Teza Seleniu

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

ALIMENTELE ŞI SUPLIMENTELE NUTRITIVE –

SURSE DE SELENIU PENTRU ORGANISM

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

COORDONATOR ŞTIINŢIFIC:

PROF. UNIV. DR. RODICA CUCIUREANU

DOCTORAND:

VLAD - IOAN TEODOR

IAŞI, 2011

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi

Facultatea de Farmacie

Doamnei/Domnului

Vă facem cunoscut faptul că în ziua de 30 noiembrie 2011 la ora

9.00, în sala S.M.N. Iaşi va avea loc susţinerea publică a tezei de doctorat

intitulată “Alimentele şi suplimentele nutritive – surse de seleniu pentru

organism” elaborată de farmacist Vlad - Ioan Teodor, conducător ştiinţific

prof. Dr. Rodica Cuciureanu, în vederea conferirii titlului ştiinţific de

doctor în Domeniul fundamental Ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.

Vă invităm să participaţi la această manifestare!

Comisia de doctorat are următoarea componenţă:

PREŞEDINTE: Decan Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu,

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Gr. T. Popa” Iaşi,


CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu



REFERENŢI OFICIALI:

Prof. Univ. Dr. Vasile Dorneanu



Conf. Univ. Dr. Lorena Filip

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-

Napoca, Facultatea de Farmacie

Conf. Univ. Dr. Ana Corina Ioniţă

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Carol Davila” Bucureşti,


CUPRINS

Introducere................................................................................................................................. 1

Partea generală ......................................................................................................................... 5

CAPITOLUL I. SELENIUL ŞI ORGANISMUL UMAN.................................................... 6

I.1. Seleniul şi organismul uman. Aspecte generale.................................................................... 6

I.1.1. Scurt istoric................................................................................................................... 6

I.1.2. Stare naturală. Surse de seleniu. Cciclul biologic al seleniului.................................... 6

I.1.3. Seleniul – microelement eseţial pentru organism......................................................... 12

I.2. Farmacocinetica seleniului.................................................................................................... 18

I.3. Rolul seleniului în organismul uman..................................................................................... 20

I.3.1. Seleniul şi metabolismul uman..................................................................................... 20

I.3.2. Acţiunea detoxifiantă a seleniului................................................................................. 26

I.3.3. Necesarul zilnic de seleniu........................................................................................... 28

I.4. Patologia provocată de deficitul de seleniu........................................................................... 33

I.4.1. Deficitul de seleniu şi Boala Keshan (cardiomiopatia) ............................................... 33

I.4.2. Deficitul de seleniu şi Boala Kashin-Beck (boala Urov) ............................................. 33

I.4.3. Deficitul de seleniu în cretinismul mixedematos endemic.......................................... 34

I.4.4. Implicaţii ale seleniului în carcinogeneză..................................................................... 34

I.4.5. Deficitul de seleniu şi funcţia imună............................................................................ 36

I.4.6. Rolul seleniului în infecţiile virale .............................................................................. 37

I.4.7. Deficitul de seleniu şi bolile cardiovasculare.................................................................. 37

I.4.8. Seleniul şi funcţia respiratorie...................................................................................... 38

I.4.9. Seleniul şi funcţia tiroidiană......................................................................................... 38

I.4.10. Seleniul şi funcţia pancreatică.................................................................................... 38

I.4.11. Seleniul - implicaţii în alte patologii ......................................................................... 38

I.5. Patologia provocată de excesul de seleniu............................................................................ 39

I.6. Surse alimentare de seleniu................................................................................................... 41

I.6.1. Alimente de origine vegetală - surse de seleniu........................................................... 41

I.6.2. Alimente de origine animală – surse de seleniu........................................................... 43

I.6.3. Metode de îmbogăţire a conţinutului de seleniu al alimentelor.................................... 45

I.6.4. Suplimente nutritive – surse de seleniu......................................................................... 48

Partea experimentală.................................................................................................................. 51

CAPITOLUL II. ESTIMAREA APORTULUI DE SELENIU PRIN CONSUM DE

ALIMENTE................................................................................................................................

52

II.1. Introducere............................................................................................................................ 52

II.2. Determinarea spectrofotometrică a seleniului din produse alimentare................................ 54

II.2.1. Protocol de validare analitică a metodelor spectrofotometrice................................... 54

II.2.2. Stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei spectrofotometrice de determinare a

seleniului din produse alimentare...........................................................................................

59

II.2.2.1. Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă........................... 60

II.2.2.2. Stabilirea volumului soluţiei de acid clorhidric necesar sistemului seleniu

(IV) - iodură de potasiu-albastru variamin.....................................................................

61

II.2.2.3. Stabilirea volumului soluţiei albastru variamin necesar sistemului seleniu

(IV) - iodură de potasiu- albastru variamin...................................................................

62

II.2.2.4. Stabilirea volumului soluţiei de iodură de potasiu necesar sistemului

seleniu (IV) - iodură de potasiu-albastru variamin ...................................................... 62

II.2.2.5. Stabilirea volumului soluţiei de acetat de sodiu necesar sistemului seleniu

(IV) - iodură de potasiu - albastru variamin...................................................................

63

II.2.2.6. Studiul influenţei EDTA asupra sistemului seleniu (IV)-iodură de potasiu

- albastru variamin.........................................................................................................

63

II.2.2.7. Studiul stabilităţii produsului de reacţie......................................................... 64

II.2.3. Raportul de validare a metodei de analiză a seleniului..................................................... 65

II.2.3.1. Liniaritatea....................................................................................................... 65

II.2.3.2. Precizia metodei................................................................................................. 67

II.2.3.2.1. Repetabilitatea detecţiei.................................................................. 67

II.2.3.2.2. Precizia intermediară...................................................................... 68

II.2.3.2.3. Repetabilitatea metodei.................................................................. 68

II.2.3.3. Exactitatea metodei......................................................................................... 69

II.2.3.4. Randament de recuperare................................................................................ 70

II.2.3.5. Limita de detecţie (LD) şi limita de cuantificare (LC).................................... 71

II.2.4. Determinarea seleniului din produse alimentare............................................................... 71

II.2.4.1. Probe de analizat.............................................................................................. 71

II.2.4.2. Separarea seleniului din probele de analizat (material vegetal,

pâine,seminţe) (JAOAC, 2000) ....................................................................................

71

II.2.4.3.Determinarea seleniului din probele de produse alimentare............................ 72

Concluzii...................................................................................................................................... 74

CAPITOLUL III. ROLUL SUPLIMENTELOR NUTRITIVE ÎN ASIGURAREA

APORTULUI DE SELENIU PENTRU ORGANISM.......................................................

76

III.1. Suplimente nutritive: aspecte generale................................................................................ 76

III.2. Suplimente nutritive cu seleniu........................................................................................... 78

III.2.1. Determinarea seleniului prin metoda spectrofotometrică cu iodură de potasiu -

albastru variamin.................................................................................................................

80

III.2.2. Determinarea seleniului din probele de suplimente alimentare.............................. 81

III.2.3. Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive.................................. 82

Concluzii...................................................................................................................................... 88

CAPITOLUL IV. EVALUAREA ROLULUI PROTECTOR AL SELENIULUI ÎN

INTOXICAŢIA ACUTĂ CU ACRILAMIDĂ PE BAZA UNOR PARAMETRI

BIOCHIMICI, HEMATOLOGICI ŞI HISTOPATOLOGICI............................................

90

IV.1. Introducere ......................................................................................................................... 90

IV.1.1. Expunerea populaţiei la acrilamidă.......................................................................... 92

IV.1.2. Toxicitatea experimentalăa acrilamidei................................................................... 94

IV.2. Obiectivele cercetării.......................................................................................................... 97

IV.3. Investigaţii biochimice....................................................................................................... 98

IV.3.1.Determinarea activităţii transaminazelor................................................................. 98

IV.3.1.1. Determinarea activităţii alanin-amino-transferazei (ALT) ........................ 99

IV.3.1.2. Determinarea aspartat-amino-transferazei (AST) ...................................... 100

IV.3.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei (GGT) ............................................ 101

IV.3.3.Determinarea lactat dehidrogenazei (LDH) ............................................................ 103

IV.3.4. Determinarea fosfatazei alcaline (ALP) ................................................................ 104

IV.3.5. Determinarea creatin kinazei (Creatin-fosfokinaza, CK)....................................... 105

IV.3.6. Determinarea albuminelor din sânge...................................................................... 106

IV.3.7. Determinarea proteinelor totale........................ ..................................................... 107

IV.3.8. Determinarea bilirubinei....................... ................................................................. 109

IV.3.8.1. Determinarea bilirubinei totale....................... ........................................... 109

IV.3.8.2. Determinarea bilirubinei directe................................................................ 109

IV.3.9. Determinarea colesterolului.................................................................................... 110

IV.3.10. Determinarea LDL – colesterolului...................................................................... 111

IV.3.11. Determinarea trigliceridelor.................................................................................. 112

IV.3.12 .Determinarea calciului total.................................................................................. 113

IV.3.13. Determinarea magneziului.................................................................................... 114

IV.3.14. Determinarea ferului............................................................................................. 115

IV.3.15. Determinarea sodiului şi potasiului..................................................................... 116

IV.3.16. Determinarea nivelului plasmatic al ureei............................................................ 119

IV.3.17. Determinarea creatininei....................................................................................... 120

IV.3.18. Determinarea acidului uric.................................................................................... 121

IV.3.19. Determinarea triiod-tironinei (T3) ....................................................................... 123

IV.3.20. Determinarea tiroxinei (T4) .................................................................................. 124

IV.3.21. Determinarea cortisolului...................................................................................... 126

IV.3.22. Determinarea glicemiei......................................................................................... 128

IV.3.23.Evaluarea potenţialului protector al seleniului asupra stresului oxidativ

provocat de intoxicaţia cu acrilamidă.................................................................................

129

IV.3.23.1. Determinarea superoxid dismutazei (SOD) ............................................ 132

IV.3.23.2. Determinarea glutationperoxidazei în sânge total................................... 133

IV.3.23.3. Determinarea glutationului redus............................................................. 135

IV.3.23.4. Determinarea malondialdehidei (MDA).................................................. 136

IV.3.23.5. Determinarea statusului total antioxidant (TAS)..................................... 138

IV.4. Evidenţierea modificărilor histopatologice........................................................................ 149

Concluzii...................................................................................................................................... 154

CAPITOLUL V. CONCLUZII GENERALE........................................................................

Bibliografie..................................................................................................................................

157

159

1

INTRODUCERE

Seleniul a fost cunoscut, încă de la descoperirea sa de către

Berzelius, în anul 1817, ca fiind un element toxic. Cercetările ulterioare au

demonstrat că acesta este de fapt, un nutrient esenţial pentru organismul

uman, cu rol fiziologic împortant în prevenirea şi chiar vindecarea unor

afecţiuni. Din punct de vedere biochimic, seleniul este un component al

enzimei glutation-peroxidaza care, alături de alte enzime cum sunt

superoxid-dismutaza, catalaza şi de vitamina E, protejează componentele

celulare de efectele negative produse de acumularea de peroxizi în ţesuturi.

Seleniul este un important antioxidant biologic, acţiune la care

participă în diferite moduri; este constituent al glutation-SH-peroxidazei,

seleno-enzimă care catalizează reducerea peroxizilor lipidici şi a

peroxidului de hidrogen, şi în acest mod previne efectele nocive ale

peroxidării lipidelor cu un conţinut ridicat în acizi graşi nesaturaţi şi

protejează eritrocitele de hemoliză.În plus, seleniul protejează celulele şi

membranele celulare de procesele oxidative, facilitând reacţia dintre oxigen

şi hidrogen şi transferul ionilor la nivel membranar; în concentraţii mici are

acţiune antinecrotică.

Alături de vitamina E şi de tioaminoacizi, seleniul reprezintă un

factor hepatoprotector, numit curent factorul 3-hepatoprotector. De

asemenea, este binecunoscută acţiuna detoxifiantă a seleniului; în

concentraţii mici reduce acţiunea nocivă a unor ioni metalici toxicogeni:

Hg2+, Cd2+, Pb2+, Cu2+, As3+.

Deficitul de aport alimentar de seleniu (semnalat în regiunile în

care solul este sărac în acest element chimic) este corelat cu apariţia unor

manifestări patologice specifice: anemie hemolitică; cardiopatii (mai ales la

copii - maladia Keshan); maladia Kashin-Beck caracterizată prin rigiditate

musculară, dureri articulare, osteoartrită generalizată; malnutriţie proteico-

calorică. În concentraţii mari are acţiune carcinogenă.

Alimentaţia echilibrată asigură necesarul zilnic de seleniu. Alimente

mai bogate în seleniu sunt: carnea, viscerele (ficat, rinichi), peştele (mai ales

cel de apă sărată), laptele şi derivatele, oul, cerealele, unele legume şi fructe;

concentraţia de seleniu în alimente este dependentă de concentraţia acestuia în

sol. Concentraţiile seleniului în sol variază în medie între 0,1 şi 2 mg/kg, în

zonele selenifere putând ajunge până la 1200 mg/kg.

Seleniul este în mod eficient transferat din sol prin intermediul

plantelor şi alimentelor de origine animală în organismul uman. Cantitatea

de seleniu din alimente variază în limite largi în funcţie de zona geografică

de provenienţă şi de cantitatea de seleniu din solul regiunii respective.

2

Aportul inadecvat de alimente, respectiv absorbţia incompletă a

principiilor nutritive conduce progresiv la stări de dezechilibru concretizate

prin simptome de carenţă. Explorarea status-ului nutriţional al organismului

este necesară pentru a corecta prompt fenomenele de carenţă sau de aport

excesiv de principii nutritive.

Utilizarea suplimentelor alimentare autorizate este justificată numai

în cazul unei carenţe dovedite; dozele recomandate trebuie sa corespunda

nevoilor fiziologice. Doza zilnică de seleniu din dietă nu este întotdeauna

de ajuns pentru nevoile nutriţionale ale organismului, mai ales pentru

persoanele care locuiesc în zone cu soluri sărace în acest element.

Numeroşi medici recomandă mărirea dozei de seleniu din dietă şi folosirea

de suplimente nutritive cu acest produs, mai ales ca mijloc de a reduce

riscul apariţiei unor forme de cancer. Acest lucru presupune o grijă sporită

pentru a găsi forma potrivită de seleniu din suplimente, a supraveghea

calitatea produselor de pe piaţă, siguranţa lor şi modul în care sunt ele

consumate. Suplimentarea cu seleniu ar trebui să se facă cu forma care

apare în alimentele consumate în mod uzual.

MOTIVAŢIA CERCETĂRII

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un

subiect de mare actualitate şi importanţă pentru descifrarea mecanismelor

prin care seleniu, ca microelement, este implicat în efortul comun al

farmacologilor şi nutriţioniştilor de a preveni bolile neoplazice.

Subiectul este cu atât mai important cu cât datele din literatura de

specialitate privind rolul seleniului în prevenirea carcinogenezei şi,

respectiv acţiunea carcinogenă a aportului excesiv de seleniu sunt

controversate. Implicarea seleniului, sub diferite forme (compuşi minerali,

respectiv compuşi organici) suscită încă interesul specialiştilor.

Studiile epidemiologice confirmă faptul că nivelele scăzute de

seleniu plasmatic reprezintă indicatori al riscului crescut de apariţie şi

dezvoltare a maladiilor neoplazice. S-a demonstrat că există o corelaţie

directă a nivelului redus de seleniu plasmatic cu incidenţa cancerului

tiroidian, existenţa de leziuni pre-canceroase la nivelul cavităţii bucale, a

adenomului colo-rectal, cancerului pulmonar, gastric, de sân sau de

prostată.

Seleniul are acţiune dublă: compuşii seleniului, printre care

selenitul de sodiu, au acţiune pro-oxidanta directă conducând la toxicitate

acută dar şi acţiune antioxidantă, prin inglobarea în selenoproteine şi

participarea reglarea diferitelor procese biologice din organism. Ca parte

3

componentă a glutation peroxidazei (GSH-Px), seleniul aparţine primului şi

celui de al doilea nivel de protecţie antioxidantă a celulei. Doze crescute de

selenit de sodiu pot reduce inflamaţia printr-un efect direct pro-oxidativ şi

poate creşte capacitatea antioxidantă a celulei prin incorporarea seleniului

în selenoenzime.

Conţinutul în seleniu în alimentelor este dependent de concentraţia

acestuia în sol. În România, se cunoaşte faptul că solul este sărac în seleniu

şi, în consecinţă este posibil ca necesarul zilnic să nu fie acoperit. În aceste

condiţii, pacienţii cu diferite afecţiuni, dar şi populaţia generală apelează,

cu sau fără recomandarea medicală, la consumul de suplimente nutritive

care conţin seleniu. Trebuie să recunoaştem că aceasă practică de a

consuma suplimente nutritive a devenit o „modă”. Dar, nu trebuie să uităm

că administrarea acestor suplimente, fără a şti dacă organismul are sau nu

nevoie de nutrientul respectiv implică riscuri, uneori cu consecinţe grave

pentru organism.

În România, problematica asigurării aportului optim de seleniu pentru

organismul uman a fost abordată sporadic, atât din punct de vedere analitic cât

şi prin prisma evaluării statusului acestui microelement în organismul uman.

Studierea relaţiei dintre seleniu şi cancer a presupus că acesta îşi exercită

efectele ca antioxidant. Ca şi componentă a glutation peroxidazei (GPx), o

funcţie biochimică larg recunoscută a seleniului este inactivarea speciilor

oxigen reactive (ROS). Deşi s-a demonstrat că statusul scăzut al Se se asociază

cu activitate GPx scăzută, observaţia că efectele anticarcinogene au continuat

să se manifeste după ce GPx a atins nivelurile optime a fost o sugestie că Se şi-

ar putea exercita activitatea anticarcinogenă prin alte mecanisme.

