Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

32
C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora Testul pentru determinarea grupelor sanguine ABO şi Rh Reactivi pentru grupele de sânge ABO Reactivi Anti-A, Anti-B, Anti-AB sunt derivaţi din liniile de celule hibridizate care sunt obţinute prin fuzionarea anticorpilor de şoarece ce produc limfocite B cu celule de mielom. Anticorpii derivaţi dintr-o singură clonă (celulele apărute din celula hibrid), precum şi amestecul de diferiţi anticorpi derivaţi de la diferite clone sunt desemnaţi ca monoclonali: Anti-A, Anti-B, Anti-AB. Reactivii Anti-A, Anti-B, Anti-AB au fost evaluaţi în toate tipurile de teste, incluzând sisteme automate în paralel cu reactivii ABO convenţionali, policlonali. Nu s-au observat reacţii fals-pozitive şi fals-negative între serul monoclonal şi cel policlonal. Afinitatea serului reactiv a fost adesea mai puternică decât a serului policlonal, în mod special faţă de celulele de nou- născuţi şi subgrupele cu reactivitate slabă. Material biologic Se foloseşte sânge total (puncţie în deget) Modul de lucru I. Testul pe lamă A.Testul rapid -Se pune o picătură de anti-A, Anti-B, Anti-AB pe o lamă de sticlă -Se adaugă o picătură mică de sânge total şi se omogenizează bine -Se roteşte uşor lama timp de 2 min. -Se observă apariţia aglutinării. Aglutinarea apare între 30-60 sec Rezultatele negative pot fi semnalate după 2 min. 1

description

Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Transcript of Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Page 1: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora

Testul pentru determinarea grupelor sanguine ABO şi Rh

Reactivi pentru grupele de sânge ABOReactivi Anti-A, Anti-B, Anti-AB sunt derivaţi din liniile de celule hibridizate care sunt

obţinute prin fuzionarea anticorpilor de şoarece ce produc limfocite B cu celule de mielom.Anticorpii derivaţi dintr-o singură clonă (celulele apărute din celula hibrid), precum şi

amestecul de diferiţi anticorpi derivaţi de la diferite clone sunt desemnaţi ca monoclonali: Anti-A, Anti-B, Anti-AB.

Reactivii Anti-A, Anti-B, Anti-AB au fost evaluaţi în toate tipurile de teste, incluzând sisteme automate în paralel cu reactivii ABO convenţionali, policlonali.

Nu s-au observat reacţii fals-pozitive şi fals-negative între serul monoclonal şi cel policlonal.

Afinitatea serului reactiv a fost adesea mai puternică decât a serului policlonal, în mod special faţă de celulele de nou-născuţi şi subgrupele cu reactivitate slabă.

Material biologicSe foloseşte sânge total (puncţie în deget)

Modul de lucru

I. Testul pe lamă

A.Testul rapid-Se pune o picătură de anti-A, Anti-B, Anti-AB pe o lamă de sticlă-Se adaugă o picătură mică de sânge total şi se omogenizează bine-Se roteşte uşor lama timp de 2 min. -Se observă apariţia aglutinării. Aglutinarea apare între 30-60 secRezultatele negative pot fi semnalate după 2 min.

B.Testul cu incubare-Se prepară o suspensie de celule 5-10% în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total-Se pune o picătură din fiecare reactiv Anti-A, Anti-B, anti-AB pe o lamă-Se adaugă o picătură de suspensie ori o picătură mică de sânge şi se amestecă bine-Se incubează 15-30 min. la temperatura de 200C-Se amestecă uşor şi se observă apariţia aglutinării

II. Testul în tub-Se prepară o suspensie de celule de 3-5% în soluţie salină izotonică-Se pune o picătură de Anti-A, Anti-B, Anti-AB în tubul notat corespunzător-Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine-Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm sau 20 sec. La 3000 rpm ori se incubează 20 min. la temperatura de 200C-Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă apariţia aglutinării

1

Page 2: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Reactivul anti-DAnticorpi monoclonali umani din clasa IgM, obţinuţi din culturi celulareSe păstrează la 2-80CConservare cu NaN3-0,1%Reactivul este pentru diagnosticul in vitro

ReactiviConţine anticorpi monoclonali de origine umană din clasa IgM, obţinut din culturi

celulare. Specificitatea şi reproductibilitatea sunt proprietăţi bine cunoscute la anticorpii monoclonali.

Majoritatea reactivilor anti-D monoclonali aparţin clasei de IgM.

Modul de lucru

I. Testul pe lamă

A. Testul rapidTestul trebuie efectuat pe o suprafaţă ce are temperatura cuprinsă între 20-370C

-Se pune o picătură de reactiv Anti-D pe lamă-Se adaugă o picătură mică de sânge total. Se omogenizează bine.-Se roteşte energic lama 2 min. Se observă dacă apare aglutinarea-Se citeşte rezultatul după 2 min. (suprafaţa uscată poate fi interpretată ca o reacţie fals-pozitivă.

B. Testul cu incubareSe poate folosi sânge total sau suspensia de celule-Se prepară o suspensie de 5-10% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total-Se pune câte o picătură de reactiv anti-D în cerculeţele lamei, ce se vor folosi-Se adaugă o picătură de suspensie sau o picătură mică de sînge total şi se omogenizează bine-Se incubează 30 minla 20-370C-Se agită uşor lama şi se observă aglutinarea

II. Testul în tub

-Se pregăteşte o suspensie 3-5% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică-Se pune o picătură de reactiv anti-D în tubul-probă-Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine-Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm-Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă prezenţa aglutinării. Dacă reacţia este negativă se incubează tubul 15 min. la 200C, se centrifughează 2 min la 1000 rpm, se dislocă uşor butonul de celule şi se observă aglutinarea.

Anti-A Anti-B Anti-ABGrupa A + - +

2

Page 3: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Grupa B - + +Grupa O - - -Grupa AB + + +

Testul pentru determinarea anticorpilor antistreptolizina OReacţia ASLO

Test calitativ şi cantitativ pentru explorarea stării de imunitate antitoxică faţă de toxinele streptococului.

