni disulfidice i legturi noncovalente.

Numrul de legturi disulfidice i aezarea acestora difer n funcie de familia deimunoglobuline.

Structura imunoglobulinelor este strns legat de funciile pe care acestea trebuies le ndeplineasc. Pe de o parte, anticorpii se leag n mod specific de antigene, iar pe dealt parte pot forma legturi cu o varietate de molecule efectoare i celule.

Papaina este o enzim care scindeaz molecula de imunoglobulin n trei fragmente:

dou fragmente identice care au capacitatea de a lega antigene. Acestea au fostdenumite Fab - antigen binding. Aceste fragmente sunt alctuite dintr-un lanuor L i captul N-terminal al unui lan greu H, legate prin puni disulfurice.Fragmentele Fab conin regiunea variabil V. Existena a dou situsuri de legarepermite anticorpului s lege dou molecule de antigen.

un fragment Fc - fragment cristalizabil, care nu prezint capacitatea de legare aantigenelor. Acest fragment este alctuit din resturile lanurilor H. FragmentulFc este diferit n funcie de familia de imunoglobuline.

Exist dou tipuri de lanuri uoare L: i . Nu exist diferene funcionale ntreanticorpii care au lanuri fa de cei cu lanuri , iar motivul pentru care exist aceastvariaie nu este cunoscut. Aceste dou tipuri de lanuri intr n alctuirea tuturor claselormajore de imunoglobuline.

n schimb, diferenele structurale existente ntre lanurile grele H sunt definitoriipentru ncadrarea imunoglobulinelor n anumite clase i influeneaz semnificativ funciaacestora. Exist 5 izotipuri majore de lanuri grele H: , , , , . Pe baza deosebirilorexistente n structura lanurilor H au fost descrise 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA,IgD, IgE.

Situsul combinativ

Primii 100 de aminoacizi ai capetelor N-terminale ale lanurilor H i L prezint ovariabilitate marcat ntre anticorpi cu specificitate diferit. Aceste segmente suntdenumite regiunile V: VL pentru lanurile uoare i VH pentru lanurile grele.

Specificitatea diferit a anticorpilor este datorat acestei regiuni variabile.


23/60



2015-2016 23

Asocierea dintre VH i VL creaz o zon hipervariabil, care este locul de legare aantigenelor. Aceasta a fost denumit situs combinativ sau situs de legare a antigenului. ninteriorul regiunii variabile, exist anumite poziii care sunt relativ constante de lamolecul la molecul i zone care foarte rar sunt ocupate de acelai aminoacid. Acestepoziii numite hipervariabile constituie locul de legare cu antigenul i au fost denumiteregiuni determinante ale complementaritii(CDR - Complementary Determining Regions).

Sistemul imun este capabil s produc anticorpi mpotriva unei repertoriu vast de antigeneprin generarea de imunoglobuline care prezint CDR specifice pentru fiecare antigen.

Situsul combinativ pentru antigen este o cavitate mic format prin plicaturareadomeniilor VH i VL. Antigenul intr n aceast cavitate i angajeaz legturi cu domeniile Vprin complementaritate, pe principiul cheie-broasc.

Secvenele de aminoacizi care nu stabilesc legturi cu antigenul formeaz regiuneasuport FR (framework region).

Cu excepia regiunilor variabile, structura imunoglobulinelor este relativ constantpentru moleculele din aceast clas.

Clasele de imunoglobuline

Imunoglobulinele G

Imunoglobulinele G (IgG) sunt distribuite egal n sectorul intravascular i

interstiial.Moleculele de IgG sunt formate din dou lanuri grele i dou lanuri uoare sau . Exist 4 subclase de IgG, pe baza diferenelor existente la nivelul lanurilor : IgG1,IgG2, IgG3 i IgG4.

Auconcentraiaplasmatic cea mai mare Realizeaz imunizarea pasiv umoral a nou-nscuilorn primele luni de via

Fixeazcomplementul(IgG4) Reprezint peste 75% din totalul Ig circulante

Apar nRIU secundar Sintezalor este indus de IL-4

Imunoglobulinele M

Imunoglobulinele M (IgM) reprezint ntre 5 i 10% din totalul imunoglobulinelorserice. Forma monomeric de IgM se afl pe suprafaa limfocitelor B i intr n structuraBCR.

Plasmocitele secret IgM circulant ca pentameri. Monomerii sunt aranjai astfelnct fragmentele Fc se afl n centru iar cele 10 situsuri de legare al antigenului se afl la


24/60



2015-2016 24

periferia moleculei. Fiecare pentamer este format prin legarea monomerilor prin legturidisulfurice, legturi care se constituie ntre anumite zone ale lanurilor grele, situate nsprecaptul C-terminal. n plus, molecula de IgM conine un lan suplimentar polipeptidic numitlanul J (joining), care este necesar pentru polimerizarea monomerilor.

