Biotehnologie generalSef lucrri dr. Diana Gropoil-Constantinescu

Lucrarea practic nr. 1

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR UTILIZATE N PROCESELE BIOTEHNOLOGICE

Mediul de cultur reprezint un complex de substane organice i anorganice ce constituie suportul nutritiv sterilizat necesar cultivrii microorganismelor n afara niei lor ecologice naturale.

Un mediu de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s fie nutritiv, s conin toate substanele necesare ntreinerii, dezvoltrii i multiplicrii microorganismelor s fie steril

s aib pH-ul optim microorganismului pe care dorim s-l cultivm s satisfac aerofilia microorganismului cultivatMediile de cultur prezint o mare importan n procesele biotehnologice, ele influennd direct reproductibilitatea i eficiena tehnologiei aplicate.

Ele permit studierea la nivel de laborator a particularitilor morfologice, fiziologice, genetice i de biosintez a microorganismelor de cultivate.

Mediile de cultur utilizate n biotehnologie sunt diferite, avnd n compoziie elemente specifice fiecarui tip de microorganism.

1. Clasificarea mediilor de cultur

Mediile de cultur pot fi clasificate n funcie de mai multe criterii.

a) Dup natura substanelor nutritive care intr n compoziia lor:

naturale sinteticeb) Dup spectrul lor de activitate:

uzuale, pentru izolare i ntreinerea microorganismelor

selective, pentru selecia microorganismelorc) Dup consisten:

lichide, pentru mbogirea culturilor microbiene, pentru studiul proprietilor biochimice i modificrilor asupra substratul lichid solide, pentru izolarea microorganismelor i pentru studiul caracterelor coloniilor semisolide, favorizeaz migrarea microorganismelor n mediu pentru diferenierea ntre speciid) Dup tipul respirator al microorganismelor cultivate:

pentru microorganisme aerobe pentru microorganisme anaerobee) Dup scopul i frecvena ntrebuinrii:

curente de mbogire de conservare de identificare de bioprocessf) Dup de numrul ingredientelor pe care le conin i n funcie de scop:

minimale

complexe

g) n funcie de scara la care sunt folosite:

de laborator, sunt medii complete, relativ simple care permit obinerea unei biomase microbiene corespunztoare industriale, sunt medii ieftine, ce asigur necesitile nutriionale ale microorganismelor cultivate i producerea compuilor dorii; utilizarea lor permite obinerea de produse finale la un pre de cost convenabil2. Compoziia mediilor de cultur

Mediile de cultur utilizate n biotehnologie conin n principal:

surs de carbon i energie surs de azot oligoelemente microelemente

factori de cretere (hormoni, steroizi)Surse de carbon

n majoritatea proceselor biotehnologice, principala surs de carbon o constituie glucidele. n mediile de cultur naturale, sursele de carbon sunt reprezentate de monoglucide (glucoz, fructoz) sau diglucide (maltoz, zaharoz, lactoz), fie sub form de substane pure, fie furnizate de produse agroalimentare ca melasa, siropul de glucoz, fina de porumb, zerul de lapte, deeuri celulozice.Pentru obinerea unui mediu de cultur, sursa de carbon se prepar sub forma unei soluii de concentraie cunoscut, astfel nct dup reunire cu celelalte componente ale mediului de cultur, concentraia sursei de carbon n mediu s corespund valorii indicate n tehnologie.

Surse de azotSursa de azot necesar preparrii unui mediu de cultur este reprezentat fie de substane organice sau anorganice simple ca amoniacul, ureea, sulfatul de amoniu, fosfatul de amoniu, fie de produse naturale, ce conin aminoacizi sau proteine cum sunt fina de soia, peptona, extractul de carne, extractul de porumb, extractul de drojdie.Substana reprezentnd sursa de azot se cntrete la balana tehnic, se dizolv n cantitate minim n ap, se sterilizeaz, iar dup rcire se amestec cu celelalte componente ale mediului de cultur.

Oligoelemente i microelementeFosforul, potasiul, sodiul, sulful i magneziul sunt elemente de baz pentru microorganisme, fr de care nu pot exista. Ele sunt furnizate din srurile minerale care se introduc n mediul de cultur. Microelemente ca fier, cupru, cobalt, mangan, zinc i molibden sunt de asemenea eseniale, fiind de regul prezente n mediu sub form de impuriti existente n alte ingrediente ale mediului.Srurile minerale componente ale mediului de cultur se cntresc i se dizolv separat n ap, apoi se reunesc i se sterilizeaz conform protocolului indicat n reeta de lucru.

3. Reguli generale de preparare a mediilor de culturn general, exist dou variante de preparare a mediilor de cultur:

a) cntrirea i dizolvarea pe rnd a substanelor indicate n reet, ntr-o cantitate minim de ap, completarea cu ap pn la volumul dorit i apoi sterilizarea mediului de culturb) cntrirea, dizolvarea i sterilizarea separat a ingredientelor indicate n reeta de lucru, urmat de reunirea lor n condiii aseptice

Cea de-a doua variant prezint avantajul c elimin eventuale interaciuni ce pot s apar ntre diferite componente din mediu n timpul operaiei de sterilizare termic. De exemplu, n timpul sterilizrii prin autoclavare a sursei de carbon, reprezentat de glucide i a sursei de azot, reprezentat de aminoacizi, au loc reacii Maillard, cu formarea unor produi denumii melanoide care au efect inhibitor asupra microorganismelor.

Pentru prepararea mediilor de cultur utilizate n biotehnologie, se parcurg urmtoarele operaii:

pregtirea i cntrirea ingredientelor dizolvarea substanelor, de obicei la rece, ntr-o cantitate de ap distilat mai mic dect volumul total de mediu preparat

verificarea i ajustarea pH-ului cu ajutorul unor soluii alcaline de NaOH sau NH3, sau soluii acide de HCl sau acid lactic, dup caz. Msurarea pH-ului se efectueaz cu ajutorul hrtiilor indicatoare pH sau cu pH-metru filtrarea, pe hrtie de filtru (daca este cazul) completarea cu ap distilat la volumul final topirea agarului, pentru mediile solide, prin fiebere 30 min sau autoclavare (0,5 atm)

repartizarea mediilor lichide, n recipiente de diverse capaciti, n funcie de necesiti (eprubete, flacoane Erlenmeyer, sticle)

sterilizarea mediilor, de regul 15-20 min, la 1210C pentru mediile care nu conin glucide, iar cele cu glucide 15-20 min, la 1150C, pentru a evita caramelizarea lor controlul sterilitii mediilor, prin incubare timp de 24 ore, la temperatura la care urmez s se incubeze mediul de cultur adugarea eventualelor substanelor termosensibile sterilizate separat prin alte metode stocarea mediilor, la 4-80C, nu mai mult de 4 sptmniExemple de medii de cultur

Bulion nutritiv

- Extract de carne

- Pepton

- Clorur de sodiu

- Ap distilat

pH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min0,3%

0,5%

0,5%

1000 ml

Geloz nutritiv

- Bulion nutritiv

- Agar

pH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min 1000 ml

1,5-2,0%

Mediu YPG - solid

Glucoza

2%

Peptona

2%

Extract de drojdii1%

Agar

2% ; pH = 7Lucrarea practic nr. 2

STABILIREA CURBEI DE CRETERE A MICROORGANISMELOR

n sens biotehnologic, prin fermentaie se nelege procesul de cretere controlat a microorganismelor pe medii de cultur adecvate, cu scopul de a obine diveri produi utili, respectiv metabolii primari sau secundari ai celulei microbiene.

n funcie de sistemul de cultivare, exist dou tipuri principale de culturi microbiene:

a) culturi discontinue

b) culturi continue

Culturile discontinue (sistem batch, culturi asincrone) corespund cultivrii n sisteme nchise, n care un anumit volum de mediu este nsmnat cu microorganismele respective. n cazul acestui tip de cultivare ritmul de cretere este impus de compoziia chimic a mediului de cultur care variaz pe parcursul bioprocesului, numrul microorganismelor variaz continuu, vrsta acestora este variabil, iar numrul de generaii posibile este limitat.

Culturile continue presupun cultivarea microorganismelor n sisteme deschise, n care volumul de mediu nsmnat este suplimentat continuu cu nutrieni.

Cunoaterea modificrii n timp a unei populaiei bacteriene cultivat n condiii controlate este deosebit de important pentru conducerea proceselor de fermentaie, deoarece biosinteza metaboliilor de interes este strict corelat cu anumite stadii de evoluie a culturii bacteriene, care se succed n mod constant.

1) Faza de lag este cuprins ntre momentul introducerii celulelor n mediu (nsmare) i momentul nceperii multiplicrii. n cursul acestei faze, are loc adaptarea treptat a microorganismului la noile condiiile de mediu, iar numrul celulelor rmne constant sau chiar scade temporar.

2) Faza de cretere accelerat corespunde momentului de ncepere a multiplicrii, care crete progresiv.

3) Faza exponenial (de multiplicare logaritmic) se caracterizeaz prin faptul c multiplicarea bacteriilor se efectueaz n progresie geometric, cu ritm de cretere constant, numrul celulelor viabile n aceast faz este de peste 90%, iar durata unei generaii este minim.