Acrilamida este o substanţă toxică, din categoria „probabil

cancerigenă pentru om” prezentă constant în alimentele tratate termic.

Obiceiurile alimentare ale populaţiei din România exced în consumul de

alimente, care în procesul culinar intens (cartofi prăjiţi, carne bine friptă,

chipsuri etc) favorizează formarea acestui toxic.

Specialiştii recomandă aplicarea unor măsuri care să limiteze

conţinutul în acrilamidă al alimentelor, respectiv, reducerea toxicităţii

acesteia. Printre acestea se numără consumul de alimente care conţin

componente cu rol antioxidant. In cercetările noastre am iniţiat un studiu

experimental privind capacitatea seleniului de a influenţa unii parametri

biochimici şi histopatologici modificaţi în intoxicaţia subacută cu

acrilamidă. Considerăm că rezultatele acestor cercetări vor sta la baza altor

studii care vor contribui la optimizarea alimentaţiei populaţiei şi, implicit la

menţinerea sănătăţii.

4

OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT

Obiectivele cercetărilor experimentale care au condus la realizarea

tezei de doctorat au urmărit:

Adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de

determinare a seleniului din produse alimentare;

Determinarea seleniului din probe de produse alimentare prin

metoda validată;

Determinarea seleniului din suplimente alimentare conţinând

acest microelement. Studiul cedării seleniului din suplimente

nutritive;

Evaluarea potenţialului protector al seleniului la şobolani, în

intoxicaţia subacută experimentală, pe cale orală, cu doze crescute

de acrilamidă, prin determinarea unor parametri biochimici şi

hematologici.

Studiul comparativ al modificărilor histopatologice apărute în

intoxicaţia subacută cu acrilamidă după administrarea de seleniu, la

şobolani.

5

PARTEA GENERALĂ

Capitolul I

SELENIUL ŞI ORGANISMUL UMAN

I.1. Seleniul şi organismul uman. Aspecte generale

I.1.1. Scurt istoric

Seleniul ca element chimic a fost identificat în 1817 de către renumitul

chimist Berzelius ca element rezidual ce contamina producţia de acid sulfuric

într-o fabrică din Stockholm. Seleniul are proprietăţi similare cu ale telurului,

descoperit cu 35 de ani mai devreme, şi a fost numit după denumirea grecească

a Lunii, selene (telurul şi-a căpătat numele după latinescul tellus, pământ).

Berzelius îşi publică noua descoperire anul următor, în 1818, în „Annales de

chimie et de physique“. Vreme de un secol, puţine lucruri s-au mai auzit despre

acest element, dar în 1996 se estima că seleniul este subiectul a peste 100 000

de lucrări ştiinţifice. Mai târziu, acest nou element este găsit şi în unele

minerale, de către alţi cercetători. (Oldfield, 2002; Selenium in Nutrition, 1983;

Environmental Health Criteria 58, 1987).

În 1937, A.L. Moxon a publicat un raport în care seleniul era

identificat ca vinovat de îmbolnăvirea unor cirezi prin consumul de plante

toxice, boala fiind greşit denumită «alkali disease»-boala alcalină, numită

astăzi selenoza. În 1957, biochimistul de origine germană Klaus Schwarz a

publicat o lucrare care va schimba radical percepţia publică asupra

seleniului. El era preocupat de problema necrozei ficatului la şobolanii de

laborator hrăniţi cu drojdie. Când a înlocuit drojdia „torula” cu drojdia de

bucătărie (Saccharomyces), problema a dispărut. După îndelungate

cercetări, a descoperit că torula era deficitară în seleniu, identificând, deci,

prima boală cauzată de defictul de seleniu. În prezent, seleniul a fost

identificat ca nutrient mineral esenţial (McCoy et al., 1969).

Primele utilizări ale seleniului au fost minore: în colorarea sticlei şi

în ceramică. În anul 1851, Hittorf observă că seleniul – ca şi sulful –

prezintă mai multe stări alotropice, iar în 1873, May şi Smith, pe de o parte,

şi Sale, pe de altă parte, constată schimbarea conductibilităţii electrice a

seleniului sub acţiunea luminii (deci proprietăţi fotochimice). Fenomenul

acesta este lămurit în 1907 de Marc şi, într-adevăr, aceste proprietăţi i-au

deschis seleniului căi în utilizări moderne, extrem de importante în

fotometrie, telefotografie, redresoare etc. (Oldfield, 2002; Environmental

Health Criteria 58, 1987).

6

I.1.2. Stare naturală. Surse de seleniu. Ciclul biologic al

seleniului

Distribuţia seleniului pe glob este neuniformă. În distribuţia şi

transportul acestui element, ca şi în ciclul său, sunt implicate procese:

- naturale: geografice şi biologice

- umane: industriale şi agricole.

Ciclul biologic al seleniului nu este în întregime descifrat, deşi au

existat mai multe încercări de a realize diagrame ale acestui proces (Fig. I.1).

Plante Soluri

Animale

Om

Viaţa acvatică

Oceane, mări şi lacuri

Ape curgătoare şi de suprafaţă

Sedimente şi roci sedimentare

Roci vulcanice

Miezul Pământului

Atmosfera

Vulcanism

Roci topite

Fig. I.1. Ciclul seleniului în natură (Adaptare după National Research Council

(U.S), Subcommittee on Selenium, 1983)

I.1.3. Seleniul – microelement eseţial pentru organism

Seleniul este un oligoelement esenţial, îndeplinind criteriile care

definesc acest tip de elemente (Reilly, 2004):

- au o concentraţiei relativ constantă;

- deficitul induce schimbări biochimice specifice;

- schimbările sunt acompaniate de anormalităţi echivalente la

specii diferite;

- suplimentarea aportului acestui element corectează carenţa.

7

Seleniul îndeplineşte o serie de roluri esenţiale în organismul uman.

Ca parte a unui număr de selenoproteine active funcţional are

funcţie de protejare a celulelor împotriva distrugerilor cauzate de radicalii

liberi, de hidroperoxizi sau de lipoperoxizi.

Seleniul este implicat în controlul şi sinteza prostaglandinelor,

prostaciclinelor, leucotrienelor şi tromboxanilor. Funcţiile organelor

reproductive şi hormonale depinde de un status suficient al seleniului din

organism.

Seleniul joacă, de asemenea, un rol important în funcţionarea

creierului. S-a dovedit că seleniul poate influenţa funcţia cognitivă şi starea

emoţională. Îndepărtarea genei selenoproteinei P a dus la scăderea nivelului

de seleniului din creier şi la disfuncţii neuronale. Tot selenoproteina P

poate promova supravieţuirea celulei neuronale. Schimbările statusului

seleniului pot avea implicaţii în boala Alzheimer sau în boala Parkinson.

Seleniul este important şi pentru că are rol protector împotriva

perturbărilor genetice apărute ca rezultat al stresului oxidativ excesiv.

Selenoproteine

Ca selenocisteină, al 21-lea aminoacid, seleniul este component al

selenoproteinelor, unele dintre acestea având funcţii enzimatice. Toate

aceste enzime sunt dependente de seleniu. În prezent se cunosc până la 100

de selenoproteine în sistemele enzimatice ale mamiferelor, dintre care în jur

de 30 au fost identificate. Majoritatea selenoproteinelor prezintă funcţii

redox enzimatice care le conferă activitate antioxidantă şi catalitică.

Selenoproteinele pot fi împărţite în două grupe:

- reductazele tioredoxinei Sel S (selenoproteina S), Sel R

(selenoproteina R), Sel O (selenoproteina O), Sel I (selenoproteina I). Sec =

L seril – tARN (Seleniu transferază) se află în regiunea C- terminal.

- a doua grupă include restul selenoproteinelor, caracterizate prin

prezenţa Sec în regiunea terminal-N.

O altă clasificare pentru selenoproteinele mamiferelor (Behne et

al.,2001), le împarte în trei categorii:

- proteine ce conţin seleniu încorporat nespecific;

- proteine ce conţin seleniu legat specific;

- selenoproteine specifice care conţin selenocisteina.

Selenoproteine umane

Glutation peroxidaza

Glutation peroxidaza (GPx) a fost prima selenoproteină

caracterizată din punct de vedere funcţional.

8

Această selenoproteină prezintă patru izoforme: citosolică

(GPx1), gastrointestinală (GPx2), plasmatică (GPx3) şi fosfolipid

hidroperoxid glutation peroxidaza (GPx4).

Glutation peroxidazele sunt enzime tetramerice, fiecare monomer

conţinând câte un atom de seleniu sub formă de selenocisteină în poziţia

35 a lanţului polipeptidic. Glutation peroxidaza este o enzimă

antioxidantă endogenă care catalizează reacţia de descompunere a

peroxidului de hidrogen sau a altor peroxizi organici.

GSH-Px intervine la concentraţii mici de H2O2 şi protejează

celulele de stresul oxidativ produs de speciile reactive ale oxigenului.

Glutation peroxidaza reduce H2O2 şi transformă hidroperoxizii

lipidici şi fosfolipidici în produşi inofensivi (apă şi alcooli).

Enzima foloseşte ca substrat glutationul (GSH) şi acţionează

conform reacţiei:

ROOH + 2GSH GSH -Px > R - OH + GSSG + H2O

în care: ROOH - poate fi H2O2 sau un peroxid organic

GSSG - glutation disulfidul (forma oxidată a glutationului)

Glutationul cedează enzimei electronii necesari reducerii peroxidului

de hidrogen sau a altor peroxizi. Seleniul este centrul redox al enzimei. În

prima etapă, el se oxidează de la starea de oxidare (-2) în enzimă, la starea de

oxidare zero într-un compus de tip acid selenenic (-SeOH).

Acesta reacţionează cu glutationul formând un compus de tip

selenilsulfid (-Se-SG). Prin adiţia unei molecule de glutation, se reface

glutation peroxidaza activă prin gruparea de tip selenolat şi, respectiv,

glutation disulfidul (GSSG)

Tioredoxin reductaza (TR)

Tioredoxin reductaza (Koishi et al, 2000; Zhong et al, 2000)

(TR) este o enzimă recent identificată, care conţine un rest de

selenocisteină în secvenţa terminală şi are trei izoforme (TR 1, TR 2, TR

3). Aceasta catalizează reducerea tioredoxinei dependentă de NADPH

precum şi a altor constituenţi sau oxidaţi ai celulelor.

Fiind o enzimă reducătoare, cu specificitate redusă pentru substrat,

tioredoxin-reductaza contribuie la homeostazia redox şi este implicată în

prevenirea şi ameliorarea dereglărilor provocate de stresul oxidativ generat

de peroxidul de hidrogen.

Activitatea tioredoxin reductazei umane este influenţată atât de

deficienţa de seleniu în dietă cât şi de suplimetarea excesivă a acestuia.

9

Iodotironin deiodinazele

Iodotironin deiodinazele reprezintă o altă clasă de selenoproteine

de importanţă majoră; iodotironin 5'-deiodinaza conţine seleniu sub formă

de selenocisteină şi are trei izoforme (DI 1, DI 2, DI 3). Ele catalizează

mono-deiodinarea-5’5 a tiroxinei prohormon (T4) în hormonul tiroidian

activ 3,3’5-triiodotironin (T3) şi conversia rezervei inactive de T3 în 3-

3’diiodotironină. Hormonii tiroidieni joacă un rol reglator în expresia

enzimei hepatice şi în funcţia neutrofilă (Arthur JR et al., 1993).

I.2. Farmacocinetica seleniului

Seleniul, sub forma de compuşi, poate ajunge în organism prin

inhalare sau prin ingestie. Rata de absorbţie variază în funcţie de forma

seleniului. Biodisponibilitatea orală a seleniului este independentă de

nivelul de expunere, dar poate să crească la persoanele care au deficit de

seleniu. Selenatul şi selenometionina sunt absorbite nemodificate la nivelul

intestinului, iar selenitul şi selenocisteina sunt metabolizate în timpul

absorbţiei.

Mecanismul absorbţiei intestinale este cunoscut. Mecanismele

absorbţiei cutanate şi pulmonare nu sunt complet elucidate.

Seleniul absorbit este transportat de sânge, fiind distribuit către

ţesuturi. Ajuns în sânge, seleniul este legat în proteine, iar selenitul este

acumulat în eritrocite printr-un mecanism de transport activ, aşa după cum

demonstrază studiile in vitro. Seleniul este incorporat în selenoproteine ca

selenocisteine.

Indiferent de forma de administrare, modelele de distribuţie sunt

similare, dar concentraţia atinsă este mai mare la administrarea de seleniu

organic (selenometionina) decât la seleniul anorganic.

Selenometionina nu este sintetizată de organismul uman, dar poate

fi incorporată în proteine în locul metioninei. De aceea, selenometionina e

păstrată mai mult timp în organism decât formele anorganice, putând să

reprezinte o formă de a depozita seleniul. Selenocisteina şi seleniul

anorganic sunt metabolizate. Selenocisteina incorporează seleniul în

selenoproteine, dar numai sub această formă.

I.3. Rolul seleniului în organismul uman

I.3.1. Seleniul şi metabolismul uman

Seleniul este încorporat sub formă de selenoaminoacizi la centrul

activ al unui mare număr de proteine, unele dintre ele având importante

10

funcţii enzimatice. În condiţii fiziologice, seleniul din selenocisteine este

aproape în întregime ionizat şi, prin urmare, este un catalizator biologic

extrem de eficient.

Selenoaminoacizii, în principal selenocisteina şi selenometionina,

sunt aminoacizi în care atomul de sulf din cisteină şi respectiv metionină

este înlocuit cu seleniu.

Studiile lui Sunde (1990) au subliniat rolul crucial al selenidului sau al

unei forme echivalente chimic a seleniului în procesul conversiei formelor

anorganice de seleniu în forme organice. Sinteza selenoaminoacizilor, a

selenoproteinelor, a seleno-tARN şi a genelor care controlează aceste procese

pentru sistemele bacteriene este cunoscută. În studiile pe forme mutante de E.

Coli au fost identificate cel puţin patru tipuri de gene, Se1A, Se1B, Se1C şi

Se1D ca esenţiale pentru sinteza proteinelor ce conţin selenocisteină.

c. Metabolismul seleniului în organismul uman

Biotransformările suferite de compuşii seleniului la om sunt

asemănătoare celor de la animale. Metabolismul seleniului în organismul

uman este complex şi depinde de forma chimică a seleniului. Căile

metabolice ale seleniului sunt prezentate schematic în figura 10. Formele

organice ale seleniului sunt selenocisteina şi selenometionina, iar cele

anorganice sunt selenitul şi selenatul. Compuşii organici ai seleniului-

selenocisteina, selenometionina, Se-metilselenocisteina-, cât şi cei

anorganici – selenit, selenat- sunt metabolizaţi la diferiţi metaboliţi ai

seleniului. Dintre formele organice, selenometionina este forma

predominantă în alimentaţie. Atât formele organice, cât şi cele anorganice

par să fie utilizate cu aceeaşi eficacitate în organism pentru a produce

selenoproteine (Shiobara et al., 1998), dar seleniul pătrunde în metabolism

în momente diferite, în funcţie de forma chimică, (figura I.11) .

11

Metabolismul

reducător

SELENAT

Na2SeO4

SELENIT

Na2SeO3

Proteinele generale ale

corpului

SELENOMETIONINA

SELENOCISTEINA

GS-Se-SG

GSH GS-SeH

GSH/NADPH

SELENID

Na2Se

Incorporare în

selenoproteine

SELENOFOSFAT

SELENURA DE HIDROGEN H2Se

METILSELENOL

CH3SeH

Calea metilării

TRIMETILSELENONIU

(CH3) 3Se+

DIMETILSELENID

(CH3)2Se

Se-METILSELENOCISTEINA

ACID METILSELENIC SELENOBETAINĂ

METILSELENOCIANAT

Prezent în aerul

expirat la doze

toxice de Se

Excretat în urină la doze toxice de

Se

Metioninază

Fig. I.12. Metabolismul seleniului în organismul uman

(adaptare după Meuillet et al., 2004)

I.3.2. Acţiunea detoxifiantă a seleniului

Seleniul reduce toxicitatea unor metale grele precum cadmiul,

mercurul anorganic, metilmercurul, taliul şi chiar a argintului, prin

formarea unor compuşi inerţi, neabsorbabili.

I.3.3. Necesarul zilnic de seleniu

Nu există criterii universal acceptate pentru stabilirea necesarului

zilnic de seleniu şi, prin urmare, nici estimări coerente pentru acest necesar,

deşi au existat preocupări în acest sens (Thomson, 2004).

Multe dintre estimările şi recomandările privind necesarul de

seleniu au la bază cercetările făcute în China, unde distribuţia seleniului în

sol este variată (de la un conţinut foarte scăzut la un conţinut crescut).

12

Estimările necesarului sunt dificil de făcut, ţinând cont şi de aportul zilnic

de seleniu din diferite ţări ale lumii.

T

Necesarul de seleniu (WHO/FAO, 2004)

Categoria de populaţie Greutate

medie

Media recomandată Doza

recomandată

(μg/zi) μg/ kgc/zi) μg /zi)

Sugari şi copii

0-6 luni 6 0,85 5,1 6

7-12 luni 9 0,81 8,2 10

1-3 ani 12 1,13 13,6 17

4-6 ani 19 0,92 17,5 22

7-9 ani 25 0,68 17,0 21

Adolescenţi

Fete 10-18 ani 49 0,42 20,6 26

Băieţi 10-18 ani 51 0,50 22,5 32

Adulţi

Femei 19-65 ani 55 0,37 20,4 26

Femei 65+ ani 54 0,37 20,2 25

Bărbaţi 19-65 ani 65 0,42 27,3 34

Bărbaţi 65+ ani 64 0,41 26,2 33

Sarcină

Trimestrul II 28

Trimestrul III 30

Alăptare

0-6 luni după naştere 35

6-12 luni după naştere 42

*DRN, Doza de Nutrient Recomandată, derivată din SeR + 2x deviaţia standard

asumată (12,5%).