Prima Ig produs de fetus i de ctre LB

IgM sunt mai eficiente dect IgG n activarea complementului

Particip la aprarea contra bacteriilor ivirusurilor

Apare n RIU primar

Sintezaeste stimulat de IL-2

Imunoglobulinele A (IgA)

IgA este clasa de imunoglobuline predominant n secreii: lapte matern, saliv,lacrimi, mucusul tracturilor digestiv, bronic i genitourinar. n ser, IgA reprezint 10 -15%

din totalul Ig.n snge, IgA circul n principal sub forma de monomeri. n secreiile mucoase, IgA

exista aproape exclusiv sub form de dimeri (IgAs).Moleculele de IgAs conin un lan polipeptidic J i o component secretorie, de

asemenea de natur peptidic. Lanul polipeptidic J este identic cu cel care se gsete npentamerii de imunoglobulin M. Componenta secretorie este sintetizat de celuleleepiteliale.

Mecanismele de protecie ale IgAs la nivelul mucoasei:

mpiedicarea colonizrii bacterene neutralizarea particulelor virale

neutralizarea enzimelor i toxinelor aciune sinergic cu factori ai sistemului de aprare nnscut: lactoferina,

peroxidaz, lizozimIgAs au un rol important n meninerea relaiei simbiotice cu bacteriile comensale

din cavitatea oral. Exist un repertoriu larg de IgAs care conine anticorpi pentruantigenele exprimate de bacteriile comensale i care mpiedic trecerea acestora prinmucoas.

Imunoglobulinele E (IgE)

IgE este o clas de imunoglobuline cu efecte biologice importante, cu toate c segsete n cantiti reduse n plasm 0,3 micrograme/mL.

Lanul greu epsilon este format din cinci domenii, unul variabil i patru constante.Molecula de IgE nu are o zon balama i din aceast cauz este foarte rigid.


25/60



2015-2016 25

Au rol n aprarea antiparazitar i intervin n reacia de hipersensibilitate de tip 1,care este responsabil pentru o varietate de afeciuni alergice, de la rinit alergic,urticarie, astm bronic, pn la oc anafilactic.

IgE sunt anticorpi citofili, adic dup ce sunt sintetizai nu rmn n lichidulextracelular, ci se ataeaz prin receptori specifici pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor.Mastocitele i bazofilele posed un bogat echipament enzimatic i de mediatori aiinflamaiei, care se afl n granulaiile citop lasmatice. Legarea antigenului deimunoglobulinele E care se afl pe suprafaa acestor celule declaneaz degranularea ieliberarea mediatorilor inflamaiei n esuturi, cu apariia manifestrilor alergice.

Genele imunoglobulinelor

Localizarea cromozomial a genelor pentru Ig:

Sinteza lanurilor grele este codificat de gene plasate pecromozomul autozom14, braul lungq, regiunea 32

Sinteza lanurilor uoare este codificat de gene plasate pe cromozomul autozom2, braul scurtp, regiunile 11-12

Antigenele

Sistemul imun are capacitatea fundamental de a deosebi structurile proprii ale

organismului (self) de cele strine (non-self). Structurile non-self sunt eliminate prinmecanismele aprrii imune.Termenul de non-self nu implic obligatoriu originea exogen a substanei

respective. Exist molecule sau celule proprii ale organismului, care au fcut parte din self,dar au suferit modificri i au devenit non-self.

Antigenul este o substan recunoscut ca non-self de ctre sistemul imun alorganismului.

In definiia clasic, termenul de antigen desemna orice substan de origine exogencapabil s induc formarea de anticorpi i s reacioneze n mod specific cu acetia.Aceast definiie a fost considerat prea restrictiv, pe msur ce s-a observat c exist

antigene de origine endogen sau antigene care nu induc sinteza de anticorpi, dei suntrecunoscute de sistemul imun.

ntr-o definiie folosit n prezent, termenul de antigen denumete o substan deorigine endogen sau exogen capabil s determine un rspuns imun i sreacioneze specific cu moleculele rezultate n urma declanrii acestuia (anticorpisau receptori celulari).


26/60



2015-2016 26

Aceast definiie subliniaz cele dou proprieti fundamentale ale antigenului:imunogenitatea (capacitatea de a induce un rspuns imun) i specificitatea (capacitatea dea reaciona specific cu produsele sistemului imun activat).

Imunogenelesunt antigene complete, avnd att capacitatea de a declanarspunsimun umoral sau celular, ct i de a se lega de produsele rezultate.Antigenele incomplete(numite i haptene) sunt capabile s reacioneze cu anticorpii sau receptorii de membran,dar nu pot declana un rspuns imun, dect dacsunt cuplate cu o altmolecul (numitcarrier).