4) Faza de ncetinire a ritmului de cretere se caracterizeaz prin acumularea de produi metabolici, scderea vitezei de cretere i a viabilitii microorganismelor datorit epuizrii mediului n nutrieni.

5) Faza staionar cu ritm de cretere nul corespunde unei scurte perioade, caracterizat prin faptul c numrul celulelor vii rmne constant din cauza unui echilibru care se stabilete ntre numrul de celule care mor i al celor care apar printr-un proces de diviziune foarte lent.

6) Faza de declin accelerat este aceea n care multiplicarea microorganismelor nceteaz, iar numrul celulelor vii scade progresiv.

7) Faza de declin logaritmic corespunde unei perioade n care numrul de celule continu s scad, ntr-un ritm logaritmic.

Pentru a aprecia dinamica multiplicrii microorganismelor, se recolteaz probe din mediul de fermentaie, la intervale egale de timp, care apoi sunt analizate, iar valorile logaritmice ale numrului de celule sunt reprezentate grafic.

Figura 1. Reprezentarea grafic a curbei de cretere

Trasarea curbei de cretere prin msurtori de turbiditate

Msurarea turbiditii se realizeaz prin spectrofotometrie, adic prin msurarea modului n care suspensia microbian reduce transmiterea luminii. Rezultatele se exprim n procente de transmitere (X) sau ca densitate optic (DO), aceasta reprezentnd o funcie logaritmic a procentului de transmitere:

DO = 2 x log10 X

unde, X = % de transmitere a luminii

dac X = 100% atunci log10 100 = 2,

DO > 0, DO variaz de la 0 la infinit

La trecerea unui fascicul de lumin printr-un mediu lichid ce conine celule bacteriene acestea, determin mprtierea luminii la anumite lungimi de und la care raportul dintre absorban i mprtierea luminii este mic. Densitatea optic a suspensiei bacteriene se msoar cu un spectofotometru i este direct proporional cu numrul celulelor n mediu.

Relaia exact dintre DO i numrul de celule la o anumit lungime de und variaz n funcie de tulpin i de condiiile de mediu, deoarece raportul mas celular/numr de celule variaz i el n funcie de mediul de cultur folosit.

Metoda turbidimetric poate fi aplicat doar microorganismelor care manifest o cretere uniform, adic tulbur omogen mediul lichid n care sunt cultivate.

Prin dezvoltarea microorganismelor ntr-o soluie perfect limpede, mediul se tulbur n funcie de gradul de dezvoltare al acestora. Determinarea densitii optice la ( = 570 nm a soluiei respective, exprim turbiditatea probei respective.

Mod de lucru:

Se preleveaz din mediul de cultur, n condiii sterile, cte 2 ml de prob, la intervale regulate de timp (0, 4, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ore). Fiecare prob se dilueaz n raport de 1:50 astfel: 1 ml prob se aduce ntr-un balon cotat la 50 ml cu ap distilat. Se determin extinciile probelor la 570 nm, toate determinrile facndu-se fa de ap distilat. Curba de cretere este reprezentat grafic pe hrtie milimetric prin nscrierea pe abscis a timpului i pe ordonat a D.O. la 570 nm.

Rezultatele obinute se noteaz conform urmtorului model:

Vrsta culturii (ore)D.O. =570 nm

Calculul rezultatelor:

D.O. = E 570 x D

unde: E570 = extincia probei la ( = 570 nm

D = diluia

Lucrarea practic nr. 3FERMENTAIA LACTICPrin fermentaie lactic se nelege procesul biologic prin care n urma degradrii unui mediu de cultur rezult ca produs principal acidul lactic.

Fermentaia lactic are numeroase aplicaii practice n domenii diferite cum sunt:

industria alimentar, la conservarea crnii, petelui, legumelor, la prepararea erbetului i dulceurilor, ca acidifiant pentru sucuri i siropuri, la prepararea laptelui acru, a iaurtului i a altor produse lactate, la obinerea unor buturi din cereale i a unor specii de bere zootehnie, la conservarea i nsilozarea nutreurilor medicin, ca antiseptic

industria chimic, ca mordant la colorarea i imprimarea textilelor n industria pielriei

Calea metabolic de formare a acidului lactic (glicoliza)

Principiul metodei

Materiile prime de natur amidonoas sau zaharoas din fermentatoare sunt nsmnate cu culturi selecionate de Lactobacillus delbrueckii, pentru amidon, glucoz, melase, Lactobacillus bulgaricus, pentru zer sau Lactobacillus plantarum, pentru leii bisulfitice. Dup 8-10 zile de incubare la 45-500C, 90-98% din materia prim este transformat n acid lactic. Pe msur ce se formeaz, acidul lactic este neutralizat cu Ca(OH)2 astfel nct, produsul final obinut este lactatul de calciu. Acidul lactic este separat din lactatul de calciu prin tratare cu H2SO4 formndu-se astfel CaSO4 care precipit i poate fi separat prin filtrare. Soluia de acid lactic se concentreaz prin evaporare n vid pn la 50-80% din volumul iniial, dup care se purific.

C6H12O6 ( 2 CH3 CHOH COOH

glucoz acid lactic ((-hidroxipropionic)

2 CH3 CHOH COOH + CaCO3 ( (CH3 CHOH COO)2Ca + CO2 + H2O

acid lactic lactat de calciu

(CH3 CHOH COO)2Ca + H2SO4 ( 2 CH3 CHOH COOH + CaSO4 lactat de calciu acid lacticPrepararea inoculului

Bacteriile folosite pentru fermentaia lactic difer n funcie de materia prim utilizat i de temperatura de incubare. Lactobacili folosii sunt rezisteni la aciditate i foarte activi n producerea acidului lactic:

Lactobacillus bulgaricus

Lactobacillus casei

Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus leichamanni

Streptococcus lactis

Materiale necesare:

tulpini de bacterii lactice

ans, eprubete sterile, pipete sterile

ap distilat sau ser fiziologic sterile bec de gaz

Mod de lucru: Se introduc 5 ml de ap distilat sau ser fiziologic peste o cultur vegetativ de bacterii lactice, se omogenizeaz bine. Suspensia obinut va fi folosit ca inocul pentru nsmnarea baloanelor cu mediu de fermentaie

nainte de nsmnare se verific microscopic puritatea inoculului.Fermentaia la flacoane

Procesul de fermentaie decurge cu rezultate bune ntr-un mediu cu materii amidonoase zaharificate i cu aciditate mic (pH = 5,5).

Materii prime i materiale:

glucoz, (NH4)2HPO4, pepton, CaCO3 flacoane Erlenmeyer de 100 ml pahare Berzelius de 500 ml

pipete sterile

cilindru gradat hrtie de pH termostat

Mod de lucru:

Se prepar 100 ml mediul de cultur cu urmtoarea compoziie: glucoz

10%

(NH4)2HPO40,1%

pepton

0,5%

CaCO3

1%

pH = 5,5

Dup cntrire i dizolvare mediul se repartizez n flacoane Erlenmayer de 100 ml, cte 50 ml/flacon i se sterilizeaz la 1100C, 20 minute. Dup rcire, n fiecare flacon se adaug steril cte 2 ml inocul de bacterii lactice pregtite anterior. Flacoanele se incubeaz 72 de ore la 420C.

1. Variaia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaiei lactice1.1. Determinarea consumului de glucoz pe parcursul fermentaiei lactice

Dezvoltarea microorganismelor este influenat de variaiile concentraiei de substrat. Din acest motiv, n mediile de biosintez se determin i se urmrete pe tot parcursul bioprocesului, concentraia sursei de carbon.

n cazul n care sursa de carbon a unui mediu de biosintez este constituit din glucide, concentraia acestora se determin prin metoda Schoorl sau prin metoda Bertrand, bazate pe reacia Fehling sau prin metoda enzimatic. Menionm c primele dou metode, nu ofer un grad de precizie foarte ridicat, astfel nct, atunci cnd se dorete un control riguros al concentraiei sursei de carbon pe parcursul bioprocesului, se aplic alte metode.

n probele colectate pe parcursul biosintezei, se determin concentraia glucozei, dup care se traseaz curba de variaie a glucozei pe parcursul fermentaiei, nscriind pe abscis timpul de fermentaie, iar pe ordonat concentraia n glucoz.DETERMINAREA GLUCIDELOR REDUCTOARE PRIN METODA SCHOORLPrincipiul metodei

n mediul alcalin, la cald, glucidele reductoare reduc complexul cuprotartric, format prin amestecarea soluiilor Fehling I i Fehling II, pn la oxid cupros (Cu2O), precipitat rou crmiziu. Gruparea aldehidic se oxideaz la carboxil.

Soluia de sulfat de cupru i sarea Seignette, n exces de hidroxid de sodiu, poart numele de soluie Fehling. De obicei, aceasta se prepar n momentul ntrebuinrii prin amestecarea a dou soluii de baz, n cantiti egale:

soluia Fehling I, soluie cupric: CuSO4 x 5H2O

soluia Fehling II, soluie bazic: NaOH + tartrat dublu de Na i K (sare Seignette)

Complexul cuprotartric format oxideaz funciunea aldehidic a glucidului reductor (glucoza), el reducndu-se la oxid cupros. Cantitatea de oxid cupros este proporional cu cantitatea de glucoz din mediul de reacie.

n metoda Schoorl, restul de Cu(OH)2 care nu a fost redus se aciduleaz cu H2SO4, transformndu-se din nou n CuSO4 i I2 care se titreaz cu tiosulfat de sodiu.

