Transferul de zigoți la bovine

Apăvăloaei Sergiu

Grupa C

Ameliorarea producției animale a beneficiat de progrese realizate în mai multe domenii:

selecția geneticii, controlul reproducției, vaccinarea și echilibrul rațiilor alimentare. Atât pe plan

mondial, cât și în România, pentru perfecționarea continuă a procesului de reproducție se aplică cu

succes biotehnologia transferului de zigoți.

Transferul de zigoți este o metodă modernă de intensibizare a reproducției ce constă în

recoltarea, după poliovulație și fecundație, a zigoților din aparatul genital al femelei donatoare și

transferul acestora în aparatul genital al femelelor receptoare, unde urmează ca acesta să se

dezvolte.

Biotehnologia transferului de zigoți presupune cunoașterea proceselor fiziologice legate de

ovulație, particularități ale ciclului sexual al femelelor și evoluția zigotului în primele zile de la

fecundație.

Din punct de vedere zooeconomic, transferul de zigoți oferă posibilitatea folosirii cu

eficientță crescută a rezervelor de ovocite de la animalele cu o înaltă valoare zootehnică

(donatoare), prin provocarea maturării și eliberării mai multor gameți femeli, cu obținerea unui

număr mai mare de produși de la aceeași femelă. Tranferul de zigoți se practică și pentru scurtarea

intervalului dintre generații. Prin instalarea gestației, femela intră în repaus productiv pe întreaga

durată a gestației. Prin practicarea transferului de zigoți, produșii de concepție sunt transferați în alte

organisme, lucru care oferă posibilitatea obținerii unor noi produși de la aceeași femelă în intervalul

de timp în care, în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă. Datorită scurtării intervalului dintre

generații, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale.

Din punct de vedere științific, transferul de zigoți reprezintă o biotehnologie prin intermediul

căreia se pot efectua studii științifice ale proceselor intime legate de fecundație și de influiențele

maternă și paternă asupra produsului de concepție. Produșii obținuți astfel permit studierea

influiențelor factorilor genetici și ai mediului extern asupra dezvoltării zigoților, ereditatea grupelor

sangvine, obținerea de animale ”mozaic de gene”, a concentrării mai multor caractere pe același

individ, a instituirii unei profilaxii și terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism.

Etapele tranferului de zigoți la vacă

1. Selecția și pregătirea vacilor donatoare

Criteriile selecției donatoarelor sunt:

- performanța reproductivă- stare ginecoligică perfectă, intervalul dintre parturiție și primul estru să

fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiție-însămânțare mai mic de 80 de zile, indicele de

gestație să fie mai mic de 1,5;

- superioritate genetică- ritm superior de creștere, înainte și după înțărcare, randament ridicat la

sacrificare, producția de lapte;

- valoarea produsului obținut prin transfer embrionar.

Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, să suporte mai multe intervenții de poliovulație și

recolare de zigoți. Alimentația lor are un rol foarte important, acestea fiind grupate după mărime și

necesități nutriționale, pentru care sunt întocmite rații cât mai complete care să asigure necesarul de

hrană zilnic pentru fiecare grupă.

Vacile donatoare, după poliovulație, vor fi însămânțate artificial cu material seminal provenit

de la cei mai valoroși tauri.

2. Selecția și pregătirea vacilor primitoare

Este important ca receptoarele să aibă aparatul genital integru, de aceea se recomandă

folosirea vițelelor. Ele trebuie să fie sănătoase, fără afecțiuni ginecologice (să aibă fișe ginecologice

în care vor fi menționate ciclurile sexuale, data și caracterul estrului, durata ciclului sexual), să aibă

aceeași talie cu donatoarea (în momentul transferului să aibă 80% din greutatea adultului), să fie

apte să nască descendeți cu aceeași greutate la naștere ca donatoarele.

Un alt aspect important este ca alimentația să fie echilibrată.