Au fost descoperite antigene care, dei ndeplinesc caracteristicile fundamentale deimunogenitate, nu produc rspuns imun umoral sau celular. Acestea au fost denumitetolerogene, iar semnificaia lor imunologic este diferit. Spre desebire de haptene, pecare le putem aprecia ca fiind indiferente sistemului imun, tolerogenele activeazanumite mecanisme de inhibiie activ a sistemului imun.

Clasificarea antigenelor n funcie de origine

Majoritatea antigenelor sunt exogene: bacteriile, paraziii, unele substane chimiceindustriale, alergenele ca polenul, praful de cas, alergenele alimentare.

O alt categorie important este reprezentat de antigenele endogene:autoantigenele, antigenele virale i antigenele tumorale.

Autoantigenele sunt antigene proprii care n mod normal sunt sechestrate prinbariere anatomice. Aceste antigene sunt situate n aa-numitele situsuri imunologiceprivilegiate, protejate prin bariere hemato-tisulare cu permeabilitate sczut pentrusubstanele hidrosolubile. n mod normal autoantigenele nu vin niciodat n contact cucelulele sistemului imun i nu induc un rspuns imun. Exemple de astfel de autoantigenesunt: sperma, cristalinul, esutul cerebral i unele structuri din celulele miocardice. Pentruc autoantigenele nu sunt cunoscute de ctre sistemul limforeticular, pentru ele nu existtoleran imun nnscut, ca pentru celelalte structuri self cu care limfocitele vin ncontact n cursul traficului lor prin organism. n condiii patologice se producedesechestrarea acestor autoantigene. Autoantigenele vin n contact cu sistemul imun i seproduce un rspuns imun fa de ele, deci fa de nite structuri self. Aceste rspunsuriimune autoreactive dau o patologie autoimun.

Antigenele virale fac parte din categoria antigenelor endogene pentru c vir usurilei includ genomul n genomul gazdei. Celula gazd sintetizeaz proteinele virale antigenicepe aceleai ci metabolice ca proteinele proprii.

Antigenele tumorale se gsesc pe membranele i n citoplasma celulelor canceroase.Ele nu se gsesc pe membranele sau n citoplasma celulelor normale din care a derivattumora. Orice organism normal produce un numr mic de celule canceroase, care sunt


27/60



2015-2016 27

distruse rapid de sistemul imun. Prevenirea apariiei tumorilor se face prin distrugereacelulelor tumorale izolate, n cadrul unui proces de imunosupraveghere. Dac o celulneoplazic izolat reuete s se divid i apare o tumor constituit, rspunsul imunmpotriva tumorii seamn cu cel din respingerea grefelor. n ambele situaii acioneaz nspecial mecanismele rspunsului imun celular.

Superantigenele sunt o categorie special de antigene, care prezint particularitateac nu sunt fagocitate de macrofage. Au rol n activarea mai multor limfocite princapacitatea lor de a se fixa pe exteriorul celulei, de MHC II de pe macrofag i de lanul alreceptorului pentru antigen de pe limfocitul T (TCR T cell receptor).

Din punct de vedere al necesitii participrii limfocitelor T helper n cadrul RIU,antigenele se mpart n:

timoindependente- antigene care pot declana RIU n absena LThelper (mai

ales antigenele polizaharidice bacteriene). Rspunsul este rapid, fapt importantn infeciile cu microorganisme agresive(ex: pneumococul). Dezavantajul este caceti anticorpi nu sunt la fel de funcionali ca cei rezultai prin participarea LT helper i nu exist mecanismul de comutare izotipic, care permite sinteza adiferite clase de imunoglobuline. n plus, nu se formeaz limfocite B cu memorie.

timodependente - reprezint majoritatea antigenelor. Rspunsul imundeclanat de aceste antigene este mai puin rapid, dar mai versatil i mai eficient.n plus, apar limfocite B cu memorie, care permit un rspuns mult mai rapid iintens la un nou contact cu antigenul (rspunsul imun umoral secundar).

Antigenele cu care organismul vine n contact pot fi solubile sau corpusculate:

Antigenele solubilesunt molecule recunoscute ca non-self. De obicei antigenele

solubile sunt proteine cu greutate molecular mare. Uneori antigenele solubilesunt polizaharide, acizi nucleici sau glicolipide.

Antigenele corpusculate sunt structuri non-self mai complexe: virusuri,

bacterii, protozoare, celule strine, celule infectate, celule neoplazice. De fapt,antigenele corpusculate sunt formate dintr-un numr foarte mare de moleculeantigenice. Dintre ele, cele mai importante pentru recunoaterea i distrugereaantigenului corpusculat sunt antigenele de suprafa.

Sistemul complement

Sistemul complement este un sistem multienzimatic care particip la rspunsulimun i la reacia inflamatorie. n acest fel el face legtura ntre aprarea specific inespecific. Factorii sistemului sunt sintetizai n principal n ficat. Ca i sistemul coagulrii,complementul funcioneaz pe principiul cascadei.