La titrare, se utilizeaz ca indicator o soluie de amidon care formeaz cu iodul un compus colorat n albastru nchis. Dup titrare, soluia devine alb.

Reactivi necesari:

- soluie Fehling I

- soluie Fehling II

- soluie H2SO4 25%

- soluie KI 20%

- soluie amidon 1%

Mod de lucru:

Se preleveaz 10 ml din mediul de fermentaie i se filtreaz pe hrtie de filtru. Din proba filtrat se iau n lucru dup cum urmeaz:

n primele 48 de ore de fermentaie (glucoza variaz ntre 12-5%) 0,5 ml

ntre 48-96 ore de fermentaie (glucoza variaz ntre 5-0%) 1 ml

ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml, se pipeteaz 10 ml soluie Fehling I i 10 ml soluie Fehling II, 20 ml ap distilat i 0,5 ml / 1 ml prob. Se nclzete la flacr potrivit, pe o sit de azbest, astfel nct soluia s ajung la fierbere n aproximativ 3 minute, dup care se menine la fierbere 2 minute. Deasupra flaconului se aeaz o plnie se sticl pentru condensarea vaporilor de ap. Se rcete cu ap curent, dup care adaug 10 ml soluie H2SO4 25% i 10 ml KI 20%.

Soluia obinut se titreaz sub agitare cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,1N, pn cnd soluia devine glbuie. Se adaug cteva picturi soluie amidon 1% i se continu titrarea pn ce culoarea soluiei devine alb.

n paralel se realizeaz un martor folosind 20 ml ap distilat, 10 ml soluie Fehling I i 10 ml soluie Fehling II. La martor nu este necesar fierberea. n continuare se lucreaz identic ca la prob.

Tabelul 6. Corespondena ntre concentraia glucidelor reductoare i volumul de tiosulfat utilizat la titrareml Na2S2O30,1ml Na2S2O3Glucoz [mg]Zahr invertit [mg]Zaharoz [mg]

10,313,23,23,1

20,316,36,46,2

30,329,49,79,3

40,3212,613,012,4

50,3215,916,415,6

60,3219,219,818,8

70,3222,423,222,0

80,3225,626,525,0

90,3428,929,928,4

100,3432,333,431,7

110,3335,736,835,0

120,3439,040,338,5

130,3442,443,841,6

140,3545,847,344,9

150,3549,350,848,2

160,3552,854,351,6

170,3556,358,055,1

180,3558,961,858,7

190,3663,365,562,3

200,3666,969,465,9

Calculul rezultatelor:

(N - n)* F = X ml Na2S2O3

unde: N = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit pentru titrarea martorului

n = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei

F = factorul soluiei de tiosulfat de sodiu 0,1N (0.9900)

Echivalena n susbstan reductoare din proba luat n lucru se gsete n tabelul 6.

1. Cnd se iau n lucru 0,5 ml:

Concentraie n glucoz (%) = mg glucoz (tabel) x 0,2

2. Cnd se iau n lucru 1 ml prob:

Concentraie n glucoz (%) = mg glucoz (tabel) x 0,1n cazul n care sursa de carbon din mediu este reprezentat de un diglucid ca zaharoza, pentru determinarea coninutului n glucide reductoare se aplic aceeai metod, cu deosebirea c se efectuaez n prealabil o hidroliz a probei de analizat.

Pentru hidroliza diglucidelor se preleveaz din proba respectiv 5 ml, se dilueaz cu 20 ml ap distilat, se adaug 5 ml HCl 10%. Amestecul se menine n ap fierbinte la 670C, timp de 5 minut i apoi se rcete imediat n jet de ap rece. Se aduce amestecul la 50 ml cu ap distilat ntr-un balon cotat. Din aceast soluie se iau cte 5 ml pentru dozarea glucozei n modul descris mai sus.

Lucrarea practica nr. 41.2. Variaia pH-ului pe parcursul biosintezei de acid lacticPe parcursul procesului de fermentaie pH-ul mediului variaz, determinarea lui fcndu-se cu ajutorul hrtiei indicatoare de pH sau cu pH-metrul.

Pentru neutralizarea aciditii i pentru meninerea pH-ului n intervalul 5-5,5 (optim pentru dezvoltarea bacteriilor lactice), pe msur ce se formeaz acid lactic, n mediul de fermentaie se adaug CaCO3, Ca(OH)2 sau NH3. CaCO3 se poate aduga n mediu fie la nceputul fermentaiei, fie treptat, pe parcurs.

n timpul fermentaiei se colecteaz probe la intervale regulate de timp. Dac pH-ul scade sub 4 (att fermentaiile cu bacterii, ct i cu drojdii), se fac corecii cu CaCO3, soluii amoniacale (12,5%) sau cu soluii de NaOH 40%.

n final, se traseaz curba de pH, nscriind pe abscis timpul de fermentaie, iar pe ordonat valoarea pH-ului.

1.3. Determinarea concentraiei totale de acid lactic pe parcursul fermentaiei

Pe parcursul fermentaiei lactice exist permanent un amestec de acid lactic liber i lactat de calciu. Pentru determinarea concentraiei n acid lactic total existent n mediul de cultur se determin concentraia acidului lactic liber la care se adaug concentraia n acid lactic existent sub form de lactat de calciu.

A. Determinarea lactatului de calciu n mediul de fermentaie

Principiul metodei

Metoda se bazeaz pe dozarea ionilor de calciu prin complexarea lor cu sarea disodic a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA-Na2) sau complexon III, n prezen de murexid, ca indicator. Complexul iniial, format ntre ionii de calciu i indicator, este colorat n roz-violet.

Complexonat de calciu

Ionii de calciu rmai n mediul de reacie se titreaz cu soluie EDTA-Na2 formnd complexonatul de calciu. n momentul apariiei n soluie a unui exces de complexon III, acesta va reaciona cu complexul iniial, format ntre ionii de calciu i murexid, elibernd murexidul care coloreaz soluia n albastru.

Reactivi necesari: soluie EDTA 0,05M (C10H14N2Na2O8 x 2H2O): 18,612 g EDTA disodic se dizolv n ap distilat i se completeaz la 1000 ml

soluie tampon amoniacal pH = 10: 5,4 g clorur de amoniu se dizolv n 50 ml ap distilat, se adaug 35 ml NH3 25% i se completeaz cu ap distilat la 100 ml

soluie sulfat de magneziu 0,05M (MgSO4 x 7H2O): se cntresc 1,23 g i se dizolv n 100 ml ap distilat

eriocrom negru T (C20H12N3O7SNa): 1 g eriocrom negru T se amestec cu 100 g NaCl

proba de mediu: 20 ml lichid de fermentaie se trateaz un vrf de spatul de CaCO3 i se las 30 de minute n repaus pentru neutralizare, apoi se filtreaz pe hrtie de filtru

Mod de lucru:

Din mediul filtrat se msoar un volum de lichid astfel nct cantitatea de lactat de calciu s fie 200 mg.

Pe parcursul fermentaiei, numrul de ml prob luai n lucru variaz astfel:

24 ore

n = 3 ml

72 ore

n = 2 ml

72-96 oren = 1 ml

ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: n ml prob, 5 ml soluie tampon amoniacal i 100 ml ap distilat.

ntr-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu 0,05M, un vrf de spatul de eriocrom negru T. Se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraie albastr.

Soluia obinut (denumit edetat de Na i Mg) din flaconul (2) se adaug n flaconul (1) ce conine proba de titrat pentru observarea corect a virajului culorii (magneziul adugat intensific culoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat).

Soluia reunit se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraia albastr, notndu-se volumul total folosit.

Calculul rezultatelor:

Concentraia n lactat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

unde: A = volumul de EDTA cu care s-a titrat

f = factorul soluiei de EDTA 0,05M

n = numrul de ml prob luai n lucru

Cantitatea de acid lactic existent n mediul de cultur sub form de lactat de calciu se calculeaz conform urmtorului raionament:

218 g lactat de calciu 2 x 90 g acid lactic

b g lactat de calciu obinut Y g acid lactic

Y g acid lactic = 2 x 90 x b / 218

Concentraia de acid lactic sub form de lactat calculat pentru 1 ml prob luat n lucru se calculeaz astfel:

C acid lactic sub form de lactat (%) = Y x 100

Lucrarea practica nr. 5B. Determinarea acidului lactic liber n mediul de fermentaie

Principiul metodei

Acidul lactic formeaz n urma reaciei cu hidroxidul de sodiu, lactat de sodiu. Hidroxidul de sodiu rmas neconsumat se determin titrimetric cu o soluie de acid clorhidric 0,1N, n prezen de fenolftalein, ca indicator. Cantitatea de hidoxid de sodiu consumat n reacie este direct proporional cu cantitatea de acid lactic din prob.