Statusul seleniului în organism se apreciază pe termen scurt şi,

respectiv, pe termen lung:

statusul seleniului pe termen scurt: concentraţia de seleniu din

urină, plasmă, ser;

statusul seleniului pe termen lung: concentraţia din unghii, păr,

eritrocite.

Valorile de referinţă ale seleniului au fost stabilite, în general, prin

evaluarea cantităţii necesare pentru maximizarea activităţii GPx din sânge

sau plasmă(Thomas, 2004).

13

I.4. Patologia provocată de deficitul de seleniu

Carenţa de seleniu în organismul uman este responsabilă de efecte

şi sindroame specifice.

I.4.1. Deficitul de seleniu şi Boala Keshan (cardiomiopatia)

Această maladie a fost descrisă în China încă de acum peste 100 de

ani şi a avut un puseu important în 1935; legătura dintre boală şi deficitul

de seleniu a fost descoperită relativ recent (Ge et al.,1993). Cercetătorii au

realizat studii clinice în zonele în care boala este endemică, pe aproximativ

10 000 probe de sânge, păr, cereale locale, din care au analizat concentraţia

de seleniu şi măsurători ale glutation peroxidazei şi ale nivelului excreţiei

seleniului în urină. În timpul studiilor au fost suplimentate dietele celor

implicaţi cu selenit de sodiu. Totalul populaţiei tratate excede un milion de

persoane. Rezultatele cercetării confirmă relaţia strânsă între seleniu şi

boala Keshan.

I.4.2. Deficitul de seleniu şi Boala Kashin-Beck (boala Urov)

Boala Kashin-Beck este o osteoartropatie endemică care a fost

detectată la copii de 5-13 ani din China şi mai puţin la cei din Siberia de

sud-est. Se caracterizează prin necroză asociată cu degenerarea în regiunea

epifizeală a articulaţiilor mâinilor şi picioarelor şi duce la scurtarea

structurală a degetelor şi oaselor lungi cu întârzierea creşterii şi chiar

oprirea acesteia.

I.4.7. Deficitul de seleniu şi bolile cardiovasculare

Seleniul poate avea acţiune protectoare în afecţiunile

cardiovasculare. Această ipoteză se bazează pe abilitatea GPx de a combate

modificarea oxidativă a lipidelor şi de a reduce agregarea plachetară.

Mortalitatea cauzată de bolile de inimă a scăzut cu aproximativ 61% în

perioada 1972-1992 în Finlanda, lucru care se datorează, în parte, şi

creşterii nivelului de seleniu din dietă după introducerea, în 1985, a

fertilizării cu seleniu (se ştie că nivelul de seleniu din solul finlandez este

foarte scăzut) (Brown &Arthur, 2001).

Studiile epidemiologice au ajuns la rezultate diferite. Unii

cercetători au constatat o creştere de 2-3 ori a morbidităţii cardiovasculare

şi a mortalităţii din această cauză la persoanele cu concentraţia seleniului în

ser mai mică de 45 µg/L, comparativ cu subiecţi cu o concentraţie în

seleniu în ser mai mare, alte studii nu prezintă o asociere clară între

14

riscurile cardiovasculare şi concentraţia mică a seleniului (Salonen et al.,

1982;Virtamo et al., 1985). Totuşi în zonele cu deficienţă mai mare de

seleniu s-a putut remarca o asociere inversă între nivelul seleniului şi riscul

infarctului de miocard.

I.4.9. Seleniul şi funcţia tiroidiană

Deşi activitatea deiodinazei este relativ protejată în condiţiile unei

disponibilităţi reduse de seleniu, nivelul seleniului la populaţiile din Europa

şi din alte regiuni poate compromite totuşi metabolismul tiroidian. În

zonele cu deficit sever de seleniu, incidenţa tiroiditelor este mai mare, din

cauza scăderii activităţii glutation peroxidazei dependentă de seleniu din

celulele tiroidei. Enzimele dependente de seleniu influenţează şi ele

sistemul imunitar. Chiar şi o deficienţă mai uşoară de seleniu contribuie la

dezvoltarea şi menţinerea bolii tiroidiene autoimune (Negro, 2008). Carenţa

de seleniu asociată cu cea de iod exacerbează hipotiroidismul şi poate

determina chiar cretinismul mixedematos aşa cum se întâmplă în unele

zone din Zair, unde ambele elemente sunt deficitare. Suplimentarea cu

seleniu este benefică în cazul bolnavilor cu tiroidită autoimună (Gärtner et

al., 2002). Suplimentarea cu seleniu în timpul sarcinii şi după naştere

inhibă progresia tiroiditelor cronice autoimune (Negro et al., 2006).

I.5. Patologia provocată de excesul de seleniu

Toxicitatea seleniului este cunoscută indirect încă din evul mediu;

în timpul călătoriei în China în secolul al XIII-lea, Marco Polo şi însoţitorii

săi au fost avertizaţi asupra plantelor „otrăvitoare”. Astăzi se ştie că aceste

plante sunt cele acumulatoare de seleniu din genul Astragalus (Reilly,

1996).

Efectele toxice la animale sunt bine cunoscute şi sunt diferite în

funcţie de specie. Toxicitatea depinde de doza şi durata ingerării, dar şi de

forma chimică a seleniului. Toleranţa la toxicitatea seleniului depinde de

rata excreţiei, iar aceasta depinde de rata metilării seleniului (Mézes &

Balogh, 2009).

Selenoza este prezentă la majoritatea rumegătoarelor, din cauza

consumului de plante acumulatoare de seleniu, care transformă seleniul

anorganic în seleniu organic.

La om, aportul toxic este de aproximativ 850-900 µg/zi.

Simptomele intoxicării sunt greaţă, căderea părului, modificări în structura

unghiilor; la dozele mai mari, poate surveni decesul.

Toxicitatea seleniului este cunoscută de multă vreme, şi, deşi este

mai periculoasă, este mai puţin luată în seamă în comparaţie cu a altor

15

elemente, cum ar fi arsenul. Toxicitatea seleniului provoacă unele confuzii

din mai multe cauze.

În primul rând, seleniul este un nutrient esenţial utilizat de

selenoproteine. În al doilea rând, seleniul are beneficii majore pentru

sănătatea umană. În al treilea rând, toxicitatea seleniului este complexă.

Toate formele de seleniu sunt toxice, dar concentraţiile necesare pentru a

atinge nivelurile toxice similare diferă foarte mult. De asemenea, dieta

individuală joacă un rol important în ceea ce priveşte pragul toxicităţii. La

diete echilibrate, cu aceeaşi cantitate de seleniu, dar cu diferenţe în ceea ce

priveşte cantitatea de vitamina E, un individ poate fi sănătos (dacă vitamina

E este în exces) sau se poate îmbolnăvi (dacă vitamina E este în cantitate

mai redusă).

I.6. Surse alimentare de seleniu

Alimentaţia este sursa principală de seleniu pentru organismul

uman (şi este naturală). Cantitatea de seleniu pe care o luăm din alimente

depinde de tipul alimentului, de influenţa factorilor de mediu asupra

alimentului respectiv (tipul de sol pe care a crescut planta, tipul de hrană de

care a beneficiat animalul), de intervenţia umană asupra alimentului.

Intervenţia obişnuită a omului asupra alimentului este prelucrarea materiei

prime (măcinatul grâului, de exemplu) şi gătitul. În ceea ce priveşte

seleniul, se ştie că mulţi dintre compuşii seleniului sunt instabili şi volatili.

Unele vegetale care, în mod obişnuit, au nivele ridicate de seleniu

(sparanghelul) pierd în jur de 40% din conţinutul de seleniu în procesul

culinar (Higgs et al., 1972). Adăugarea de sare, pH-ul acid sau gătitul prea

intens duc la pierderi ale conţinutului de seleniu (lucru valabil şi pentru alţi

nutrienţi). De obicei însă, gătitul obişnuit nu are efecte semnificative.

Măcinatul şi fierberea cerealelor (Ferretti & Levander, 1974)), tratamentul

termic pentru carne de pui sau peşte nu au impact semnificativ pentru

conţinutul de seleniu.

I.6.3. Metode de îmbogăţire a conţinutului de seleniu al

alimentelor

Scăderea cantităţii de seleniu din organismul uman, constatată în

unele zone ale lumii, poate fi rectificată prin diversificarea în dietă,

suplimente minerale la subiecţii umani sau la animale, fortificarea

alimentelor în timpul procesării sau biofortificarea recoltelor.

De vreme ce alimente precum nucile de Brazilia, viscerele şi carnea

de crab, care conţin în mod natural nivele ridicate de seleniu, nu sunt

16

consumate, de regulă, în cantităţi mari, potenţialul pentru diversificarea

dietei este limitat.

Folosirea suplimentelor cu conţinut ridicat de seleniu, inclusiv

formule pe bază de drojdie, pare o opţiune eficientă şi sigură pentru

subiecţii umani. Totuşi, suplimentele sunt relativ scumpe, restricţionate la

folosire în unele zone sau ineficiente.

O altă metodă ar fi biofortificarea, creşterea concentraţiilor

biodisponibile ale elementelor esenţiale în porţiile comestibile ale plantelor

cultivate prin folosirea îngrăşămintelor (biofortificarea agronomică) sau

prin selecţia recoltelor sau raselor (biofortificarea genetică).

1.6.4. Suplimentele nutritive – surse de seleniu

Suplimentele nutritive sunt destinate compensării nevoilor crescute

în principii nutritive în urma efectuării unor activităţi particulare (sportivi),

fumătorilor şi, în egală măsură prevenirii sau optimizării unor stări

(oboseală, memorie), încetinirea îmbătânirii şi chiar, pentru a permite

scăderea greutăţii corpului.

Conform datelor dintr-un studiu apărut în revista Genome Biology

(Lobanov et al., 2008) anumite suplimente alimentare conţinând seleniu ar

putea să nu fie la fel de benefice pentru majoritatea indivizilor, care în

cursul evoluţiei au suferit modificări fiziologice de natură să li se reducă

nevoile de seleniu. Consumul de suplimente pe bază de seleniu este

justificat în unele regiuni din China (maladia Kesham, prin deficit de

seleniu) şi din Africa (cretinism endemic, prin deficit de seleniu şi iod)

unde solul este foarte sărac în aceste oligoelement, dar trebuie recomandat

cu precauţii pentru populaţia sănătoasă, în general.

Referitor la uşurinţa cu care populaţia acceptă şi consumă

suplimentele alimentare Hercberg (2006) afirmă că cea mai bună sursă de

acoperire a nevoilor de nutrienţi a organismului este alimentaţia. A priori,

în afara indicaţiilor medicale foarte exacte pentru suplimentarea aportului la

femeile însărcinate, la persoanele supuse unor regimuri restrictive, la

subiecţii vârsnici cu polimedicaţie nu există nici o justificare ,,nici

biologică, nici clinică, nici epidemiologică pentru a recomanda consumul

de suplimente alimentare pentru populaţia generală”. În plus, au apărut

semnalări (mai ales date epidemiologice) care sugerează că administrarea

regulată de suplimente nutritive poate induce efecte dăunătoare, contrare

celor aşteptate.

17

PARTE PERSONALĂ

Capitolul II

ESTIMAREA APORTULUI DE SELENIU PRIN CONSUM DE

ALIMENTE

II.1. Introducere

Valoarea ştiinţifică a rezultatelor analizei unei anumite componente

dintr-o probă complexă depinde nu numai de sensibilitatea şi specificitatea

metodei de analiză ci şi de modul în care sunt parcurse etapele anterioare

determinării propriu-zise, de la recoltarea probei, separarea, analitului de

interes la stabilirea condiţiilor optime de aplicare a metodei. Literatura de

specialitate prezintă numeroase metode pentru determinarea seleniului din

numeroase categorii de probe: apă potabilă, apă reziduală, produse

alimentare, sol, suplimente nutritive, medicamente, lichide biologice etc.

Obiective

Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit:

adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de

determinare a seleniului din produse alimentare prin stabilirea condiţiilor de

aplicare a metodei şi determinarea parametrilor de validare ai metodei;

aplicarea metodei validate la determinarea seleniului din probe

de produse alimentare de natură vegetală şi animală;

estimarea aportului zilnic de seleniu pe baza conţinutului de

seleniu determinat pentru cele trei modele de alimentaţie: convenţională,

vegetariană şi vegetaliană;

determinarea seleniului din unele suplimente nutritive care

conţin seleniu.

II.2.2. Stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei

spectrofotometrice de determinare a seleniului din produse alimentare

Principiul metodei

Pentru determinarea spectrofotometrică a seleniului din produse

alimentare s-a adaptat şi validat metoda spectrofotometrică realizată de

Revanasiddappa et al. (2001), o metodă indirectă bazată pe reacţia

seleniului (IV) cu iodura de potasiu în mediu acid. Iodul eliberat

reacţionează cu albastru variamin, formând un compus colorat în roz-violet

(Fig. II.1.), cu absorbanta maximă la 545 nm.

18

12

I2 + CH3O NH NH2 CH3O N NH2 + I

-+

SeO3

2-+ 4I

- + 6H

+ Se

0 + 2I2 + 3H2O

Fig. II.1. Reacţiile de determinare a seleniului prin metoda indirectă

seleniu (IV)- albastru variamin

Metoda este uşor de aplicat, sensibilă şi selectivă şi a fost adaptată

la determinarea cantitativă a seleniului (IV) din apă, sol, produse alimentare

de origine vegetală şi animală, suplimente alimentare conţinând seleniu.

Pentru îndepărtarea influenţei ionilor interferenţi asupra intensităţii

culorii s-a utilizat EDTA, ca agent de complexare.

Metoda analitică

În vederea stabilirii condiţiilor de aplicare a metodei

spectrofotometrice de determinare a seleniului din probe de produse

alimentare s-a urmărit:

• Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă;

• Stabilirea volumului soluţiei de acid clorhidric necesar sistemului

seleniu (IV)- iodură de potasiu - albastru variamin;

• Stabilirea volumului soluţiei albastru variamin necesar sistemului

seleniu (IV)- iodură de potasiu- albastru variamin;

• Stabilirea volumului soluţiei de iodură de potasiu necesar

sistemului seleniu (IV)- iodură de potasiu-albastru variamin;

• Stabilirea volumului soluţiei de acetat de sodiu necesar sistemului

seleniu (IV)- iodură de potasiu - albastru variamin;

• Stabilirea volumului soluţiei de EDTA necesar sistemului seleniu

(IV) - iodură de potasiu- albastru variamin pentru complexarea ionilor

interferenţi;

• Studiul stabilităţii produsului de reacţie.

II.2.2.1. Stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este

maximă

Volume de soluţie etalon de lucru conţinând 25, 50 respectiv 100

µg Se4+ se tratează cu câte 1 mL soluţie iodură de potasiu 2% şi 1 mL

soluţie acid clorhidric 2M şi se agită uşor. Se adaugă succesiv 0,5 mL

soluţie albastru variamin şi 2 ml soluţie acetat de sodiu şi, 1 mL soluţie

EDTA 0,2M, se completează volumul la 20 mL cu apă distilată.

19

Spectrele de absorbţie pentru sistemul Se (IV)-iodură de potasiu -

albastru Variamin s-au înregistrat faţă de martorul corespunzător, iar al

martorului faţă de apă distilată, la spectrofotometrul UV-VIS T 80 PG

Instruments LTD.

Tabel II.1

Stabilirea lungimii de undă cu absorbanţă maximă

Nr.

crt

Lungimea de

undă (nm)

Absorbanţa

25 µg Se4+

50 µg Se4+

100 µg Se4+

1. 400 - 0,032 0,083

2. 420 - 0,054 0,112

3. 440 0,036 0,076 0,139

4. 460 0,049 0,083 0,162

5. 480 0,534 0,101 0,215

6. 500 0,060 0,115 0,252

7. 520 0,069 0,143 0,302

8. 530 0,086 0,169 0,341

9. 540 0,102 0,205 0,425

10. 545 0,106 0,218 0,420

11. 550 0,105 0,215 0,418

12. 560 0,088 0,183 0,368

13. 580 0,064 0,154 0,312

14. 600 0,051 0,121 0,256

15. 620 0,032 0,098 0,218

16. 640 - 0,067 0,134

Din analiza spectrelor de absorbţie ale produsului reacţiei

sistemului Se (IV)-iodură de potasiu - albastru Variamin se constată un

maxim de absorbţie la lungimea de undă 545 nm. La acestă lungime de

undă, absorbanţa martorului este neglijabilă.

În urma stabilirii parametrilor optimi de desfăşurare a reacţiei a

rezultat modul de lucru pentru determinarea seleniului tetravalent din probele

de analizat: volume de soluţie etalon de seleniu conţinând 5-100 µg Se4+ se

tratează cu cu 1 ml soluţie de iodură de potasiu, 2 mL acid clorhidric şi se

agită lent. Se adaugă 1 ml soluţie albastru variamin, 1mL soluţie EDTA

0,2M şi 2 mL soluţie acetat de sodiu, se completează volumul la 20 ml cu

apă distilată şi se măsoară absorbanţele la 545 nm, cuva de 1 cm, faţă de un

martor preparat în aceleaşi condiţii.

20

II.2.3. Raportul de validare a metodei de analiză a seleniului

Metoda de validare şi procedura de analiză a probelor s-a realizat în

conformitate cu normele de validare pentru metodele analitice prezentate în

protocolul de validare.