Testul este bazat pe reacţia de aglutinare. Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecţii streptococice, ca şi a celui de reumatism articular acut (RAA).

Menţinerea titrului ASLO crescut chiar şi la câteva luni după puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii.

Principiul metodeiReactivul folosit este o suspensie de particule latex de polistiren încărcate cu streptolizina

O stabilizată. Reactivul a fost astfel preparat încât, în prezenţa unui titru ASLO normal de 200 ui/ml

sau mai crescut, să dea o aglutinare vizibilă a particulelor latex, fără diluarea serului.

Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia

Material biologicSerul de cercetat trebuie să fie clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic ori contaminat poate determina erori în obţinerea rezultatelor. Dacă

testul nu poate fi efectuat imediat, atunci serul se păstrează la 2-80C, maximum 72 ore. Pentru o perioadă mai îndelungată serul trebuie să fie păstrat congelat.

Modul de lucru

I. Testul ASLO calitativ

-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în unul din cercurile plăcuţei de testare. -Se pun 2 picături (50 l) de control (-) în al doilea cerc.-Cu o pipetă se pun câte o picătură de ser (45 l) din fiecare probă în cercurile următoare.-Se agită uşor suspensia de reactiv latex şi se pune în fiecare cerc folosit câte o picătură de reactiv. Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test în parte.-Se roteşte plăcuţa 2 min şi se citeşte aglutinarea imediat lângă o sursă de lumină.

3

Page 4: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

II. Testul ASLO cantitativ

-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire cu 30 min.-Se diluează probele 1/2; 1/4; 1/8 1/16 în soluţie salină izotonică. Se pot face diluţii şi mai mari dacă este necesar-Se pune 1 picătură (45 l) din fiecare diluţie în succesiunea de cercuri ale plăcuţei de testare-Se agită reactivul latex şi se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerc de testare. -Se omogenizează cele două picături folosind un beţişor pentru fiecare probă-Se roteşte uşor placa 2 min. şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină

Interpretarea testuluiReacţia ASLO negativă: obţinerea unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea

observată la controlul negativReacţia ASLO pozitivă: obţinerea unei aglutinări observată în cercul probei asemănătoare

cu cea observată la controlul pozitiv.Reacţia ASLO indică starea de imunitate antitoxică faţă de streptococ.Valori normale: între 0-200 uiValori crescute: I. > 200 uiLa pacienţii care au avut în ultimele trei luni o angină streptococică sau alte infecţii

streptocociceII. > 300 uiÎn infecţii streptococice: glomerulonefrită acută streptococică, scarlatină, purpură

reumatoidăIII. 600-2500 uiÎn reumatismul articular acut, reacţia ASLO ajută în stabilirea diagnosticului retrospectiv

al bolii, deoarece titrul anticorpilor antistreptolizină O se menţine crescut timp de câteva luni după puseul reumatismal acut.

Titrul ASLO creşte odată cu evoluţia puseului reumatismal. Reacţia ASLO este pozitivă în stenoză mitrală, amigdalită acută streptococică, endocardita streptococică lentă.

ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând asfel deveni

explozibili. Controlul pozitiv şi negativ a fost preparat din ser uman care a fost testat folosind metoda

licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HCV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la

temperatura de 2-80C. Reactivii nu se păstrează la congelator.

Testul pentru identificarea proteinei C reactive

Testul este utilizat pentru identificarea proteinei C reactive (CRP) în ser pentru diagnosticul unor afecţiuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaţiei.

Principiul metodei

4

Page 5: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o fracţiune de gamaglobulină a serului anti-uman CRP specific. Când CRP este prezentă în probă, se observă o aglutinare ce indică un conţinut de 6 mg/l.

Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia

Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o perioadă mai îndelungată, serul trebuie păstrat congelat.

Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min.-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare-Se pune o picătură (45 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează-Se agită uşor suspensia de reactiv latex-Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 l)Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină

Interpretarea rezultatelorReacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată în

controlul negativReacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba asemănătoare celei observate la

controlul pozitivProteina C reactivă nu este prezentă în serul pacienţilor aparent sănătoşi. Determinarea CRP poate servi la monitorizarea activităţii inflamatorii, fie ca

rezultat al terapiei, fie al remisiunii spontaneValori normale: <6 mg/lValori crescute:I. În faza iniţială a inflamaţiei în

-infecţii bacteriene: pneumonii-infarct miocardic, stări postoperatorii, afecţiuni maligne, mielom multiplu, lupus eritematos sistemic (LES)

II. Alte afecţiuni -febre reumatice, afecţiuni reumatice diverse, colagenoze, tuberculoza activă

Observaţii

5

Page 6: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni explozibili.

Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV.

Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la

temperatura de 2-80C, maximum 72 de ore. Reactivii nu se păstrează congelaţi.

Testul pentru identificarea factorului reumatoid

Principiul metodei Reactivul pentru factorul reumatoid (FR) este o suspensie de particule latex de polistiren

încărcate cu IgG uman. Sensibilitatea reactivului FR detectează o concentraţie minimă de 8 ui/ml, în acord cu WHO Internaţional Standard, fără diluarea probei. În mod practic, particulele de polistiren-latex învelite cu gamaglobulină denaturată sunt aglutinate de seruri ce conţin FR.

Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează testul

Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic sau contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă

testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat.

Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare-Se pune o picătură (45 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează-Se agită uşor suspensia de reactiv latex-Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 l)Pentru omogenizarea conţinutului se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină

Interpretarea rezultatelorReacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată în

controlul negativReacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba întocmai celei observate la controlul

pozitivFactorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. FR sunt prezenţi la

pacienţii care prezintă poliartrită reumatoidă (PR). În continuare se recomandă folosirea testului Waaler-Rose-test specific pentru determinarea FR împotriva IgG de animal

6

Page 7: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Factorul reumatoid este prezent şi la persoanele aparent sănătoase. Peste vârsta de 60 de ani, frecvenţa FR este de 5-6%

Valori normale: între 0-6 ui/mlValori patologice:Reacţia pozitivă: poliartrită reumatoidă; boli de colagen (la 10-50%), ex: lupus eritematos

sistemic, sclerodermie; unele disglobulinemii (ex: Kala-Azar, maladia Waldenström)Reacţia negativă: gută, reumatism articular acut, artroze

ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni

explozibili.Controlul pozitiv şi negativ din serul uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a

demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la

temperatura de 2-80C. Reactivii nu se congelează.Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive. Nu se

poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice.

Testul pentru identificarea Factorul Reumatoid (FR) în serul şi lichidul articular cu reactivul Waaler-Rose

Principiul metodeiReactivul Waaler-Rose este o suspensie stabilizată de hematii de oaie sensibilizate la

rândul lor cu anti IgG de şoarece. Sensibilitatea reactivului este pentru a detecta o cantitate minimă de FR de 6 ui/ml în acord cu WHO Internaţional Standard), fără diluarea probei.

Material biologicSe foloseşte serul clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă

testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru un timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat.

Modul de lucru

I. Testul calitativ

-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min.-Se agită bine reactivul astfel încât particulele să se disperseze-Se pun 2 picături (50 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile plăcuţei de testare-Se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerculeţ utilizat-Se omogenizează conţinutul cu un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se pune plăcuţa pe o suprafaţă plană 2 min.-După expirarea timpului se apleacă plăcuţa la 450 şi se aşteaptă 1 min.-Se citeşte prezenţa sau absenţa aglutinării vizibile aparută în acest timp. Dacă se depăşeşte timpul, atunci se va citi o reacţie de aglutinare nespecifică.

7

Page 8: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Prezenţa aglutinării indică prezenţa în ser a unei cantităţi de FR egal cu 6 ui/ml. Scăderea intensităţii aglutinării indică un nivel mai scăzut.

II. Testul semicantitativ

Acest test se realizează prin efectuarea unor diluţii succesive ale serului în soluţie salină izotonică.

Diluţii 12 14 18 116

Serul probei 100 lSoluţie salină 100 l 100 l 100 l 100 l

100 l100 l

100 l

Volumul probei 50 l 50 l 50 l 50 l

Calcularea conc. 6x2 6x4 6x8 6x16

Factorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. Factorii reumatoizi sunt prezenţi la majoritatea pacienţilor cu poliartrită reumatoidă (PR).

Interpretarea rezultatelorValori normale: între 0-6 ui/mlValori patologice: poliartrita reumatoidă (95% dintre cazuri), în unele colagenoze

(lupusul eritematos sistemic, dermatomiozită), în unele forme de neoplasm şi unele hemopatii maligne, intr-un numar mare de afecţiuni reumatismale ale copilăriei (spondilartrita anchilozantă), boli infecţioase (sifilis, TBC, hepatita virală), boli respiratorii (astm bronşic, fibroza pulmonară, bronşite).

ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni

explozibili.Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a

demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivul se va agita bine înainte de folosire, astfel încât suspensia să fie bine

omogenizată. Sensibilitatea testului depinde de volumul picăturii (50 l). Reactivii şi controalele sunt

stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-8 0C. Reactivul nu se păstrează congelat.

Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive. Nu se poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice.

8

Page 9: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Testul pentru identificarea AgHBs

Principiul metodeiTestul pentru identificarea AgHBs este un test rapid se efectuează din ser, este util în

diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatul testului poate fi citit vizual, fără niciun instrument. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a AgHBs din ser, cu ajutorul

metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpii monoclonali şi policlonali sunt folosiţi pentru identificarea AgHBs cu o înaltă sensibilitate. Testul durează aprox. 15 min.

Reactivi25 de plăcuţe imunocromatograficeReactivul 1=enzima conjugatăReactivul 2=soluţia de spălareReactivul 3=soluţia revelatoare

Material biologicPacientul nu necesită o pregătire prealabilă.

-Se recoltează sânge fără anticoagulant-Se lasă sângele să se coaguleze-Se separă serulDacă probele nu pot fi testate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelat. Nu se recomandă congelare şi decongelare repetată. -După decongelare, serul se omogenizează bine.

Modul de lucru-Se aduc toţi reactivii, plăcuţa şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului cu 30 min. Nu se amesteca capacele eprubetelor ce conţin probe-Se adaudă 300-400 l de ser în situsul de testare. Se lasă serul să se absoarbă complet-Se adaugă 2 picături Reactiv 1 (Enzima conjugată). -Se lasă soluţia să se absoarbă complet. Se aşteaptă 10 min.-Se adaugă 8 picături Reactiv 2 (Soluţia de spălare) în situsul de testare.-Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se îndepărtează filtrul-Se adaugă 3 picături Reactiv 3 (Revelator de culoare) în situsul de testare. -Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se adaugă încă 5 picături Reactiv 3-Se citeşte rezultatul după 3 min.

Interpretarea rezultatelorNegativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi miciIntens pozitiv: toate cele trei spoturi mici şi spotul mare sunt vizibile, iar spotul mare este

intens colorat

9

Page 10: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici şi spotul central, dar spotul mare nu foarte intens colorat

Neconcludent: când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau când nu apare nici un spot. Se repetă testul

ObservaţiiKitul trebuie păstrat la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, kitul poate fi

păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 30 0C. Flaconul cu reactiv reprezintă enzima conjugată şi trebuie păstrată la 2-80C.

Testul calitativ pentru identificarea AgHBs

Principiul metodeiReactivul este o suspensie de particule latex de polistiren ]nc[rcate cu gamaglobulină

anti-HBs înalt purificată. Când AgHBs este prezent în probă se observă o aglutinare evidentă.

Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia

Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Probele pot fi păstrate la 2-80C pentru 48 de ore, înainte

de efectuarea testului. Pentru o perioadă mai lungă serul trebuie păstrat congelat

Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei cu 30 min. înaintea folosirii-Se agită uşor reactivul pentru dispersia particulelor şi pentru omogenizare -Pentru fiecare probă se pregăteşte o eprubetă etichetată şi se adaugă în 2 ml soluţie salină izotonică, 50 l de probă (diluţie 1/40)-Se pipetează 1 picătură de control negativ şi pozitiv nediluat în câte un cerculeţ al plăcuţei.-Se pipetează 50 l de probă diluată într-un cerculeţ al plăcuţei şi 50 l de probă nediluată într-un alt cerculeţ-Se adaugă o picătură de suspensie latex AgHBs în fiecare cerculeţ utilizat. Se amestecă ambele picături de pe plăcuţă cu un beţişor-Se roteşte plăcuţa manual sau cu un rotator (60-80 rpm) timp de 5 min. -Se citeşte imediat lângă o sursă de lumină aglutinarea-Sensibilitatea testului descreşte proporţional cu temperatura camerei

Rezultatul testului calitativ:

Proba nediluată Proba diluată

Negativ Aglutinare.- Aglutinare –

10

Page 11: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

PozitivConc. scăzută Aglutinare + Aglutinare –Conc. medie Aglutinare+ Aglutinare +Conc. mare Aglutinare - Aglutinare +

ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu care în contact cu plumbul şi cuprul ţevilor poate forma

azidă metalică explozivă. După îndepărtarea reactivilor se spală sistemul de scurgere cu un volum mare de apă.

Reactivii se aruncă sub jet de apă pentru a preveni formarea de azidă metalică explozivă .Controlul pozitiv prezintă caracteristicile antigenice nu şi pe cele infecţioase. Totuşi, nici

o metodă de testare nu poate oferi siguranţa absolută. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.

Testul pentru identificarea anticorpilor anti-HBs

Principiul metodeiAcesta este un test rapid pentru identificarea anticorpilor anti-HBs în ser, fiind util în

diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatele pot fi citite vizual. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a anticorpilor anti-HBs în ser

cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpi sintetici şi recombinaţi sunt folosiţi pentru identificarea specifică a anticorpilor anti-HBs, metoda prezintă o sensibilitate crescută.

Anticorpii anti-HBs mai mici de 10 mui/l pot fi detectaţi în 10-15 min.Spotul mare sau linia celor 3 spoturi mici ne ajută la citirea rezultatelor pozitive şi

negative. Cele 3 spoturi mici servesc pentru controlul intern. Spotul mic central este un control slab pozitiv, celelalte 2 spoturi laterale sunt pentru controlul intens pozitiv. Aceste spoturi apar cînd reacţia imunoenzimatică este completă

Reactivi25 de pliculeţe imunocromatograficeR1 Enzima conjugatăR2 Soluţia de spălareR3 Soluţia de developare

Kitul se păstrează la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, acesta poate fi păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 300C.

Flaconul cu enzima conjugată trebuie păstrat la 2-80C.

Material biologicPacientul nu necesită în prealabil o pregătire. Se recoltează sânge într-o eprubetă fără

anticoagulant. Se lasă sângele să se coaguleze şi se separă serul. Dacă probele nu pot fi lucrate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelator. Se evită congelarea şi decongelarea repetată. După decongelare serul trebuie să se omogenizeze.

Modul de lucru

11

Page 12: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

-Se aduc toţi reactivii, plăcuţa, probele şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului. Pentru fiecare test se foloseşte o singură casetă.-Cu pipeta se adaugă 3 picături de soluţie de spălare (R2) în dispozitivul de testare. Se lasă să se absoarbă complet soluţia înaintea continuării testării. -Se adaugă 300-400 l de ser în situsul de testare.-Se adaugă 2 picături de Reactiv 1 (Enzima conjugată). Se lasă reactivul să se absoarbă complet (se aşteaptă 10 min).-Se adaugă 8 picături de Reactiv 3 (Soluţia de developare) în situsul de testare. Din nou se lasă să se absoarbă complet-Se adaugă alte 5 picături de Reactiv 3. Se lasă 2 min-Se citeşte rezultatul

Interpretarea rezultatelorNegativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi miciIntens pozitiv: Sunt vizibile toate cele 3 spoturi mici şi spotul mare. Spotul mare este

intens coloratSlab pozitiv: Apar cele 3 spoturi mici şi spotul mare central, dar spotul mare nu este

foarte intens coloratNeconcludent: Când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sunt vizibile sau când nu

apare nici un spot. În această situaţie se recomandă repetarea testului.

Testul pentru identificarea anticorpilor anti-HCV

Principiul metodeiEste un test rapid pentru identificarea anticorpilor anti-HCV din ser, care ajută la

diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic C.Se bazează pe principiul reacţiei imunoenzimatice, determinându-se anticorpii anti-HCV

în ser. Antigenele sintetice şi recombinate HCV sunt folosite pentru identificarea specifică a anticorpilor anti-HCV cu înaltă specificitate. Testul durează 3 min. Anticorpii anti-HCV nu reacţionează cu IgM, iar IgG este marker pentru HCV.

Formarea unui spot mare (Ref. A) şi o linie cu 3 spoturi mici indică un rezultat pozitiv sau negativ. Cele 3 spoturi mici servesc ca un control intern. Spotul central mic indică un control slab pozitiv şi cele 2 spoturi laterale indică un control intens pozitiv. Acestea apar după ce reacţia imunoenzimatică este completă.

Reactivi25 de teste (fiecare plăcuţă imunocromatografică este pentru un test)2 flacoane cu soluţie conjugată de aur coloidal

Material biologicRecoltarea probelor nu necesită pacientului o pregătire specială.

Recoltarea sângelui se face într-o eprubetă fără anticoagulant. Se foloseşte numai ser.