3. Sincronizarea estrului și ovulației la vacile donatoare și primitoare

Se face prin mijloace medicamentoase, urmărind succesiv două-trei cicluri de călduri la

vacile donatoare, stabilindu-se durata cicluilui. Astfel se calculează data apariției ciclului și, în

funcție de data previzibilă, se acționează prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele

primitoare, având ca scop inducerea căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei.

Această sincronizare medicamentoasă cuprinde mai multe metode:

- metoda cu spirale;

- implantul subcutanat cu progeteron;

- metoda cu PGF2α

- metoda cu progesteron și PGF2α

4. Inducerea poliovulației și însămânțarea arficială a vacilor donatoare

Poliovulația reprezintă provocare eliberării concomitente la aceeași perioadă de călduri a

unui număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei. În prezent sunt aplicate două principale

metode clasice de tratament poliovulator:

- gonadotropina serică (PMSG) în doză de 2500-3000 U.I. intramuscular; la două-trei zile de la

administrare se injectează intramuscular o doză de PGF2α, căldurile apărând la 48-60h după.

Dezavantajul acestei metode este producerea de chiști ovarieni.

- FSH în doze de 28-40 mg intramuscular sau subcutanat, fracționat dimineața și seara, timp de 4

zile. Administrarea PGF2α în doză de 500-700 μg se face la 72h de la începerea tratamentului,

estru apărând la 50-60h de la injectarea prostaglandinei. Avantajul acestei metode este că nu

produce chiști ovarieni.

În ceea ce privește repetarea tratamentelor de poliovulație la aceeași donatoare, s-a constatat

că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau ani, fiind necesar un interval de

cel puțin 60 de zile după fătare în vederea începerii unui nou tratament.

5. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate în urma însămânțării artificiale, de regulă efectuându-se două

însămânțări artificiale la 12 și 24h de la începutul căldurilor observate clinic sau sistematic, după 56

și 72h de la administrarea PGF2α.

6. Recoltarea zigoților

Zigoții sunt recoltați din cornul uterin, după ieșirea din oviduct, recoltarea realizându-se de

regulă între zilele 6-8 după fecundație. Se foloseau două metode de recoltare a zigoților, chirurgical

și nechirurgical, metoda chirurgicală fiind abandonată în prezent.

Metoda nechirurgicală presupune: contenția femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta

vulvei și a regiunii perivulvare, identificarea prezenței corpilor galbeni pe ovar, introducerea

lichidului de spălare în lumenul cornelor uterine, spălarea acestora, recuperarea lichidului împreună

cu zigoții, identificarea și recuperarea zigoților din lichidul recuperat și supus decantării și

aprecierea morfologică a lor.

Prin examen transrectal apreciem răspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpându-se

cu atenție ambele ovare și numărându-se corpii galbeni. Se introduce cateterul de tip Folley prin

cervix până în cornul uterin, la circa 5-8cm de la bifurcația coarnelor uterine. Cu o seringă se

introduce prin cateter aproximativ 8-15ml de aer cu scopul de a fixa cateterul și a împiedica

refularea lichidului de spălare. Irigarea coarnelor uterine se face continuu, calea de evacuare a

lichidului fiind conectată la vasul de colectare a mediului recuperat printr-un tub de plastic. În cazul

cateterului cu două căi recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie căruia îi este

adaptată o piesă în forma literei y. Evacuarea lichidului se face printr-un tub din plastic conectat la

un filtru de colectare cu orificii foarte mici care au rol de reținere a zigoților, lichidul traversând

filtrul și fiind colectat într-un recipient. Același mediu de spălare este folosit și la spălarea celuilalt

corn uterin.

Între momentul recuperării zigoților și cel al inovulării lor în uterul receptoarelor, zigoții

trebuie să fie menținuți în viață în condiții speciale și manipulați în cele mai bune condiții tehnice și

igienice.

În ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluții tampon fosfat- PBS pentru spălarea

coarnelor uterine și pentru păstrarea zigoților recuperați. Acest lichid are un pH de 7,2 și conține

multe săruri minerale, glucoză și proteină.

Rezultatele recuperării zigoților depind în mare măsură de abilitatea și antrenamentul

operatorului, mediile, soluțiile, serurile, emzimele și substanțele crioprotectoare care vin în contact

cu zigoții trebuind să fie sterile.

7. Căutarea și aprecierea calității zigoților

După prelevare zigoților, vasul cu lichidul recoltat este lăsat să se decanteze timp de 20-30

minute. Stratul superior se îndepărtează, iar cel inferior în care se găsesc zigoții se transferă într-o

placă Petri cu diametrul de 10cm.

Pentru identificarea zigoților se examinează cu mare atenție la stereolupă fiecare pătrat de la

niveului plăcii Petri. Zona pelucidă garantează protecția zigotului, motiv pentru care ea trebuie să

fie perfect integră, fără fisuri și perfect sferică. După identificare, aceștia sunt transferați în plăci

Petri mai mici cu lichid de conservare, cu ajutorul unei seringi de aspirare. După ultima baie, zigoții

sunt condiționați pentru congelare în paiete, pe care se menționează identificarea donatoarei, rasa,

data colectării, numărul de zigoți și centrul de producție.

8. Conservarea și deconservarea zigoților

Congelarea rămâne cea mai avantajoasă metodă de menținere pentru un interval de timp

practic nelimitat a viabilității zigoților. Zigoții sunt menținuți în stare solidă în azot lichid la o

temperatură de circa -196°C.

În timpul congelării intervin doi factori letali pentru zigoți: formarea gheții intracelulare și

concentrația salină ridicată. Pentru a preîntimpina efectul negativ al acestor factori metoda de răcire

constă în deschidratarea parțială a celulelor și evitarea șocului produs de concentrații ridicate în

săruri prin ultilizarea unui crioprotector, în general glicerol, în mediul de congelare.

Protocolul de congelare a zigoților bovini prevede:

alegerea zigoților

timp de recoltare până la începerea congelării 2-3h

introducerea lor în mediu de congelare la temeratura laboratorului

introducerea în paiete identificate

răcirea până la -6°C sau -7°C cu o viteză de 4°C/minut

inducerea cristalizării

răcirea până la -30°C cu o viteză de 0,4°C/minut

introducerea paietelor direct în azot lichid și stocarea lor la -196°C.

La decongelare paietele se scot repede din containerul cu azot și se introduc direct într-o

baie de apă la 37°C, unde se mențin circa 30 de secunde.Îndepărtarea crioprotectorului se face

progresiv astfel încât ieșirea acestuia și pătrunderea apei în celulă să fie compatibile cu

permeabilitatea membranei celulare.

Nivelul supraviețuirii zigoților după congelare este condiționat de mai mulți factori: stadiul

de dezvoltare, calitatea înainte de congelare, femela donatoare.

9. Transferul zigoților

Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a cilului sexual cu cel al

femelei donatoare. O atenție specială se va acorda depistării ciclurilor (dimineața, prânz, seara),

apoi se determină momentul exact al începutului estrului. Prin examen transrectal se identifică

corpul galben de pe ovar, inovularea făcându-se în vârful cornului uterin adiacent ovarului cu corp

galben. Înainte și după transfer se va evita orice stres: tratamente antiparazitare, vaccinări, lotizări,

recoltări de sânge, schimbări de alimentație, etc. Variațiile climatice determină creșterea mortalității

zigoților.

Pentru transfer se folosește un pistolet Cassou în care se introduce paieta cu zigotul

decongelat. Traversarea cervixului trebuie să se realizeze cu mare precauție pentru a nu leza

mucoasa cervicală. Anestezia epidurală cu 4-6ml procaină 2% determină relaxarea cervixului și

evitarea contracțiilor organelor genitale.