NOTIUNI DE IMUNOLOGIE FUNDAMENTALA

ANTIGEN

Substanta straina organismului substanta proprie organismului

nerecunoscuta ca self in urma unor

modificari in structura (auto-antigen)

RASPUNS IMUN SPECIFIC

ANTICORPI

Ag + Ac Ag-Ac

ANTIGEN = orice substanta recunoscuta ca straina de un organism si care

suscita un raspuns imun dirijat impotriva ei insisi.

Raspunsul imun poate fi de tip umoral, adica se va concretiza prin secretia

de anticorpi care vor reactiona de maniera specifica si observabila cu acest

antigen.

ANTICORP = proteina protectoare produsa ca raspuns imun la stimularea

de catre un antigen.

- secretati de plasmocite

- numiti si imunoglobuline / gamaglobuline (se gasesc in

fractiunea gama a globulinelor serice)

- cea mai mare masa moleculara dintre proteinele serice

- se impart in 5 clase (Ig G, M, A , D, E) si subclase

!!! In transfuzie, discutam in special de IgM si IgG

Ig G = 73% din totalul Ig ;

- pot traversa placenta si sunt frecvent asociate cu maladia

hemolitica a nou-nascutului (MHNN)

- durata de viata= 60-70 zile

- nu induc aglutinarea eritrocitelor purtatoare de antigen

aflate in solutie salina ;au doar proprietatea de a le

sensibiliza (se fixeaza pe antigenul corespunzator)

Ig M = 8 % din totalul Ig

- molecula mult mai mare decat IgG

- nu pot trece placenta, deci nu pot determina MHNN

- durata de viata de maxim 10 zile

- aglutineaza eritrocitele purtatoare de antigen aflate in

solutie salina

- activeaza frecvent Complementul in cursul unei reactii

antigen-anticorp si antreneaza o hemoliza a eritrocitelor,

mai frecvent decat doar aglutinarea lor

Ig.G Ig.M

%din totalul imunoglobulinelor 73-80% 3- 8%

Greutate moleculara 150 000 D 900 000 D

Aglutinarea eritrocitelor in sol.salina nu da

Traverseaza placenta da nu

Activeaza complementul da da

Optim termic 37oC 4

oC

Tip de anticorpi Imuni/ naturali Naturali/ imuni

Complement = proteina serica normala frecvent implicata in procese

imunologice ; implicat in hemoliza intravasculara

Celule sensibilizate = celule pe care s-au fixat anticorpi, la nivelul

antigenelor corespunzatoare, dar care nu aglutineaza

Hemoliza = distrugerea/liza membranei eritrocitare, ceea ce antreneaza

eliberarea continutului lor, hemul si globina.Se produce in urma fixarii unui

anticorp hemolizant la antigenul eritrocitar specific, in prezenta

complementului

Clasificarea anticorpilor :

“naturali” regulari completi (aglutinanti)

dobanditi (imuni) iregulari incompleti (neaglutinanti)

Ac.naturali”= aparuti fara stimulare antigenica cunoscuta.Notiunea

sfideaza legile imunologiei conform carora anticorpii sunt sintetizati in urma

unui stimul antigenic clar identificat. In general de tip IgM .

Ac.dobanditi/imuni apar in urma unei stimulari antigenice evidente;

Anticorpii imuni de grup sanguin, de obicei de tip IgG, sunt produsi ca

raspuns la un antigen purtat de eritrocitele straine / proprii modificate, fie in

cursul unei transfuzii, fie in cursul unei sarcini, ca urmare a pasajului

sangelui fetal in circulatia materna sau in cadrul unui proces patologic care

induce modificari la nivelul Ag eritrocitare proprii.

In functie de natura antigenului care a determinat aparitia lor, se pot clasifica

in allo- si autoanticorpi.

Ac.regulari - apar in serul tuturor indivizilor care nu prezinta Ag.

corespunzator, in urma contactului cu acest antigen strain

Ac.iregulari –apar in serul unui procent din indivizii care nu prezinta Ag.

corespunzator, in urma contactului cu antigenul . Pot fi naturali sau imuni.