28/60



2015-2016 28

Factorii complementului se gsesc permanent n plasm. Ei extravazeaz n focarulinflamator datorit permeabilitii capilare crescute. n circulaie factorii sistemuluicomplement se gsesc sub form de profactor (enzim inactiv sau zimogen). Profactorii seactiveaz succesiv prin procese de proteoliz limitat. Factorii C 2, C3, C4i C5sunt clivai ncte doufragmente notate cu a i b. Fragmentele a sunt mai mici. Ele rmn solubilen lichidul interstiial i au efecte de tip proinflamator. Fragmentele b sunt mai mari. Eleintervin n distrugerea antigenelor corpusculate i n epurarea antigenelor solubile.

Componentele sistemului complement:

C3a, C5a= anafilatoxinele

C5b= factorul chemotatic

C3b= factorul opsonizant

MAC= complexul litic terminal

Anafilatoxinele sau factorii anafilactici acioneaz asupra mastocitelor tisulare ibazofilelor atrase n focarul inflamator prin chemotactism. Din aceste celule se elibereazmediatorii preformai, dintre care cel mai important este histamina i mediatoriineoformai: factorul de activare plachetar (PAF), prostaglandine, leucotriene, tromboxan.

Factorii chemotactici au o aciune puternic asupra leucocitelor i macrofagelor.Factorii opsonizani se ataeaz imunologic nespecific de membranele non-self i decomplexele imune. Acest proces stimuleaz fagocitoza bacteriilor i a complexelor imune.

Complexul litic terminal sau Membranary Attack Complex (MAC) se ataeaz pemembrana celulei int, o perforeaz i produce liza osmotic a celulei int sau a bacterieiacoperite de Ac.


29/60



2015-2016 29

Colaborarea ntre anticorpi i complement duce la ndeprtarea sau distrugereaantigenelor prin intermediul a trei mecanisme principale:

anticorpii se fixeaz pe membrana bacteriilor i determin activareacomplementului. Sistemul complement este un sistem enzimatic care se activeaz ncascad i care determin liza osmotic a antigenelor corpusculate prin perforareamembranei.

activarea local a sistemului complement de ctre anticorpi determin apariia unorcantiti crescute de molecule de C3b. Acestea au la rndul lor capacitatea deopsoniza antigene i promoveaz fagocitoza.

eritrocitele prezint receptori pentru C3b. Molecule de C3b au capacitatea de a seataa de complexele imune. Complexele imune care nu pot fi fagocitate local sunttransportate de ctre eritrocite la ficat sau splin, unde macrofagele localefagociteaz complexele imune fr a distruge eritrocitele care au avut rol detransport.

Desfurarea rspunsului imun umoral

Rspunsul imun umoral (RIU) pentru antigenele timodependente se produce printr-o cooperare celular la care particip patru tipuri de celule: APC, LTH (helper), LTS(supresoare), LB. Cooperarea celular este bidirecional.

Cooperarea dinspre APC spre LB are ca efecte:

Selecia i activarea clonelor de LB i LT antigen-specifice Expansiunea clonal a limfocitelor antigen-specifice

Producia unei cantiti adecvate de imunoglobuline pentru neutralizarea idistrugerea antigenelor

Secvena de retrocontrol, de la LB spre APC, limiteaz intensitatea RIU la un minimnecesar pentru o aprare eficient.

Caracteristicile RIU primar si secundar

RIU primar este declanat de primul contact cu un anumit antigen. LB virgine suntrecrutate n organele limfoide periferice i se nmulesc n foliculii limfatici, n aa -numiiicentri germinativi primari, care sunt activi cam trei sptmni. RIU primar are o serie de

caracteristici:

Producie de IgM, stimulat de IL-2, n titruri mici sau moderate

Laten de 4-5 zile de la contactul antigenic pn la decelarea Ac specifici

IgM au o afinitate sczut de legare a antigenului


30/60



2015-2016 30

RIU secundar apare la al doilea contact cu un anumit antigen i continu laurmtoarele contacte. Dup contactul cu antigenul, RIU secundar ncepe mult mai rapiddect RIU primar (n 2-3 zile), iar panta de cretere a titrului de anticorpi este foarteabrupt. Se formeaz LB de memorie. Cooperarea celular i proliferarea clonal se producn centrii germinativi din foliculii limfatici secundari. Dup ndeprtarea din organism aantigenului, n circulaie rmn doar anticorpii, cu titrul mult mai mare dect alanticorpilor din RIU primar.

Anticorpii sunt IgG cu titru mare care persist mult, timp de mai muli ani. Frecventacetia confer protecie pentru toat viaa fa de antigenul corespunztor, ca n cazulanticorpilor antirujeolici, antirubeolici i cei contra toxinei eritrogene a streptococului.