CH3 CHOH COOH + NaOH CH3 CHOH COONa + H2O

HCl + NaOH NaCl + H2O

Mod de lucru:

Proba de mediu se filtreaz pe hrtie band albastr. ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml se introduc 0,5 ml prob, 20 ml ap distilat i 50 ml NaOH 0,1N. Se astup flaconul cu dop rodat i se las n repaus 30 de minute. Se titreaz n prezen de fenolftalein cu HCl 0,1N pn la decolorare. n paralel, se face un martor, n aceleai condiii dar fr prob de acid lactic.

Calculul rezultatelor:

1ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g acid lactic

unde:Vm = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea martorului

Vp = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea probei

g = cantitatea de prob luat n lucru

f = facturul soluiei de HCl 0,1N

CALCULUL RANDAMENTULUI DE OBINERE A ACIDULUI LACTICCaracterizarea bioprocesului de obinere a acidului lactic prin fermentaie se realizeaz prin calcularea mai multor randamente.

Pentru evidenierea gradului de utilizare a glucozei la sfritul fermentaiei, att pentru dezvoltarea microorganismelor ct i pentru biosintez, se calculeaz randamentul de consum al glucozei i randamentul de transformare a glucozei n acid lactic.Pentru evaluarea bioprocesului la sfritul biosintezei se calculeaz randamentul de obinere a acidului lactic.a) Randamentul de consum al glucozeiPrin calculul acestui randament se obin informaii referitoare la proporia total n care a fost consumat substratul pentru dezvoltarea microorganismelor i pentru producerea de acid lactic. Acesta nu ofer ns informaii referitoare la gradul de transformare a glucozei n acid lactic.

cantitatea de glucoz consumat

= x 100

cantitatea de glucoz iniial

b) Randamentul de transformare a glucozei n acid lacticAcest calcul ofer informaii cu privire la specificitatea microorganismului productor i capacitatea acestuia de a produce acid lactic i nu ali produi.cantitatea de glucoz transformat n acid lactic

= x 100

cantitatea de glucoz consumat

c) Randamentul de obinere a acidului lacticAcesta intereseaz din punct de vedere tehnologic, ntruct ofer informaii globale referitoare la desfurarea bioprocesului.

cantitatea de acid lactic obinut practic

= x 100

cantitatea de acid lactic teoretic

Cantitatea de acid lactic obinut practic, se calculeaz n funcie de volumul final al mediului de fermentaie.

Cantitatea teoretic de acid lactic se deduce din stoechiometria reaciei chimice de transformare a glucozei, innd cont de cantitatea introdus la nceputul procesului de fermentaie.Pentru o mai bun nelegere a randamentelor prezentate mai sus, se consider urmtorul exemplu:Exemplu: Se consider urmtoarele concentraii i volume iniiale i finale: volum iniial de fermentaie = 95 ml

volum final de fermentaie = 80 ml

concentraie iniial de glucoz = 9,0% (g/v)

concentraie de acid lactic = 3,5% (g/v)

concentraie de lactat de calciu = 4% (g/v)

concentraie final de glucoz = 0,3% (g/v)S se calculeze randamentele de consum al glucozei, de transformare a glucozei n acid lactic i cel de obinere a acidului lactic.a) Randamentul de consum al glucozeiCantitatea de glucoz iniial introdus n mediul de fermentaie se calculeaz astfel:

9 x 95 / 100 = 8,55 g glucoz iniialcantitatea de glucoz consumat = cantitatea iniial de glucoz cantitatea final de glucoz

Cantitatea de glucoz rmas n mediu la sfritul fermentaie se calculeaz astfel:

0,3 x 80 / 100 = 0,24 g glucoz finalCantitatea de glucoz consumat = 8,55 0,24 = 8,31 g glucoz comsumat( c = 8,31 / 8,55 x 100 = 97%

b) Randamentul de transformare a glucozei n acid lacticCantitatea de glucoz transformat n acid lactic se obine din calculul stoechiometric al reaciei globale:

C6H12O6 2 CH3 CHOH COOH

glucoz acid lactic

180 90

cantitatea total de acid lactic =cantitatea de acid lactic liber+cantitatea de acid lactic din lactatul de calciu

Cantitatea de acid lactic aflat sub form de lactat de calciu se calculeaz din reacia:

2 CH3 CHOH COOH + CaCO3 ( (CH3 CHOH COO)2Ca + CO2 + H2O

acid lactic lactat de calciu

90 218Cantitatea de acid lactic aflat ca lactat de calciu se calculeaz astfel:4 x 80 / 100 = 3,2 g lactat de calciu

218 g lactat de calciu 180 g acid lactic

3,2 g lactat de calciu .............. x g acid lactic

x = 3,2 x 180 / 218 = 2,64 g acid lactic din lactat de calciuCantitatea de acid lactic liber se calculeaz astfel: 3,5 x 80 / 100 = 2,8 g acid lactic liberCantitatea total de acid lactic = 2,8 + 2,64 = 5,44 g

Cantitatea de glucoz din care provine acidul lactic se calculeaz astfel:

180 g glucoz ..... 2 x 90 g acid lactic

y g glucoz ..... 5,44 g acid lactic

y = 180 x 5,44 / 180 = 5,44 g glucoz( tr = 5,44 / 8,3 x 100 = 65,5%

c) Randamentului de obinere a acidului lacticCantitatea de acid lactic teoretic ce ar fi trebuit obinut:

180 g glucoz ...... 2 x 90 g acid lactic

8,55 g glucoz ..... z g acid lactic

y = 180 x 8,55 / 180 = 8,55 g acid lactic teoretic

( = 5,44 / 8,55 x 100 = 63%

Lucrarea practica nr. 6FERMENTAIA ALCOOLICFermentaia alcoolic are numeroase aplicaii practice n industrie:

fabricarea spirtului, a buturilor spirtoase;

fabricarea vinului, a berii;

fabricarea sucurilor de fructe;

n panificaie.

Etanolul se poate obine prin metode chimice sau prin fermentaia complet de ctre unele drojdii a diferitelor substane hidrocarbonate, umat de distilarea i purificarea alcoolic.

Drojdiile au un echipament enzimatic foarte bogat, graie cruia, prin procese anaerobe de fermentaie ii pot procura energia necesar reaciior metabolice vitale.

C6H12O6 ( 2 CH3 CH2OH + 2 CO2

n realitate, mersul reaciei este mult mai complicat, formndu-se i numeroi compui secundari de fermentaie.

nceputul fermentaiei corespunde perioadei de multiplicare a drojdiei n care consumul sursei de carbon este de 2%, iar degajarea de dioxid de carbon este slab (fermentaie redus). Dup 20 de ore, fermentaia este nsoit de degajare intens de dioxid de carbon, concentraia sursei de carbon scznd de la 85%, la 15% (fermentaia principal). Urmeaz o perioad linitit, cu degajare slab de dioxid de carbon, concentraia sursei de carbon ajungnd la 2% (fermentaia secundar). Formarea etanolului se observ dup mai multe zile, n funcie de temperatur de incubare.

Prin procesul de fermentaie alcoolic, rezult o cantitate redus de energie, fapt confirmat i de randamentul energetic sczut, realizat ntr-o unitate de timp. Pentru a obine aceeai cantitate de energie rezultat prin respiraia unei molecule de glucoz, n fermentaia alcoolic sunt necesare 12 molecule de glucoz. ntr-un proces mixt de descompunere a glucidelor pe cale anaerob i aerob, 98% din aceast cantitate se folosete pentru fermentaie i numai 2% pentru respiraie.

Bilanul energetico-chimic al procesului de fermentaie alcoolic este:

C6H12O6 ( 2 C2H5OH + 2 CO2 18 kcal

n biotehnologie se realizeaz o fermentaie dirijat cu tulpini selecionate, care dureaz 20-24 de ore, aa cum se exemplific n continuare.

Materii prime i materiale necesare:

cultura stoc de Saccharomyces cerevisiae eprubete sterile

bec de gaz

ans

mediu lichid de dezvoltare

Prepararea inoculului

Fermentaia alcolic poate fi produs de o serie de microorganisme:

Saccharomyces cerevisiae Bacillus macerans

Sarcina ventriculi

Zymomonas mobilis

Erwinia amylovora

Thermoanaerobacter ethanolicus

n comparaie cu fermentaia alcoolic produs de drojdii, obinerea etanolului pe cale bacterian este un proces mai avantajos deoarece bacteriile cresc mai rapid i au o rat de productivitate mult mai mare.

Mod de lucru:

Se preleveaz cu ansa o cultur stoc de Saccharomyces cerevisiae i se colecteaz ntr-o eprubet steril cu mediu lichid. Se incubeaz static, 24 ore, la 280C. Se obine astfel o suspensie omogen de drojdii ce va constitui inoculul pentru fermentaia la nivel de laborator (flacoane).

Fermentaia la baloane

Se prepar 1.000 ml de mediu pentru multiplicarea drojdiilor cu urmtoarea compoziie:

Glucoz 15%

Extract de drojdie 0,4%

Pepton

0,4%

(NH4)2SO4

0,4%

KH2PO4

0,2%

Materii prime i materiale necesare:

flacoane Erlenmayer de 500 ml sterile balan tehnic spatule, pahare Berzelius (mensur) cilindru gradat baghet de sticl pH-box

bec de gaz

autoclavMod de lucru:

Se cntresc i se dizolv pe rnd substanele componente ale mediului de cultur, se corecteaz pH-ul la valoarea 4-5, se repartizeaz cte 250 ml n fiecare flacon Erlenmayer i se sterilizeaz prin autoclavare la 1150C, 15 minute. Fiecare flacon este nsmnat cu 10% inocul i se termostateaz la 280C, static, timp de 24-48 h.