Validarea metodei a fost realizată pe baza verificării următorilor

parametri: liniaritate/domeniu de concentraţie, precizie, acurateţe, stabilitate,

randament de recuperare, limită de detecţie, limită de cuantificare.

II.2.3.1. Liniaritatea

Pentru studiul liniarităţii metodei au fost preparate soluţii de lucru

prin diluarea unei soluţii stoc care conţine 100 µg Se4+/mL cu apă distilată

la concentraţii în ioni seleniu cuprine între 5 şi 100 µg Se4+/probă, respectiv

0,5 – 5,0 µg Se4+/mL, care se prelucrează conform modului de lucru stabilit

anterior.

Răspunsul ionului de seleniu este liniar pentru un interval de

concentraţie de 0,5-5 µg Se4+/mL având un coeficient de corelaţie (R2) de

0,9977. Valorile absorbanţelor reprezintă media a 3 determinări şi sunt

redate în tabelul II.9.

Tabel II.9.

Liniaritatea funcţiei de răspuns

Nr. crt Concentraţie Absorbanţa

(µg/mL) µg/probă I II II IV Medie

1. 0,5 10 0,0399 0,0411 0,0420 0,0414 0,0411

2. 1,0 20 0,0800 0,0790 0,0786 0,0783 0,0789

3. 1,5 30 0,1549 0,1505 0,1489 0,1503 0,1511

4. 2,0 40 0,1706 0,1720 0,1698 0,1721 0,1711

5. 2,5 50 0,2135 0,2202 0,2181 0,2106 0,2156

6. 3,0 60 0,2605 0,2597 0,2561 0,2543 0,2576

7. 3,5 70 0,3108 0,3200 0,3115 O,3102 0,3131

8. 4,0 80 0,3412 0,3409 0,3398 0,3429 0,3412

9. 4,5 90 0,3800 0,3901 0,3814 0,3827 0,3835

10. 5,0 100 0,4209 0,4261 0,4303 0,4265 0,4259

Se reprezintă grafic variaţia absorbanţei medii în funcţie de

concentraţie şi se determină intervalul de concentraţie pentru care această

variaţie este liniară.

Se trasează dreapta de regresie pentru acest interval, iar datele

obţinute se evaluează statistic, determinându-se coeficientul de corelaţie (r),

deviaţia standard a pantei dreptei de regresie (s), eroarea standard a dreptei

de regresie (SD) şi ecuaţia dreptei, Absorbanţa = f(c):

21

Absorbanta = p x C + b,

în care: p = panta; C = concentraţia; b = interceptul

Reprezentarea grafică a variaţiei concentraţiilor calculate funcţie de

concentraţia teoretică este prezentată în fig. II.2.

Fig. II.2. Curba de calibrare pentru validarea liniarităţii metodei

Curba de calibrare obţinută în studiul liniarităţii metodei de

determinare a seleniului în sistemul seleniu-iodură de potasiu-albastru

variamin.

Ecuaţia dreptei de calibrare, calculată prin regresie matematică, este:

Absorbanţa = 0,00425 x Concentraţia (g/probă) +0,0041

Tabel II.10.

Datele evaluării statistice

Nr. crt. Parametrul Valoarea

1. Coeficient de corelaţie (r) 0,9954

2. Coeficient de regresie (r2) 0,9977

3. Eroare standard a dreptei de regresie (SD) 0,00927

4. Interceptul (b) + 0,00411

5. Panta (p) 0,00425

Evaluarea liniarităţii rezultatelor se realizează prin calcularea

concentraţiei regăsită utilizând ecuaţia dreptei de calibrare. Între

concentraţia introdusă teoretic şi cea calculată folosind ecuaţia dreptei calibrare

există o corelaţie liniară, panta acestei drepte fiind egală cu +0,00425;

interceptul este +0,00411. Coeficientul de corelaţie a acestei drepte are

valoarea r2 = 0,9954. În concluzie, între concentraţia teoretică şi cea calculată

utilizând ecuaţia dreptei de calibrare, corelaţia este optimă.

22

În urma prelucrării statistice a datelor experimentale privind

liniaritatea metodei de determinare spectrofotometrică a ionului de seleniu

tetravalent se desprind următoarele concluzii. Metoda este liniară în domeniul

de concentraţie ales (0,5-5µgSe 4+/mL) (10 – 100 µg Se 4+/probă).

Ecuaţia dreptei este:

Absorbanţa = 0,00425c + 0,00411

Datele experimentale obţinute în urma cercetărilor confirmă

validitatea metodei spectrofotometrice de determinare a seleniului în

intervalul 10 -100 µg Se4+; coeficientul de corelaţie are valoarea 0,9954.

II.2.3.4. Randament de recuperare

Randamentul de recuperare a fost determinat pe trei tipuri de

probe: pâine integrală şi usturoi. Probele de produs alimentar au fost

prelucrate în vederea separării seleniului, şi anume, cantităţi de 5-10 g

probă de analizat au fost tratate cu volume de soluţie de selenit de sodiu

etalon, corespunzătoare concentraţiilor de 50 şi 100 µg/kg produs

alimentar. Separarea seleniului s-a realizat prin două variante: calcinare la

450ºC şi mineralizare umedă nitro-sulfurică.

Tabel II.16.

Randamentul de recuperare determinat pe probe de pâine integrală

Seleniu

adăugat

(µg/kg)

Concentraţie

teoretică

(µg/kg)

Concentraţie determinată

(µg/kg)

Randament de recuperare

(%)

Mineralizare

uscată

Mineralizare

umedă

Mineralizare

uscată

Mineralizare

umedă

- 253,45 258, 34

50 303,45 204,17 256,20 67,28 84,43

- 234,12 237,09

50 284,12 196,38 236,35 69,12 83,19

- 264,32 270,14

50 314,32 224,51 264,53 71,43 84,16

- 253,45 258, 34

100 353,45 313,72 342,10 88,76 96,79

- 209,74 252,44

100 309,74 273,68 300,88 88,36 97,14

- 216,75 255,38

100 316,75 276,64 307,43 87,34 97,06

Rezultatele obţinute au evidenţiat diferenţe ale randamentului de

recuperare atât în funcţie de metoda de separare a seleniului din probele de

analizat, cât şi de concentraţia de seleniu adaugată (Tabel II.16).

Astfel, pentru probele de pâine integrală, la care separarea

seleniului s-a realizat prin calcinare randamentul de recuperare a avut valori

de 67,28 % pentru concentraţia adăugată de 50 µg/kg şi 84,43% la

23

adăugarea selenitului de sodiu în concentraţie de 100 µg/kg. Separarea

seleniului prin mineralizare umedă a condus la procente mai mari ale

randamentului de recuperare, de 88,36% şi, respectiv 97,14%.

II.2.3.5. Limita de detecţie (LD) şi limita de cuantificare (LC)

Limita de detecţie se poate aprecia prin cantitatea sau concentraţia

minimă de analit, care se poate detecta faţă de blanc, cu un anumit nivel de

încredere ales şi care poate fi distinsă de zero.

Pentru determinarea limitei de detecţie am utilizat relaţia:

Limita de cuantificare (cea mai mică concentraţie de analit care

poate fi determinată cu un nivel acceptabil al repetabilităţii şi exactităţii) se

calculează după formula:

II.2.4. Determinarea seleniului din produse alimentare

II.2.4.1. Probe de analizat

În cercetările noastre am analizat 45 de probe de produse

alimentare de origine vegetală procurate din reţeaua comercială şi de la

producători individuali de pe teritoriul oraşelor Iaşi şi Buhuşi.

II.2.4.2. Separarea seleniului din probele de analizat (material

vegetal, pâine, seminţe) (JAOAC, 2000)

Mineralizarea umedă nitro - sulfurică

În jur de 5g probă (produs vegetal proaspăt, pâine, seminţe)

mărunţită se aduc în baloane Kjehdahl de 250 mL; se adaugă 10-15 mL

amestec 1:1 (v/v) de acid sulfuric şi acid azotic concentrat (d= 1,27) şi se

menţine pe baia de nisip până la obţinerea unei soluţii limpezi şi incolore.

Soluţia a fost diluată cu apă deionizată, filtrată şi adusă cantitativ la

volumul de 50 mL. Soluţia mineralizată obţinută serveşte la determinarea

cantitativă a seleniului tetravalent din probe.

Mineralizarea uscată (calcinare)

Cantităţi de probă de analizat în jur de 5g se aduc în capsule de

platină cu masa cunoscută (probele de produs vegetal se menţin în etuvă la

temperatura de 105 - 110ºC pentru îndepărtarea apei) şi se introduc în

cuptorul de calcinare (Nabertherm). Mineralizarea uscată se realizează la

temperatura de 450ºC. Cenuşa se reia cu 5mL soluţie de acid azotic 5% se

diluează cu apă deionizată se filtrază şi se aduce cantitativ la volumul de 50

(g/mL) = 0,36 g/mL

(g/mL) = 1,09 g/mL LC

24

mL. Soluţia mineralizată obţinută serveşte la determinarea cantitativă a

seleniului tetravalent din probe.

II.2.4.3.Determinarea seleniului din probele de produse alimentare

Determinarea seleniului sub formă de seleniu tetravalent (Se4+) s-a

realizat prin metoda spectrofotometrică bazată pe oxidarea ionului iodură la

iod elementar şi reacţia acestuia cu albastru variamin, adaptată şi validată

de noi după metoda Revanasiddappa et al., (2001), (validată de noi).

Modul de lucru pentru determinarea seleniului din probele de

produse alimentare

Volume de 1-10 mL de soluţie mineralizată se prelucrează în

modul indicat la trasarea curbei de calibrare. Cu ajutorul curbei etalon se

determină conţinutul de seleniu din probă, iar rezultatul se exprimă în mg

Se4+/ 100 g produs alimentar.

Rezultatele şi discuţii

Rezultatele obţinute la determinarea seleniului din cele 46 probe de

produse alimentare sunt consemnate în tabelele II.19 – 21.

Tabel II.19.

Conţinutul în seleniu al produselor alimentare studiate

Nr.

crt Denumirea probei Masa probei

Concentraţia în seleniu

µg/probă µg/kg

1. Arahide prăjite cu sare 4,2132 0,4220 10,02

2. Franzelă albă 4,7853 0,1510 3,17

3. Pâine neagră coaptă vatră 4,2092 0,1772 4,21

4. Paine albă feliată la vatră Afer 2,0704 0,0797 3,85

5. Pâine integrală Vita Star 2,3839 0,0967 4,03

6. Ridiche neagră - România 5,3416 0,0357 0,67

7. Sfeclă roşie - România 5,3854 0,0096 0,18

8. Kiwi – Grecia 9,6449 0,0617 0,64

9. Pătrunjel - România 6,3395 0,0312 0,49

10. Mărar - România 6,2740 0,0263 0,42

11. Măsline - Grecia 5,1635 0,0294 0,57

12. Hrean - Buhuşi 2,3865 0.0334 1,40

13. Ţelină - Buhuşi 2,4105 0,0127 0,52

14. Morcov - Buhuşi 5,2987 0,1166 2,20

15. Varză roşie 6,0548 0,1290 2,13

16. Varză albă România vrac 5,2881 0,1090 2,06

25

Tabel II.20.


Nr.

crt Denumirea probei

Masa

probei


µg/probă µg/kg

17. Banane 5,1492 0,0324 0,63

18. Portocale - Grecia 6,9798 0,0865 1,24

19. Lamai - Turcia 6,8381 0,0500 0,74

20. Porumb dulce "Aro" - Ungaria 4,8750 0,0234 0,48

21. Fasole - bob alb „Deroni"Polonia 2,4889 0,0154 0,62

22. Linte verde "Deroni" - Canada 2,1090 0,0099 0,47

23. Texturat din soia - vrac 2,2223 0,0246 1,11

24. Orez 1,4800 0,0316 2,14

25. Spaghete "Pambac" 1,3713 0,1151 8,40

26. Biscuiti obisnuiti vrac 2,3611 0,1444 6,12

27. Malai extra "Pan Group" 1,9005 0,0203 1,07

28. Faina alba 000 "Pambac" 1,3900 0,1932 13,90

29. Ciuperci 3,4222 0,9281 27,12

Concentraţiile în seleniu determinate în cele 46 de probe de

produse alimentare studiate variază în limite foarte largi; astfel, pentru

acelaşi tip de aliment – mere, concentraţiile de seleniu sunt cuprinse întrte

0,23 µg/100g şi 0,43 µg/100g. Pentru probele de ardei gras, concentraţiile

determinate variază de la 0,18 µg/100g la 0,32 µg/100g. Conţinutul în

seleniu al probelor de pâine analizate variază între 3,17 şi 4,21 µg/100g.

Cele mai mari concentraţii de seleniu s-au determinat în probele de ciuperci

(27,12 µg/100g) usturoi (14,54 µg/100g), arahide prăjite (10,02 µg/100g) şi

făină albă 000 (13,90 µg/100g). Aceste rezultate sunt destul de apropiate de

cele publicate în literatura de specialitate. Astfel, Barclay et al., (1992) au

raportat pentru făina albă o concentraţie medie de seleniu cuprinsă între 7,9

şi 23,4 µg/100g de produs. Diferenţele sunt explicate prin conţinutul diferit

în proteine al făinii; făina cu cel mai ridicat nivel al seleniului are un

conţinut ridicat în proteine (mai mult de 150g/kg) comparativ cu cea cu un

conţinut proteic de 130g/kg care are cel mai coborât nivel de seleniu. Alţi

autori (Barkley et al., 1995) au determinat în probe de făină „de referinţă”

concentraţii de seleniu de 14 µg/100g de produs.

26

Tabel II.21.


Nr.crt Denumirea probei Masa

probei


µg/probă µg/100g

30. Morcovi vrac Olanda 5,0965 0,0571 1,1223

31. Roşii vrac Turcia 5,9737 0,0262 0,4397

32. Ardei iuţi vrac Turcia 6,1944 0,0076 0,1243

33. Ardei capia roşu 5,4450 0,0125 0,2313

34. Ardei gras verde Turcia 5,6883 0,0102 0,1800

35. Ardei gras Bianca vrac Turcia 5,8901 0,0188 0,3208

36. Ardei gras portocaliu Spania 6,2447 0,0147 0,2354

37. Cartofi România - Buhuşi 5,4525 0,0163 0,3007

38. Cartofi albi - România 5,4209 0,0195 0,3607

10. Usturoi – China 5,3079 0,7718 14,5422

39. Ceapă roşie - România - Buhuşi 5,6904 0,0359 0,6322

40. Ceapă albă - România - Buhuşi 5,4776 0,0280 0,5123

41. Mere Golden delicious - Austria 5,6883 0,0134 0,2356

42. Mere - România - Buhuşi 5,8021 0,0248 0,4276

43. Mere Starkinson vrac Grecia 5,4548 0,0106 0,1954

44. Mere Yonagold – Belgia 5,6633 0,0246 0.4378

45. Grapefruit alb vrac Turcia 8,6108 0,0448 0,5208

Concentraţia seleniului în pâine, raportată de Barcley et al. (1995)

variază între 3,5 şi 4,8 µg/100g de produs. Autorii egipteni (Hussein et al.,

1999) au raportat pentru făina albă concentraţii de seleniu de 19,3 µg/100g

de produs. Analizate comparativ, datele obţinute de noi şi cele prezente în

literatura dev specialitate, evidenţiază valori suficient de apropiate pentru

aceleaşi tipuri de produse alimentare. Pe această bază se poate estima

aportul zilnic de seleniu prin consumul de produse alimentare de origine

vegetală. Valorile mai mici pentru unele produse recoltate din România ar

putea fi explicate prin nivelul scăzut al seleniului în sol (Lăcătuşu et al.,

2010; Lăcătuşu et al., 2002; Lăcătuşu et al., 1992).

Concluzii

Cercetările experimentale incluse în acest capitol au condus la

adaptarea şi validarea unei metode spectrofotometrice de determinare a

seleniului din produse alimentare prin stabilirea condiţiilor de aplicare a

metodei şi determinarea parametrilor de validare ai metodei Astfel, după

stabilirea lungimii de undă la care absorbanţa este maximă s-au stabilit

volumele optime ale tuturor reactivilor utilizaţi la aplicarea metodei.

27

Raportul de validare a confirmat valori optime pentru parametrii

impuşi metodelor spectrofotometrice de analiză. Astfel, liniaritatea metodei

este corespunzătoare pentru intervalul de concentraţii 0,5-5 μg/mL (10-100

g/probă), coeficient de regresie (r2) are valoarea 0,9954, coeficientul de

corelaţie (r) = 0,9977; panta = 0,00425, iar interceptul = 0,00411.

Precizia metodei, indică pentru deviaţia relativă standard (RSD %)

valori de 0,9493% pentru repetabilitatea detecţiei, 1,2900% pentru

repetabilitatea metodei şi 1,8302% pentru precizia intermediare. Valoarea

limită admisă pentru deviaţia standard relativă este de 5%; cerinţa este

îndeplinită, ceea ce dovedeşte o bună repetabilitate a metodei.

În ceea ce priveşte exactitatea metodei, regăsirea medie este de 100,19% pe

intervalul 97,97 – 103,60%. Valorile experimentale obţinute indică faptul

că metoda este exactă.

Rezultatele obţinute au evidenţiat diferenţe ale randamentului de

recuperare atât în funcţie de metoda de separare a seleniului din probele de

analizat, cât şi de concentraţia de seleniu adaugată. Astfel, pentru probele

de pâine integrală, la care separarea seleniului s-a realizat prin calcinare

randamentul de recuperare a avut valori de 67,28 % pentru concentraţia

adăugată de 50 µg/kg şi 84,43% la adăugarea selenitului de sodiu în

concentraţie de 100 µg/kg. Separarea seleniului prin mineralizare umedă a

condus la procente mai mari ale randamentului de recuperare, de 88,36% şi,

respectiv 97,14%. Pentru probele de usturoi, randamentele de recuperare

sunt apropiate de cele determinate pentru probele de pâine şi sunt cuprinse

între 76,16% şi 97,73%.