Majoritatea Ag care declaneaz RIU sunt Ag T-dependente, care induc activarea,proliferarea i diferenierea LB antigen specifice, prin cooperarea cu LTh i secreia decitokine. Factorii de transcriere induc expresia anumitor gene, ducnd la proliferare i

difereniere celular.

Desfurarea rspunsului imun celular

RIC are rol de aprare n trei condiii patologice: eliminarea celulelor infectate cu microorganisme cu dezvoltare intracelular:

virusuri, bacterii (mycobacterii, Listeria, Brucella, Legionella)

supravegherea i distrugerea celulelor canceroase rejecia grefelor

RIC este implicat n recunoaterea i distrugerea: celulelor singenice devenite Ag: celulele infectate sau neoplazice

celulelor alogenice aprute prin gref sau transplant

Recunoaterea i distrugerea celulelor antigenice se face prin dou tipuri de celule:LTC (LT citotoxice) i celulele NK (natural killer). Acestea recunosc celulele non -self prinmecanisme diferite, dar le distrug printr-un mecanism comun, numit citotoxicitate

extracelular sau citotoxicitate mediat celular.

La contactul cu celula int, LTC i NK elibereaz nite mediatori care: lezeaz membranele celulelor non-self, ducnd la liza osmotic a celulelor

altereaz nucleul celulelor int, producnd apoptoza lor


31/60



2015-2016 31

Recunoaterea celulei int de ctre LTCLTC recunosc specific celulele int, pentru c acestea prezint pe suprafa Ag

cuplate cu moleculele MHC I. Normal celulele organismului prezint diverse fragmentepolipeptidice rezultate din proteinele celulare degradate n cursul procesului de regenerarefiziologic sau din proteinele cu structur defectuoas, pe care celula le distruge.Asamblarea MHC I cu aceste fragmente se face n RER, iar dup aceea complexul rezultateste expus pe membran. Celulele sistemului imun, n special LT, nu reacioneaz fa defragmentele peptidice self, deoarece nc din timpul maturaiei intratimice au fost distruseclonele de LT care recunosc autoAg.

Celula infectat viral sau care a devenit neoplazic prezint pe suprafa n complexcu moleculele MHC I diverse Ag virale sau neoplazice, fa de care LTC reacioneaz.

Fragmentele din primele celule int distruse de LTC sunt fagoc itate de MF, caredevin APC i prezint polipeptidele non-self pe suprafa n complex cu moleculele MHC II.Sunt stimulate LTH. Secret IL2 i stimuleaz astfel chemotactismul, proliferarea i

activarea de noi LTC. LTC au pe suprafa CD25, receptorul pentru IL2.

Din punct de vedere funcional, limfocitele T se mpart n: Limfocite T citotoxice (LTC) au pe suprafa receptorul specific CD8. Recunosc

peptidele antigenice rezultate din degradarea agenilor patogeni intracelulari,peptide care sunt prezentate ctre LT citotoxice mpreun cu moleculelecomplexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor

limfocite este de a distruge celulele int infectate.

Limfocitele T helper (LTH) prezint pe suprafa receptori CD4. Pot srecunoasc peptide antigenice care rezult n urma prelucrrii agenilorpatogeni extracelulari, peptide prezentate mpreun cu molecule MHC II.

Limfocitele T supresoare reprezint o subpopulaie de limfocite T a creiexisten este controversat. Aceste limfocite au efecte inhibitorii n cadrulrspunsului imun.

Concluziile mecanismelor de reacie imun

Celulele T i B recunosc diferit Ag Ag trebuie prelucrat nainte de a fi prezentat celulelor T

Procesarea Ag genereaz peptide antigenice Mecanismul de procesare a Ag depinde de compartimentul n care se replic agentul

patogen


32/60



2015-2016 32

Principalele reacii Ag-Ac i aplicaiile acestora

1. Testul pentru determinarea Ac antistreptolizina O reacia ASLO Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecie

streptococic, ca i a celui de reumatism articular acut (RAA) Meninerea titrului ASLO ridicat chiar i la cteva luni dup puseul reumatismal

permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii.

Principiul metodei:

Reactivul folosit: suspensie de particule latex de polistiren ncrcate cu streptolizinaO stabilizat.

Reactivul a fost astfel preparat nct, n prezena unui titru ASLO normal de 200U.I/mL sau mai crescut, s dea o aglutinare vizibil a particulelor latex, fr diluareaserului.

Reactivi: 1 flacon cu reactiv latex de 5mL

1 flacon control pozitiv de 1mL

1 flacon control negative de 1mL

1 plcu pe care se efectueaz reaciaInterpretarea testului:

Reacia ASLO negativ: obinerea unei suspensii lptoase, fr aglutinare, ca ceaobservat la controlul negativ

Reacia ASLO pozitiv: obinerea unei aglutinri observat n cercul probei

asemntoare cu ceaobservat la controlul pozitivValori crescute: > 200 U.I.: la pacienii care au avut n ultimele trei luni o angin streptococic sau

alte infecii streptococice > 300 U.I.: n glomerulonefrita acut poststreptococic, scarlatin

600-2500 U.I.: n RAA

2.