Produsul rezultat conine n principal alcool etilic, n concentraie de 5-7% dar i cantiti mici de produi secundari, ca acetaldehida, glicerina, acizi organici volatili i alcooli superiori.

1. Variaia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaiei alcoolice

1.1. Determinarea variaiei sursei de carbon pe parcursul fermentaiei

Cnd se foloseete glucoza n mediul de fermentaie, determinarea consumului acesteia se face prin metoda Schoorl, fr hidroliz prealabil. n general, n mediile de cultur pentru drojdii se utilizeaz glucide fermentescibile ale cror concentraii variaz ntre 2 i 20%. Gradul de asimilare al glucidelor depinde de concentraia lor n mediu, de cantitatea de biomas, de temperatur i pH.

Cantitatea de glucoz consumat se determin recoltnd probe din 4 n 4 ore.

1.2. Determinarea coninutului n alcool etilic n mediul de fermentaie

Mod de lucru:

Se msoar ntr-un cilindru gradat un litru de mediu de fermentaie, se introduce ntr-un balon de 2 litri, dup care se distil la 2/3 din cantitatea introdus, urmrindu-se ca temperatura n corpul coloanei s creasc spre 1000C. Se msoar volumul distilat i se determin coninutul n alcool cu un alcoolmetrul. Cantitatea de alcool se exprim procentual, cu ajutorul urmtoarei formule:

% alcool = (V x C) / 100 ( v/v)

unde: V = volumul de alcool distilatC = concentraia de alcool determinat cu alcoolmetrul

Pentru o mai mare precizie, fraciunea distilat care conine acizi distilai se neutralizeaz cu NaOH n prezen de fenolftalein i se redistil. Raportarea cantitii de alcool se face ca n primul caz.2. Prelucrarea mediului de fermentaie alcoolic

n urma fermentaiei alcoolice se obine un produs ce conine alcool etilic i diferii produi secundari. Alcoolul etilic se recupereaz din mediul de fermentaie prin distilare. n urma distilrii simple se obine o soluie alcoolic avnd un coninut n alcool de 27-32%.

3. Calculul randamentului n alcool etilicRandamentul de obinere a alcoolului etilic obinut la sfritul procesului de fermentaie, se calculeaz astfel: cantitatea de alcool etilic obinut practic

( alcool = x 100 cantitatea de alcool etilic obinut teoretic

Cantitatea de alcool etilic teoretic se deduce din stoechiometria reaciei chimice, innd seama de cantitatea de glucoz pur iniial supus procesului de fermentaie:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 (1) 180 46

Exemplu: Se consider urmtoarele concentraii i volume iniiale i finale:

concentraie iniial de glucoz = 9,7% (g/v)

volum iniial mediu de fermentaie = 500 ml

concentraie final de alcool etilic = 5,2% (v/v)

volum final mediu de fermentaie = 495 ml

Cantitatea iniial de glucoz:

9,7 x 500 / 100 = 48,5 g glucoz iniial

Cantitatea de alcool etilic teoretic se calculeaz din ecuaia (1) astfel:

180 g glucoz . 92 g alcool etilic

48,5 g glucoz . X g alcool etilic

X = 92 x 48,5 / 180 = 24,7 g alcool etilic teoretic

Volumul de alcool etilic obinut practic:

5,2 x 495 / 100 = 25,74 ml alcool etilic practic

Masa alcoolului etilic din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

m = ( x v

unde: m = masa (g)

( = densitatea (g/ml); pentru alcoolul etilic 100% = 0,79 g/ml

v = volumul (ml)

Cantitatea de alcool etilic practic:

m alcool = 0,79 x 25,74 = 20,33 g alcool etilic practic

( = 20,33 / 24,7 x 100 = 82,32%Lucrarea practica nr. 7OBINEREA ACIDULUI GLUCONICAcidul gluconic este un acid slab, biodegradabil (98% n 48 ore), nu este coroziv, volatil sau toxic. n natur, acidul gluconic se gsete n fructe, miere, ceai de kombucha si vin.

Se poate obine prin oxidarea glucozei sub aciunea glucoz-oxidazei, produs de fungi (Aspergillus niger) sau a glucoz-dehidrogenazei, produs de bacterii (Gluconobacter). Fermentaia cu Aspergillus niger dateaz de cteva decenii i este cea mai rentabil metod de obinerea acidului gluconic. Acidul gluconic i derivaii lui i gsesc aplicaii n numeroase industrii: alimentar, farmaceutic, textil, a detergenilor i cea a produselor de igien.

n principal, este folosit ca aditiv alimentar (E574) pentru reglarea aciditatii produselor. El imprim un gust proaspt, acidulat multor produse alimentare ca vinul, sucurile de fructe, etc. Gluconatul de sodiu, datorit proprietii de chelatare a metalelor grele, superioar EDTA-ului, i gsete aplicaii n domenii din cele mai variate: n metalugie, pentru prevenirea formrii i curarea ruginii, n industria textil, pentru prevenirea formrii depunerilor de fier, n industria detergenilor, pentru ndeprtarea depozitelor calcaroase de pe metale i alte suprafee. De asemenea, mai poate fi folosit ca aditiv la cimentului reglnd procesul de maturare, crescndu-i duritatea, rezistena la ap, la nghe i la crpare.

Gluconatul de calciu este folosit n terapia deficienelor de calciu, n nutriia animalelor, iar pe cale injectabil, pentru tratarea malariei.Gluconolactona se folosete ca acidifiant slab n panificaie, n procesarea crnii, n coagularea proteinelor din soia, n industria produselor lactate, pentru creterea stabilitii la fierbere a laptelui i pentru obinerea unor tipuri de brnzeturi.

Microorganismele utilizate frecvent pentru obinerea acidului gluconic sunt:

Fungi: - Aspergillus niger

Penicillium chrysogenum

Bacterii: - Acetobacter aceti

Acetobacter gluconicum

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas ovalis

Pentru obinerea acidului gluconic prin fermentaie se folosete ca materie prim glucoza. Ea este oxidat incomplet sub aciunea glucozo-oxidazei elaborat de microorganismele din cultur. Metabolizarea glucozei se realizeaz n culturi submerse aerate, sub presiune, randamente mari de producie (90-95%) putnd fi obinute cu condiia neutralizrii acidului gluconic din mediu cu carbonat de calciu sau hidroxid de sodiu. n aceste condiii, produsul final se obine sub form de gluconat de Ca sau de Na, n funcie de natura substanei folosit pentru neutralizare.Reacia global devine:

Prepararea inoculului de Aspergillus nigerPentru nsmnarea mediului de fermentaie la nivel de laborator se folosete o suspensie de microorganisme, dezvoltat pe mediu solid.Mediul solid pentru obinerea conservului vegetativ are urmtoarea compoziie: must de mal 2%, agar 2%, pH=6,4. Mediul astfel preparat se repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz la 1100C, timp de 30 de minute, se rcete pe o suprafa nclinat i se nsmneaz cu o suspensie de spori provenit dintr-o cultur pur de Aspergillus niger. Incubarea se face la termostat, la 28-300C, timp de 7 zile, pentru sporulare.

Fermentaia la baloane agitaten scopul efecturii unei fermentaii gluconice n laborator, se pregtesc 300 ml mediu de cultur cu urmtoarea compoziie:

glucoz (dextroz) 20%

carbonat de calciu 1%

azotat de sodiu 0,05%

sulfat de magneziu 0,0125%

fosfat monopotasic 0,01%

Soluia de glucoz mpreun cu srurile (fr carbonatul de calciu) se repartizeaz n 6 baloane Erlenmayer de 100 ml, cte 50 ml/balon i apoi se sterilizeaz la 1200C, timp de 30 de minute. Dup sterilizarea i rcirea mediului, se adaug cte 0,5 g carbonat de calciu/balon, sterilizat separat n etuv la 1800C, 2 ore. Fiecare balon se nsmneaz cu 0,5% suspensie de spori preparat astfel: 5 ml ap distilat steril se adaug peste cultura de Aspergillus niger dezvoltat pe solid. Cultura se dezvolt la 28-300C sub agitare continua la 220 rpm, timp de 48 de ore. Dup aceast perioad cultura trebuie s s fie pur, s prezinte un miceliu crenelar, cu hife distincte la microscop, mpslite, dar nu aglomerate, iar pH-ul mediului trebuie s fie de aproximativ 6,0.

1. Determinarea coninutului de acid gluconic n mediul de fermentaieAcidului gluconic se determin de fapt ca gluconat de calciu, aceasta fiind forma regsit la sfritul procesului de fermentaie, dup care se calculeaz concentraia corespunztoare n acid gluconic.

Principiul metodeiMetoda se bazeaz pe dozarea ionilor de calciu prin complexare cu sarea disodic a acidului etilendiaminotetraacetic.Mod de lucru:

Se filtreaz 5 ml mediu de fermentaie pe hrtie de filtru (band albastr).