Calcularea limitei de detecţie (LD) şi a limitei de cuantificare (LC)

a condus la concentraţii de 0,36 µg/mL şi respectiv 1,07 µg/mL. Aceste

valori confirmă nivelul modest de sensibilitate a metodelor

spectrofotometrice de determinare a seleniului din probe a căror

concentraţie a acestui element este scăzută.

Determinarea seleniului din produsele alimentare de origine

vegetală a condus la rezultate comparabile cu cele raportate de alţi autori

pentru produse similare. Valorile mai mici pentru unele produse recoltate

din România ar putea fi explicate prin nivelul scăzut al seleniului în sol.

28

Capitolul III

ROLUL SUPLIMENTELOR NUTRITIVE ÎN ASIGURAREA

APORTULUI DE SELENIU PENTRU ORGANISM

III. 2. Suplimente nutritive cu seleniu

Doza zilnică de seleniu din dietă nu este întotdeauna de ajuns pentru

nevoile nutriţionale ale indivizilor, mai ales pentru cei care locuiesc în zone cu

soluri sărace în acest element. Numeroşi medici recomandă mărirea dozei de

seleniu din dietă şi folosirea de suplimente nutritive cu acest produs, mai ales

ca mijloc de a reduce riscul apariţiei unor forme de cancer. Acest lucru

presupune o grijă sporită pentru a găsi forma potrivită de seleniu din

suplimente, a supraveghea calitatea produselor de pe piaţă, siguranţa lor şi

modul în care sunt ele consumate.

Suplimentele cu seleniu necesită o mai atentă supraveghere, iar

populaţia trebuie informată mai corect referitor la conţinutul acestor

suplimente, la forma de seleniu din suplimente, la posibilele intercaţiuni cu

alte substanţe, la pericolele supradozării.

Obiectivele cercetării

Suplimentele alimentare care au seleniu în compoziţia lor sunt

recomandate şi administrate pentru completarea necesarului de seleniu

pentru organism. Deoarece, în general aceste suplimente nu se

administrează după evaluarea statusului nutriţional al organismului în

seleniu, se impun precauţii pentru a se evita aportul excesiv al acestui

microelement. Inregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare

nu este supusă aceloraşi reglementări ca şi în cazul medicamentelor şi de

aceea, în cazul seleniului, microelement la care balanţa deficit-exces este

atât de sensibilă este necesară respectarea concentraţiei microelementului

pe doza unitară administrată.

Cercetările experimentale incluse în acest capitol au urmărit:

Determinarea conţinutului în seleniu al unor suplimente

nutritive

Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive

conţinând seleniu.

29

III.2.1. Determinarea seleniului prin metoda spectrofotometrică

cu iodură de potasiu - albastru variamin.

Material şi metode

Probe de analizat

Probele de analizat - 12 suplimente alimentare conţinând seleniu au

fost achiziţionate din reţeua farmaceutică a oraşului Iaşi:

1. Taxofit (V) – comprimate cu eliberare retard

2. Se – spirulin – comprimate acoperite

3. Additiva superform (V) - comprimate acoperite

4. Additiva 50+ (V) - comprimate filmate

5. Diabetiker (V) - comprimate filmate

6. Bio – Seleniu – Zinc (V) - comprimate filmate

7. Additiva Okio-clar (V) - comprimate filmate

8. Complex de antioxidanţi (V) - capsule moi

9. Walmark Seleniu formula forte (VI) – comprimate

10. Walmark Antioxidant (V) – comprimate

11. Multivitamine şi minerale junior – pulbere oro – solubilă (2 g –

compoziţia)

12. Multivitamine şi minerale adulţi – pulbere oro – solubilă (2 g –

compoziţia)

III.2.2. Determinarea seleniului din probele de suplimente

alimentare

Separarea seleniului din probe

Separarea seleniului din probe s-a realizat prin mineralizare uscată,

la temperatura de 600ºC. Reziduul final reluat cu amestec acid sulfuric

concentrat - acid azotic concentrat (1:1), s-a neutralizat şi după filtrare s-a

adus cantitativ cu apă distilată la volumul de 50 ml – soluţia mineralizată.

Soluţia obţinută a fost utilizată pentru dozarea seleniului prin cele două

metode spectrofotometrice prezentate în capitolul anterior.

Cotă parte din soluţia mineralizată (1-3 mL) se prelucrează în

modul indicat la trasarea curbei de etalonare. După 20 de minute se

măsoară absorbanțele la 545 nm, cuva de 1 cm, faţă de un martor preparat

în aceleaşi condiţii,

Rezultate şi discuţii

Rezultatele obţinute la determinarea seleniului prin metoda

spectrofotometrică cu iodură de potasiu-albastru variamin sunt înserate în

tabelul III.2.

30

Tabel III.2.

Conţinutul în seleniu al probelor analizate

Nr.

probei

Conţinut în seleniu (µg/comprimat/ capsulă) Abatere

(%) Declarat Determinat

1. 15 15,45 +3,00

2. 50 53,23 +6,46

3. 40 37,12 -7,20

4. 30 30,07 +0,23

5. 100 101,15 +1,15

6. 17,5 18,32 +4,68

7. 15 16,06 +7,06

8. 100 98,14 -1,86

9. 50 49,05 -1,90

10. 50 51,14 +2,28

11. nedeclarat 24,45/2 g pulbere -

12 nedeclarat 44,14/2 g pulbere -

Din analiza rezultatelor obţinute la determinarea seleniului din

probele de suplimente alimentare luate în studiu se constată variaţii faţă de

concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de concentraţiile

declarate variază între – 7,2% şi +7,06%.

III.2.3. Studiul cedării in vitro a seleniului din suplimente nutritive

Testul de dizolvare este un test de studiu al cedării (eliberării) in

vitro a substanţei active dintr-o formă farmaceutică solidă.

Punerea la dispoziţia organismului a substanţei active din formele

farmaceutice orale este diferită de aceea a unei forme cu aplicare topică sau

pe mucoase (ovule, supozitoare).

Timpul de dizolvare stabileşte cantitatea de substanţă activă

dizolvată dintr-o formă farmaceutică solidă cu administrare orală, într-un

anumit timp, în mediul de dizolvare prevăzut.

Principiul determinării

Comprimatul se plasează într-un recipient în lichidul de dizolvare.

Cu un sistem de agitare, are loc o agitare lentă în jurul comprimatului, dar

suficientă pentru a asigura omogenitatea mediului, în vederea prelevării

probelor.

Agitarea mediului se realizează mecanic prin intermediul unei tije,

care la primul aparat se termină cu o paletă, iar la al doilea, cu un coşuleţ

31

confecţionat dintr-o sită. În primul aparat, comprimatul se introduce în mediul

de dizolvare, iar în al doilea aparat, comprimatul este plasat în coşuleţ şi se

roteşte o dată cu el.

Condiţii de calitate pentru comprimatele cu minerale

Tabletele cu minerale conţin două sau mai multe minerale derivate

din substanţe recunoscute general ca fiind sigure, furnizând două sau mai

multe din următoarele elemente sub formă ionizabilă: calciu, crom, cupru,

fluor, iod, fier, magneziu, mangan, molibden, fosfor, potasiu, seleniu şi

zinc. Tabletele conţin nu mai puţin de 90.0 la sută şi nu mai mult de 125.0

la sută din cantitatea etichetată de calciu (Ca), cupru (Cu), fier (Fe),

magneziu (Mg), mangan (Mn), fosfor (P), potasiu (K) şi zinc (Zn) şi nu mai

puţin de 90.0 la sută şi nu mai mult de 125.0 la sută din cantităţile etichetate

de crom (Cr), fluor (f), iod (I), molibden (Mo) şi seleniu (Se). Ele nu conţin

vitamine. Pot conţine alte substanţe adăugate, menţionate pe etichetate în

cantităţi care nu sunt subiectul obiecţiilor.

Rezultate

Testul de dizolvare in vitro (probele 1-9)

Pahar Proba

Masa (g)

3

comprimate

Conţinut Se

declarat

(µg)/cp

Observaţii

1 B 2,74 15

- după 60 min. toate cele trei

comprimate prezentau nucleu

palpabil

2 C 4,20 50 - 1 comprimat a prezentat nucleu

palpabil, după 60 min

3 D 3,70 40 - dizolvare totală

4 E 3,55 30

- după 60 min. toate cele trei

comprimate prezentau nucleu

palpabil (> 50% din masa

comprimatului)

5 F 1,32 100 dizolvare totală

6 G 3,51 17,5 dizolvare totală

7 I

(clasa VI) 1,01 100 - comp. au dezagregat după 10 min.

8 J

(clasa V) 1,69 50 - comp. au dezagregat după 10 min.

9 H

(clasa V) 2,53 50

- învelişul şi-a păstrat integritatea

pe parcursul celor 60 de min. (la

prox. 20 min. am observat o gonflare

evidentă a caps.).

32

Tabel III.7.

Estimarea capacităţii de dizolvare a suplimentelor nutritive, prin

determinarea seleniului cedat

Intervalul

de timp

(minute)

Concentraţiile de seleniu cedate {(µg/comprimat sau capsulă)/ %}

Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Proba

5 Proba 6

Proba

7 Proba 8 Proba 9

10 4,35/29 16/32 19,2/48 - 47/47 8,4/48 92/92 48,25/96,5 -

20 6,45/43 19/38 21,2/53 - 59/59 11,02/63 96/96 - -

30 8,53/57 27/54 25,6/64 3,6/12 61/61 13,82/79 = = 9,6/19,2

40 9,15/61 29,5/59 28,8/72 7,5/25 73/73 15,22/87 = = 13,25/26,5

50 10,20/68 35/70 31,6/79 8,7/29 84/84 16,1/92 = = 16/32

60 10,45/70 36,5/73 33,2/83 11,1/37 92/92 16,8/96 = = 23,4/46,2

Discuţii

Rezultatele obţinute la determinarea capacităţii de dizolvare a celor

9 probe de suplimente nutritive luate în studiu scot în evidenţă faptul că în

unele situaţii forma farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din

cantitatea de seleniu declarată. Două dintre probe (proba 7 şi proba 8) au

cedat seleniul după numai 10 sau 20 de minute de experiment. În schimb,

probele 1, 2, 4 şi 9 au prezentat o capacitate de cedare a seleniului de 70%,

73%, 37,5 şi, respectiv 46,2%.

Rezultatele obţinute de noi sugerează că nu toate suplimentele

alimentare condiţionate sub formă de comprimate sau capsule respectă

condiţiile impuse privind capacitatea de dizolvare in vitro. Această

concluzie susţine rezultatele unui studiu realizat în Franţa asupra calităţii

suplimentelor alimentare în care, pentru 382 de produse s-a determinat

conţinutul în principii nutritive (valoare nutritivă, vitamine, minerale),

conservanţi şi alţi aditivi, metale grele, pesticide, etichetare, s-a constatat că

75% dintre ele erau necorespunzătoare: prezentau substanţe neautorizate,

conţineau plante sau părţi din plante neautorizate în alimentaţia umană,

erau adăugate vitamine şi substanţe minerale sub formă neautorizată şi în

concentraţii mai mari decât dozele zilnice recomandate, prezentau pesticide

organoclorate în concentraţii care nu pot fi neglijate, prezentau etichetare

incompletă.

Concluzii

Rezultatele obţinute la determinarea seleniului din probele de

suplimente alimentare luate în studiu evidenţiază variaţii faţă de

concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de concentraţiile

declarate variază între – 7,2% şi +7,06%.

33

Pentru rezultatele obţinute de noi, concentraţiile de seleniu

determinate variază între 92,8% şi 107,06%, valori care se încadrează în

limitele impuse de legislaţia în vigoare (variaţii cuprinse între 90% şi 125%

faţă de concentraţia declarată).

Rezultatele obţinute la determinarea capacităţii de dizolvare a celor

9 probe de suplimente nutritive luate în studiu scot în evidenţă faptul că în

unele situaţii forma farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din

cantitatea de seleniu declarată. Două dintre probe au cedat seleniul după

numai 10 sau 20 de minute de experiment, în schimb, altele dintre probele

analizate au prezentat o capacitate de cedare a seleniului de 70%, 73%, 37,5

şi, respectiv 46,2%.

Rezultatele obţinute de noi sugerează că nu toate suplimentele

alimentare condiţionate sub formă de comprimate sau capsule respectă

condiţiile impuse privind capacitatea de dizolvare in vitro.

34

Capitolul IV

EVALUAREA ROLULUI PROTECTOR AL SELENIULUI ÎN

INTOXICAŢIA SUBACUTĂ CU ACRILAMIDĂ PE BAZA UNOR

PARAMETRI BIOCHIMICI, HEMATOLOGICI ŞI

HISTOPATOLOGICI

IV.1. Introducere

Pe lângă efectele favorabile pe care procesul culinar le produce

asupra alimentului în general, sau asupra anumitor principii nutritive din

componenţa acestuia, tratamentul termic poate avea şi consecinţe nedorite:

reducerea valorii biologice prin distrugerea unor principii nutritive

(aminoacizi, vitamine), modificarea unor proprietăţi senzoriale (culoare,

textură), apariţia unor compuşi de degradare nocivi (acroleină, compuşi

furanici, acrilamidă) (Cuciureanu, 2005).

Acrilamida (AA), compus chimic cunoscut încă de la sfârşitul

secolului XIX pentru efectele sale neurotoxice şi cancerigene, a fost

decelată în alimentele prelucrate termic prin prăjire sau coacere (produse pe

bază de cartofi, chips-uri, pâine) de către cercetătorii suedezi în aprilie 2002

(Mottram et al.,2002; SNFA, 2002 ). Se găseşte în fumul de ţigară şi, este

inclusă şi în categoria toxicilor “de mediu” (“environmental“) toxic pe baza

efectelor neurotoxice consecutive expunerii, la fumătorii activi sau pasivi.

După anul 2002, Organizaţia Mondială a Sănătăţii a lansat programe

de cercetare care abordează aspecte începând cu mecanismul de formare,

concentraţia în alimente, acţiunea toxică, până la elaborarea recomandărilor

privind prelucrarea termică a alimentelor în vederea reducerii formării AA.

Aceste cercetări (studii experimentale şi date epidemiologice) au confirmat

acţiunea cancerigenă a AA la animalele de laborator. În plus, au fost puse în

evidenţă efecte toxice asupra funcţiei de reproducere, a dezvoltării, în

general, precum şi efecte genotoxice (WHO 2002).

IV.2. Obiectivele cercetării

Prezentul capitol îşi propune ca obiective:

Studierea potenţialului protector al seleniului (administrat sub

formă de selenit de sodiu) şi a unor suplimente alimentare cu seleniu asupra

şobolanilor Wistar în intoxicaţia experimentală, pe cale orală, cu doze

crescute de acrilamidă prin:

35

Evaluarea modificărilor biochimice, hematologice şi

histopatologice la şobolani cu intoxicaţie subacută cu acrilamidă

(50mg/kgc/zi);


histopatologice la şobolanii la care administrarea de acrilamidă (intoxicaţie

subacută) a fost asociată cu administrarea simultană de seleniu (selenit de

sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând seleniu (Celnium).

Material şi metode

Protocol experimental

Şobolani Wistar adulţi cu greutatea cuprinsă între 180-220g, au fost

constituiţi în 8 loturi de câte 3 animale cărora, timp de 12 zile, după 12 ore de

post, li s-a administrat prin gavaj gastric:

Lot I (Control) – ser fiziologic = Control;

Lot II – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kgc/zi) = AA;

Lot IV – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de

selenit de sodiu 1mg/kg/zi (echivalent cu 1 mg Se) = AA + Se 1;


selenit de sodiu 0,2 mg/kgc/zi (echivalent cu 0,2 mg Se) = AA + Se 0,2;

Lot V - acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie Celnium

(supliment nutritiv cu seleniu, echivalent cu 0,2 mg Se/kgc/zi = AA + Ce.

La finalul experimentului, după 12 ore de post animalele au fost

sacrificate şi s-au recoltat probe de sânge în eprubete cu anticoagulant în

funcţie de tipul de analiză. Probele din ţesutul hepatic (pentru analizele pe

omogenat de ficat) au fost recoltate pe ser fiziologic la temperatura de 2-3

grade şi păstrate la - 35°C până la efectuarea determinărilor (GSH, GPx, TAS,

MDA).

Probele pentru examenul histopatologic (ficat, rinichi, creier,

testicul, pancreas) au fost recoltate şi păstrate în soluţie de formol 10 %.

IV.3. Investigaţii biochimice

După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor

biochimice au fost centrifugate pentru 15 minute, la 3000 rotaţii pe minut.

Plasma obţinută a fost supusă imediat determinărilor biochimice care s-au

realizat metode standardizate folosind kituri ELITech.

Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de

experimentul realizat s-au efectuat pe analizoarele semiautomate LITech,

Randox sau prin determinări spectrofotometrice clasice. Toate rezultatele

prezentate reprezintă media a 5 determinări (fiecare parametru a fost

determinat individual pe plasma recoltată de la 5 şobolani).

36

IV.3.1.1. Determinarea activităţii alanin-amino-transferazei (ALT)


Fig. IV. 3. Valorile plasmatice ale alanin-amino-transferazei

Rezultatele obţinute (figura IV.3.) evidenţiază creşterea valorilor

activităţii ALT la lotul AA comparativ cu lotul Control. Asocierea

administrării AA cu seleniu a avut ca efect creşterea valorilor ALT de la

51,1 U/L la lotul Control la 95,5 la loturile la care AA a fost asociată cu

seleniu sub formă de selenit de sodiu (0,2 mg/kg), respectiv Celnium.