Ac. aglutinanti (completi)= provoaca aglutinare in solutie salina ; Ig M

Ac.neaglutinanti (incompleti) =produc doar sensibilizarea hematiei, fara

aglutinare; IgA, Ig G

RASPUNS IMUN:

1. celular – activarea Li T

2. umoral – activarea Li B , care vor secreta anticorpi

RASPUNS IMUN UMORAL

a. primar = se produce dupa primul contact al organismului cu antigenul ;

apare lent si anticorpii pot fi secretati in cantitati mici , uneori detectabili

abia dupa luni de zile ;anticorpii sunt de tip IgM (exista exceptii-aglutininele

alfa si beta la persoane de grup O ;vezi sistemul ABO)

b. secundar = se produce la o a doua expunere a organismului la acelasi

antigen ; apare rapid si se produc anticorpi de tip IgG in cantitate mare, intr-

un timp relativ scurt.

!!! Memoria imunologica

REACTIA ANTIGEN-ANTICORP:

Anticorpii se unesc cu antigenele formand complexe specifice Ag-Ac,

legaturile stabilindu-se pe baza complementaritatii chimice intre

determinantul antigenic si receptorul de recunoastere a antigenului .

.

!!! Pe suprafata moleculei de antigen exista grupari chimice denumite

determinanti antigenici ===== confera specificitate

!!! Pe suprafata anticorpilor exista

situsuri antigenice=receptori de recunoastere a determinantului

antigenic

Reactia Ag- Ac se produce:

- in vivo, in cadrul diverselor procese imune

!!! Factori determinanti, dependenti de caracteristicile :

- antigenului

- organismului gazda

- in vitro, in laboratorul de imunologie; se creeaza artificial conditiile

din organism

In vitro, formarea complexelor Ag - Ac depinde de :

• Cantitatile de Ag. si Ac :

-zona de echivalenta –cantitatea de agregate este

maxima

- Ac / Ag este in exces-cantitatea de

agregate este mica sau nula

• Numarul determinantilor antigenici si numarul situsurilor de

recunoastere

• Mediul de reactie – sarcini electrice, compozitie, temperature

In anumite situatii (Ac aglutinanti) , aceste complexe formeaza agregate

vizibile cu ochiul liber.

In cazul Ac neaglutinanti, cand nu apar agregate vizibile, desi anticorpii sunt

fixati pe hematii, se folosesc diferite tehnici care sa permita vizualizarea

complexelor antigen-anticorp.

In imunohematologie, numeroase tehnici utilizate pentru detectarea reactiilor

antigen-anticorp se bazeaza, pentru evidentierea acestora (fie a efectului

reactiei, fie a complexului Ag- Ac), pe reactii de :

A. aglutinare

B. hemoliza

A. Aglutinarea este un fenomen complex ce conduce la gruparea in gramezi

a celulelor (eritrocite, bacterii, virusi)

Aglutinarea eritrocitelor este vizibila cu ochiul liber sau la microscopul

optic.

Aglutinarea hematiilor este un fenomen determinat de mai multi factori

externi (imunologici, fizico-chimici), carora li se adauga caracteristici ale

eritrocitelor (plasticitatea membranei eritrocitare).

!!! Factor esential in aparitia aglutinarii = distanta medie dintre 2

hematii in suspensie in mediul salin, determinata de potentialul zeta:

In mediul salin, potentialul zeta (diferenta intre potentialul

electrostatic la suprafata eritrocitului si cel al norului cationic)

favorizeaza o forta de repulsie intre eritrocite, determinand mentinerea

unei distante minime de 35 nm intre 2 eritrocite vecine.

Pentru obtinerea aglutinarii trebuie ca dimensiunea Ac.(distanta dintre

2 Fab) sa fie egala sau superioara valorii de 35nm.

!!! Modalitati de modificare: procese pur imunologice/ alterari fiz-ch/

modificari ale mediului;

!!! Stabilitatea aglutinatelor este asigurata si intarita de legaturile

multiple ale unei molecule de Ac cu situsurile Ag prezente pe hematiile

vecine

Aglutinarea se poate produce prin mecanism immunologic (a),

neimunologic (b) sau pasiv(c).

a. Aglutinarea imunologica :

Aglomerarea de hematii datorita fixarii unui anticorp pe antigenele

corespunzatoare prezente pe mai multe hematii, ceea ce conduce la formarea

unei retele ce mentine hematiile impreuna.