12

Page 13: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Modul de lucru-Se aduc toţi reactivii, plăcuţa, probele şi orice alte materiale necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului-Se adaugă 10 picături de soluţie conjugat în spaţiul de reacţie de pe plăcuţă-Se adaugă 30 l ser peste soluţia conjugat şi se agită-Folosind o pipetă se transferă toată soluţia din spaţiul de reacţie respectiv peste pre-filtrul care acoperă spaţiul în care se găseşte hârtia imunocromatografică-Se lasă ca probele să fie absorbite complet de pre-filtru-Se aşteaptă să apară spoturile de control înainte de a continua următoarea etapă.-Se adaugă 10 picături de soluţie conjugat peste prefiltru-Se lasă să se absoarbă toată soluţia-Se îndepărtează prefiltrul plăcuţei-Se citeşte rezultatul

Interpretarea rezultatelorNegativ: dacă numai cele 3 spoturi mici de pe linia de control sunt vizibile. Uneori

datorită concentraţiei crescute a probei poate să apară şi un spot superior liniei de control, mai puţin intens colorat

Pozitiv: spotul superior şi linia de control sunt vizibileSlab pozitiv: spotul superior apare mai puţin intens, dar este însoţit de linia de controlNeconcludent: când apare doar spotul central şi linia de control nu apare sau când atât

spotul central cât şi linia de control nu apare. În acest caz se recomandă repetarea testului.

Testul RPR carbon

Principiul metodeiReactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizată cu cristale de colesterol marcate cu

cardiolipin lecitină şi particule de mangal (pentru îmbunătăţirea interpretării rezultatelor). Reactivul are rolul de antigen faţă de anticorpii prezenţi în organismul persoanelor infectate cu Treponema pallidum.

Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 3 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 set de plăcuţe pe care se efectuează testul1 flacon pipeta pentru reactivul latex

Material biologicSe foloseşte ser clar, obţinut prin centrifugarea sângelui recoltat fără anticoagulant.

Probele pot fi păstrate la 2-80C maximum 48 de ore înainte de efectuarea testului. Pentru o perioadă mai lungă, serul trebuie păstrat congelat.

Serurile hemolizate, lipemice sau contaminate pot da erori la interpretarea rezultatelor.

Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire

13

Page 14: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

-Se agită uşor reactivul pentru dispersarea particulelor-Se pune câte o picătură din controlul pozitiv şi negativ în câte un cerculeţ al plăcuţei-Se pune câte o picătură (50 l) de ser nediluat din fiecare probă în câte unul din cercurile plăcuţei-Se adaugă o picătură de reactiv RPR Carbon, ori se pipetează 20 l de reactiv în fiecare cerculeţ folosit-Se amestecă ambele picături, fără să se disperseze pe toată suprafaţa cercului-Se roteşte plăcuţa manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min. -Se citeşte prezenţa aglutinării vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecifică poate apare dacă testul este citit mai târziu de 8 min.Testul semicantitativ-Se poate efectua o diluţie succesivă cu soluţie salină izotonică-Titrul serului este diluţia cea mai mare care produce reacţia pozitivă

Interpretarea rezultatuluiRezultat pozitiv: prezenţa unor nori cenuşii pe albul plăcuţeiRezultat negativ: lipsa unei reacţii de floculare uniforme şi a unei culori cenuşii Sifilisul este o boală cu transmitere sexuală, cauzată de Treponema pallidum.

ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Pb şi Cu putând deveni

explozibili. Controlul pozitiv şi negativ din ser uman a fost testat folosind metoda licenţiată FDA şi s-

a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii faţă AgHBs şi HIV. Oricum, toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.

Se pune reactivul de RPR Carbon în sticluţa specială înainte de folosire. Acesta trebuie foarte bine omogenizat, reactivul se agită bine înainte de folosire. Nu se folosesc decât picăturile care sunt puse perpendicular pe suprafaţa plăcuţei. Dacă nu se foloseşte sticluţa picurătoare, atunci se foloseşte pipeta automată pentru 20 l. Sensibilitatea acestui test depinde de volumul picăturii. Reactivul şi controalele se păstrează la 2-80C.

Tehnica ELISA

În cazul utilizării sistemelor de fază solidă pentru separarea moleculelor libere şi a celor marcate, tehnica este denumită ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe reacţia Ag-Ac.

Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii:- Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plăci de pastic cu godeuri)- Ag sau Ac din proba de testat se leagă specific de reactantul imobilizat- reactantul marcat enzimatic reacţionează cu complexul reactant imobilizat-Ag (sau Ac)

din probă. Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzimă este activ atât

imunologic cât şi enzimatic şi reacţionează atât cu Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid cât şi cu substratul corespunzător enzimei.

Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi complexul Ag-Ac iniţial se realizează prin adăugarea unui substrat corespunzător enzimei utilizate.

14

Page 15: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Formarea complexului este identificată prin reacţia de culoare care apare la adăugarea substratului specific (p-nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi tetrametilbenzidina pentru peroxidază).

Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag, respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric folosind un cititor de plăci ELISA).

Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenţierea Ac (boliinfecţioase, autoimune) sau a Ag (boli infecţioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie).

Teste calitative de aglutinare sunt utilizate in demonstrarea prezentei unui Ac sau a unui Ag. Anticorpii sunt mixati cu antigenele particulate si un test pozitiv este indicat de aglutinarea Ag particulat.

De exemplu se pot mixa eritrocitele unui pacient cu anticorpi in scopul determinarii grupei sanguine sau se amesteca Er cu grupa cunoscuta cu serul unui pacient primitor pentru a determina prezenta sau nu de Ac anti – Er in serul acestuia.Teste cantitative de aglutinare utilizate pentru a masura nivelul de Ag particulate. In acest tip de teste se fac dilutii seriale pe o proba si apoi se adauga un numar fix de Er sau bacterii sau alte Ag particulate. Dilutia maxima ce produce aglutinare vizibila constituie valoare titru.In figura de mai jos, test de hemaglutinare cantitativa.