Evoluţia alanil aminotransferazei, enzimă cu localizare strict citosolică,

evidenţiază creşteri semnificative ale activităţii, sugerând permeabilizarea

membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul intercelular.

IV.3.1.2. Determinarea aspartat-amino-transferazei (AST)


Rezultatele obţinute în urma investigaţiei activităţii primului

indicator de citoliză hepatică, aspartat aminotransferaza, sunt redate în

figura IV.4.

Studiul acestor rezultate evidenţiază variaţii majore, a căror

interpretare poate conduce la date importante privitoare la farmacocinetica

acrilamidei administrate oral.

Se observă o creştere a activităţii acestei enzime celulare de la

203,66 la 229,66 26 UI pentru lotul la care s-a administrat AA. Această

tendinţă de creştere a activităţii hepatice a AST este neconcordantă cu

rezultatele raportate de Yousef et al. (2005) care evidenţiază o scădere a

valorilor AST hepatic pentru toate dozele de acrilamidă administrate

37

(Fig.IV.5). Pentru lotul la care AA a fost administrată simultan cu selenitul

de sodiu în concentraţie de 1 mg/kg, valoarea plasmatică a aspartat-amino-

transferazei a scăzut la 145,51 U/L.

Fig. IV.4. Valorile plasmatice ale aspartat-amino-transferazei

Aceste valori sugerează că ar avea loc migrarea AST din

citoplasma hepatocitelor în spaţiul intercelular datorită creşterii

permeabilităţii membranare. Această permeabilizare a membranei

hepatocitului fi datorată lezării consecutive legării acrilamidei sau a unor

metaboliţi de proteinele membranare.

38

Fig.IV. 5. Evoluţia activităţii ALT, AST şi ALP în ficat după tratamentul cu

acrilamidă (Yousef et al. 2005)

IV.3.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei (GGT)


Aşa cum arată aceste date (Fig.IV.7.), activitatea y-glutamil

transpeptidazei pentru lotul de referinţă este de 8,1U/L; activitatea GGT

înregistrează o creştere semnificativă pentru lotul AA, tratat cu acrilamidă

la 11,6U/L. Această creştere se corelează cu evoluţia indicatorilor de

citoliză hepatică la acest lot. Pentru loturile de animale care au primit

acrilamidă în asociere cu seleniu valorile γ-glutamil transpeptidazei au

evoluat spre cele caracteristice lotului Control.

39

Fig. IV.7. Valorile plasmatice ale γ-glutamil transpeptidazei

IV.3.5. Determinarea creatin kinazei (Creatin-fosfokinaza, CK)


Fig. IV.10. Concentraţiile plasmatice ale creatin-fosfokina

Rezultatele obţinute la determinarea activităţii creatin-fosfokinazei

(figura IV.10.) evidenţiază valorile crescute pentru lotul intoxicat cu

acrilamidă, comparativ cu lotul control (1606,2 U/L, comparativ cu 1127,1

U/L). Din datele prezentate în figură reiese capacitatea seleniului administrat

simultan sub formă de selenit de sodiu sau de supliment alimentar (Celnium)

40

de a contracara acţiunea toxică a acrilamidei şi a normaliza leziunea

biochimică produsă de aceasta. Rezultatele obţinute de noi nu sunt corelate

cu cele raportate de alţi autori (Fig. IV.11.) (Yousef et al., 2005).

Fig. IV.11. Valorile plasmatice ale creatin kinazei în urma tratamentului cu

acrilamidă (Yousef et al., 2005).

IV.3.7. Determinarea proteinelor totale


Rezultatele concentraţiei proteinelor plasmatice (figura IV.13) pentru cele 5

loturi de şobolani luate în studiu evidenţiază concentraţii diminuate ale

proteinemiei la loturile intoxicate cu acrilamidă în concentraţie de 50

mg/kg corp. Asocierea seleniului normalizează evident valorile plasmatice

ale proteinelor totale în plasma sanguină. Valorile obţinute în acest

experiment sunt în concordanţă totală cu cele raportate de Yusef et al.

(2006) şi Odland (1994).

Fig. IV.13. Concentraţia plasmatică a proteinelor totale

41

Yusef et al. (2006) au obţinut pentru lotul de şobolani intoxicat cu

acrilamidă administrată oral (50 mg/kgc) o scădere a proteinemiei la 6,3

mg/dl, faţă de 6,8 pentru lotul control (figura IV.14).

Fig.IV.14.Valorile plasmatice ale unor proteine plasmatice în urma

tratamentului cu acrilamidă (Yousef et al., 2005)

IV.3.8.2. Determinarea bilirubinei directe

Principiul metodei – determinare

Determinarea bilirubinei conjugate (directe) se bazează pe

capacitatea bilirubinei directe de a reacţiona cu acidul sulfanilic şi reactivul

diazo (fără accelerator). Se formează un compus colorat în roşu, intensitatea

culorii fiind direct proporţională cu concentraţia bilirubinei directe în ser.


În ceea ce priveşte bilirubina directă (figura IV.16), situaţia este

asemănătoare; valoarea plasmatică a acestui parametru a crescut de 19 ori

pentru lotul intoxicat cu acrilamidă (0,38mg/dl) faţă de martor (0,02 mg/dl).

Şi în cazul bilirubinei directe se poate afirma, pe baza valorilor obţinute, că

42

administrarea de seleniu ar normaliza traseul bilirubinei totale la nivel

hepatobiliar.

Fig. IV. 16. Valorile plasmatice ale bilirubinei directe

IV.3.10. Determinarea LDL – colesterolului


Dinamica valorilor colesterolului total este în concordanţă cu datele

publicate de Khalil et al. (2005). Astfel, concentraţiile colesterolului total sunt

mai mari decât ale lotului control. Administrarea a 50 mg acrilamidă/kgc a

condus la o creştere a total colesterolului la 85,2 mg/dl (figura IV.17).

Fig. IV.17. Concentraţiile plasmatice ale colesterolului total

43

Fig. IV.18. Concentraţiile plasmatice ale LDL colesterolului

Şi pentru loturile la care administrarea acrilamidei a fost asociată cu

seleniu s-a obţinut o creştere a valorilor colesterolului, dar în măsură mult mai

redusă. Astfel, pentru lotul care a primit 1 mg selenit de sodiu/kgc valoarea

parametrului este de 55,8 mg/dl, comparativ cu 67,1 mg/dl pentru lotul care a

primit 0,2 mg selenit/kgc.

Aceeaşi dinamică a fost obţinută şi la determinarea valorilor LDL

colesterolului. Astfel, pentru lotul intoxicat cu acrilamidă, valoarea LDL

este de 10,33 mg/dl, comparativ cu martorul la care sau obţinut 8,66 mg

colesterol/dl. Şi pentru acest parametru, putem aprecia că seleniul a

manifestat acţiune protectoare. Astfel comparativ cu lotul care a primit

acrilamidă, la cel la care toxicul a fost asociat cu 1 mg selenit de sodiu/kg,

valoare LDL colesterol a scăzut la 9,23 mg/dl (figura IV.18).

IV.3.14. Determinarea ferului

Principiul metodei- determinare

Fierul se dozează; prin metoda colorimetrică cu ferozina. Ionul

feric din ser este disociat de pe proteina transportoare, transferina, în mediu

acid şi, simultan, redus la ionul feros. Acesta reacţionează cu ferozina din

reactivul cromogenic şi formează un compus colorat, care are maximum de

absorbanţă la 546 nm şi a cărei intensitate de culoare este direct

proporţională cu concentraţia de fier măsurată.

Reacţia este lineară până la concentraţia de 198 μmol/l, în caz de

rerun, liniaritatea merge până la 398 μmol/l.

44

Concentraţia minimă detectabilă de Fe cu această metodă este de

2.0 μmol/l.


Fig. IV.22. Concentraţiile ferului plasmatic

Concentraţiile ferului plasmatic au crescut semnificativ la lotul de

animale intoxicat cu acrilamidă, 223,1 mg/dL comparativ cu 107,1 mg/dl la

lotul martor. Loturile care au primit acrilamidă şi selenit de sodiu prezintă

concentraţii ale ferului de 133,8 mg/dL pentru lotul AA+Se 1, 141,1mg/dL

pentru lotul AA+se 0,2, respectiv 153,4 pentru lotul AA+Ce (figura IV.22).

Rezultate concordante cu cele obţinute de noi au fost raportate de

Allam et al. (2010) care au obţinut creşteri ale concentraţiilor plasmatice

ale ferului la şobolani alimentaţi cu hrană conţinând acrilamidă timp de 21

de zile.

Pe toată durata experimentului realizat de autorii citaţi, de 28 de

zile concentraţia plasmatică a ferului a scăzut uşor. Astfel, după 21 de zile

valoarea ferului a fost de 94,11 mg/dl, comparativ cu lotul martor, la care

valoarea a fost de 106,97 mg/dL.

După 28 de zile de experiment concentraţia ferului a scăzut de la

104, 46 mg/dL la maror la 95, 56 mg/dl la lotul intoxicat cu acrilamidă.

Perturbarea homeostaziei ferului se poate explica prin scăderea în greutate

a animalului în prima etapă a experimentului şi prin formarea unor aducţi

acrilamidă-hemoglobină, respectiv glicidamidă-hemoglobină (Ling et al.,

1996; Konings et al., 2003).

45

IV.3.16. Determinarea nivelului plasmatic al ureei

Fig. IV.25. Concentraţiile plasmatice ale ureei

Rezultatele obţinute la determinarea ureei în sânge confirmă

toxicitatea renală a acrilamidei (BIBL). Astfel, la animalele intoxicate cu

acrilamidă nivelul ureei a crescut de la 38,9 mg/dL la martor la 57,5 mg/dL

(figura IV.25).

Valorile obţinute pentru loturile la care acţiunea toxică a

acrilamidei ar putea fi protejată prin asocierea cu seleniu sub formă de

selenit de sodiu, respectiv sub formă de supliment alimentar, Celnium,

evidenţiază faptul că valorile plasmatice ale concentraţiei ureei au scăzut

până la valori mai apropiate de ale lotului martor.

IV.3.17. Determinarea creatininei


Creatinina, ca parametru al evaluării funcţiei renale a prezentat

valori crescute la lotul de animale intoxicat cu acrilamidă. La toate loturile

la care acrilamida a fost asociată cu seleniu, nivelurile plasmatice ale

creatininei sunt mai scăzute decât cele ale lotului martor (figura IV.26).

Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu cele publicate de Khalil et al.

(2007), care au obţinut creşteri ale valorilor creatininei de la 1,18 mg/dL la

grupul martor la 1,83 la lotul care a consumat cartofi prăjiţi şi la 2,20

mg/dL la animalele de laborator alimentate cu pâine prăjită cu un conţinut

ridicat de acrilamidă timp de 6 săptămâni.

46

Fig. IV.26. Concentraţiile creatininei din plasmă

IV.3.19. Determinarea triiod-tironinei (T3)


Rezultatele obţinute pentru valorile triiodtironinei sugerează

confirmarea ipotezei conform căreia seleniul intervine în metabolismul

tiroidian. Pentru lotul de animale intoxicat cu acrilamidă, concentraţia T3 a

scăzut de la 2,63 μg/ml la 2,53 μg/ml. Intervenţia seleniului s-a concretizat

prin modificări ale concentraţiilor T3 necorelate cu doza de seleniu

administrată (Fig. IV. 28).

Fig. IV.28. Valorile plasmatice ale triiod-tironinei

47

IV.3.20. Determinarea tiroxinei (T4)


Fig. IV.29. Valorile plasmatice ale tiroxinei

Valorile plasmatice ale tiroxinei au scăzut dramatic la animalele

tratate cu acrilamidă, comparativ cu lotul martor (fig. IV.29). Rezultatele

sunt concordante cu cele obţinute de Bowyer et al. (2008), (fig. IV.30).

Scăderea este mult mai redusă la asocierea seleniului în concentraţie de 1

mg/kg (de la 10,63 μg/ml la 10,3 μg/ml).

Prin urmare, în studiile de administrare de doze mari de seleniu la

animale, lipsa relaţiei între efectul asupra enzimelor care metabolizează

medicamentele şi metabolismul glutationului în ficat, funcţia neutrofilă şi

schimbările în activitatea GSHPx au necesitat ca investigaţiile să facă

asocierea între seleniu şi statusul tiroidei.

IV.3.23. Evaluarea potenţialului protector al seleniului asupra

stresului oxidativ provocat de intoxicaţia cu acrilamidă

Obiective

Ca parametri pentru cercetarea prezenţei perturbărilor biochimice

provocate de intoxicaţia cu acrilamidă şi evidenţierea rolului seleniului ca

antioxidant în normalizarea valorilor acestor parametri s-au determinat:

superoxid dismutaza (SOD),

glutathion peroxidaza (GPx),

glutationul redus (GSH),

malondialdehida (MDA),

48

statusul total antioxidant (TAS).

Material şi metode

Răspunsul sistemelor antioxidative împotriva nivelurilor ridicate de

acrilamidă administrate la sobolani ;ieventualul potential protector al

seleniului a fost evaluat ]n cadul unui experiment ]n care s-a lucrat pe

şobolani albi Wistar cu greutăţi cuprinse între 220-250 g. Animalele au fost

achiziţionate de la Institutul Cantacuzino şi au fost menţinute în condiţii

standard de laborator. Animalele au fost ţinute în cuşti de dimensiuni

corespunzătoare conform normelor în vigoare; de asemenea au fost

asigurate condiţiile de ventilaţie.

Şobolanii au fost repartizaţi aleator în 5 loturi (de câte 5 animale

fiecare) care au primit: Lot I (Control) – ser fiziologic = Control;

Lot II – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kgc/zi) = AA;

Lot III – acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie de

selenit de sodiu 1mg/kg/zi (echivalent cu 1 mg Se) = AA + Se 1;


selenit de sodiu 0,2 mg/kgc/zi (echivalent cu 0,2 mg Se) = AA + Se 0,2;

Lot V - acrilamidă, soluţie apoasă (50 mg/kg/zi) şi soluţie Celnium

(supliment nutritiv cu seleniu, echivalent cu 0,2 mg Se/kgc/zi = AA + Ce. La

finalul experimentului, după 12 ore de post animalele au fost sacrificate şi s-

au recoltat probe de sânge în eprubete cu anticoagulant în funcţie de tipul de

analiză. Probele din ţesutul hepatic (pentru analizele pe omogenat de ficat) au

fost recoltate pe ser fiziologic la temperatura de 2-3 grade şi păstrate la -

35°C până la efectuarea determinărilor (GSH, GPx, TAS, MDA).

Cercetarile pe modele experimentale animale au respectat conditiile

impuse de ghidul Societatii Internationale de Studiu al Durerii (IASP) si al

Comitetului Consiliului European (86/609/EEC) cu privire la folosirea

animalelor de experienta si a preparatelor biologice.

S-au recoltat probe de sânge din plexul retroorbitar la 72h de la

administrare sub anestezia şobolanilor cu ketamină (75mg/kg i.p.), în

scopul efectuãrii analizelor biochimice.

Activităţile glutation peroxidazei din sânge şi a antioxidanţilor

totali din plasmă au fost măsuraţi folosind trusa Randox.

Analiza statistică a fost efectuat folosind o variantă a analizei

ANOVA). Testul Tukey a fost utilizat pentru comparaţii multiple (software

Statistici Direct versiunea 2.6). Rezultatele sunt prezentate ca medie a 5

determinări.


Rezultatele obţinute la determinarea superoxid dismutazei în

omogenatele de ficat sunt incluse în fig. IV.35.

49

Fig. IV. 35. Valorile activităţii SOD în omogenatele de ficat

Determinarea activităţii glutationperoxidazei în sânge, respectiv în

omogenatele de ficat a condus la valorile incluse în fig.IV. 36 şi IV.37.

1993,64

1770,72

1824,13

1803,021811,83

1650

1700

1750

1800

1850

1900

1950

2000

C ontrol AA AA +S e 1 AA +S e 0,2 AA+ C e

U/L

Fig. IV.36. Valorile glutation peroxidazei în sânge

50

35,42

30,24

41,6239,11 40,14

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


μm

ol/

g t

iss

ue

s

Fig. IV.37. Valorile glutation peroxidazei din omogenatelede ficat

Concentraţiile glutationului redus şi ale dialdehidei malonice,

determinate in omogenatele de ficat sunt consemnate în fig. IV. 38 şi IV. 39.

35,42

30,24

41,6239,11 40,14

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


μm

ol/

g t

iss

ue

s

Fig. IV.38. Valorile glutationului redus in omogenatele de ficat

Determinarea statusului total antioxidant, ca parametru global al

evaluarii intensitatii stresului oxidativ a condus la valorile inserate în fig.

IV.40.

Din analiza comparativă a valorilor privint influentarea de către

acrilamidă a statusului antioxidant şi capacitatea eventuală a seleniului de a

normaliza valorile parametrilor afectaţi rezultă că valorile activităţii

superoxid dismutazei au scăzut semnificativ la lotul la care s-a administrat

acrilamida. Valoarea medie determinată este de 133,2 U/mL la lotul AA,

51

comparativ cu 205,1 unităţi/ml la lotul martor. Pentru loturile la care s-a

asociat administrarea acrilamidei cu seleniu, valorile activităţii SOD au

crescut uşor. Astfel pentru lotul AA+Se 1 valoarea este de 185,1 U/mL, iar

pentru AA+Se 0,2 activitatea SOD este de 145,7 U/mL. Aceste date

sugerează existenţa unor diferenţe între capacitatea antioxidantă în funcţie

de concentraţia în seleniu şi forma sub care acesta este administrat.