- 2 etape principale :

*sensibilizarea celulelor purtatoare de antigen

* formarea de aglutinate

- mecanism = fenomen specific explicabil prin formarea unei retele

tridimensionale intre moleculele de Ac si structurile Ag

! Ac de tip Ig M au 10 situsuri de fixare a antigenului, pot determina atat

sensibilizarea hematiilor, cat si aglutinarea lor in mod direct, fara a fi

necesare artificii de tehnica pentru vizualizare.

! Ac de tip Ig G sunt mult mai mici, au doar cate 2 situsuri de fixare a

antigenului si pot sensibiliza hematiile, dar nu pot produce direct aglutinarea

hematiilor.

complex Ig.G-eritrocite complex Ig.M-eritrocite

(sensibilizare) (sensibilizare + aglutinare)

b.Aglutinare non-imunologica:

- Panaglutinare = anumite substante sunt capabile sa provoace aglutinarea

nespecifica a eritrocitelor normale, nesensibilizate (detergenti, siliciu

colloidal, cationi metalici,dextran, fitohemaglutinine)

!!! ATENTIE la tratamente PIV

- Poliaglutinabilitate = aglutinarea hematiilor modificate in vivo, cauzata

de Ac prezenti in toate serurile umane

c.Aglutinare pasiva:

- hematii folosite ca suport pentru fixarea pe membrana lor a unor Ag

care nu sunt sintetizate de ele ;prezenta in ser a unor Ac orientati fata de

Ag respective va fi pusa in evidenta prin aglutinarea hematiilor purtatoare

de Ag

B. Hemoliza

Se poate produce :

- in vivo (ex:AHAI)

- in vitro (in lab.)

compensata, fiziologica, de eliminare din circulatie a

eritrocitelor senescente

In vivo

necompensata, cu distrugere prematura a eritrocitelor

provocata de allo- si autoanticorpi

Localizare:

- intravasculara

- extravasculara

Poate fi provocata de anticorpi de tip:

- IgM

- IgG (uneori, in anumite conditii)

Fixarea anticorpilor hemolizanti pe antigen antreneaza activarea

complementului, ceea ce produce ruperea eritrocitelor.

!!! Hemoliza este deci martorul unei reactii antigen-anticorp de grup

sanguin si trebuie, ca si aglutinarea, sa fie observata, inregistrata si

interpretata in timpul efectuarii testelor.

Evidentierea Anticorpilor neaglutinanti “in vitro”se face prin artificii tehnice

care modifica fie mediul de reactie, fie eritrocitele (metode indirecte):

• scaderea incarcaturii electrice a eritrocitului prin tratare enzimatica cu

enzime proteolitice (papaina, bromelina, ficina,tripsina)

• aglutinare artificiala prin folosirea antiglobulinei ca reactiv (testul

Coombs)

• folosirea albuminei sau a altor polimeri incarcati electric (ser uman,

albumina bovina ,albumina de ou, PEG, etc.)

• combinatii: antiglobulina + enzima

Testul Coombs (testul cu ser antiglobulinic)

Utilizeaza serul antiglobulinic (contine Ac anti-imunoglobulina

umana) pentru detectarea prezentei de de Ac umani (globuline) pe

eritrocitele sensibilizate.

Este tehnica cea mai sensibila pt depistarea Ac.

TC –a. Direct : cerceteaza eritrocite presupuse a fi fost deja sensibilizate in

vivo/ in vitro

- b. indirect : cerceteaza prezenta in ser a unor Ac iregulari

Serul antiglobulinic- polispecific (anti-IgG + anti-C3)

- - monospecific (anti-Ig-G, anti-C3)

Test Coombs indirect

3 etape : a. sensibilizarea eritrocitelor : sunt puse in contact (incubate la 37 C,

45-60 min) cu serul pentru a permite eventualilor Ac prezenti in ser sa se

fixeze pe Ag corespunzatoare prezente pe eritrocite

!!! Atentie la cantitatile recomandate in prospect.

Ex (daca prospectul nu recomanda alte cantitati):

TUB: 3-4 pic de ser + 1 pic de eritrocite in suspensie 2-4% in SF

Incubare 45-60 min la 37C

Dupa incubare, se cerceteaza aparitia aglutinarii sau hemolizei.