Ocazional, daca este mare concentratia de Ac (dilutii joase), nu apare aglutinare apoi daca proba este diluata, apare aglutinarea (vezi pacientul 6 in schema de mai sus). Lipsa aglutinarii la concentratii mari de Ac poarta numele de efect prozone. Lipsa aglutinarii la concentratii mari se datoreaza excesului de Ac care determina formarea de complexe mici care nu se aglomereaza in aglutinate.Aplicatii ale testului de aglutinare:

15

Page 16: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

a. Determinarea grupelor sanguine

Hemaglutinarea este de rutina folosita pentru tiparea grupelor sanguine – mixare Er pe lamela cu Ac anti_A sau anti_B si daca Ag este prezent, apare aglutinare pe lama.

b. Investigarea infectiilor bacteriene – de exemplu, cresterea de 4 ori a titrului de Ac fata de o bacterie anume este considerate titru semnificativ si indica o infectie cu acel tip de bacteria.

Aglutinarea bacteriana – este folosita pentru depistarea de Ac anti bacterieni in diagnosticul infectiei. Prezenta antigenelor bacteriene in organism determina raspuns de tip imunoglobuline specific. Punerea in contact a serului pacientului cu dilutii seriale de Ag bacteriene al presupusei infectii, determina prezenta sau nu a Ac in serul de cercetatAspecte practice – desi testul este usor de facut, este numai semicantitativ.Hemaglutinarea pasivaTestul de aglutinare lucreaza numai cu Ag particulate. Cu toate acestea, este posibila acoperirea Er cu un Ag solubil (ex: viral, polizaharid, haptena) si apoi sa se foloseasca Er acoperite de Ag solubil pentru a testa/determina prezenta de Ac specifici, anti-antigen solubil (vezi figura de mai jos). Acest test se numeste hemaglutinare pasiva, se lucreaza exact ca testele de aglutinare. Este util pentru detectia Ac anti-Ag solubile si pt detectia Ac anti-virali.De-a lungul anilor s-a trecut de la Er la utilizarea unor particule sintetice cum ar fi particulele de latex.Aglutinarea cu latex – anticorpii sunt atasati pe support de latex ce serveste ca marker pentru detctarea reactiei Ag-Ac. Fiecare particula de latex cu dimensiune de aproximativ 1 micron, poate fi incarcata cu mii de molecule de Ac. Particulele de latex-Ac formeaza o suspensie laptoasa si in contact cu proba de cercetat ce contine antigenul cautat, se formeaza agregate vizibile de complexe Ag-Ac. Figura de mai jos ilustreaza evenimentele asociate reactiei de aglutinare associate cu particulele de latex.

Latex aglutinarea se face de obicei pe lame de sticla sau pe suprafete de carton special tratate, utilizand volume mici de particule de latex si serul de cercetat. In laboratoarele clinice testul este folosit pentru detectarea de Ag microbiene solubile direct in ser sau lichidul cefalorahidian sau pentru identificarea unor Ag bacteriene din culturi.

. Testul antiglobulinic – testul Coomb’s

1. Testul Coomb’s direct – Cand Ac se leaga la Er nu determina intotdeauna aglutinare datorita excesului de Ag sau de Ac sau in cazul modificarilor electrice la nivelul Er ce impiedica reactiile de linkare. Acesti Ac care se leaga la Er dar nu determina aglutinare se numesc Ac incompleti – definitie functionala si nu una care sa sugereze structura diferita a Ac. Pt a fi detectati Ac non-aglutinanti de pe suprafata Er se adauga un al doilea Ac indreptat impotriva Ac de pe Er. Acest Ac anti-imunoglobulina poate cross-linka Er si determina aglutinarea = test Coomb’s direct.

16

Page 17: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

2. Testul Coomb’s indirect – detecteaza prezenta de Ac antir-Er prezenti in ser. Presupune incubarea Er cu probe de ser, spalarea lor pt indepartarea Ac nelegati si apoi adaugarea unui al doilea Ac anti-imunoglobulina care va depista Ac legati pe suprafata Er si va cross-linka celulele.

Aplicatii practice – detectarea Ac anti – Rh – in general Ac anti-Rh nu aglutineaza Er. Astfel Er copilului cu Rh+ nascut din mama Rh- care are Ac anti-Rh, pot fi acoperite cu acesti Ac. Pt a verifica se face un test Coomb’s direct. Pt a verifica prezenta Ac anti-Rh in sangele mamei se face testul Coomb’s indirect.

I. REACTII ANTIGEN-ANTICORP

INTRODUCEREImunologia este stiinta care se ocupa cu studiul proceselor de aparare. Termenul de imunitate are ca subanteles in sens foarte larg “rezistenta”, sistemul imun aparand in evolutia biologica a organismelor pentru a le proteja de agenti patogeni. Modalitatile de contact cu microorganismele sunt variate ca atare sunt necesare variate tipuri de raspunsuri imune astfel incat apararea sa fie eficienta. Nivelele de interventie in apararea imuna se impart in doua mari categorii: apararea imuna nespecifica si apararea imuna specifica sau adaptativa.Principalele diferente intre cele doua tipuri de raspuns imun ar fi ca apararea imuna adaptativa raspunde inalt specific unui agent patogen particular si ca reexpunerea imbunatateste raspunsul astfel ca trasaturile principale ale raspunsului imun adaptativ sunt specificitatea si memoria.Componentele apararii imune nespecifice sunt:

bariera epiteliala – tegumentele si mucoasele constituie bariere fizice impotriva raspandirii agentilor patogeni

17

Page 18: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

inflamatia - proces de aparare si limitare a extensiei agentului patogen

fagocitoza - proces de aparare contra agentilor patogeni particulati pe care fagocitele ii digera enzimatic

mediatori solubili ai apararii nespecifice:

o sistemul complementului – grup de componente serice nespecifice ce mediaza fagocitoza, controleaza inflamatia si interactioneaza cu anticorpii, avand rol major in eliminarea substantelor straine;

o citokine – grup mare de molecule (interferoni, interleukine, factori de crestere, chemokine, TNF, TGF, etc) cu rol in semnalizarea intercelulara in timpul raspunsurilor imune.