Testul pentru identificarea proteinei C reactive

Testul este utilizat pentru identificarea CRP n ser n vederea diagnosticrii unorafeciuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaiei.

Principiul metodei:

Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o

fraciune de gamaglobulin a serului anti-uman CRP specific. Cnd CRP esteprezent nprob, se observ o aglutinare ce indic un coninut de 6 mg/L.


33/60



2015-2016 33

Reactivi:

1 flacon cu reactiv latex de 5 mL

1 flacon cu control pozitiv de 1 mL

1 flacon cu control negativ de 1 mL

1 plcu pe care se efectueaz reacia

Interpretarea rezultatelor:

CRP nu este prezent n sensul pacienilor aparent sntoiValori crescute:

infecii bacteriene: pneumonii infarct miocardic, afeciuni maligne, LES, stri post-operatorii

febr reumatic, afeciuni reumatice diverse, colagenoze, TBC activ

3. Testul RPR Carbon VDRL

Reactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizat cu cristale de colesterol marcatecu cardiolipin lecitin i particule de mangal (pentru mbuntirea interpretriirezultatelor). Reactivul are rol de Ag fa de Ac prezeni n organismal persoanelorinfectate cu Treponema pallidum.

Modul de lucru :

Se aduc reactivii i probele la temperatura camerei, nainte de folosire Se agit uor reactivul pentru dispersarea particulelor

Se pune cte o pictur din controlul pozitiv i negativ n cte un cercule al plcuei

Se pune cte o pictur (50 l) de ser nediluat din fiecare prob n cte unul din

cercurile plcuei Se adaug o pictur de reactiv RPR Carbon, ori se pipeteaz 20 l de reactiv n

fiecare cercule folosit Se amestec ambele picturi, frs se disperseze pe toat suprafaa cercului

Se rotete plcua manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min Se citete prezena aglutinrii vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecific poate

apare dac testuleste citit mai trziu de 8 min

Interpretarea rezultatului:

Rezultat pozitiv: prezena unor nori cenuii pe albul plcuei Rezultat negativ: lipsa unei reacii de floculare uniforme i a unei culori cenuii


34/60



2015-2016 34

4.

Testul pentru identificarea AgHBs

Testul pentru identificarea AgHBs este un test rapid, care se efectueaz din ser, este

util n diagnosticul infeciei cu virusul hepatitic B. Rezultatul testului poate fi citit vizual, fr niciun instrument. Testul se bazeaz pe principiul determinrii semicantitative a AgHBs din ser, cu

ajutorul metodei imunoenzimatice de tip sandwich. Anticorpii monoclonali ipoliclonali sunt folosii pentru identificarea AgHBs cu o nalt sensibilitate. Testuldureaz circa 15 min.

Principiul metodei:

25 de plcue imunocromatografice

Reactivul 1 = enzima conjugat Reactivul 2 = soluia de splare Reactivul 3 = soluia revelatoare


35/60



2015-2016 35

Interpretarea rezultatelor:

Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici

Intens pozitiv: toate cele 3 spoturi mici i spotul mare sunt vizibile, iar spotul mareeste intens colorat

Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici i spotul central, dar spotul mare nu foarteintens colorat

Neconcludent: cnd spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau cnd nu apareniciun spot; se repet testul

5.

Testul COOMBS

Test de diagnostic pentru anemiile hemolitice autoimune

Const n reacia de hemaglutinare Testul DIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) fixai deja pe Ag de pe

eritrocitele bolnavului

Eritocitele se pun n contact cu ser anti-Ig, care determin aglutinare n urmacuplrii anti-Ig-AAc

Testul INDIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) circulani Serul cu AAc provenit de la bolnav este pus n contact cu eritrocite normale care au

pe suprafa Ag eritrocitareAre loc cuplarea AAc de Ag

Adugarea de ser anti-Ig determin aglutinarea eritrocitelor


36/60



2015-2016 36

CAPITOLUL 3. TERAPII IMUNOSTIMULATOARE

IMUNIZAREA ORGANISMULUI

Imunizarea organismului presupune ansamblul de msuri prin care se oferprotecie specific mpotriva patogenilor frecveni i agresivi.

Edward Jenner a descoperit vaccinul mpotriva variolei (vrsatului de vnt) n anul1700.

Imunizarea natural activ const n apariia unui rspuns imun specific iprotector dup o boal infecioas, n urma contactului natural cu agentul patogen. Ea serealizeaz prin mecanismul memoriei imunologicei reprezint o achiziie a sistemuluiimun. Boala infecioas poate mbrca forme severe, uneori mortale, motiv pentru careimunizarea natural nu este ntotdeauna o variant benefic de imunizare . De aceea

cercettorii au cutat nc de acum 200 de ani metode artificiale de imunizare.