Din filtrat se msoar un volum de lichid astfel nct cantitatea de lactat de calciu s fie 300 mg.

ntr-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: 1 ml prob, 5 ml soluie tampon amoniacal i 100 ml ap distilat.

ntr-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu 0,05M, un vrf de spatul de eriocrom negru T. Se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraie albastr.

Soluia obinut (denumit edetat de Na i Mg) din flaconul (2) se adaug n flaconul (1) ce conine proba de titrat pentru observarea corect a virajului culorii (magneziul adugat intensific culoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat).

Soluia reunit se titreaz cu EDTA-Na2 0,05M pn la coloraia albastr, notndu-se volumul total folosit.

Calculul rezultatelor:

Concentraia n gluconat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

unde: A = volumul de EDTA cu care s-a titrat

f = factorul soluiei de EDTA 0,05M

n = numrul de ml prob luai n lucru

Cantitatea de acid gluconic existent n mediul de cultur sub form de gluconat de calciu se calculeaz conform urmtorului raionament:

430 g gluconat de calciu 2 x 196 g acid gluconic

Y g gluconat de calciu obinut Z g acid gluconic

Z g acid gluconic = 2 x 196 x Y / 430Concentraia de acid gluconic sub form de gluconat (%) = Z x 100

2. Prelucrarea mediului de fermentaie

Mediul de biosintez obinut n finalul fermentaiei gluconice se prelucreaz pentru izolarea acidului gluconic format pe parcursul bioprocesului i calculul randamentului. n scopul neutralizrii complete a acidului gluconic rezultat n urma oxidrii glucozei, se procedeaz la tratarea mediului de fermentaie cu hidroxid de calciu (carbonat de calciu carbonat de calciu sau carbonat de calciu.). Acesta se adaug cu o spatul, n proporie de 10% (10 g carbonat de calciu sau hidroxid de calciu la 100 ml mediu). Pentru definitivarea reaciei de neutralizare se nclzete amestecul la 60-700C, timp de 30 de minute, sub agitare continu. Dup neutralizare, amestecul de reacie se filtreaz fierbinte, pe filtru rmnnd biomasa i excesul de carbonat de calciu rmas nereacionat.

Soluia perfect limpede obinut dup filtrare se rcete pe baie de ghea, sub agitare continu, timp de 1-2 ore pentru cristalizarea gluconatul de calciu din soluie. Suspensia obinut se filtreaz n vederea separrii precipitatului. Turta de gluconat de calciu se esoreaz corespunztor, se usuc n etuv, n curent de aer cald la 40-500C, timp de 4-5 ore, se cntrete i se calculeaz randamentul de obinere.Lucrarea practica nr. 8OBINEREA DE BIOMAS PROTEIC CU TULPINI DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Biomasa proteic obinut cu tulpini de Saccharomyces constituie un produs intermediar ntre medicament i aliment, cu rol n tratamentul bolilor de nutriie i n echilibrarea metabolismelor dereglate. Biomasa poate fi utilizat n alimentaia unor categorii de populaie care necesit un aport suplimentar de nutrieni i vitamine.

Pentru alimentaia uman se utilizeaz microorganisme din genurile Saccharomyces, Torulopsis, Torula, Candida, Hansenula.

Mediile de cultur folosite pentru biosinteza proteic conin extracte de cereale, melase, alcooli, surse de azot (amoniac, sulfat de amoniu, fosfat de amoniu, uree, aminoacizi ca L-asparagina), fosfor (fosfat monopotasic, fosfat diamoniacal sau fosfat trisodic), potasiu (clorur de potasiu sau sulfat de potasiu), magneziu (sulfat de magneziu).

Creterea i dezvoltarea aerob a drojdiilor selecionate este efectuat la scar mare ntr-un proces de fermentaie continu, aseptic, n care substratul, substanele nutritive i aerul se introduc continuu ntr-un biorector, n timp ce lichidul fermentat este ndeprtat continuu. Biomasa se separ din mediul de fermentaie prin centrifugare i se usuc prin atomizare sau liofilizare.

Prepararea preinoculului de laborator

Materialul folosit pentru prepararea preinoculului se realizeaz cu o suspensie de microorganisme obinut prin splarea mediului solid, ce conine o cultura vegetativ de Saccharomyces cerevisiae (conserv vegetativ) cu ap distilat steril sau cu mediu lichid steril. Flacoanele pentru preinocul cu cte 20 ml mediu lichid, se nsmneaz cu 0,5 ml suspensie de drojdii per flacon, dup care se incubeaz la 28-300C, timpde 48 de ore, sub agitare. Pe parcursul fermentaiei se verific i se corecteaz pH-ului la valoarea 4 i se adaug etanol ca surs de carbon.

Fermentaia la flacoane agitate

Pentru inocul sau fermentaie la flacoane agitate se utilizeaz un mediu lichid ce conine:

extract de porumb

0,2%

KH2PO4

0,2%

(NH4)2SO4

0,2%

MgSO4x 7H2O

0,02%

soluie de microelemente 0,1%

etanol

0,25%

pH = 4

Fiecare flacon cu cte 100 ml mediu este nsmnat cu 10 ml preinocul. Incubarea se face la 28-300C, sub agitare (240 rpm). Pe parcursul fermentaiei pH-ul se menine constant la valoarea 4 i mediul de suplimenteaz cu etanol n porii.

La sfritul fermentaiei, procesul este caracterizat prin urmtoarele determinri:

cantitate de etanol rezidual

pH final

biomas umed (WCW) g/l

biomasa uscat (DCW) g/l (un inocul corespunztor trebuie s conin 6-10 g/l)

aspect microscopic

1. Controlul analitic al bioprocesului de obinere a proteinelor monocelulare

1.1. Determinarea biomasei umede (WCW= Wet Cell Weight)

Mod de lucru:

Proba se agit bine pentru omogenizare. ntr-o eprubet (cuv) de centrifug tarat n prealabil, se introduce un volum exact msurat din prob (10 ml) i se centrifugheaz la 4000 rpm, 20 minute. Dup nlturarea supernatantului se cntrete eprubeta cu biomas.

Formula de calcul:

WCW % = a x 10

unde: a = cantitatea de biomas umed centrifugat (greutatea eprubetei cu biomas - greutatea eprubetei goal)

10 = pentru a raporta la 100 ml mediu

1.2. Determinarea biomasei uscate (DCW= Dry Cell Weight)

Greutatea uscat reprezint ~20-25% din cea umed i este un indicator mai exact, deoarece celulele pot absorbi sau pierde ap n cantiti necorelate cu masa protoplasmatic.

Mod de lucru:

Proba se agit bine pentru omogenizare. ntr-o eprubet (cuv) de centrifug tarat n prealabil, se introduce un volum exact msurat din prob (10 ml) i se centrifugheaz la 4000 rpm, 20 minute. Dup nlturarea supernatantului eprubeta cu biomas se usuc, n trepte, mai nti la 600C, 4 ore, apoi la 105-1100C, 2 ore pn la greutate constant.

Formula de calcul:

DCW % = a x 10

unde: a = cantitatea de biomas umed centrifugat (greutatea eprubetei cu biomas - greutatea eprubetei goal)

10 = pentru a raporta la 100 ml mediu

Lucrarea practica nr. 9

BIOREACTOARE

1. Bioreactorul discontinuu de tip Braun

1.1. Descrierea i operarea bioreactorului n sistem batch

Pentru obinerea produselor biotehnologice, la nivel micropilot se utilizeaz diverse tipuri de bioreactoare, n funcie de tipul microorganismului utilizat, de natura produselor obinute i de productivitatea urmrit.

Bioreactoarele, n funcie de modul de operare pot fi conduse n regim discontinuu, semicontinuu sau continuu.

Bioreactorul BRAUN este un bioreactor cu funcionare discontinu (sistem batch), caracterizat prin operarea n arje, ceea ce presupune ncrcarea reactanilor, iar dup un interval de timp determinat, descrcarea produilor de reacie.

Acesta reprezint o construcie modular format din corpul bioreactorului i trei module de automatizare (figura 5).

Corpul bioreactorului este alctuit din dou tronsoane: unul din sticl, reprezentat de vasul din sticl i unul metalic reprezentat de capacul bioreactorului. Vasul din sticl are forma cilindric i o capacitate total de 5 l (capacitate util de 4 l) este prevazut la partea superioar cu un capac metalic format dintr-un disc solid de inox fixat de vasul din sticl cu ajutorul unui inel metalic.

Pe capac se gsesc montate dou buoane, unul pentru electrodul de pH i unul pentru cel de oxigen si 6 racorduri: dou pentru introducerea inoculului i cte unul pentru evacuarea aerului, pentru prelevarea probelor, pentru traductorul de temperatur i pentru intrarea aerului.

Bioreactorul BRAUNVasul de biosintez este de asemenea prevzut cu un condensator metalic, vertical, montat pe capac, avnd rolul de a condensa vaporii de ap eliberai n timpul procesului de biosintez din mediul de cultur sau care sunt antrenai de aerul ce iese permanent din bioreactor (n cazul fermentaiilor aerobe). Picturile de ap sunt returnate n mediul de fermentaie evitndu-se astfel o eventual concentrare a acestuia n timpul biosintezei. Condensatorul este prevzut cu o manta de nclzire-rcire, utilizat numai pentru rcire, fiind cuplat permanent la o surs de ap rece.