Enzimele antioxidante (SOD, GPx) reprezintă suportul apărării

organismului faţă de RLO (Shigeoka et al., 1991; Tabatabaie et al., 1994;

Bandhopadhay et al., 1999).

55,42

92,14

84,36

68,81

57,83

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


nm

ol/

G t

iss

ue

s

Fig. IV.39. Valorile malondialdehidei (MDA) in omogenatele de ficat

11,48

6,31

8,6

7,12

8,02

0

2

4

6

8

10

12


mm

ol/

L0

Fig. IV.40. Valorile statusului total antioxidant din plasmă

52

Scăderea activităţii SOD şi GPx la lotul tratat cu acrilamidă poate fi

datorată creşterii peroxidării lipidice sau inactivării enzimelor prin "cross-

linking" cu malondialdehida. Consecinţa acestor procese este acumularea

radicalilor peroxid şi hidrogen peroxid cu consecinţe directe asupra

peroxidării lipidelor. Rezultatele obţinute în urma acestui studiu

experimental, în concordanţă cu cele raportate de Yousef et al., 2006; Allam

et al., 2010; Khalil et al., 2005) evidenţiază capacitatea seleniului de a inhiba

acumularea H2O2 şi a altor specii reactive de oxigen (Diplocke, 1994).

Cercetările experimentale realizate au condus la confirmarea

rolului acrilamidei în intensificarea stresului oxidativ, raportat de Yousef et

al., (2006), fig. IV. 41. Astfel, valorile GPx la lotul intoxicat cu acrilamidă

au scăzut de la 1993,64 U/L la lotul martor la 1770,72 U/L (fig. IV. 36).

Administrarea simultană a seleniului a contracarat în mică măsură acţiunea

nocivă a acrilamidei. Valorile de GPx au scăzut considerabil la loturile care

au fost tratate cu asocierea acrilamida - seleniu comparativ cu lotul control,

sugerând că acrilamida declanşează scăderea activităţii protectoare a

antioxidanţilor din celulă.

Valorile GPx prezintă o scadere semnificativă atunci când sunt

comparate cu probele AA sugerând că o cantitate semnificativă de reactanţi

ar consuma acest agent reducător. O creştere neaşteptată a fost observată

când au fost comparate toate probele de seleniu cu probele de control.

Aceste date ar putea sugera că seleniul are un rol antioxidant din cauza

aceasta a fost inclus în activitatea antioxidantă a GPx (fig. IV. 36; IV. 37).

Fig.IV.41. Modificări în activitatea superoxid dismutazei în ficat în urma

tratamentului cu acrilamidă (Yousef et al., 2005).

Analiza valorilor glutationului (Fig. IV. 38) susţin experimental

dublul rol al acestuia: cel de antioxidant şi de detoxifiant. Dacă pentru lotul

control valoarea GSH este de 35,42 μmol/g de ţesut hepatic, la lotul tratat cu

acrilamidă valoarea a scăzut la 30,24 μmol/g de ţesut.

53

Această scadere a valorilor glutationului sugereaza fie intervenţia

glutationului în combaterea supraîncărcării celulare cu radicali liberi ai

oxigenului, fie implicarea sa în mecanismele de metabolizare şi conjugare a

acrilamidei (Ohkawa et al., 1979, Jihen et al., 2009).

Pentru loturile tratate simultan cu acrilamidă şi cu seleniu se

constată o creştere a valorilor glutationului redus, proportională cu doza de

seleniu administrată. Astfel, pentru lotul AA + Se1 glutationul redus are

valorea 41,62 mmol/l, mai mare chiar decât a lotului martor; aceeaşi

tendinţă de normalizare s-a constatat la lotul AA + Se 0,2 şi la cel care a

primit seleniu sub forma unui supliment nutritiv, Celnium.

Fig. IV.42. Variaţia valorilor GSH după administrarea de acrilamidă

(Yousef et al., 2005)

Evoluţia valorilor obţinute la determinarea dialdehidei malonice

(Fig. IV. 39) evidenţiază în primul rând intervenţia severă a acrilamidei în

procesele de intensificare a stresului oxidativ; valorile parametrului cresc

de la 55,42 mmol/g de ţesut hepatic la 92,14 mmol/g de ţesut. Acţiunea

antioxidantă a seleniului se manifestă prin tendinţa de normalizare a acestor

parametri; valorile MDA au scăzut semnificativ faţă de cele ale lotului

tratat cu acrilamidă, dar rămân mai mari decât cele ale lotului Control.

Rezultatele obţinute sunt concordante cu ale altor autori care semnalează

normalizarea valorilor pentru parametrii de stres oxidativ la loturile de

animale intoxicate cu diferite xenobiotice (Newairy et al., 2007; Kesiket al.,

2008; Moghadaszadeh et al., 2006; Tong et al., 1999).

Statusul total antioxidant (Fig. IV. 40) prezintă o scădere semnificativă

la toate probele care conţin AA, respectiv acrilamidă şi seleniu faţă de probele

lotului Control. Aceste date sugerează că valorea scăzută a statusului total

antioxidant este o consecinţă a administrării acrilamidei. Cea mai mare scădere

a statusului total antioxidant este întâlnită în probele AA, în celelalte probe

scăderea a fost mai puţin severă. Este surprinzător faptul că, chiar dacă GSH a

înregistrat o creştere în proba AA + SE1, statusul total antioxidant a scăzut.

54

Valorile parametrilor care evaluează intensitatea stresului oxidativ

sunt în concordanţă cu concluziile la care au ajuns Yousef et al, (2000).

Radicalii liberi sunt produşi continuu in vivo şi există un număr de enzime

protectoare cu acţiune antioxidantă, unele dependente de statusul seleniului

din organism, care fac faţă agresiunii unor substanţe toxice.

IV.3.29. Evidenţierea modificărilor histopatologice

Examenul histopatologic a urmărit identificarea unor modificări

morfologice consecutive administrării de acrilamidă, respectiv acrilamidă

asociată cu seleniu şi suplimente nutritive pe bază de seleniu, la nivelul

creierului, ficatului, rinichiului, pancreasului şi splinei, considerate posibile

organe-ţintă.


Rezultatele obţinute la examenul histopatologic al probelor

recoltate în acest scop sunt prezentate în figurile următoare.

Analiza acestor imagini histopatologice evidenţiază:

Lotul martor: organele ţintă au prezentat o structură

histoarhitectonică normală, nefiind decelată nici o modificare morfologică

(figurile IV.43 - IV.46).

Lotul tratat cu acrilamidă, 50 mg/kgc, examenul histopatologic a

evidenţiat:

Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular, reacţie zonală

de proliferare glială în substanţa albă, rari neuroni apoptotici (figura IV.47).

Ficat: organizare lobulară păstrată, focare de degenerescenţă

granulo-vacuolară hepatocitară (subcapsular şi în jurul venei centro-

lobulare), inconstant zone cu capilare sinusoide dilatate şi congestive

(figura IV.48), rare focare de piecemeal necrosis (figura IV.49), moderată

proliferare a celulelor Kupffer, limfocite prezente în spaţiile porto-biliare.

Rinichi: corpusculi renali de dimensiuni inegale, majoritate având

dimensiuni mici; leziuni glomerulare de la proliferare mezangială moderată,

limitată la matricială, la proliferare mezangială importantă (matrice şi celule

mezangiale) (figura IV.50), în asociere cu lobulaţie schiţată sau evidentă,

focare izolate de scleroză intracorpusculară (figura IV. 51); predominant tubi

contorţi normali, rari tubi contorţi cu degenerescenţă granulo-vacuolară;

congestie la nivel cortical; medulară fără modificări.

Pancreas: insule Langerhans de dimensiuni foarte mari

(hipertrofiate), componenta acinară prezentând zone de acini mici alternând

cu zone de acini mari, dilataţi, plini de secreţie – cu localizare adiacentă

insulelor Langerhans (figura IV.52); mici focare de necroză acinară în

55

interiorul zonelor cu acini dilataţi (figura IV.52), sugerând posibilitatea ca

hipertrofia acinară să preceadă necroza.

Fig.IV.47.Creier–lot acrilamidă Fig.IV.53. Creier–lot acrilamidă–

protecţie Se 1

Fig. IV.48. Ficat–lot acrilamidă Fig.IV.49. Ficat – lot acrilamidă

Fig.IV.54. Ficat lot acrilamidă –

protecţie Se1

Fig.IV.56. Ficat – lot acrilamidă –

protecţie Se 0,2

56

Fig. IV.50. Rinichi–lot acrilamidă Fig.IV.51. Rinichi–lot acrilamidă

Fig.IV.55. Rinichi – lot acrilamidă –

protecţie Se1

Fig.IV.57. Rinichi – lot acrilamidă –

protecţie Se 0,2

Fig.IV.52.Pancreas–lot acrilamidă Fig.IV.58. Pancreas – lot acrilamidă –

protecţie Se 0,2

57

Splina: histoarhitectonică normală.

Pentru loturile tratate cu 1 mg/kgc selenit de sodiu şi acrilamidă, 50

mg/kgc, modificările histopatologice la nivelul creierului, ficatului şi

rinichilor sunt mai puţin severe:

Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular (fig.IV. 53).

Ficat: organizare lobulară păstrată, capilare sinusoide dilatate în

treimea internă a lobulilor, adiacent venelor centro-lobulare (figura IV.54),

foarte rare limfocite în spaţiile porto-biliare.

Rinichi: 50% din corpusculii renali prezintă ghemul glomerular fin,

fără încărcare mezangială; 50% din corpusculii renali prezintă proliferare

mezangială importantă (matricială) (figura IV.55).

Pancreas: histoarhitectonică normală.

Splină: histoarhitectonică normală.

Concentraţiile mai mici de seleniu (0,2 mg selenit de sodiu/kgc) şi

cele trei suplimente nutritive administrate în vederea evaluarii acţiunii

potenţial protectoare în intoxicaţia cu seleniu acţionează în sensul

normalizării structurilor histoarhitectonice ale organelor investigate.

Creier: moderat edem perineuronal şi perivascular.

Ficat: organizare lobulară păstrată, infiltrat inflamator limfocitar

prezent în spaţiile porto-biliare (figura IV.56).

Rinichi: în jur de 50% din corpusculii renali prezintă ghemul

glomerular fin, fără încărcare mezangială; în plus, mai puţin de jumătate

din corpusculii renali prezintă proliferare mezangială importantă (celule

mezangiale) (figura IV.57).

Pancreas: histoarhitectonică normală (figura IV.58).

Splină: histoarhitectonică normală.

IV.4. Concluzii


histopatologice la şobolanii la care administrarea de acrilamidă (intoxicaţie

subacută) a fost asociată cu administrarea simultană de seleniu (selenit de

sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând seleniu (Celnium) a

urmărit determinarea unor parametri specifici pentru:

- Testarea integrităţii celulare după administrarea de acrilamidă şi

seleniu, pentru evidenţierea modificării permeabilităţii membranei

hepatocitului,

- Controlul capacităţii de sinteză a ficatului prin evidenţierea

perturbării funcţiei proteosintetice;

- Evaluarea stresului oxidativ consecutiv intoxicaţiei cu

acrilamidă, respectiv după administrarea acrilamidei în asociere cu seleniu;

58

Examenul histopatologic a urmărit identificarea unor modificări

morfologice consecutive aportului de acrilamidă la nivelul creierului,

ficatului, rinichiului şi pancreasului, considerate posibile organe-ţintă şi

evidenţierea capacităţii potenţiale a seleniului de a diminua aceste modificări.

Evoluţia valorilor alanil aminotransferazei, enzimă cu localizare

strict citosolică, evidenţiază creşteri semnificative ale activităţii acesteia,

sugerând permeabilizarea membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul

intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugerează că ar

avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor în spaţiul intercelular

datorită creşterii permeabilităţii membranare. Această permeabilizare a

membranei hepatocitului fi datorată lezării consecutive legării acrilamidei

sau a unor metaboliţi de proteinele membranare.

Activitatea GGT înregistrează o creştere semnificativă pentru lotul

de animale tratat cu acrilamidă; această creştere se corelează cu evoluţia

indicatorilor de citoliză hepatică la acest lot. Pentru loturile de animale

care au primit acrilamidă în asociere cu seleniu valorile γ-glutamil

transpeptidazei au evoluat spre cele caracteristice lotului Control.

Rezultatele concentraţiei proteinelor plasmatice pentru cele 5 loturi

de şobolani luate în studiu evidenţiază concentraţii diminuate ale

proteinemiei la loturile intoxicate cu acrilamidă în concentraţie de 50

mg/kg corp. Asocierea seleniului normalizează evident valorile plasmatice

ale proteinelor totale în plasma sanguină.

Rezultatele obţinute în urma determinării concentraţiilor plasmatice

ale bilirubinei totale confirmă afectarea severă a funcţiei hepato-biliare în

intoxicaţia cu acrilamidă.

Situaţia este asemănătoare şi în ceea ce priveşte bilirubina directă;

valoarea plasmatică a acestui parametru a crescut de 19 ori pentru lotul

intoxicat cu acrilamidă faţă de martor. Şi în cazul bilirubinei directe se

poate afirma, pe baza valorilor obţinute, că administrarea de seleniu ar

normaliza traseul bilirubinei totale la nivel hepatobiliar.

Dinamica valorilor colesterolului total este în concordanţă cu datele

publicate de alţi autori. Astfel, concentraţiile colesterolului total sunt mai mari

decât ale lotului control după Administrarea a 50 mg acrilamidă/kgc. Şi pentru

loturile la care administrarea acrilamidei a fost asociată cu seleniu s-a obţinut o

creştere a valorilor colesterolului, dar în măsură mult mai redusă. Aceeaşi

dinamică a fost obţinută şi la determinarea valorilor LDL colesterolului.

Perturbarea homeostaziei ferului (creşterea concentraţiilor plasmatice

la loturile intoxicate cu acrilamidă şi tendinţa de normalizare la cele la care

aceasta a fost asociată cu seleniul) se poate explica prin scăderea în greutate a

59

animalului în prima etapă a experimentului şi prin formarea unor aducţi

acrilamidă-hemoglobină, respectiv glicidamidă-hemoglobină.

Rezultatele obţinute la determinarea sodiului şi a potasiului

plasmatic reflectă o uşoară perturbare a homeostaziei acestor minerale, ca

urmare a afecării funcţiei renale.

Determinarea parametrilor care evidenţiază afectarea renală

confirmă toxicitatea renală a acrilamidei; astfel, valorile plasmatice ale

ureei, creatininei şi acidului uric au crescut semnificativ la lotul tratat cu

acrilamidă, dar au manifestat tendinţă de normalizare la administrarea

simultană de seleniu.

Investigarea funcţiei tiroidiene prin determinarea T3 şi T4 şi

urmărirea raportului acestora a evidenţiat scăderea dramatică a valorilor

plasmatice ale tiroxinei la animalele tratate cu acrilamidă, comparativ cu

lotul martor. Scăderea este mult mai redusă la asocierea seleniului în

concentraţie mai crescută. Faptul că administrarea de seleniu a perturbat

raportul T3/T4 sugerează intervenţia seleniului în metabolismul tiroidian.

Concentraţiile plasmatice ale glucozei au crescut la toate loturile

comparativ cu martorul; s-a constatat şi o uşoară creşterea valorilor glucozei la

loturile la care acrilamida a fost asociată cu seleniul. Se poate presupune

intervenţia acrilamidei în metabolismul glucidic care conduce la creşterea

valorilor glicemiei. Această perturbare a metabolismului glucidic s-ar

suprapune peste intensificarea gluconeogenezei provocată de administrarea de

seleniu.


acrilamidă administrate la sobolani şi eventualul potential protector al

seleniului a fost investigat prin determinarea (în sânge total, plasmă sau

omogenate de ficat) parametrilor de stres oxidativ: superoxid dismutaza

(SOD), glutathion peroxidaza (GPx), glutationul redus (GSH),

malondialdehida (MDA) şi statusul total antioxidant (TAS). Din analiza

comparativă a valorilor privind influenţarea de către acrilamidă a statusului

antioxidant şi capacitatea eventuală a seleniului de a normaliza valorile

parametrilor afectaţi rezultă că valorile activităţii superoxid dismutazei au

scăzut semnificativ la lotul la care s-a administrat acrilamida şi existenţa unor

diferenţe între capacitatea antioxidantă în funcţie de concentraţia în seleniu şi

forma sub care acesta este administrat. Scăderea activităţii SOD şi GPx la

lotul tratat cu acrilamidă poate fi datorată creşterii peroxidării lipidice sau

inactivării enzimelor prin "cross-linking" cu malondialdehida. Analiza

valorilor glutationului susţine experimental dublul rol al acestuia: cel de

antioxidant şi de detoxifiant. Scăderea valorilor glutationului sugereaza fie

intervenţia glutationului în combaterea supraîncărcării celulare cu radicali

60

liberi ai oxigenului, fie implicarea sa în mecanismele de metabolizare şi

conjugare a acrilamidei.

Pentru loturile tratate simultan cu acrilamidă şi cu seleniu se

constată o creştere a valorilor glutationului redus, proportională cu doza de

seleniu administrată.

Statusul total antioxidant prezintă o scădere semnificativă la toate

probele care conţin AA, respectiv acrilamidă şi seleniu faţă de probele

lotului Control. Valorile parametrilor care evaluează intensitatea stresului

oxidativ sunt în concordanţă numeroase date din literatura de specialitate;

radicalii liberi sunt produşi continuu in vivo şi există un număr de enzime

protectoare, unele dependente de statusul seleniului din organism, cu

acţiune antioxidantă, care fac faţă agresiunii unor substanţe toxice.

Evaluarea histopatologică a fragmentelor de creier provenite de la

animalele lotului de Control prezintă o structură histoarhitectonică normală.