Apararea imuna specifica implica doua etape majore: 1. recunoasterea antigenului

2. raspunsul imun umoral sau celular pentru eradicarea acestuia

Antigenul (Ag) este o substanta de origine endogena sau exogena capabila sa induca un raspuns imun care consta in stimularea si proliferarea limfocitelor si in sinteza unor molecule de recunoastere – anticorpi (Ac) sau receptori celulari ce se combina specific in vivo sau in vitro cu Ag declansator.Anticorpii sunt proteine sintetizate ca parte a raspunsului imun la o substanta straina (Ag) si care se leaga specific la Ag. Situsul de combinare al unui anticorp cu antigenul se afla in portiunea Fab a moleculei, zona hipervariabila. Combinarea se face pe principiul cheie-broasca. Legaturile cu antigenul sunt de tip necovalent (legaturi de hidrogen, forte Van der Waals, elctrostatice si hidrofobe), reversibile. Multiple legaturi intre Ac si Ag asigura intensitatea interactiunii Ag-Ac.Interactiunea antigen-anticorp in gel sau solutii constituie baza metodelor imunochimice cantitative utilizate in diagnosticul imunologic de laborator. Aceasta reactie de legare este guvernata de legea masei care in acest caz consta in aceea ca antigenul liber [Ag] si anticorpii liberi [Ac] interactioneaza reversibil pentru a forma complexe [Ag-Ac]. Relatia intre antigenul liber si cel legat in complexe cu anticorpi este determinata de constanta de echilibru sau de afinitate Ka care este egala cu raportul intre constantele de asociere K1 si disociere K2 conform formulei:

[Ag] + [Ac] K1↔K2 [Ag-Ac]Ka = K1/K2 = [Ag-Ac]/ [Ag] [Ac]

Valoarea constantei Ka depinde de intensitatea legaturilor Ag-Ac si, pentru ca toate antiserurile contin populatii de Ac cu variate capacitati de legare, valoarea Ka pentru un ser este o masura a valorii medii a intensitatii de legare pentru toate populatiile de anticorpi prezente. Adaugarea unei cantitati mari de antigen la o cantitate cunoscuta fixa de anticorpi conduce la formarea unei cantitati mari de complexe [Ag-Ac]. La o anumita concentratie de antigen, jumatate din situsurile de legare ale anticorpilor devin saturate astfel ca [Ag-Ac]= [Ac]. La echilibru, rata de asociere si cea de disociere sunt constante, astfel ca numarul de complexe Ag-Ac care se formeaza este egal cu al celor care se disociaza. Tipuri de reactii imunologice in vitro

18

Page 19: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

In functie de modul de evidentiere al reactiei in vitro, exista interactiuni Ag-Ac cu rezultat vizibil direct – reactiile de precipitare sau aglutinare sau interactiuni al caror rezultat este vizibil doar prin marcarea Ac:

fluorocrom – imunofluorescenta izotopi – dozare radioimunologica enzime – dozare imunoenzimatica

In functie de rezultatul final cuantificat, testele antigen-anticorp pot fi clasificate in primare, secundare si tertiare: evidentiere reactie Ag-Ac, evidentiere manifestari secundare (precipitare, floculare, aglutinare, fixare complement), respectiv evidentiere efecte biologice (ex: efectele biologice ale activarii complementului, cum ar fi opsonizarea, chemotaxia, fagocitoza).Reactiile primare – teste de evidentiere a recunoasterii specifice a Ag de catre Ac. Teste cantitative includ imunofluorescenta, RIA, alte metode imunoenzimatice. In general aceste metode necesita fie antigen purificat, fie marcarea cu radioizotopi, fluorescenta sau enzimatica a anticorpului, sau implica o metoda de separare a complexelor Ag-Ac de Ag, Ac liberi din solutie.Reactiile secundare – includ reactiile de precipitare in solutie sau gel, aglutinarea directa sau hemaglutinarea si fixarea complementului.Reactiile tertiare – includ opsonizarea, fagocitoza, chemotaxia, aderenta imuna, degradarea celulara.Factori ce influenteaza masurarea reactiilor antigen-anticorp sunt: afinitatea – cu cat este mai mare afinitatea anticorpului pentru antigen, cu atat este mai stabila

reactia;

aviditatea – reactia intre antigene multivalente si anticorpi multivalenti este mult mai stabila si mai usor de detectat;

raportul Ag-Ac: marimea complexelor Ag-Ac este corelata cu concentratia de Ag si de Ac;

forma fizica a Ag – un Ag particulat va fi depistat prin reactii de aglutinare, un Ag solubil va fi depistat prin reactii de precipitare.

Reactiile Ag-Ac sunt specifice si reversibile.Reversibilitatea: complexul Ag-Ac poate fi disociat de caldura, acidifierea mediului (pH<3) sau aportul de ioni in cantitate mare.

Specificitatea: Ag este capacitatea acestuia de a reactiona specific numai cu receptorii solubili (Ac) sau membranari a caror productie a fost indusa de stimulul antigenic. Cunoasterea unuia dintre reactanti (Ag sau Ac ) permite identificarea celuilalt. Din punct de vedere al terminologiei folosite, specificitatea este un termen aplicabil conditiilor in vivo, in timp ce pentru conditiile in vitro se foloseste termenul alternativ de antigenitate. Specificitatea se refera la proprietatea unui situs combinativ al unui anticorp de a reactiona specific cu un singur determinant antigenic, sau la proprietatea unei populatii de anticorpi de a reactiona cu doar un tip de antigen. In general exista un grad inalt de specificitate in reactiile antigen-anticorp. Anticorpii pot distinge diferentele intre structura primara, secundara si tertiara a unui antigen.Antigenele se clasifica in doua categorii importante: antigene complete, cele mai multe de natura proteica, capabile sa induca un raspuns imun celular si/sau umoral; antigene incomplete sau haptene, substante cu greutate moleculara mica, incapabile sa declanseze un raspuns imun daca nu sunt cuplate cu o molecula mare cu structura complexa, denumita purtator sau carrier.