- Daca se constata una din ele, se considera TEST POZITIV.

- Daca sunt absente, se trece la etapa urmatoare

b.spalarea : dupa incubare, eritrocitele sunt spalate de mai multe ori

(min 3-4)cu volume mari de SF pentru a indeparta orice urma de proteine

serice sau Ac nefixat

!!! Atentie la ph-ul SF(6,5-7,5)

Se arunca supernatantul.

c.adaugarea serului antiglobulinic : se adauga peste eritrocitele

spalate ;daca acestea au fost sensibilizate in etapa initiala de Ig sau C3,

Ac anti globulina umana le vor recunoaste, se vor fixa pe situsul

corespunzator, determinand indirect aglutinarea eritrocitelor.Daca

eritrocitele nu au fost sensibilizate cu Ac, aglutinarea nu apare.

Se adauga cantitatea recomandata in instructiuni, apoi se centrifughaza

imediat.Dupa centrifugare se citeste prezenta sau absenta aglutinarii.

+ 2 pic ser antiglobulinic si imediat centrifugare la 1000g 15-20 sec

Daca cantitatea de ser antiglobulinic este insuficienta, se poate obtine o

reactie negativa sau prea slaba, care nu se observa.

Pt a evita aceasta situatie, se poate face o verificare in cazul oricarui test

negativ:

se adauga 1 pic suspensie de eritrocite cunoscute sensibilizate cu IgG

in laborator (ca martor), se omogenizeaza si se centrifugheaza din nou;

trebuie sa obtinem o reactie pozitiva (aglutinare), ca dovada ca serul

antiglobulinic este intr-adevar activ si reactia negativa obtinuta anterior

este intr-adevar asa.

Daca la verificare se obtine o reactie negativa (absenta aglutinarii),

rezultatul negativ obtinut anterior nu poate fi validat.Se reface testul.

Prepararea eritrocitelor sensibilizate utilizate ca martor :

Eritrocite O RH(D) pozitiv - Spalare 3 ori in SF

- Se adauga volum la volum eritrocitele spalate cu reactiv

anti-D

- Incubare la 37C, 30 min

- Spalare 4 ori, apoi repunere in suspensie de 5% in SF

- Se amesteca 1 volum eritrocite martor din suspensia

anterioara + 2 vol de ser antiglobulinic

- Centrifugare

- Citire- aglutinare +++

Se pot pastra 48 h la 4C .

Cauze de reactii fals positive/ negative:

- fals positive: praf/corpi straini in tuburi, contanimare

incrucisata intre tuburi, centrifugare incorecta(prea rapida

sau prea lunga)

- fals negative: lavqaj insuficient, omiterea adaugarii serului

antiglobulinic, tuburi murdare, cheaguri, ph al SF

necorespunzator, nerespectarea vitezei de centrifugare,

intarziere intre spalare si adaugarea de ser antiglobulinic,

intarziere intre acest ultim moment si citirea rezultatelor.

T. C. Direct a. spalarea

b. adaugarea serului antiglobulinic

Situatii in care TCD ar putea fi pozitiv:

- AHAI

- MHNN

- Reactii posttransfuzionale hemolitice

Testul enzimatic

Papaina, bromelina, tripsina

Tratamentul eritrocitelor cu enzime permite detectarea unor Ac imuni, dar

nu pe toti/oricare, intrucat enzima distruge anumite structuri de pe

membrana eritrocitara, inclusiv antigene de grup sanguin (de ex din

ssistemele Duffy, MNS,Xg)

!!! Nu trebuie folosite ca inlocuitor al TCI, ci doar ca tehnica suplimentara,

complementara.

!!! Atentie la instructiuni

FACTORI CE INFLUENTEAZA REACTIILE Ag.-Ac in lab

1. Sarcina ionica a eritrocitelor

2. Temperatura

3. PH

4. « Prospetimea » probelor biologice( ser si eritrocite)

5. Raportul cantitativ Ac/Ag

6. Forta ionica a mediului de reactie

7. Caracteristicile Ac

Modalitati de aparitie a anticorpilor anti-Ag sanguine