Pentru lotul tratat cu acrilamidă în concentraţie de 50 mg/kg corp, analiza

histopatologică a evidenţiat prezenţa unor edeme perineuronale şi

perivasculare moderate, reacţie zonală de proliferare glială în substanţa

albă, precum şi rari neuroni apoptotici.

Examenul histopatologic al ficatului pentru lotul Control a relevat o

histoarhitectonică normală. Imaginile obţinute în urma evaluării

histopatologice la animale din lotul AA reliefează focare de degenerescentă

granulo-vacuolară hepatocitară (subcapsular şi în jurul venei centro-

lobulare), inconstant zone cu capilare sinusoide dilatate şi congestive rare

focare de piecemeal necrosis (fig. moderată proliferare a celulelor Kupffer.

Asocierea AA + Ce, Se 1mg/kgc şi Se 0,2 mg/kgc protejează ficatul,

stimulând apărarea – fapt susţinut de exacerbarea infiltratului inflamator

limfocitar prezent în spaţiile porto-biliare; cel mai bine a protejat SE1,

numărul de limfocite prezente fiind foarte mic.

Spre deosebire de lotul de referinţă, unde analiza histopatologică a

fragmentelor de rinichi nu au evidenţiat nici o modificare morfologică

imaginile obţinute pentru lotul intoxicat cu acrilamidă au prezentat corpusculi

renali de dimensiuni inegale, majoritatea având dimensiuni mici. De asemenea,

s-au putut observa leziuni glomerulare de la proliferare mezangială moderată,

la proliferare mezangială importantă (matrice şi celule mezangiale).

Asocierea AA + Ce, Se 1mg/kgc şi Se 0,2 mg/kgc protejează rinichiul,

la nivelul căruia leziunile identificate mai sunt reduse faţă de cele prezente la

lotul tratat exclusiv cu AA: există o populaţie importantă de corpusculi renali

(aproximativ 50%) cu aspect normal, iar afectarea mezangială alternează între

proliferare matricială, respectiv matricială şi celulară.

61

CONCLUZII GENERALE

Finalizarea cercetărilor pentru realizarea tezei de doctorat au

condus la următoarele concluzii generale:

Stabilirea protocolului de lucru pentru metoda de determinare

spectrofotometrică a seleniului din probe de produse alimentare şi

suplimente nutritive (lungimea de undă, stabilitatea culorii, volumele

optime de reactivi etc) a stat la baza validării acesteia. Parametrii de

validare studiaţi (liniaritate, repetabilitate, exactitate, limită de detecţie,

limită de cuantificare, etc) s-au înscris în limitele acceptate pentru aplicarea

acestui tip de metode. Reproductibilitatea metodei a variat între 84, 43 şi

97,06% la determinarea pe probe de pâine integrală şi între 81,14 şi 96,52

la determinarea realizată pe probe de usturoi. Aceste valori se încadrează în

cerinţele impuse pentru validarea metodelor spectrofotometrice.

Metoda validată a fost aplicată pentru determinarea seleniului din

probe de produse alimentare. Separarea seleniului din probe s-a realizat

prin mineralizare umedă nitro-sulfurică. Rezultatele obţinute, exprimate în

μg Se/100g de produs alimentar sut în concordanţă cu valorile raportate de

alţi autori pentru acelaşi tip de produse.

Aceeaşi metodă spectrofotometrică a fost aplicată pentru

determinarea seleniului din suplimente nutritive cu seleniu, comercializate

în Romania. Abaterea procentuală calculată variază între (- 7,20%) şi

(+7,06%) şi se încadrează în reglementările în vigoare (Standarde de

referinţă USP).

Cercetarea capacităţii de cedare a seleniului din suplimentele

nutritive luate în studiu scoate în evidenţă faptul că în unele situaţii forma

farmaceutică cedează, in vitro, mai puţin de 50% din cantitatea de seleniu

declarată. Două dintre probe au cedat seleniul după numai 10 sau 20 de

minute de experiment. În schimb, alte 4 probe au prezentat o capacitate de

cedare a seleniului de 70%, 73%, 37,5 şi, respectiv 46,2%. Aceste rezultate

sugerează că nu toate suplimentele alimentare condiţionate sub formă de

comprimate sau capsule respectă condiţiile impuse privind capacitatea de

dizolvare in vitro.

62

Studierea potenţialului protector al seleniului (administrat sub formă

de selenit de sodiu) şi a unor suplimente alimentare cu seleniu asupra

şobolanilor Wistar în intoxicaţia experimentală, pe cale orală, cu doze

crescute de acrilamidă realizată prin evaluarea modificărilor biochimice,

hematologice şi histopatologice la şobolani cu intoxicaţie subacută cu

acrilamidă (50mg/kgc/zi), respectiv prin evaluarea modificărilor biochimice,

hematologice şi histopatologice la şobolanii la care administrarea de

acrilamidă (intoxicaţie subacută) a fost asociată cu administrarea simultană

de seleniu (selenit de sodiu), respectiv un supliment nutritiv conţinând

seleniu (Celnium) a evidenţiat intervenţia benefică a seleniului prin tendinţa

de normalizare a u unor parametri biochimici.


acrilamidă administrate la sobolani şi eventualul potential protector al

seleniului a fost evaluat în cadrul unui experiment în care s-a lucrat pe

şobolani albi Wistar. Ca parametri pentru cercetarea prezenţei perturbărilor

biochimice provocate de intoxicaţia cu acrilamidă şi evidenţierea rolului

seleniului ca antioxidant în normalizarea valorilor acestor parametri s-au

determinat: superoxid dismutaza (SOD), malondialdehida (MDA),

glutationul redus (GSH), glutathion peroxidaza (GPx) şi statusul total

antioxidant (TAS).

Administrarea acrilamidei (AA grup) a fost asociată cu o creştere

semnificativă statistic a nivelurilor MDA în omogenatele din ficat

comparate cu probele control. Mai mult, comparat cu probele control,

acrilamida a cauzat descreşterea glutation peroxidazei din ficatul omogenat

şi a statusului total antioxidant din sânge şi, respectiv, plasmă. Co

administrarea selenitului de sodium şi a Celnium-lui cu acrilamidă a fost

asociată cu creşteri semnificative ale parametrilor de stress oxidativ în

ficatul omogenat prin comparaţie cu probele de acrilamidă. Nivelul de

MDA din ficatul omogenat a crescut puţin în probele care au primit

acrilamidă, selenit de sodiu şi Celnium, ca agenţi hepatoprotectori.

Nivelurile de GPx au scăzut considerabil când au fost comparate cu

probele care au primit acrilamidă şi probele de control, sugerând că

acrilamida declanşează scăderea activităţii protectoare a antioxidanţilor din

celulă. Cea mai mare degradre a fost observată în lotul AA care conţin

numai acrilamidă sau cu o doză diferită de selenium.

Statusul total antioxidant prezintă o scădere semnificativă la lotul

AA în comparaţie cu Lotul Control. Aceste date sugerează că activitatea

scăzută a antioxidanţilor totali este o consecinţă a administrării acrilamidei.

63

Este surprinzător faptul că, deşi GSH a înregistrat o creştere în proba AA +

SE1, capacitatea antioxidantă (TAS) a scăzut. Concentraţiile MDA din

probele AA au sunt semnificativ mai mari decât probele control. În probele

ce conţin diferite concentraţii de selenium, valorile MDA evidenţiază

refacerea parţială a activităţii antioxidante a ţesutului hepatic al animalului.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Allam A. A, El-Ghareeb A. W, Abdul-Hamid M., Bakery A. E, Gad

M., Sabri M., Arch Toxicol. 2010; 84(2):129-41.

Arthur J. R., Nicol F., Becket GT. Selenium deficiency, thyroid

hormone metabolism and thyroid hormone deiodinases. Am.J.

Clin. Nutr., 1993; 57: 5236-5239.

Barclay M.N.I., MacPherson A., Dixon J., Selenium content of a

range of UK foods. Journal of Food Composition and Analysis,

1995; 8(4): 307-318.

Brown K. M., Arthur J. R. Selenium, selenoproteins and human

health: a review, Public Health Nutr. 2001 Apr; 4(2B):593-9.

Canter P. H., Wider B., Ernst E., The antioxidant vitamins A, C,E

and selenium in the treatment of arthritis: a systematic review

of randomized clinical trials, Rheumatology, 2007; 46(8):

1223-1323.

Cuciureanu R., Elemente de Igiena alimentaţiei, Ed. „Gr. T. Popa”,

Iaşi, 2005;

Diplocke A. T. Antioxidant and free radical scavengers. In: Catherine

Rice-Evans and R H Burdon, "Free Radical Damage and its

Control", 1994; (4) 113-130. Elsevier, New York.

Environmental Health Criteria 58, Selenium, Geneva: World Health

Organisation, 1987. Eurola M, Hietaniemi V (ed.) Report of the

Selenium Monitoring Programme 1997-1999. Publications of

Agricultural Research centre of Finland, series B24, 2000

Jokoinen, Finland: Agricultural Research Centre of Finland.

Ferretti R. J., Levander O.A., Effect of Milling and Processing on the

selenium content of grains and cereal products, J. Agric. Food

Chem, 1974; 22(6), 1049-1051.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allam%20AA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22El-Ghareeb%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Abdul-Hamid%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bakery%20AE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gad%20M%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sabri%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19862503

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brown%20KM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arthur%20JR%22%5BAuthor%5D


64

Foster H. D. Selenium and Health: Insights from the People's

Republic of China. Journal of Orthomolecular Medicine, 1989;

4(3): 123-135.

Gärtner R., Gasnier B. C. H., Dietrich J. W. Selenium

Supplementation in Patients with Autoimmune Thyroiditis

Decreases Thyroid Peroxidase Antibodies Concentrations. The

Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2002;

87(4):1687–1691.

Ge K., Yang, G. The epidemiology of selenium deficiency in the

etiological study of endemic diseases in China. Am. J. Clin.

Nutr., 1993; Supplement 57: 259S-263S.

Hussein L., Bruggemann J. Selenium analysis of selected Egyptian

foods and estimated daily intakes among a population group.

Food Chemistry 65, 1999; 527 – 532.

Hussein M. M., Yousif A. A., Saeed A. M. Serum Levels of

Selenium, Zinc, Copper and Magnesium in Asthmatic Patients:

a Case Control Study, Sudan Journal of Medical Science,

2008; 3 (1): 45-49.

Khalil1 F. A., Abd El Aziem B. H. Effect of Dietary acrylamide

formed in otato crisps and toasted bread on rats, Egyptian

Journal of Natural Toxins, 2005; Vol. 2, 57-70.

Koishi R. Production of functional human selenocysteine-containing

KDRF/ thioredoxin reductase in E-coli. Journal of

Biochemistry, 2000; 127(6): 977-983.

Lăcătuşu R., Ghelase I. Seleniul în solurile zonelor hematurigene din

Carpaţii Orientali, Bul. Inf. ASAS, 1992; 22, 35-50.

Lăcătuşu R., Tripăduş I., Lungu M., Cârstea S., Kovacsovics B.,

Crăciun I., Selenium abundance in some soils of Dobrogea

(Romania) and ovine myodistrophy incidence, Trans. of

Macro- and Trace Elem. Symp., Jena, Germqany, 2002; 114-

119.

Lăcătuşu R., Lungu M., Aldea M., Lăcătuşu A-R, Stroe V.M., Lazăr

D., et al., Selenium in the rock – soil system from south/eastern

part of Romania present environment and sustainable

development, , 2010 (4): 145-157.

65

Lobanov A. V., Hatfield D. L., Gladyshev V. N. Reduced reliance on

the trace element selenium during evolution of mammals,

Genome Biol. 2008; 9(3):R62.

McCoy K. E. M., Weswig P. H. Some selenium responses in the rat

not related to vitamin E. Journal of Nutrition, 1969; 98: 383-

389.

Meuillet E., Stratton S., Cherukuri D. P. Chemoprevention of

prostate cancer with selenium: An update on current clinical

trials and preclinical findings. Journal of Cellular

Biochemistry, 2004; 91(3): 443–458.

Mézes M., Balogh K., Prooxidant mechanism of selenium toxicity- a

review, Acta Biologica Szegediensis, 2009; 53 (1): 15-18.

Moghadaszadeh B., Beggs AH. Selenoproteins and their impact on

human health through diverse physiological pathways.

Physiology, 2006; 21: 307-15

Mottram D. S., Wedzicha B. L., Dodson A. T. Acrylamide is formed

in the Maillard reaction, Nature, 2002; 419: 448-449.

National Research Council (U.S), Subcommittee on Selenium,

Selenium in Nutrition, Washington D.C.: National Academy

Press, 1983.

Negro R. Selenium and thyroid autoimmunity. Biologics: Targets &

Therapy, 2008; 2(2): 265-273.

Newairy A. A., El-Sharaky A. S., Badreldeen M. M., Eweda S. M.,

Sheweita S. A. The hepatoprotective effects of selenium

against cadmium toxicity in rats. Toxicology 2007; 242: 23-30.

Odland I., Romert L., Clemedson C., Walum E. Glutathione content,

glutathione transferase activity and lipid peroxidation in

acrylamide-treated neuroblastoma NIE 115 cells. Toxicol. In

Vitro, 1994; 8, 263-267.

Oldfield J. E. A brief history of selenium research: From alkali

disease to prostate cancer (from poison to prevention).

Reilly C., Selenium in food and Health, Blackie Academic and

Professionals, Londra, 1996.

Reilly C. The Nutritional Trace Metals. Oxford, Blackwell

Publishers, 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lobanov%20AV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hatfield%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gladyshev%20VN%22%5BAuthor%5D


66

Revanasiddappa H. D. Kumar T. N. A facile spectrophotometric

method for the determination of selenium, Anal. Sci., 2001; 17

(11):1309-12.

Salonen J., Alfthan G., Huttunen J. Association between serum

selenium and the risk of cancer. Am. J. Epidemiol.1982; 120:

342-349.

Shigeoka S., Takeda T., Hanaoka T. Characterization and

immunological properties of selenium-containing glutathione

peroxidase induced by selenite in Chlamydomonas reinhardtii,

Biochem. J., 1991; 275: 623–627.

Shiobara Y., Yoshida T., Suzuki K. T. Effects of dietary selenium

species on Se concentrations in hair, blood, and urine., Toxicol

Appl Pharmacol., 1998; 152(2): 309-314.

Sunde R. A. Molecular biology of selenoproteins. Annu Rev. Nutr.,

1990; 10: 451-474.

Swedish National Food Agency, Press release, (2002),

http://www.slv.se/engdefault.asp;

Tabatabaie T., Floyd R. A. Susceptibility of glutathione peroxidase

and glutathione reductase to oxidative damage and the

protective effect of spin trapping agents, Biochemistry and

Biophysics, 1994; 314: 112-119.

Tarp U., Overvad K., Thorling E.B. Selenium treatment in

rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatology, 1985; 14: 364–

368.

Thomas C. D. Assessment of requirements for selenium and

adequacy of selenium status, A review, Eur J Clin Nutr, 2004;

58, 391-402.

Thompson C. D., Chisholm A., McLachlan S. K., Campbell J. M.,

Brazil nuts: an effective way to improve selenium status. Am.

J. Clin. Nutr., 2008; 87: 379-384.

Virtamo J. E., Valkeila G., Alfthan S., Punsar J. K., Huttunen,

Karvonen M. J. Serum selenium and the risk of coronary heart

disease and stroke. Am. J. Epidemiol., 1985; 122: 276-282.

World Health Organization and Food and Agriculture Organization

of the United Nations, Vitamin and mineral requirement in

human nutrition, 2nd ed., 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Revanasiddappa%20HD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kumar%20TN%22%5BAuthor%5D


http://www.slv.se/engdefault.asp

67

World Health Organization. Acrylamide in Food (Update), Weekly

Epidemiological Record, 2002; 77(30): 253-254.

Yousef M. I., El-Demerdash F. M. Acrylamide-induced oxidative

stress and biochemical perturbations in rats. Toxicology, 2006;

219(1-3):133-141.

Yousef M. I., El-Demerdash F. M. Acrylamide-induced oxidative

stress and biochemical perturbations in rats. Toxicology, 2005;

219 (1-3): 231-239.

Zhong L., Holmgren A. Essential Role of Selenium in the Catalytic

Activities of Mammalian Thioredoxin Reductase Revealed by

Characterization of Recombinant Enzymes with Selenocysteine

Mutations. Journal of Biological Chemistry, 2000; 275(24):

18121-18128.

ARTICOLE PUBLICATE DIN TEZA DE DOCTORAT

1. Vlad-Ioan Teodor, Magdalena Cuciureanu, Cristiana

Filip, Nina Zamosteanu, Rodica Cuciureanu - Protective effects of

selenium N-acrylamide toxicity in rat’s liver. Effects on the oxidative

stress, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi 2011;115(2): 612-618;

2. Vlad-Ioan Teodor, Magdalena Cuciureanu, Bogdan

Şlencu, Nina Zamosteanu, Rodica Cuciureanu - Potential protective

role of selenium in acrylamide intoxication. A biochemical study,

Studia Universitatis “Vasile Goldiş”, Seria Şiinţele Vieţii 2011; 21

(2): 163-168.

3. Vlad-Ioan Teodor, Irina Vârlan, Nina Zamosteanu, D.

Chelărescu, Magdalena Cuciureanu, Rodica Cuciureanu -

Potential

protective role of selenium dietary supplements in experimental

acrylamide intoxication, European Journal of Drug Metabolism and

Pharmacokinetics (14th Pan-Hellenic Pharmaceutical Congress, 9-11

May, 2009), in extenso în CD-ul Congresului.

Teza Seleniu

Documents

Transcript of Teza Seleniu