19

Page 20: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Afinitatea este intensitatea reactiei intre un singur determinant antigenic si un singur situs combinativ al unui anticorp. Este rezultatul sumei intre toate fortele de atractie si de respingere ce exista intre determinantul antigenic si situsul combinativ.

Aviditatea este termenul utilizat pentru descrierea intensitatii legaturilor in totalitate intre un antigen cu multiplii determinanti antigenici si anticorpi multivalenti. Deci afinitatea se refera la intensitatea legaturii intre un determinant antigenic si un situs combinativ al unui anticorp, in timp ce aviditatea se refera in general la intensitatea legaturilor intre antigene si anticorpi multivalenti.

Crossreactivitatea se refera la capacitatea unor anticorpi de a se combina cu mai mult de un determinant antigenic sau la capacitatea unei populatii de anticorpi de a reactiona cu mai mult de un antigen. Crossreactivitatea apare deoarece antigenul crossreactiv are epitopi comuni cu antigenul imunizant sau pentru ca are epitopi cu structura asemanatoare unui antigen imunizant (plurispecificitate

II IMUNOSEROLOGIADefinitie: domeniul imunologiei ce se ocupa cu studiul interactiunilor Ag-Ac in vitro.Componente esentiale: reactantii imunologici

1. ANTIGENELE2. SERURILE IMUNE

Reactantii imunologici sunt produse biologice – Ac, Ag, hematii, complement – ce sunt utilizate pentru determinari calitative si cantitative de Ag si Ac. Reactivii imunochimici contin anticorpi sub diferite forme: Seruri antiproteine plasmatice

o Polispecifice – contin Ac fata de mai multe antigene – obtinute prin imunizarea

animalelor cu gamaglobuline umaneo Monospecifice – contin Ac fata de o singura proteina – se obtin prin imunizarea

animalelor cu antigene foarte pure; se folosesc ca atare in determinari imunologice de tip reactii de precipitare, sau marcate fluorescentsau enzimatic pentru metode imunofluorescente sau imunoenzimatice.

o Anticorpi monoclonali

Imunoplaci pt determinarea cantitativa a proteinelor umane – seruri monospecifice inglobate in gel de agar in scopul determinarii cantitative de antigene

III. REACTII DE AGLUTINARE

20

Page 21: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

Termenul de aglutinina este folosit pentru a descrie anticorpii care aglutineaza antigenele particulate, non-solubile. Anticorpii completi sunt cei de tip IgM care se leaga la determinantii antigenici ca pentamer si induc aglutinarea acestor antigene. Anticorpii incompleti sunt de tip IgG, se leaga la determinanti antigenici ai eritrocitelor dar nu pot determina aglutinarea. Cand antigenul utilizat este un eritrocit, vorbim despre reactii de hemaglutinare.Toti anticorpii pot teoretic sa aglutineze antigene particulate, dar datorita polivalentei, anticorpii de tip IgM reprezinta clasa cea mai eficienta de aglutinine. Pentru anticorpii de tip IgG este necesar un adjuvant de tipul albuminei in reactie, al carui rol este sa reduca distanta intre celulele rosii, permitand anticorpilor de tip IgG sa lege punti intre celule.Aglutinarea este rezultatul formarii unei retele deAg si Ac intr-un numar suficient de mare care sa permita vizualizarea cu ochiul liber. Reactiile de aglutinare sunt sensibile, pot detecta cantitati mici de Ac. Nu sunt metode cantitative, procedand insa la efectuarea de dilutii, se poate insa realiza dozarea semicantitativa. Clasificare teste de aglutinare:

1. Teste directe sau active – particulele de reactie sunt purtatoare ale Ag specific (hematii, leucocite, trombocite, bacterii, toxoplasma, etc).

2. Teste indirecte sau pasive – particule de reactie incarcate cu un determinant Ag artificial fixat pe suprafata particulei (hematii, particule latex, microcristale de colesterol).

Aglutinarea directa: particulele purtatoare ale determinantului Ag sunt puse in contact cu Ac specifici in mediu lichid salin. Ac se combina cu Ag si formeaza o retea de aglutinare. Reactia se poate desfasura in tuburi de reactie sau pe placi de sticla sau de opalin.Aplicatii practice ale aglutinarii directe sunt:

o Determinarea grupelor sanguineo Identificarea aglutininelor la rece la 40

o Diagnosticul mononucleozei infectioaseo Diagnosticul salmonelozei

Aglutinarea indirecta: Ag solubil este fixat pe particule variabile, suspensia de particule este pusa in contact cu serul de cercetat la fel ca in cazul aglutinarii directe.

Aplicatii practice:o Diagnosticul sifilisului – Ag cardiolipidic fixat pe microcristale de colesterol in

suspensie coloidala – reactie pe lama.o Diagnosticul sifilisului prin testul de hemaglutinare a Treponemei pallidum (TPHA) –

Ag treponemic este fixat pe hematiio Diagnosticul tiroiditei autoimune- Ac anti-tiroglobulina: tiroglobulina este fixata pe

hematiio Identificare factor reumatoid – IgG sau IgM modificati; reactia Waaler-Rose sau

latex-aglutinareaAglutinarea artificiala – consta in utilizarea unui artificiu tehnic pt a provoca aglutinarea (cel mai adesea directa) a Ag particulate, de catre Ac ce nu pot aglutina spontan.

o Utilizarea de medii macromoleculare – albumina bovina, ser uman sau dextran.o Incubarea hematiilor cu enzime proteoliticeo Adugarea unei antiglobuline – test Coombs

Aglutinarea inversa – identificare antigene si nu anticorpi – Ac specifici sunt fixati pe hematii.

21

Page 22: Lucrari Practice Imunologie Mg 2008

22