Imunizarea natural pasivconst n motenirea de ctre nou nscut a unui titrude anticorpi protectori de la mam, fa de bolile infecioase pentru care mama esteimunizat. Aceti anticorpi sunt de tip IgG i traverseaz placenta n timpul vieiiintrauterine. Dup natere ei continu s ajung la copil prin intermediul laptelui matern.Astfel copilul este protejat n primele luni de via de o serie de boli infecioase. ns titrulacestor anticorpi scade progresiv, astfel nct dup vrsta de 5-6 luni copilul nu mai esteprotejat.

Imunizarea artificial activ const n inducerea memoriei imunologice prinintroducerea n organism a unor ageni infecioi sau a unor antigene ale acestora prinintermediul vaccinurilor. Acestea nu sunt capabile s produc boala, dar pot induce unrpuns imun protector, similar cu cel obinut dup boal.

Imunizarea artificial pasivconst n introducerea n organism a unor anticorpispecifici preformai, prin intermediul serurilor sau imunoglobulinelor. Imunizarea pasivnu induce un rpuns imun din partea organismului, nu declanaz mecanismele memorieiimunologice i asigur o protecie de scurt durat.


37/60



2015-2016 37

IMUNOPROFILAXIA ACTIV PRINVACCINAREImunizarea activ determin protecie pe termen lung i memorie imunologic.

Profilaxia asigurat prin vaccinare se numete imunizare activ i este durabil n timp.

Ea nu trebuie confundat cu imunizarea pasiv realizat prin administrarea de seruri hiperimune sau imunoglobuline specifice, care asigur o protecie imediat dar descurt durat, de circa 3-4 sptmni.

Vaccinul este un preparat care conine fraciuni antigenice din structura unuiagent infecios. El este capabil s induc la individul vaccinat un rspuns imun protectormpotriva respectivului agent infecios. Acesta se instaleaz dup un interval de timpnecesar sintezei de anticorpi n urma vaccinrii.

Apariia unui rspuns imun n cursul vaccinrii nu este suficient pentru

protecie. Acesta trebuie saib o anumit intensitate i este necesar apariia memorieiimunologice, asigurat de limfocitele T i B de memorie.

Tipuri de vaccinuri:

Germeni vii atenuai (vaccinuri vii bacteriene sau virale) Germeni mori

Fraciuni degermeni Toxoizi (toxine secretate i detoxifiate) Recombinani de determinani antigenici

Vaccinurile vii sunt utilizate pentru imunizarea mpotriva unor infecii virale:rujeol (pojar), rubeol, oreion, varicella, poliomielit, hepatitA.

Pentru c pot determina simptome de boal majore, vaccinurile vii sunt atenuateprin cultivarea agentului patogen pentru perioade ndelungate n condiii anormale decultur.Se vor selecta mutanicare sunt adaptai supravieuirii n cultura anormal, darau patogenitate mai redus n organism. Un exemplu este vaccinul mpotrivaMycobaterium (BCG bacilul Calmette Guerin). Acesta a fost obinut prin cretereaMycobaterium bovispe un mediu cu o concentraie crescut de bil.

Pentru c au capacitate mare de replicare, microorganismele determin un rspunsimun intens i prelungit, cu un titru nalt de anticorpi i formarea de celule de memorie.Astfel, n cele mai multe cazuri, vaccinurile atenuate necesit doar o singur imunizare. nplus, n cazul vaccinurilor cu microorganisme intracelulare se declaneaz i un rspunsimun celular.


38/60



2015-2016 38

Principalul dezavantaj al vaccinurilor atenuate este reprezentat de posibilitatea ca

agentul patogen respectiv s revin la patogenitatea iniial . Administrareavaccinurilor vii atenuate este uneori urmat de reacii adverse care mimeaz infecianatural cu agentul infecios coninut n vaccin. Sunt contraindicate la pacieniiimunodeprimai pentru c pot determina reacii adverse severe i la gravide, din cauzaposibilului efect teratogen.

Vaccinurile inactivate conin virusurisau bacterii lipsite total de putere patogen.Induc, dup administrri repetate, o imunizare activ. Pot fi utilizate la gravide iimunodeprimai. Vaccinurile inactivate determin inducerea unui rspuns predominantumoral.

Exist mai multe tipuri de asemenea vaccinuri:

Vaccinurile complete sau corpusculare, care conin bacteria sau virusul nntregime. Ele sunt inactivate prin diverse procedee: formol, cldur,betapropio-lacton. Microorganismele astfel inactivate sunt incapabile s sereplice n interiorul gazdei.