Bioreactorul este prevazut cu un plonjon, dispozitiv cu ajutorul cruia se recolteaz probe din mediul de fermentaie (prin creterea presiunii n vasul de biosintez). Plonjonul const ntr-o eav de inox care intr prin capacul bioreactorului i ajunge pn la fundul vasului. Pentru o mai bun colectare a probelor, plonjonul este curbat la partea inferioar.

Capacul bioreactorului mai este prevazut cu 4 racorduri de diametru mai mic, utilizate pentru diverse adaosuri, cum ar fi: soluie acid sau bazic bazic, antispumant, componente de mediu.Adaosurile se efectueaz cu ajutorul a trei pompe peristaltice, anexe bioreactorului i grupate ntr-un modul de sine-stttor. Aceste pompe funcioneaz manual sau automat, fiind prevazute cu tuburi speciale de silicon i vase de adaos sterilizabile. Principiul de funcionare al pompelor peristaltice se bazeaz pe o micare de contracie i una de relaxare a tubului de silicon, ceea ce creeaz o diferen de presiune care asigur deplasarea lichidului din vasul de adaos n bioreactor, prin tubul de silicon.

Bioreactorul este prevazut cu un rotametru, pentru masurarea debitului de aer furnizat de compresor. Intre compresor i rotametru se interpune un filtru de aer prevzut cu vat de sticl (prefiltrare aer); ntre rotametru i vasul de cultur este fixat un filtru Millipore sterilizabil, cu diametrul porilor mai mic de 0,2 mm, care asigur sterilizarea aerului.

Pe capacul bioreactorului este montat i sistemul de agitare, format dinntr-un motor, un cuplaj metalic de fixare i axul agitatorului. Turaia agitatorului variaz ntre 0-1200 rpm, la o capacitate a vasului de 5 l. Cnd vasul de biosintez este nlocuit cu unul similar, dar de capacitate de 10 l, turaia maxim este de 600 rpm.

1.2. Sistemul de automatizare i control al bioreactoruluia) Modulul de automatizare i control al agitriiBioprocesul poate fi condus la o turaie constant, care se fixeaz la nceput, potrivit recomandrilor biotehnologului sau la o turaie variabil (n anumite perioade de timp). Turaia agitatorului pe parcursul biosintezei poate fi programat pe panoul modulului.

b) Modulul de automatizare i control al parametrilor de proces: temperatur, pH, agitare, concentraie de O2 i antispumantPe panoul acestui modul se programeaz parametrii de bioproces, urmnd ca acetia s fie meninui la valoarea introdus iniial n memoria calculatorului.

c) Modulul de control i automatizare al pompelor peristaltice (pentru adaosul soluiilor necesare coreciei pH-ului i soluii de nutrieni).

Acest modul cuprinde att cele trei pompe peristaltice ct i sistemul de automatizare aferent. Cnd se intenioneaz adugarea automat a unei soluii, programarea pompei se realizeaz pe modulul de automatizare i control. De exemplu, dac se dorete meninerea pH-ului la o anumit valoare, cnd acesta se modific fa de valoarea prescris, pompa peristaltic se declaneaz automat adugnd n mediu soluie acid sau bazic pentru corecie.

Operaiile necesare conectrii aparatului sunt urmatoarele:

pregtirea aparatului

calibrarea pompelor

dup autoclavarea vasului de cultur, conectarea electrozilor

reglarea parametrilor de masur i control

Caractensticile tehnice ale bioreactorului sunt urmatoarele:

capacitate total: 5 1

capacitate util: 4 1

debit aer furnizat: 0-240 1/h

temperatura de lucru: 20-600C

suprapresiune: 0,2-0,5 atm

presiune de sterilizare: 2 bar

temperatura de sterilizare: 1200C

turaie agitator: 0-1200 rpm

1.3. Pregatirea bioreactorului n vederea efecturii unei arje de biosinteznainte de efectuarea unei arje de biosintez se procedeaz la sterilizarea bioreactorului i a anexelor acestuia dup procedeul descris n continuare. Vasul bioreactorului se demonteaz i se sterilizeaz gol n autoclav la 1200C, timp de 20 minute (o dat cu bioreactorul se sterilizeaz i filtrul de aer). Dup rcire, vasul bioreactorului se umple cu mediu de cultur i se sterilizeaz in nou prin autoclavare.

Dup rcire la 20-400C, corpul bioreactorului se aeaz pe masa de laborator asigurand un montaj corespunzator unei bune funcionari, se fixeaz motorul i apoi se introduc electrozii de pH i de oxigen.

Se inoculeaz mediul cu microorganismul specific, n conditii sterile i se fixeaz parametrii de lucru (temperatur, debit de aer, pH, concentraie de oxigen).

La ncheierea procesului, se va decupla instalaia i se va proceda la descrcarea, splarea i igienizarea utilajului.

Dup operaiile de splare i igienizare, vasul se va terge cu tifon uscat, apoi se vor cura toate racordurile i se vor unge cu vaselin siliconic numai suprafeele de etanare, pregtind astfel vasul pentru un nou experiment.

1.4. Controlul pH-ului n bioreactor1.4.1. Noiuni generale

ntr-o soluie apoas, concentraia absolut a ionilor de hidrogen are valori mici i este incomod de intrebuinat n practic. n anul 1909, S. Sorensen, a propus s se foloseasc pentru calculul concentraiei ionior de hidrogen dintr-un mediu lichid, logaritmul zecimal cu semn schimbat numit exponent de hidrogen sau pH. Astfel, pH-ul se poate defini:

pH = lg [H3O+] = lg (1 / [H3O+])

n mod analog se definete i exponentul ionilor de hidroxil:

pOH = lg [HO-] = lg (1 / [HO-])O soluie de HCl 1N are o concentraie a ionilor de hidrogen de 1 ion g/l.

[H3O+] = 1 ( pH = lg l = 0ntruct produsul ionic al apei este [H3O+] x [HO-] = 10-14,

[HO-] = 10-14 ion g/1Pentru concentraia unei baze se poate raiona n mod analog. Astfel, rezult c n solutii apoase, concentraia ionilor de hidrogen poate varia ntre 1 si 10-14 ion g/1.

Dac se logaritmeaz expresia produsului ionic al apei se obtine:

lg [H3O+] lg [HO-] = lg 10-14pH + pOH = 14Cu ajutorul acestei relaii se poate exprima aciditatea sau bazicitatea unei soluii apoase. n concluzie, n soluiile apoase, pH-ul poate varia ntre 0 si 14. ntr-o soluie cu pH zero, concentraia ionilor de hidrogen este 1, iar cea a ionilor hidroxil este 10-14. Rezult astfel c soluia este acid. n mod asemnator, cnd concentraia ionilor hidroxil este 1, pH-ul este 14, iar soluia este bazic. n acest caz, concentraia ionilor de hidrogen este 10-14.

[H3O+] = 10-7 ( [HO-] = 10-7 ( pH = 7

Atunci cnd concentraia ionilor de hidrogen este egal cu cea a ionilor hidroxil, pH-ul este 7, iar soluia este neutr.

Rezult c la valori de pH mai mari de 7 soluiile sunt bazice, iar dac pH-ul este mai mic de 7, soluiile sunt acide. Cnd pH-ul crete cu o unitate, concentraia ionilor de hidrogen descrete de 10 ori.

La determinarea pH-ului un factor important l constituie temperatura de lucru. De pild, punctul neutru scade o dat cu creterea temperaturii. n general, cnd nu se specific, masurarea pH-ului soluiilor se face la 250C (temperatura ambiant).

Determinarea pH-ului n soluie se realizeaz cu hrtii indicatoare sau cu electrozi de pH.

1.4.2. Electrodul de pH-IngoId

Principiul de aciuneDeterminarea pH-ului cu ajutorul electrozilor se realizeaz prin msurarea potenialului de electrod al pilelor. Fora electromotoare a unei pile se datoreaz diferenelor de potenial aprute la interfaa electrod-soluie. Aceast diferen de potenial se numete potential de electrod i apare deoarece ionii metalici din soluie au un potenial diferit fa de cel al ionilor din metal, astfel c ntre acetia se stabilete un echilibru.

ntruct potenialul unui singur electrod nu se poate determina se alege prin convenie un electrod de referin, al crui potenial, se consider zero. Ca electrozi de comparaie se folosesc frecvent electrodul de hidrogen, electrodul de calomel, etc.

n anul 1947, dr. Werner Ingold a introdus pe pia modelul electrozilor combinai, acetia fiind utilizai astzi n toat lumea. n electrodul combinat, electrodul de sticl i cel de referin formeaz un corp comun. Electrodul de referin nconjoar electrodul de sticl coaxial, iar electrolitul vine n contact electric cu proba prin intermediul unei membrane.

Electrozii combinai sunt de obicei formai din electrozi de calomel sau de argint. n cazul electrozilor sterilizabili, utilizai la msurarea pH-ului n bioreactoare, se folosete electrodul de argint. Acesta se noteaz simbolic prin:

Ag / AgCl solid / KCl (soluie) sau HCl

Electrodul de argint const dintr-o plac de argint, n contact cu clorur de argint, n soluie de acid clorhidric. La electrod au loc reacii inverse, mai nti de dizolvare a argintului solid i reacia lui cu ionii de clor pentru a forma clorura de argint, insolubil, pentru ca apoi clorura de argint s se dizolve i s reformeze argintul solid.