Vaccinurile macromoleculare conin fragmente antigenice sau subuniti dinstructura virusului sau bacteriei: toxine detoxifiate (anatoxine), antigene

capsulare(polizaharidice), antigene de membran(proteice). Vaccinurile preparate prin recombinare genetic, cum ar fi vaccinul contra

hepatitei B (Engerix B). Vaccinurile obinute prin inginerie genetic suntatenuate ireversibil prin ndeprtarea selectiv a genelor care sunt responsabilepentru virulena agentului respectiv.

Vaccinurile obinute prin inactivarea toxinelor bacteriene (vaccinuri cutoxoizi): antidifteric, antitetanic, antiholeric, polivaccinuri de tip Polidin (stimularea

imunitii pentru strepto, staphyloi meningococ).

Imunizarea pasiv prin


39/60



2015-2016 39

seruri i prin imunoglobulineSerurile hiperimune conin anticorpi specifici preformai care acioneaz imediat

dup administrare. Ele pot fi seruri: heterologe i homologe.

Serurile heterologe

Sunt recoltate de la animale (cai) n prealabil imunizate activ, care posed decititruri mari de anticorpi specifici.

Din cauza riscului de accidente anafilactice ele sunt din ce n ce mai puin utilizate,fiind nlocuite cu Ig umane specifice.

Se administreaz n scop profilactic, imediat dup un presupus contact cu agentulinfecios (plag tetanigen, plag rabigen).

Serurile homologe (umane): provin de la convalesceni. Ele au fost abandonate din cauzariscului transmiterii unor virusuri, ca HIV i virusurile hepatitice.

Imunoglobulinele umanese recolteaz de la populaia adult i sunt de 2 tipuri: gamaglobuline standard (administrate n deficitele imune primitive cu

hipogamaglobulinemie, infecii bacteriene severe recidivante la copiii infectai HIV,leucemie limfoid cronic i pentru profilaxia rujeolei sau a hepatitei A dup uncontact infectant)

gamaglobuline specifice (se utilizeaz Ig antitetanice, antirabice, antihepatit B,antivariceloase)

Durata rspunsului imun post contact natural sau vaccinare

Pentru toat viaa rujeola, rubeola, oreionul, varicela Pentru 10 ani HVB, antitetanic Pentru cteva luni - holera

Imunoprofilaxia secundar DTPdiftero-tetanic-pertussis luna a 2-a de via i 3 rapeluri la 4, 6, 12 luni HVBadministrat la natere, lunile 2 i 6 VPI (antipolio) luna a 2-a de via, cu rapel BCG(antituberculos) n primul an de via

Momentul administrrii vaccinurilor Profilacticpre-expunere Terapeuticpost-expunere


40/60



2015-2016 40

Calea de administrare a vaccinurilor

Injectabili.m, s.c, i.d - rapel

Reacii adverse la imunizare

Sindrom febril

Stare general alterat

Artralgii

Tulburri neurologice Reacii alergice Sindrom inflamator rubor, edem, durere

CAPITOLUL 4. PROVOCRILE SISTEMULUI IMUNITAR

Organismul uman trebuie s fac fa prin intermediul sistemului imunitar unorprovocri majore permanente. Supravieuirea este condiionat de rspunsul la acesteprovocri, cele mai importante fiind:

Relaia cu microorganismele nconjurtoare

Interaciunea cu alte molecule provenite din mediul extern sau intern

Apariia de celule anormale n esuturile proprii

Relaia cu microorganismele nconjurtoaren decursul vieii, organismul uman poate veni n contact cu:

Virusuri (dimensiuni ntre 5 500 nm)

Bacterii (dimensiuni ntre 500 10 000 nm)

Fungi (dimensiuni ntre 2 20 000 m)

Parazii (dimensiuni ntre 1 mm 20 m)

ntre acestea i organism putem deosebi urmtoarele tipuri de relaii posibile:

Comensalismmicroorganismele beneficiaz de pe urma interaciunii, fra produce efecte negative sau pozitive asupra gazdei

Simbiozgazda i microorganismele beneficiaz n urma interaciunii

Oportunism microorganismele sunt puin virulente i devin patogenenumai cnd aprarea organismului este deficitar

Patogenitate microorganismele au capacitatea s depeasc barierelefizice ale gazdei i sistemele de aprare locale i ptrund n mediul intern,unde se multiplic i produc distrugeri tisulare.


41/60



2015-2016 41

n prezent este recunoscut rolul extrem de important al florei bacteriene carecolonizeaz tegumentele i mai ales mucoasele, n special cea digestiv. Tegumentele imucoasele reprezint principalele pori poteniale de intrare pentru agenii patogeni.Numrul de bacterii aflate la nivelul mucoaselor tubului digestiv este de aproximativ 10 14,fiind de 10 ori mai mare dect numrul total al celulelor din organismul uman.Supravieuirea nu ar fi posibil timp ndelungat n

12324edSuport LP Imunologie 2015-2016

Documents

Transcript of 12324edSuport LP Imunologie 2015-2016