Ag Ag+ + e-Ag+ + Cl- AgCl

Reacia global devine: AgCl + e- Ag + Cl-Clorura de potasiu care nconjoar electrodul mpiedic creterea concentraiei ionilor de argint la electrozi, care ar putea face electrodul mai pozitiv i l-ar polariza.

n biotehnologie, pH-ul constituie un parametru biochimic deosebit de important pentru desfurarea diferitelor procese biologice, ceea ce impune controlul i corecia lui permanent la valoarea indicat n tehnologie.Electrodul de pH Ingold

Pstrarea electroduluiPentru o bun funcionare, electrodul de pH nu se pstreaz n atmosfer uscat (n aer liber), ci se menine permanent n soluia electrolitului de referin (KCl).

Dup o perioad lung de stocare, membrana de sticl trebuie reactivat cu acid fluorhidric procedndu-se astfel: membrana electrodului se introduce 1 minut, ntr-o soluie concentrat de acid fluorhidric, apoi se menine 12 ore n soluia stoc.

Calibrarea electrodului de pH aferent bioreactorului Braun

Electrodul de pH trebuie calibrat, nainte de a-l folosi ntr-un proces de fermentaie n bireactor. Electrodul de pH Ingold utilizat pentru controlul pH-ului n bioreactor este sterilizabil (suport sterilizare termic umed).

Calibrarea electrodului de pH se realizeaz la temperatura de fermentaie. Pentru calibrare, se utilizeaz dou soluii tampon de pH cunoscut. n general, se folosesc o soluie acid cu pH=4,1 i o soluie neutr cu pH=7.

Procedeul de calibrare a electrodului se realizeaz prin parcurgerea mai multor etape:

1. Se scoate electrodul din soluia de stocare i se spal cu ap distilat, cu ajutorul unei pisete;2. Se introduce electrodul n soluia tampon de pH=4, se selecteaz canalul Calibrare, se stabileste valoarea 4,1 pentru prima soluie tampon (BUF Z) i se confirm cu Enter. Sistemul de automatizare nregistreaz aceast valoare ca fiind pH=4,1. Cnd valoarea nregistrat pe panou este 4,1 se confirm din nou cu Enter;3. Se scoate electrodul din soluia tampon cu pH=4,1, se spal cu ap distilat i se introduce n soluia cu pH=7. Se selecteaz pe canalul Calibrare funcia corespunzatoare celei de-a doua soluii tampon (BUF S) i se confirm cu Enter. Sistemul de automatizare nregistreaz aceast valoare ca fiind pH=7. Dac semnalul msurat i nregistrat pe panoul de comand este constant i egal cu 7, se confirm din nou cu Enter;

4. Se selecteaz pe canalul Calibrare funcia corespunzatoare pantei (Slope). Cele dou puncte nregistrate formeaz o dreapt a crei pant trebuie s aib o anumit valoare. n momentul selectrii funciei Slope se introduce o valoare cuprins ntre 54-60 mV si se confirm cu Enter.

1.5. Msurarea concentraiei de oxigen din mediul de fermentaie1.5.1. Noiuni generale

Relaia de echilibru ntre presiunea total i presiunea parial de oxigen este dat de legea lui Henry:

pAG = pT x yAG = H x CAL (1)

unde: pAG = presiunea parial a componentului A n gazpT = presiunea total a gazuluiyAG = fracia molar a componentului A n amestecul gazosH = constanta lui Henry, care este funcie de temperatura de lucru i este tabelatCAL = solubilitatea componentului gazos A n lichid, de asemenea tabelat n funcie de temperatura de lucruDin ecuaia (1), rezult c la creterea presiunii totale a gazului sau a concentraiei de oxigen n amestecul gazos, n condiii de temperatur constant, solubilitatea componentului gazos n lichid crete peste valoarea de echilibru ceea ce se concretizez, n final, printr-o intensificare a transferului de mas dintre cele doua faze.De multe ori, n procesele de fermentaie care necesit o aerare intens, se introduce aer mbogit n oxigen pentru mbuntirea transferului de mas dintre cele dou faze.

1.5.2. Electrodul de oxigen

Concentraia oxigenului dizolvat n fermentatoare se msoar, n mod uzual, cu ajutorul unui electrod de oxigen.

Exist dou tipuri constructive pentru un astfel de electrod:

1. electrozi galvanici2. electrozi polarograficiLa ambele tipuri, o membran permeabil pentru oxigen separ fluidul de fermentaie, de electrodul de msur.

Principiul de aciune

Oxigenul difuzeaz prin membran la catod, unde reacioneaz i produce un curent electric ntre anod i catod, proporional cu presiunea parial a oxigenului n mediul de fermentaie.

Schema transferului de oxigen din mediu la catodul electrodului de masur

n funcie de debitul de alimentare a mediului, de proprietile fizico-chimice ale lichidului i de proporia de utilizare a oxigenului de ctre microorganisme, stratul de lichid ce nconjoar membrana de msur a electrodului formeaz o interfa ntre electrodul solid i lichidul de msurat.

Dup cum rezult si din figura 7, eliberarea i transmiterea moleculelor de oxigen din mediu spre catod se realizeaz prin procese de transfer de mas. ntruct nu exist o micare propriu-zis a fluidului prin membran sau prin soluia de electrolit, ci exist o micare redus prin pelicula de lichid de la interfaa membranei, n cazul operrii cu sonda electrodului oxigenul difuzeaz prin grosimea acestei pelicule de lichid. Acest proces necesit o perioad mai lung de timp i este cunoscut sub denumirea de timp de rspuns al electrolitului. Durata acestuia poate fi masurat prin transferarea rapid a sondei dintr-un mediu saturat cu azot ntr-un saturat cu oxigen. Timpul de rspuns este definit ca timpul necesar aparatului pentru a indica 63% din valoarea total a concentraiei de oxigen dizolvat n mediul de masurat. Electrozii comercializai la ora actual au timpi de rspuns cuprini ntre 10-100 secunde.

Timpul de rspuns al electrodului de oxigen poate fi mbuntit prin urmatoarele aciuni:

agitarea intens a lichidului n care se msoar concentraia de oxigen dizolvat micorarea grosimii peliculei de lichid de la suprafaa membranei micorarea catodului, deci a cantitii de oxigen consumat, prin utilizarea de microsondeAmbele tipuri de electrozi, galvanic si polarografic, msoar, presiunea parial aoxigenului sau tensiunea de oxigen n mediul de fermentaie i nu direct concentraia de oxigen dizolvat.

Pentru convertirea acestora n concentraie de oxigen dizolvat este necesar cunoaterea solubilitii oxigenului n lichidul de msurat, la temperatura i presiunea la care au loc msurtorile.

Operarea electrodului Cand se lucreaz prima dat cu sistemul sau cnd senzorul a fost deconectat de la sursa de tensiune pentru o durat mai mare de 5 sau 10 minute, acesta trebuie polarizat nainte de calibrare, prin conectare la transmitorul de oxigen sau la un modul de polarizare Mettler. Senzorul este polarizat i gata de operare dup 6 ore de polarizare. Mai puin de 6 ore vor fi suficiente dac senzorul a fost deconectat numai pentru cteva minute.

Calibrarea electroduluiElectrodul trebuie recalibrat nainte de fiecare msuratoare. Dac senzorul lucreaz cu un transmitor Mettler tip 170, este suficient numai o calibrare simpl ntr-un punct, ntr-un mediu saturat cu oxigen sau ntr-o incint cu aer saturat n vapori de ap. Aducerea la zero nu este necesar.

Dac lucrul se desfaoar n condiii sterile, sistemul trebuie calibrat dup sterilizare, deoarece temperatura poate modifica panta senzorului. Dup rcire, fermentatorul este aerat. La calibrare, dupa ce semnalul s-a stabilizat, se ajusteaza potentiometric "panta" pentru a aduce pe ecran valoarea dorit. Modificarea pantei poate atinge cteva procente cnd se utilizeaz un modul cu membrana nou. Modificarea pantei este de obicei foarte mic.

Dac senzorul lucreaz cu alte tipuri de transmitori Mettler trebuie efectuat o calibrare n 2 puncte. n mod particular, aceasta se recomand pentru msurtori la presiuni pariale de oxigen foarte sczute.

n timpul calibrrii punctului zero, senzorul trebuie sa fie plasat ntr-un gel de punct zero sau ntr-un alt mediu care nu conine oxigen (ex. 99,98% azot sau dioxid de carbon). Dac soluia analizat poate fi eliberat complet de oxigen prin saturare cu azot sau dioxid de carbon, aceasta poate fi utilizat drept etalon pentru calibrarea punctului zero. Dupa 10 minute citirea ar trebui sa fie stabil i punctul zero poate fi setat. Calibrarea pantei poate fi efectuat n ap saturat cu aer sau ntr-o incinta cu aer saturat n vapori de apa. Verificarea calibrrii se face periodic pentru validarea punctului zero, cu ajutorul unui simulator de oxigen Mettler.

- 1 -